Summary
ここで我々 は説明の幼虫が 3 令単一分子光重合ローカリゼーション顕微鏡することができますライブキイロショウジョウバエのモーター神経ターミナルに実施されるどのように。
Abstract
超解像顕微鏡技術の増加する数は、ナノスケールの携帯電話の世界を支配するメカニズムを明らかに貢献しています。単一分子イメージングは、生きている細胞の個々 の分子の可視化への例外的なアクセスを提供するので、勢いを増しています。ここでは、我々 はショウジョウバエ幼虫における単一粒子追跡写真活性局在顕微鏡 (sptPALM) を実行する開発手法について述べる。シナプスを通じてコミュニケーションはシナプス前の主要なタンパク質ドッキング、プライミング、および神経伝達物質含有の融合を推進して、活動するに依存している細胞膜と小胞。タンパク質間およびタンパク質-脂質相互作用の範囲は、しっかりとこれらのプロセスを調節してシナプス蛋白質は、したがって各キー イベントに関連付けられている移動性の変化を展示します。どのこれらの蛋白質の移動性がそのまま生きている動物の生理機能と関連の調査は、その正確な作用機序を理解することに不可欠です。高解像度生体内で蛋白質の移動性を抽出には、光透過性、アクセシビリティ、および浸透深さなどの制限事項を克服する必要があります。蛍光蛍光タンパク質変異シンタキシン 1 a を若干斜光を介して可視化およびモーター神経ターミナルまたは第三の運動ニューロン軸索に沿って追跡できるシナプス前のタンパク質にタグがショウジョウバエに齢期について述べる幼虫。
Introduction
神経細胞のコミュニケーションは、伝達物質の放出、細胞膜1神経伝達物質を含むシナプス小胞の規制の融合による発生するに依存します。エキソサイトーシス2,3,4,5,6と呼ばれるこのプロセスは、非常にダイナミックな刺激7のレートの変動に従ってアップまたはダウンの調整をすることができます。これらのプロセスに関わるたんぱく質ブラウン運動、及びしたがってバインドこれらの生理機能を支える行動の範囲を維持できるナノ組織が表示されます。膜蛋白質は非常にダイナミックな細胞膜7,8,9,10、11、ナノクラ スターに分子の外側トラップを許可します。 12。など、アクション8の彼らのモードを明らかにすることができますこれらの蛋白質の移動性を調査します。可溶性 N-エチルマレイミド敏感な要因添付ファイル蛋白質の受容器 (スネア)、たとえば変異シンタキシン 1 a などのシナプス蛋白質が分子として役立つかもしれないナノクラ スター内のトラップを横し同様、横の高速移動を展示に現在知られています。デポと小胞融合9,13,14,15のためのサイト。
蛍光蛍光タンパク質、単量体 (m) Eos16,17楓18, などの最近の開発を許可しているアプローチを使用して神経細胞膜タンパク質のナノ分解能など光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率論的光再建顕微鏡 (嵐)14,15,19。これらの開発は、モビリティと培養細胞とニューロンの生物の蛋白質の nanoclustering 調査を有効にしています。最近では、研究を行ったこのようなハツカネズミ、線虫とダイナミクスとそのまま生物の神経細胞にこれらの膜タンパク質の組織 (と同様の高解像度) で明らかにするショウジョウバエ14,20,21,22。
しかこのような障害を克服するために能力も (やし、嵐、および蛍光 fluorophores) など最近開発された超解像イメージング ツールの使用だけでなく、蛋白質の生体内組織の動態・必要です。タンパク質とイメージングのレーザーの浸透深さのアクセシビリティとしてそのまま動物細胞内タンパク質のイメージングは、そのままマウスの海馬など、そのままの動物の生体組織内に深く埋め込まれた構造のタンパク質が、画像として本質的に困難です。それ故に、蛋白質または組織の表面近くにはイメージより簡単に。生体内イメージングと別の難しさは、動物間での再現性を確保するためにです。もう 1 つのサンプルから解剖学が異なることがありますとそのまま動物の異なるサンプルで複製の容易さと構造を選択するも挑戦を証明します。シナプスのようにステレオタイプの構造の使用、これらの問題のいくつかを克服するを助けます。
