Summary
Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.
Abstract
Süper çözümleme mikroskobu teknikleri giderek artan sayıda Nano hücresel dünya yöneten mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı oluyor. Canlı hücreler içinde bireysel moleküllerin görselleştirme olağanüstü erişim sağlar gibi tek molekül görüntüleme ivme kazanıyor. Burada, tek-parçacık izleme fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (sptPALM) Drosophila larva gerçekleştirmek için geliştirdiğimiz bir tekniğini tanımlamak. Sinaptik iletişim kullanır bağlantı istasyonu, astar ve nörotransmitter içeren füzyon teşvik hareket anahtar presynaptic proteinler veziküller ile plazma zarı. Presynaptic proteinler bu nedenle bu önemli olaylar ile ilişkili hareket değişiklikleri sergi ve a sıra-in protein-protein ve protein-lipid etkileşimleri sıkıca bu işlemleri düzenler. Nasıl bu proteinler hareketliliğini sağlam bir canlı hayvan fizyolojik işlevleri ile ilişkili olan soruşturma kesin onların etki mekanizmaları anlamak için gerekli. Protein hareketlilik ile yüksek çözünürlüklü vivo içinde açılan optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi sınırlamalar üstesinden gerektirir. Biz nasıl photoconvertible floresan proteinler ile hafif eğik aydınlatma görüntülenir ve motor sinir terminalinde veya üçüncü motor nöron akson boyunca izlenen sözdiziminin-1A presynaptic protein öğesini Drosophila biçim tarif larva.
Introduction
Nöronal iletişim nörotransmitter içeren sinaptik veziküller plazma zarı1ile düzenlenmiş füzyon yoluyla oluşur nörotransmitter yayın kullanır. Ekzositozu2,3,4,5,6 adı verilen bu işlem son derece dinamik ve yukarı - veya aşağı-düzenlenmiş göre stimülasyon7oranı dalgalanmalar olabilir. Bu süreçlerle ilgili proteinler Albert hareket tabi vardır ve bu nedenle Ortaölçek organizasyon bu fizyolojik fonksiyonları temelini oluşturan eylemleri bağlama bir dizi sürdürülmesi yetenekli görüntüleyin. Plazma membran proteinlerinin plazma zarı7,8,9,10,11nanoclusters içine moleküllerin yanal yakalama sağlayan son derece dinamik, 12. Bu nedenle, bu proteinler hareketliliğini soruşturma eylem8onların modu aydınlatmak için yardımcı olur. Sinaptik proteinler çözünür N-ethylmaleimide hassas faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına), örneğin sözdiziminin-1A, gibi şimdi yanı sıra yanal hızlı hareketlilik sergi lateral görüntü bindirme olarak moleküler sunabilir nanoclusters içinde olduğu bilinmektedir depoları ve siteleri vezikül füzyon9,13,14,15.
Monomeric (m) Eos16,17 ve Kaede18, gibi photoconvertible floresan proteinlerin son gelişmeler böyle nöronal plazma membran proteinlerinin yaklaşımlar kullanarak Ortaölçek çözünürlüğe sağladı Fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)14,15,19. Bu gelişmeler hareketlilik ve nanoclustering kültürlü canlı hücreleri ve nöronlar biyolojik proteinlerin soruşturmalar etkinleştirdiniz. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar (benzer yüksek çözünürlüklerde) dinamiği ve canlı olduğu gibi organizmalar nöronlar içinde bu membran proteinlerinin organizasyonu böyle Mus musculus, Caenorhabditis elegans ve aydınlatmak için gerçekleştirilen Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Araştırma dynamics ve protein vivo içinde organizasyonu sadece (örneğin fluorophores) PALM, fırtına ve photoconvertible, son zamanlarda geliştirilen süper çözünürlük görüntüleme araçlarının kullanımı bu tür engelleri aşmak için de alması gereken Erişilebilirlik protein ve düşsel lazer penetrasyon derinliği. Sağlam bir hayvan hücre içi proteinlerin Imaging proteinler sağlam hayvan, sağlam bir farenin Hipokampus gibi dokuların yaşam içinde derin gömülü yapıları üzerinde görüntüleme doğal olarak meydan okuyor. Bu nedenle, proteinler veya doku yüzeyine yakın daha kolay görüntüsü. Vivo Imaging ile başka bir zorluk hayvanlar arasında tekrarlanabilirlik sağlamada olduğunu. Anatomi bir örnekten diğerine farklı olabilir gibi farklı olduğu gibi hayvan örnekleri çoğaltması kolaylığı ile bir yapı seçerek de zorlu kanıtlamak. Basmakalıp yapıların kullanımını gibi synapses, bazı bu zorlukların üstesinden ile yardımcı.
