Summary
Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.
Abstract
Een toenemend aantal super resolutie microscopie technieken helpen bij het ontdekken van de mechanismen die de nanoschaal cellulaire wereld regeren. Single-molecuul imaging is goed op stoom als het biedt uitzonderlijke toegang tot de visualisatie van individuele moleculen in levende cellen. Hier beschrijven we een techniek die we ontwikkeld om uit te voeren single-deeltje tracking foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (sptPALM) in Drosophila larven. Synaptic mededeling berust op belangrijke presynaptische eiwitten die handelen door docking, priming en bevordering van de fusie van de neurotransmitter-bevattende blaasjes met het plasma-membraan. Een bereik van eiwit-eiwit en lipide-eiwit interacties strak regelt deze processen en de presynaptische eiwitten vertonen daarom wijzigingen in mobiliteit die is gekoppeld aan elk van deze belangrijke gebeurtenissen. Onderzoeken hoe de mobiliteit van deze proteïnen correleert met hun fysiologische functie in een intact levend dier is essentieel om te begrijpen hun precieze werkingsmechanisme. Winning van eiwit mobiliteit met hoge resolutie in vivo vereist het overwinnen van de beperkingen zoals optische transparantie, toegankelijkheid en diepte van de penetratie. We beschrijven hoe photoconvertible fluorescerende eiwitten gelabeld aan de presynaptische proteïne Syntaxin-1A kan worden gevisualiseerd via lichte schuine verlichting en bijgehouden op de motorische zenuw terminal of langs de motor neuron axon van de derde instar Drosophila larve.
Introduction
Neuronale communicatie is afhankelijk van de neurotransmitter release, die door de gereglementeerde fusie van synaptische vesikels neurotransmitter-bevattende met het plasmamembraan1 ontstaat. Dit proces genoemd exocytose2,3,4,5,6 is zeer dynamisch en kan up - of down-geregeld volgens schommelingen in het tempo van de stimulatie7. De eiwitten die betrokken zijn bij deze processen zijn onderworpen aan de Brownse beweging, en daarom nanoscopische organisatie staat voor het behoud van een aantal bindende acties die ten grondslag liggen aan deze fysiologische functies weer te geven. Plasma membraaneiwitten zijn zeer dynamisch, waardoor laterale overlapping van moleculen in nanoclusters op het plasmamembraan7,8,9,10,11, 12. Als zodanig, helpt onderzoekt de mobiliteit van deze eiwitten hun wijze van actie8ophelderen. Synaptic eiwitten zoals de oplosbare N-ethylmaleimide gevoelige factor bijlage eiwit receptoren (SNAREs), bijvoorbeeld Syntaxin-1A, is nu bekend dat ze vertonen laterale snelle mobiliteit, alsmede zijdelingse overlapping binnen nanoclusters die als moleculaire dienen kan depots en sites voor vesikel fusion9,13,14,15.
De recente ontwikkeling van photoconvertible fluorescerende eiwitten, zoals monomeer (m) Eos16,17 en Kaede18, heeft toegestaan de nanoscopische resolutie van neuronale plasmamembraan eiwitten door het gebruik van benaderingen dergelijke als foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)14,15,19. Deze ontwikkelingen hebben ingeschakeld onderzoeken naar de mobiliteit en de nanoclustering van biologische eiwitten in gekweekte levende cellen en neuronen. Meer recentelijk, studies zijn verricht ophelderen (bij vergelijkbare hoge resoluties) de dynamiek en de organisatie van deze membraaneiwitten in de neuronen van levende intact organismen dergelijke Mus musculus, Caenorhabditis elegans, en Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Onderzoeken van de dynamiek en de organisatie van een proteïne in vivo vereist niet alleen gebruik van de onlangs ontwikkelde super resolutie beeldvormende instrumenten (zoals PALM, STORM en photoconvertible fluorophores), maar ook het vermogen om dergelijke belemmeringen overwinnen Als de toegankelijkheid van het eiwit en de diepte van de penetratie van de beeldvorming laser. Imaging van intracellulaire eiwitten in een intact dier is inherent uitdagend zoals eiwitten op structuren diep in levende weefsels van het intact dier, zoals de hippocampus intact muizen ingesloten is imaging. Vandaar, eiwitten op of dicht bij het oppervlak van het weefsel zijn gemakkelijker beeld. Een ander probleem met in vivo imaging is bij het waarborgen van reproduceerbaarheid over dieren. Ook de anatomie kan afwijken van één monster naar de andere, het selecteren van een structuur met gemak van replicatie in verschillende intact dierlijke monsters zou kunnen blijken uitdagend. Het gebruik van stereotiepe structuren, zoals synapses, helpen met een aantal van deze moeilijkheden te overwinnen.