一方、他の調査は、たとえば組織・臓器の表面にタンパク質の組織をイメージして、最近の研究は動物線虫22など光学的に透明な表皮で蛋白質の移動性をイメージしてライブ マウス21の頭蓋骨を介して大脳皮質ニューロンにおけるアクチン画像。不動; 動物を維持するいくつかのケースで麻酔薬を使用されています。ただし、特定の麻酔薬が興味の蛋白質に悪影響を与える可能性があります。生体内でイメージ投射の間不動の動物を維持する代替手段は、エラーを最小限に抑えるため検討必要があります。
超解像イメージング体内に別の注意点は興味の蛋白質を照らすに使用されるレーザーが周囲の組織に悪影響を与える可能性したがって励起強度を可能な限り低く保つことをお勧めします。レーザーで周囲の組織の照明はまた背景信号を増加させる傾向があります。低励起強度の使用背景を減らすことができます、それをされていることに注意が蛍光タンパク質光子収率の減少につながる可能性も。イメージ分析の前にバック グラウンド信号を削減する代わりの手段として、分析中に背景差分をされる可能性があります。
ショウジョウバエは、生体内イメージング機能の特定の蛋白質の調査を提供する確立された遺伝的ツールとしての理想的な生物を提示します。上流活性化シーケンス (UAS)-Gal4 システムでタンパク質発現の時空と神経伝達23を操作するため、ことができますようなショウジョウバエ過渡熱遺伝的刺激受容体の潜在的な家族 A1 (dTRPA1)24または遠赤色シフト CsChrimson25を使用して光遺伝的刺激は14のイメージングと併用できます。我々 はこのシステムで生体内単一分子イメージングを実行する複雑さの多くを克服しているし、今ショウジョウバエ第 3 齢幼虫単一粒子追跡することができます実行する方法を説明します。
Protocol
1. mEos2 付けられた蛋白質を表現する遺伝子組換えショウジョウバエのデザイン
- MEos2 タンパク質とタグに蛋白質を選択します。画像処理の成功率を上げるには、膜貫通ドメインを持つタンパク質で選択神経膜14 (例えば、変異シンタキシン 1 a)、シナプス小胞またはオートファゴソーム26,27 (例えば、蛋白質Synaptobrevin-2)、または神経の膜蛋白質 (例えばMunc18 1) と密接な相互作用と細胞質蛋白質。
- MEos2 タグ付きタンパク質 (図 1) をエンコードする遺伝子を構築します。蛋白質および mEos2 のための前方および逆のプライマーを設計します。
注: mEos2 コーディング シーケンスは興味の蛋白質の C 末端に融合するように設計された pmEos2 N1 プラスミッドから増幅することができます。クローニングなど、酵母pFL44S を使用して体内組換えによって行うことが-attB-MCS-w +14,28のベクトル、ギブソンなど他のクローンの作成方法を使用できる代わりにアセンブリ プロトコル29。- 病原と XbaI ベクトルを線形化し、共同ura3 mEos2 および興味の蛋白質を符号化する PCR のフラグメントと酵母細胞に変換します。トランスジェニック フライ ライン30を生成する構築とショウジョウバエの胚を注入します。
- リアの標準酵母、糖蜜培地またはプラスチック バイアルに含まれているいくつか他の適切な代替のトランスジェニック フライ文化。確実に健康的なかなり大規模なシナプス研究31をバイアル、過密のハエや毎日産卵; の後新しい瓶にハエを反転これにより第 3 齢幼虫も供給し、彼らは媒体の徘徊開始時間によって適切なサイズに達する。室温 (25 ° C) でトランスジェニック フライを上げます。
注: 大きなシナプス ボタン イメージの中に可視化蛋白質の大きい量を生成する傾向があります。
2. 第 3 齢幼虫の郭清
- 円柱状または凹形ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基本引時間: 20 mm 径と引時間: 20 mm の高さの適切なシリコーン エラストマー キット (図 2 a) を使用して。硬化剤 10:1 の比率でシリコーンとシリコーン ・ エラストマーをミックスします。