Diğer araştırmalar yüzeyi protein organizasyonu bir doku/organ, örneğin yansıma iken son yıllarda yapılan çalışmalarda protein hareketlilik Caenorhabditis elegans22gibi optik şeffaf bir epidermis ile hayvanlarda görüntüsü bir canlı fare21kafatası ile kortikal nöronlar aktin görüntüleme. Bazı durumlarda, anestezikler hayvan hareketsiz tutmak için kullanılmıştır; Ancak, belirli anestezikler faiz protein olumsuz etkileyebilir. Hayvanlar vivo içinde görüntüleme sırasında hareketsiz tutmak için alternatif yolları bu nedenle hata en aza indirmek için keşfedilmeyi.
Süper çözünürlük görüntüleme vivo içinde için başka bir uyarı faiz proteinlerin aydınlatmak için kullanılan lazerler çevreleyen doku olumsuz etkileyebilecek ve bu nedenle uyarma yoğunluk mümkün olduğunca düşük tutmak tavsiye edilir. Aydınlatma lazer tarafından çevreleyen doku aynı zamanda arka plan sinyal artırmak eğilimindedir. Düşük uyarma yoğunluğu kullanımı arka plan azaltmak yardımcı olur, olmak uyarı da floresan protein foton verim azalmasına neden olabilir. Alternatif arka plan sinyal görüntü analizi önce azaltmak aracı olarak arka plan çıkarma analizi sırasında kullanılabilir.
Drosophila belirli protein fonksiyon incelenmesi için köklü genetik araçları sağladığından vivo içinde görüntüleme için ideal bir organizma sunar. Ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS)-Gal4 sistemi proteinlerin zamansal ve mekansal ifade sağlar ve bu nedenle neurotransmission23, işlemek için kullanılabilir öyle ki termo-genetik stimülasyon Drosophila geçici kullanma reseptör olası alt aile A1 (dTRPA1)24 veya opto-genetik uyarı far kırmızı kaymıştır CsChrimson25 kullanarak14Imaging ile birleştirilebilir. Vivo içinde tek molekül görüntüleme programında küçük bir sistem performans komplikasyonlar çoğunun üstesinden var ve şimdi nasıl tek-parçacık izleme Drosophila melanogaster üçüncü INSTAR larva içinde yürütülen olabilir açıklar.
Protocol
1. tasarım transgenik Drosophila mEos2 öğesini proteinler ifade
- MEos2 protein ile etiketlenmesi için protein seçin. Proteinler bir transmembran etki alanı ile görüntüleme başarı oranını artırmak için proteinler sinaptik veziküller veya autophagosomes26,27 (Örneğin, nöronal plazma zarı14 ' te (örneğin, sözdiziminin-1A), seçin Synaptobrevin-2), ya da yakın etkileşim nöronal plazma membran proteinlerinin (örneğin, Munc18-1) ile sitozolik protein.
- Transgenes (şekil 1) mEos2 öğesini protein kodlama oluşturmak. Protein ve mEos2 için ileriye ve geriye doğru astar tasarım.