Recente studies hebben beeld eiwit mobiliteit bij dieren met een optisch transparante epidermis zoals Caenorhabditis elegans22, terwijl andere onderzoeken hebben bijvoorbeeld eiwit organisatie op het oppervlak van een weefsel/orgel, beeld actin imaging in corticale neuronen via de schedel van een levende muis21. In sommige gevallen, zijn verdoving gebruikt om te houden van het dier immobiel; echter kunnen specifieke verdoving negatief beïnvloeden de proteïne van belang. Alternatieve middelen om te houden van dieren immobiel tijdens in vivo imaging moeten daarom worden onderzocht om te minimaliseren van de fout.
Een andere valkuil super resolutie imaging in vivo is dat de lasers die gebruikt voor het verlichten van de proteïnen van belang het omringende weefsel ongunstig kunnen beïnvloeden, en vandaar de excitatie-intensiteit zo laag mogelijk te houden wordt aanbevolen. Verlichting van het omringende weefsel door de laser ook de neiging om het signaal van de achtergrond. Het gebruik van lage excitatie-intensiteit vermindert de achtergrond, het voorbehoud wordt het kan ook leiden tot een afname van de fluorescente proteïne foton opbrengst. Aftrekken van de achtergrond tijdens de analyse kan worden gebruikt als een alternatief middel om het signaal van de achtergrond voorafgaand aan beeldanalyse.
Drosophila presenteert een ideale organisme voor in vivo imaging aangezien deze gevestigde genetische hulpmiddelen voor het onderzoek van specifieke eiwitfunctie biedt. De upstream activerend volgorde (UAS)-Gal4 systeem kunt temporele en ruimtelijke uitdrukking van eiwitten en kan daarom worden gebruikt om te manipuleren transmissie23, zodanig dat thermo-genetische stimulatie via Drosophila voorbijgaande receptor potentiële subgroep A1 (dTRPA1)24 of opto-genetische stimulatie met behulp van de far-rode-verschoven CsChrimson25 kan worden gecombineerd met imaging14. We hebben veel van de complicaties van het uitvoeren van in vivo single-molecuul imaging in dit systeem overwonnen en nu beschrijven hoe single-deeltje bijhouden kan worden uitgevoerd in Drosophila melanogaster derde instar-larven.
Protocol
1. ontwerp van transgene Drosophila uiting van mEos2-gelabelde proteïnen
- Selecteer de proteïne moeten worden gecodeerd met de mEos2-eiwit. Het vergroten van de beeldvorming slagingspercentage, selecteer eiwitten met een transmembraan domein in de neuronale plasmamembraan14 (bijvoorbeeldSyntaxin-1A), eiwitten op synaptic blaasjes of autophagosomes26,(bijvoorbeeld 27 Synaptobrevin-2), of cytosolische eiwitten met nauwe interactie met de neuronale van de plasma-membraaneiwitten (bijvoorbeeldMunc18-1).
- Bouw transgenen codering van de mEos2-gelabeld proteïne (Figuur 1). De voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor de eiwitten en mEos2 ontwerpen.