- 5 分、dimsensions と金型に混合物が上記を注ぐのため徹底的に混合物をかき混ぜなさい。45 分間 100 ° C のオーブンで強化しましょう。PDMS のベースは、郭清を行う基盤として機能します。ガラス底培養皿のよく収まる PDMS ベースを確認します。
- バイアル壁から放浪の 3 令幼虫を選択します。4.5 倍率光学ステレオ顕微鏡を使用して、幼虫を背側と PDMS 円筒底面配置を視覚化します。
- 使用する曲線し、口フック、前気門を拡張する 2 つの頭と 2 つの後部気門の間、肛門の上尾 minutien ピンを固執するピンセットします。固定化の幼虫に室温でシュナイダーの昆虫媒体の 40 μ L を追加します。
注: (HL3 または HL6) Hemolyph のようなソリューションは、シュナイダーのソリューション32,33の代わりにも使用可能性があります。 - 壁の正中に切開に minutien ピンの使用によって幼虫の腹部体壁の背側でアクセスを提供します。
- 体壁を切るに使用春はさみを切開ポイントから開きます。前後方向34で正中線に沿ってカットします。
- 微細鉗子を使用し、春の幼虫を独特にはさみ: 唾液腺、気管や腸など内臓を削除します。シュナイダーの昆虫の中で 2 回幼虫を洗います。
- 微細鉗子で 2 体壁フラップを保持、穏やか、それらをストレッチして、それぞれの側に 2 つの minutien ピンをスティックします。これは六角形の準備 (図 2 a) を生成する必要があります。
- イメージ投射; 中に筋肉の動きの可能性を減少する春のはさみを使用して腹側神経索から脳をデタッチします。これはまた平らなイメージングの料理準備を保持するために提供しています。PDMS ベースにすべての六つの minutien ピンをプッシュするのに、ピンセットを使用します。
注: 腹壁内のピンの小さな部分だけを埋め込む必要があります。 - 幼虫が、術を生存していることを確認は、やや腹側神経索を突く、これは幼虫の腹部壁の蠕動収縮を引き出す必要があります。
3. やや斜め照明単一粒子追跡顕微鏡
- ガラス底培養皿に切り裂かれた幼虫 PDMS ベースを反転します。室温シュナイダー昆虫媒体 (図 2 b) の 2 mL でイメージングの皿を満たし。
- 腹筋 6 と 735 63 x を使用してシナプスの 2 番目と 3 番目のセグメントの運動ニューロンを検索/1.2 蛍光の全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡の NA 水浸対物レンズです。
- 顕微鏡の接眼レンズを使用して切り裂かれた幼虫; を検索明視野照明の使用によって筋 6 を識別します。
- 顕微鏡取得ソフトウェアを使用 (材料の表を参照)、全反射構成で浸透深さを増加する、それ以外の場合全反射臨界角から斜めの照明を達成するために移動を 1 ° コリメータ カメラ アングルまでスライドさせます。
- 緑の mEos2 を視覚化する 488 nm レーザーをオンに。低いレーザー力を使用 (22.8 の 5% 未満 mW) 緑の蛍光性を漂白を避けるために。(これは文字列のビーズのように見える) 神経筋接合部を検索し、全反射する、低解像度の画像を取得します。
- 同時に 405 nm レーザーのスイッチ (緑から赤の種の photoconverts の mEos2) 561 nm のレーザー (画像 photoconverted 赤 mEos2) 確率的単一 mEos2 蛍光蛋白質を集中させる。
注: 405 nm レーザの低消費電力の使用は推奨 (4.78 の 0.9% に 0.005 mW) 映画集録時に比較的一定光電率のことができます。50 と 75 %561 nm レーザーの間 (20.1 mW)、これは周囲の神経筋接合部、筋肉組織の形態に悪影響せず赤 mEos2 種からの蛍光性を取得するための十分な。 - 各神経筋接合部チェーン シリーズ以上で構成される 15,000 フレーム 33 Hz」下車 as.czi 形式保存可能な参照の付属メタ データを保存するために時間を取得します。
- '.Czi' 映画ファイルを「.tiff」ファイルに変換するのに ImageJ を使用します。