Not: MEos2 kodlama dizisi üzerinden faiz protein C-terminus sigorta için tasarlanmış pmEos2-N1 plazmid çoğaltılabilir. Klonlama örneğin yapılabilir pFL44S kullanarak Saccharomyces cerevisiae vivo içinde rekombinasyon tarafından-attB-MCS-w + vektör14,28, klonlama başka yöntemler Gibson gibi alternatif olarak kullanılabilir derleme protokolü29.- Vektör BamHI ve XbaI ile linearize ve ura3 - Maya hücreleri mEos2 ve faiz protein kodlama PCR parçaları ile birlikte ortak dönüştürmek. Drosophila embriyo bir transgenik sinek çizgi30oluşturmak için sahip yapı enjekte.
- Transgenik sinek kültürler standart Maya ve Şeker Pekmezi orta veya bazı diğer uygun yerine Plastik şişeleri bulunan arka. Sağlıklı ve oldukça büyük sinaptik boutons31emin olmak için şişeleri doluluk sinekli önlemek ve sinekler için yeni tüpleri yumurta atma her gün sonra çevir; Bu üçüncü INSTAR larva iyi beslenir ve medyada dolaşan başlamak zaman uygun büyüklük ulaşmak sağlar. Oda sıcaklığında (25 ° C) transgenik sinek yükseltmek.
Not: Daha büyük sinaptik boutons proteinler görüntüleme sırasında görselleştirildiği daha büyük miktar verim eğilimindedir.
2. üçüncü INSTAR Larva diseksiyon
- Silindirik veya semicylindrical şekilli polydimethylsiloxane (PDMS) temel ≤20 mm çap ve ≤20 mm yüksekliğinde bir uygun silikon elastomer Kiti (şekil 2A) kullanarak olun. Ajan 10:1 oranında artırma bir silikon silikon elastomer karıştırın.
- İyice için 5 dk. dimsensions ile bir kalıp içine karışımı yukarıda listelenen Pour karışımı ilave edin. Bir fırında 45 dk için 100 ° C'de sertleşmesine izin. PDMS Bankası hangi diseksiyon taşımak temel olarak hizmet verecek. PDMS Bankası kültür cam popolu çanak kuyuya uyuyor emin olun.
- Bir göçebe üçüncü INSTAR larva şişe duvardan seçin. Optik bir stereo mikroskop 4,5 büyütme oranında PDMS silindir tabanı dorsal yüzü yukarı yerleştirilen larva görselleştirmek için kullanın.
- Kavisli ve açılı ön vızıltısı, genişletme ikisi arasında ağız kanca kafasına ve iki arka vızıltısı arasında anüs üzerinde kuyruk minutien iğne sopa için cımbız kullanın. Schneider'ın böcek Orta 40 µL üzerine immobilize larva oda sıcaklığında ekleyin.
Not: Hemolyph benzeri çözümler (HL3 veya HL6) de Schneider'ın çözüm32,33yerine kullanılabilir. - Duvar orta hat deşmek için minutien iğne kullanımı tarafından larva karın vücut duvarına sırt tarafında üzerinden erişimi sağlar.
- Vücut duvar kesmek için kullanım bahar makas kesiği noktadan açın. Ön-arka yönü34orta çizgi boyunca kesin.
- İyi forseps kullanın ve bahar larva deşeceğin makas: tükürük bezleri, trakea ve gut gibi iç organların kaldırın. Larva Schneider'ın böcek orta ile iki kez yıkayın.
- İyi Forseps ile iki vücut duvar flep tutun, yavaşça onları dışarı uzatmak ve her iki tarafta iki minutien iğne sopa. Bu bir Altıgen şeklinde hazırlık (şekil 2A) üretmek gerekir.