Opmerking: De codering volgorde van mEos2 kan worden versterkt uit de pmEos2-N1 plasmide, die is ontworpen om de zekering aan de C-terminus van de proteïne van belang. Klonen kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door in-vivo recombinatie bij Saccharomyces cerevisiae met behulp van de pFL44S-attB-MCS-w + vector14,28, afwisselend andere klonen methoden kunnen worden gebruikt zoals de Gibson assemblage protocol29.- Linearize de vector met BamHI en XbaI en co transformeren in ura3 - gistcellen samen met de PCR-fragmenten codering van mEos2 en de proteïne van belang. Injecteren Drosophila embryo's met de constructie voor het genereren van een transgene vlieg lijn30.
- De achterkant van de transgene vliegen culturen op standaard gist en melasse medium of sommige andere geschikte vervanging vervat in plastic flesjes. Om ervoor te zorgen dat gezond en vrij groot synaptic los31, voorkomen van overbevolking vliegen in de flesjes, en vliegen aan nieuwe flesjes wegknippen na elke dag van het leggen van eieren; Dit garandeert de derde instar-larven worden goed gevoed en juiste grootte bereiken tegen de tijd dat ze beginnen zwerven op het medium. Verhogen de transgene vlieg bij kamertemperatuur (25 ° C).
Opmerking: Grotere synaptic los neiging om grotere hoeveelheid eiwitten gevisualiseerd tijdens imaging opleveren.
2. dissectie van derde Instar larve
- Maak een cylindrische of semicylindrical gevormde Polydimethylsiloxaan (PDMS) basis ≤20 mm in diameter en ≤20 mm in hoogte met behulp van een passende silicone-elastomeer kit (figuur 2A). Meng silicone-elastomeer met een siliconen verharding agent bij een verhouding van 10:1.
- Roer het mengsel grondig voor 5 min. Giet het mengsel in een mal met de dimsensions hierboven vermeld. Laat het harden in een oven bij 100 ° C voor 45 min. De PDMS base zal dienen als de basis waarop dissectie uitvoeren. Zorg ervoor de PDMS base past in de put van een glassbottom cultuur schotel.
- Selecteer een dolende derde instar larve in de muur van de flacon. Gebruik een optische stereomicroscoop op 4.5 vergroting te visualiseren de larve op de PDMS cilindrische base met de dorsale zijde up geplaatst.
- Gebruik schuin pincet te houden minutien pinnen op het hoofd over de mond-haken, tussen de twee voorste spiracles, uit te breiden en op de staart over de anus, tussen de twee achterste spiracles en gebogen. Voeg 40 µL van Schneiders insect medium bij kamertemperatuur op de larve van de geïmmobiliseerdet.
Opmerking: Hemolyph-achtige oplossingen (HL3 of HL6) kunnen ook worden gebruikt in de plaats van Schneiders oplossing32,33. - Bied toegang door de dorsale zijde van de buikwand van de body van de larve door gebruik van een minutien-pin om incise in de middellijn van de muur.
- Gebruik voorjaar schaar te snijden de lichaam muur open vanaf het punt van de snede. U snijdt langs de middellijn in de richting van het anterior-posterior-34.
- Gebruik fijne Tang en schaar aan buik opensnijden van de larve van de lente: verwijderen van de inwendige organen, met inbegrip van de speekselklieren, de luchtpijp en de darm. Wassen van de larve tweemaal met Schneiders insect medium.
- Met een fijne Tang, houden de twee lichaam muur kleppen voorzichtig rekken ze uit en stok twee minutien pinnen aan elke kant. Dit moet een zeshoek-vormige voorbereiding (figuur 2A) produceren.
- Loskoppelen van de hersenen van het koord van de ventrale zenuw voorjaar schaar met de mogelijkheid om van de spierbeweging verlagen tijdens imaging; Dit dient ook om te houden van de voorbereiding plat tegen de imaging schotel. Gebruik de gebogen pincet alle zes minutien pinnen in de base PDMS duwen.