- フィジー/ImageJ37トラッキング解析ソフトウェア11,14,36 TrackMate など適切な分子を取得した映画を分析 (材料の表を参照してください)。'X' と 'y' を検索各ローカライズ強度ポイントのガウスのフィットでの座標分布関数 (PSF)。
注:トラブルシューティング: 緑色蛍光を観測されていないか、または 488 nm レーザーへの露出に神経筋接合部が暗すぎる場合は簡単に、photoconverting とレーザー イメージングをオン (405 nm と 561 nm) これは赤いのより多くを作り出すを助けるように、mEos2 の種。488 nm レーザーに切り替えてし、TIRF 画像を取る。
4. 単一分子局在固定幼虫
- パームを介してタンパク質ナノクラ スターのサイズを測定、定着剤 - リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈した 4% パラホルムアルデヒドで郭清後シュナイダーの昆虫媒体を交換してください。
- 室温で 30 分間幼虫を孵化させなさい。
- 削除解剖ピンし、固定の幼虫が、1.7 mL クリア スナップ ロック遠心チューブです。
- 解剖し、修正は他の多くの幼虫、必要に応じて、それら 3 回 PBS で洗浄します。
- PBS をブロック バッファー (PBS、0.1% トリトン X-100 および 3% のヤギ血清のソリューション) に置き換えます。
- 3 回は、PBS で幼虫を洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な一次抗体とインキュベートします。
- 4 oc. で一晩インキュベートします。
- PBS に幼虫を 3 回洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な二次抗体とインキュベートします。
- PBS に幼虫を 3 回洗いは、PDMS ベース、およびイメージの単一分子追跡のため前述のように幼虫を取り付けます。
Representative Results
上記、変異シンタキシン 1 a mEos2 トランスジェニックキイロショウジョウバエされたプロトコルを使用すると、(図 1) が生成されます。遺伝子組換え第三令ショウジョウバエ幼虫は PDMS 円筒ベース (図 2 a-f) の解剖されました。変異シンタキシン 1 a の単一の分子を可視化、やや斜めレーザー照明14全反射顕微鏡にパームを使用しました。
変異シンタキシン 1 a の分子は、2 番目の腹節の筋 6 シナプスの運動神経終末に追跡されました。タイプ 1 b 研究 488 nm レーザー (図 3 a) を使用して興奮しているときに変異シンタキシン 1 a mEos2 の低解像度の画像で示すように、mEos2 の緑色の蛍光を検出できます。イメージングの実験、405 nm と 561 nm 励起レーザー イメージング深さ 133.5 であった nm と比 165.6 nm、それぞれ。緑のイメージは、16 の個々 のフレームの平均として買収されました。この緑のイメージは、単独でのシナプスの運動神経終末に photoconverted 映画のローカライズの極限解析に使用される対象地域を作成に使用されました。
取得 photoconverted sptPALM 映画の分析が超解像の強度、拡散係数を生成され、軌道マップ (図 3 a)。変異シンタキシン 1 a mEos2 モビリティのさらに個々 の軌道 (図 3 b) の平均二乗変位 (MSD) の解析による定量化を行った。統計上の比較を行うことができます (図 3 b) MSD 曲線下の領域を使用します。モビリティのさらなる分析シンタキシンがはたす-1 a-mEos2 の拡散係数の分布が得られます、これは統計的に不動の集団 (図 3) に携帯の比較によって評価できます。
図 1: MEos2 タグ構造を生成します。PFL44S-attB-MCS-病原と XbaI w + ベクトルが線形化されます。重複するポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の断片 (ポイ) の蛋白質を符号化と mEos2、それぞれ、クローンを作成できます、たとえば、 ura3 -酵母細胞の生体内での再結合、ギブソン アセンブリ。我々 の内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターとターミネーター シーケンスが並ぶ構成クローン変異シンタキシン 1 a mEos2 遺伝子を生成するために注意してください。結果としての構築はその後 (ポイ) の mEos2 に融合蛋白を発現するトランスジェニック フライラインを作成するショウジョウバエの胚に注入することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ショウジョウバエ幼虫の郭清と斜光。ショウジョウバエ幼虫郭清の半円筒の PDMS ベースの実施を示す (A) スキーマ。フィレットの幼虫に開催されました、PDMS ゲル minutien ピンの使用によって。(B ・ C)幼虫 PDMS 準備は、シュナイダーの昆虫媒体を含んでいるガラス底培養皿の中に置かれました。やや斜めの照明構成で全反射顕微鏡は、運動神経終末における変異シンタキシン 1 a mEos2 を視覚化に使用されました。(D F)切り裂かれたショウジョウバエ幼虫の半円筒 PDMS ベース。シュナイダーの中でいっぱい画像皿に置かれた幼虫 PDMS 準備と幼虫を超解像パーム顕微鏡をイメージしました。スケール バー、10 mm。 (この図は、14から変更されている)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:生体内でシンタキシンがはたす-1 a-mEos2 シナプス前のモーター神経ターミナルでの追跡をします。(A) A 低解像度全反射のイメージ変異シンタキシン 1 a mEos2 タイプ 1 b モーター神経ターミナルに。光電映画の分析はマップ生成 33 Hz sptPALM 超解像強度、拡散係数および軌道でイメージ。5,309 個々 の軌道がイメージ以上 16,000 フレーム取得。スケール バー、3 μ m。(B ・ C)6 別のモーター神経ターミナルからプロットした変異シンタキシン 1 a mEos2 の平均二乗変位 (MSD)(AUC) MSD 曲線下面積は、モビリティのレベルを定量化に使用されました。拡散係数の分布を明らかにする; 他の比として定量化することができます携帯電話や不動の変異シンタキシン 1 a 集団モーター神経ターミナルあたり 〜 2,400 軌道の平均値が得られた (n = 3 の幼虫)。平均の平均の標準誤差として表示されるデータ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルでは、ショウジョウバエの 3 令幼虫の神経筋接合部で mEos2 タグ付きタンパク質の単一分子追跡について説明します。遺伝子組換え蛋白質の過剰発現を避けるためには、変異シンタキシン 1 a mEos2 式は内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターによって駆動されました。シナプス蛋白質の移動性に関する研究はほとんど体外培養細胞と大脳皮質ニューロン9,11,12,13の調査に限られています。これらの蛋白質が生きている動物のようなモビリティ署名を展示かどうかは、あまり知られていません。単一蛋白質の移動性生体内可視化するには、光学的透明性、アクセシビリティ、および浸透深さなど制限が克服しなければならないあります。幼虫の準備を解剖と神経筋接合部、筋肉の表面に埋め込まれたを可視化、光透過性とアクセシビリティの問題を避けてください。通常の全反射設定イメージ分子移動しようは失敗を証明しました。ただし、貫通深さ増加励起レーザーのやや斜めの照明の使用ができます。さらに、幼虫を固定するために使用 minutien ピンは蛋白質の移動性に麻酔使用の可能な影響を避けるために貢献。高い倍率の目的、油浸漬目標 × 100 などを使用して、単一分子の生体内を視覚化することが可能です。ただし、拡大率が焦点の外のドリフトの発生を高める可能性があります。さらに、我々 は低強度 (30%) を使用しています。561 nm レーザー画像単一分子運動神経終末に正常に。追加のテストより低いレーザー力を使用する必要があります。