Opmerking: Slechts een klein gedeelte van de pinnen moet worden ingebed in de buikwand. - Om te bevestigen dat de larve de dissectie-procedure heeft overleefd, iets steken het ventrale zenuw snoer, moet dit een peristaltische samentrekking van de buikwand larve uitlokken.
3. iets schuin verlichting Single-deeltje Tracking microscopie
- Omkeren van de ontleed larve-PDMS base op een schotel glassbottom cultuur. Vul de imaging schotel met 2 mL van kamertemperatuur Schneiders insect medium (figuur 2B).
- Zoek motorische neuronen in de tweede en derde segmenten met synapsen op buikspieren 6 en 735 met behulp van de 63 x / 1.2 nb water-onderdompeling doelstelling op een Microscoop fluorescerende totale interne reflectie fluorescentie (TIRF).
- Gebruik de oculairs van de Microscoop om te zoeken van de larve van de ontleed; spier 6 identificeren door gebruik van heldere veld verlichting.
- Gebruik van de Microscoop verwerving software (Zie Tabel of Materials), in TIRF-configuratie; Schuif de camerahoek collimator naar 1° tot het verhogen van de indringingsdiepte, anders verlaat TIRF kritische hoek schuine verlichting bereiken.
- Schakel de 488 nm laser te visualiseren van mEos2 in het groen. Gebruik de kracht van een lage laser (minder dan 5% van 22,8 mW) om te voorkomen dat de groene fluorescentie bleken. Zoek de neuromusculaire kruispunten (die er uitzien als parels aan een touwtje) en verwerven van de afbeelding met een lage resolutie-TIRF.
- Tegelijkertijd zet de 405 nm laser (photoconverts mEos2 van groen naar rood soorten) en de 561 nm laser (afbeelding de photoconverted rode mEos2) stochastically het lokaliseren van interne mEos2 fluorescerende eiwitten.
Opmerking: Gebruik van 405 nm laser energiebesparende wordt aanbevolen (0.005 tot 0,9% van 4,78 mW) omdat dit voor een relatief constant photoconversion tarief tijdens de overname van de film zorgt. Gebruik tussen de 50 en 75% van de 561 nm laser (20,1 mW), zoals dit voldoende om te verwerven van de fluorescentie van de rode mEos2 soorten is zonder negatieve effecten op de morfologie van het spierweefsel rondom de motorische eindplaat. - Voor elke keten van de motorische eindplaat, krijgt u een tijd serie uit 15.000 frames of meer op 33 Hz. opslaan as.czi bestaat oog op het behoud van de bijbehorende meta-gegevens voor mogelijke verwijzing.
- Gebruik ImageJ '.czi' filmbestanden te converteren naar '.tiff' bestanden.
- Analyseren van de verworven films met geschikt zijn honkslag-molecuul bijhouden van analytische software11,14,36 zoals TrackMate op FIJI/ImageJ37 (Zie Tabel van materialen). Lokaliseert de 'x' en 'y' coördinaten van elke lokalisatie door de Gaussiaanse pasvorm van de intensiteit punt verspreiden functie (PSF).
Opmerking: problemen oplossen: als groene fluorescentie niet wordt nageleefd of ook dim op de motorische eindplaat bij blootstelling aan de laser nm 488, kort zet de photoconverting en imaging lasers (405 nm en 561 nm), als dit helpt om de productie van de rode soorten mEos2. Ga terug naar de 488 nm laser en een TIRF beeld te nemen.
4. single-molecuul lokalisatie in vaste larven
- Voor het meten van de grootte van de nanocluster eiwitten via PALM, vervangt u de Schneiders insect medium na dissectie met een fixeer - 4% paraformaldehyde verdund in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Incubeer de larve gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de dissectie pinnen en de larve van de vaste plaats in een 1,7 mL Schakel module-lock microcentrifuge buis.
- Ontleden en monteren zoals vele andere larven desgewenst, daarna ze driemaal met PBS wassen.
- De PBS vervangen door blok buffer (een oplossing van PBS, 0.1% Triton X-100, en 3% normale geit serum).
- Spoel de larven met PBS driemaal en incubeer met de nodige primair antilichaam (verdund in de bufferoplossing blok).
- Na een nacht bebroeden bij 4 oC.
- Wassen van de larven driemaal met PBS en incubeer met de nodige secundair antilichaam (verdund in de bufferoplossing blok).
- Wassen van de larven driemaal met PBS, hechten de larve terug op de PDMS base, en het imago zoals eerder beschreven voor single-molecuul bijhouden.
Representative Results
Met behulp van het protocol vermelde boven, Syntaxin-1A-mEos2 transgene Drosophilamelanogaster werden gegenereerd (Figuur 1). Transgene derde instar Drosophila larven werden ontleed op de PDMS cilindrische base (figuur 2A-F). Om te visualiseren van afzonderlijke moleculen van Syntaxin-1A, we PALM op een Microscoop TIRF met licht schuine laser verlichting14gebruikt.
Afzonderlijke moleculen van Syntaxin-1A werden bijgehouden op de terminals van de presynaptische motorische zenuw op spier 6 van het tweede abdominale segment. De groene fluorescentie van mEos2 kon worden opgespoord, zoals blijkt uit de lage-resolutie afbeelding van Syntaxin-1A-mEos2 op type 1b los wanneer opgewekt met behulp van de 488 nm laser (figuur 3A). In de beeldvorming experimenten, de 405 nm en 561 nm excitatie laser imaging diepten werden 133.5 nm en 165,6 nm, respectievelijk. Het groene imago werd overgenomen als een gemiddelde van 16 afzonderlijke frames. Deze groene imago werd gebruikt voor het maken van de regio van belang gewend Beperk de scan van lokalisaties in de film van de photoconverted aan de presynaptische motorische zenuw terminals alleen.
De analyse van de verworven photoconverted sptPALM films gegenereerd een super opgelost intensiteit, diffusie coëfficiënt, en traject kaarten (figuur 3A). Syntaxin-1A-mEos2 mobiliteit werd verder gekwantificeerd door analyse van de verplaatsing van de mean square (MSD) van de individuele trajecten (figuur 3B). Statistische vergelijkingen kunnen worden gedaan met behulp van het gebied onder de MSD-curve (figuur 3B). Verdere analyse van mobiliteit opbrengsten de distributie coëfficiënt verspreiding van Syntaxin-1A-mEos2, en dit statistisch kan worden geëvalueerd door vergelijking van de mobiele immobiel populaties (Figuur 3 c).