このプロトコルは、神経細胞の細胞膜の近さ内のシナプス蛋白質の移動性を視覚化に適しています。このアプローチを使用する - 変異シンタキシン 1 a とタンパク質 Atg18a をバインドされたオートファゴソーム - スネア蛋白質の移動性は正常にイメージで vivo14,26をされています。運動ニューロン軸索することができます蛋白質の移動性は、27を検討しました。しかし、脳の腹側神経索蛋白質の移動性の調査により、基になる組織作り出された高いバック グラウンド信号を評価することは困難証明するかもしれないさらに、蛍光 (replicability ように) 脳構造のタグ付けが必要になります同じ脳構造の蛋白質の移動性の可視化とデュアル カメラ画像の使用が必要になります。
ショウジョウバエの超解像顕微鏡に使用できる現在の方法より開発第 3 齢幼虫38,39ではなくほとんどイメージング胚に限定。これらのプロトコルの主な問題は彼らがイメージ領域における軌道の数が少ないをもたらす、したがって移動状態22,40の詳細な分析を防ぐ。私たち生体内単一分子追跡プロトコルは軌道の数が多いを生成する能力を持っているし、 Caenorhabiditis 線虫ゼブラフィッシュなど他の動物モデルのため、可能性があります。確かに、すべて NMJ チェーンは、さまざまなモバイル状態やこれらの状態14,27間の遷移分析に適して 〜 2,400 軌道を生成しました。さらに、多く生体内単一分子イメージング戦略は、イメージングの実行される生理学的な機能を変更するか、動物20,22を動けなく麻酔薬の使用に依存します。ここで我々 は minutien のピンを使用して幼虫を固定する '麻酔無料' プロトコルを最適化されています。
このプロトコルの潜在的な使用は、3 つの次元で蛋白質の移動性を可視化するかもしれません。超解像顕微鏡の最近の進歩により蛋白質の移動性を可視化する生体外で'x' で 'y' と 'z' 寸法41,42。私たちの現在のメソッドは、'z' 軸の蛋白質の移動性については考慮しません。まだショウジョウバエモーター神経ターミナルは球状構造を三次元ボリューム43蛋白質の移動性を定量化する貴重な将来のアプローチになります。Z 次元のイメージングは、乱視のレンズを使用して実現可能です。また、全反射モード44,45, z 座標精度が増加もします。しかし、実験では、乱視のレンズなし syntaxin1A mEos2 の分子を可視化するのにやや斜めの照明を使用している私たち。
結論としては、両方を遺伝子組換えショウジョウバエはえ在庫の蛋白質を表現するが付いた蛍光タンパク質ベース PDMS の変更の可能性を搭載した全反射蛍光顕微鏡と同様、遺伝子組換えの幼虫を解剖する、照明の角度は、このプロトコルで説明されているように単一蛋白質を可視化するために必要な最も重要なツールです。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ジャン = バティスト ・ Sibarita とダニエル ・ ショケ (会社の IIN、CNRS/ボルドー大学) の単一分子解析とフレンドリーな対応感謝します我々 は特に、ニック Valmas を感謝し、ジェシカ Mcgaw (下さい QBI、クイーンズランド大学) ビデオの録画、ナレーションと同様、グラフィック デザインを図します。この仕事に支えられたオーストラリアの研究評議会 (AR) 発見プロジェクト (F.A.M. DP170100125)、オーストラリアの研究評議会 (F.A.M にリーフ グラント LE0882864)、未来の交わり (B.V.S.、FT100100725)、オーストラリア研究会議 (リーフ グラントF.A.M に LE130100078。)・ NHMRC プロジェクト (B.V.S.、APP1103923) を付与します。F.A.M NHMRC 主任研究員 (ONT1060075) であります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |
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