Figuur 1 : Genereren van mEos2-gelabeld constructies. De pFL44S-attB-MCS-gelineariseerde w + vector is met BamHI en XbaI. Overlappende polymerase-kettingreactie (PCR) fragmenten codering van de proteïne van belang (POI's) en mEos2, respectievelijk kunnen worden gekloond, bijvoorbeeld door in vivo recombinatie bij ura3 - gistcellen of Gibson vergadering. Merk op dat we voor het genereren van de transgenic Syntaxin-1A-mEos2, de constructie geflankeerd door de endogene Syntaxin-1A promotor en terminator sequenties gekloond. De resulterende constructie kan vervolgens worden geïnjecteerd in Drosophila embryo's maken een transgene vlieg lijn uitdrukken van de proteïne van belang (POI's), gesmolten tot mEos2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Drosophila larve dissectie en schuine verlichting. (A) Schema Drosophila larve dissectie uitgevoerd op basis van half-cilindrische PDMS tonen. Een larve wordt gefileerd werd gehouden op het PDMS gel door gebruik van minutien pinnen. (B-C) De larve-PDMS prep werd geplaatst binnen een glassbottom cultuur schotel met Schneiders insect medium. Een Microscoop TIRF in een enigszins schuin verlichting-configuratie werd gebruikt om Syntaxin-1A-mEos2 visualiseren in de motorische zenuw-terminals. (D-F) Een half-cilindrische PDMS base met ontleed Drosophila larve. De larve-PDMS voorbereiding werd geplaatst in een imaging schotel gevuld met Schneider's medium, en de larve was beeld op de super resolutie PALM Microscoop. Schaal bar, 10 mm. (dit cijfer is gewijzigd van14). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : In vivo bijhouden van Syntaxin-1A-mEos2 op de presynaptische motorische zenuw terminal. (A) A met een lage resolutie TIRF afbeelding van Syntaxin-1A-mEos2 op een type 1b motorische zenuw terminal. Analyse van photoconversion films beeld op 33 Hz gegenereerd sptPALM Super opgelost intensiteit, diffusie coëfficiënt en traject kaarten. 5,309 individuele trajecten werden verbeelde meer dan 16.000 frames film acquisitie. Schaal bar, 3 μm. (B-C) Mean square verplaatsing (MSD) van Syntaxin-1A-mEos2 was uitgezet vanaf 6 verschillende motorische zenuw terminals; gebied onder de MSD-curve (AUC) werd gebruikt voor het meten van de mate van geografische mobiliteit. De verdeling van de coëfficiënt diffusie onthult mobiele en immobiel Syntaxin-1A populaties die kunnen worden gekwantificeerd als de ratio's van elkaar; een gemiddelde van ~ 2.400 trajecten werden verkregen per motor zenuw terminal (n = 3 larven). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol beschrijft één-molecuul bijhouden van mEos2-gelabelde proteïnen in de motorische eindplaat van de Drosophila derde instar larve. Voorkom overmatige expressie van transgene eiwit, werd Syntaxin-1A-mEos2 expressie gedreven door endogene Syntaxin-1A promotor. Studies van synaptic eiwit mobiliteit zijn meestal beperkt tot in vitro onderzoeken bij gekweekte cellen en corticale neuronen9,11,12,13. Of deze proteïnen vergelijkbaar mobiliteit handtekeningen in een levend dier vertonen is grotendeels onbekend. Om te visualiseren single-eiwit mobiliteit in vivo, beperkingen zoals optische diepte van de transparantie, toegankelijkheid en penetratie overwonnen moeten worden. Door de ontrafeling van de larvale voorbereiding en visualiseren van de neuromusculaire kruispunten ingesloten op het oppervlak van de spier, vermijden we de kwestie van de optische transparantie en toegankelijkheid. Pogingen om te afbeelding single-molecuul mobiliteit in normale TIRF configuratie bewezen mislukt. Echter zorgt gebruik van enigszins schuin verlichting voor verhoogde excitatie laser doordringing van diepte. Bovendien hielp de pinnen van de minutien gebruikt voor het immobiliseren van de larve te vermijden van elke mogelijke nadelige effect van verdoving gebruik op eiwit mobiliteit. Het is mogelijk om hogere vergroting doelstellingen, zoals de 100 x olie onderdompeling doelstellingen, gebruiken om te visualiseren van afzonderlijke moleculen in vivo. Grotere vergroting kan echter het voorkomen van driften onscherp toenemen. Daarnaast hebben we een lagere intensiteit (~ 30%) gebruikt 561 nm laser met succes naar de afzonderlijke moleculen van de afbeelding bij motorische zenuw terminals. Aanvullende tests kan worden vereist om lagere laser macht te gebruiken.
Dit protocol is geschikt voor het visualiseren van de mobiliteit van synaptic eiwitten in de nabijheid van de neuronale plasmamembraan. Met behulp van deze aanpak, de mobiliteit van de SNARE-eiwit - Syntaxin-1A en de autophagosome gebonden eiwit Atg18a - geweest met succes verbeelde in vivo14,26. De mobiliteit van eiwitten op motor neuron axonen kunnen ook worden onderzocht27. Onderzoek van de mobiliteit van eiwitten op de hersenen of de ventrale zenuw snoer blijken echter moeilijk in te schatten als gevolg van het signaal van de hoge achtergrond geproduceerd door het onderliggende weefsel; Daarnaast visualiseren van eiwitten mobiliteit op de dezelfde hersenstructuur vergt fluorescently tagging de hersenstructuur (zodat de dupliceerbaarheid), en gebruik van dual-camera imaging nodig zou zijn.
Huidige beschikbare methoden voor super-resolutie microscopie in Drosophila zijn meestal beperkt tot imaging embryo's, in plaats van de meer ontwikkelde derde instar larve38,39. Het belangrijkste probleem met deze protocollen is dat ze opbrengen van een laag aantal trajecten op het gebied van beeld, en vandaar diepgaande analyse van mobiliteit Staten22,40 voorkomen. Onze in-vivo enkel molecuul volgen protocol heeft de capaciteit voor het genereren van een groot aantal trajecten en kan daarom worden gebruikt in andere dierlijke modellen zoals Caenorhabiditis elegans en zebravissen. Inderdaad, elke keten NMJ gegenereerd ~ 2.400 trajecten makend het geschikt is voor het analyseren van de verschillende mobiele Staten en de overgangen tussen deze Staten14,27. Veel in vivo enkel molecuul imaging strategieën is bovendien afhankelijk van het gebruik van verdoving te immobiliseren van de dieren20,22, waardoor de fysiologische functie, waaronder de beeldvorming wordt gedaan kan worden gewijzigd. We geoptimaliseerd hier een protocol 'anesthesie-vrij' om te immobiliseren van de larven met minutien pinnen.
Een mogelijke toepassing van dit protocol kan worden voor het visualiseren van de mobiliteit van eiwitten in drie dimensies. Recente vooruitgang in super resolutie microscopie toestaan eiwit mobiliteit gevisualiseerde in vitro in 'x', 'y', en 'z' afmetingen41,42. Onze huidige methode houdt geen rekening met de mobiliteit van eiwitten in de 'z'-as. Nog de Drosophila motorische zenuw terminal is een bolvormige structuur en een waardevolle toekomstige aanpak zal te kwantificeren eiwit mobiliteit in een driedimensionale volume43. Beeldvorming in de z-dimensie is haalbaar met behulp van een astigmatic lens. U kunt ook in TIRF modus44,45, is de z-resolutie ook verhoogd. In onze experimenten, hebben wij echter iets schuin verlichting gebruikt om te visualiseren van afzonderlijke moleculen van syntaxin1A-mEos2 zonder de astigmatic lens.
Kortom, beschikbaarheid van zowel een transgene Drosophila vliegen voorraad uiting van eiwitten gelabeld met een photoconvertible eiwit, een basis PDMS te ontleden de transgene larve, evenals een TIRF Microscoop uitgerust met de mogelijkheid van het wijzigen van de hoek van verlichting zijn de belangrijkste instrumenten die nodig zijn voor het visualiseren van één eiwitten zoals beschreven in dit protocol.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Jean-Baptiste Sibarita en Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universiteit van Bordeaux) voor hun vriendelijke ondersteuning met de analyse van de single-molecuul. Wij danken vooral Nick Valmas en Jessica Mcgaw (QBI, Universiteit van Queensland) voor hun hulp bij de video opname, voice-over, alsmede figuur van grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door het Australische onderzoek Raad (AR) ontdekking project (DP170100125 F.A.M.), de Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 F.A.M.), toekomst Fellowship (FT100100725 naar B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 naar F.A.M.) en NHMRC Project verlenen (APP1103923 naar B.V.S.). F.A.M. is een NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |
References
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