- Beyin görüntüleme sırasında kas hareketi olasılığını azaltmak için Bahar makas kullanarak ventral sinir kablosu bağlantısını kesin; Bu da hazırlık karşı düz görüntüleme çanak tutmak için hizmet vermektedir. Tüm altı minutien mandal PDMS temel içine itmek için eğri cımbız kullanın.
Not: Pimleri yalnızca küçük bir bölümünü karın duvarı içinde gömülü olması. - Larva diseksiyon yordamı yaşamıştır onaylamak, biraz it ventral sinir kablosu için bu larva karın duvarı Peristaltik bir daralma temin.
3. hafifçe eğik aydınlatma tek-parçacık izleme mikroskobu
- Bir cam popolu kültür yemek üzerine disseke larva-PDMS Bankası tersine çevirin. Görüntüleme yemek oda sıcaklığında Schneider'ın böcek orta (şekil 2B) 2 mL ile doldurulması.
- Motor nöronlar sinapslarda karın kasları 6 ve 735 63 x kullanarak üzerinde olan ikinci ve üçüncü kesimi bulun / 1.2 NA su-daldırma amaçta floresan toplam iç yansıma (TIRF) floresan mikroskop.
- Mikroskop göz mercekleri disseke larva bulmak için kullanın; kas 6 parlak alan aydınlatma kullanımı ile tanımlayın.
- Mikroskop edinme yazılım kullanın (bkz. Tablo reçetesi) TIRF yapılandırma; Kolimatör kamera açısını penetrasyon arttırmak, aksi takdirde eğik aydınlatma elde etmek için TIRF kritik açı dışarı taşımak için 1 ° için kaydırın.
- 488 nm lazer mEos2 yeşil görselleştirmek için geçiş yapma. Düşük lazer gücü kullanmak (22,8 az % 5 mW) yeşil Floresans ağartma önlemek için. (Bu boncuklar gibi bir ipe bak) nöromüsküler kavşak bulun ve düşük çözünürlüklü TIRF görüntü elde etmek.
- Aynı anda 405 nm lazer üzerinde geçiş (photoconverts mEos2 gelen yeşil kırmızı türler için) ve stochastically tek mEos2 floresan proteinler yerelleştirmek için 561 nm lazer (İmaj photoconverted kırmızı mEos2).
Not: Düşük 405 nm lazer güç kullanılması tavsiye edilir (4,78 %0,9 0.005 mW) gibi bu film satın alma sırasında bir nispeten sabit photoconversion oranı için sağlar. 50 ve 561 nm lazer % 75'i arasındaki kullanım (20,1 mW), bu olumsuz nöromüsküler kavşak çevreleyen kas dokusu morfolojisi etkilemeden Floresans kırmızı mEos2 türlerden elde etmek yeterli olduğu gibi. - Her nöromüsküler kavşak zinciri için serisi 15.000 çerçeveler ya da daha fazla 33 Hz., as.czi biçimi eşlik eden meta veri olası başvuru için korumak için oluşan bir zaman alacak.
- ImageJ '.czi' film dosyaları '.tiff' dosyalarını dönüştürmek için kullanın.
- Uygun tek molekül FIJI/ImageJ37 ' TrackMate gibi analitik yazılım11,14,36 izleme ile alınan Filmler analiz ( Tablo malzemelerigörmek). 'X' ve 'y' bulur her yerelleştirme tarafından Gauss uygun yoğunluk noktasının koordinatlarını yayıldı fonksiyonu (PSF).
Not: sorun giderme: yeşil floresan değil görülmektedir veya çok karanlık 488 nm lazer maruz üzerine nöromusküler kavşakta, kısaca photoconverting ve lazerler Imaging geçiş (405 nm ve 561 nm), bu kırmızı daha fazla üretmek için yardımcı olarak mEos2 tür. 488 nm lazer geri geçiş yapmak ve TIRF resim al.
4. tek molekül yerelleştirme sabit larva içinde
- Protein nanocluster boyutu PALM ile ölçmek için sonra diseksiyon bir sabitleştirici - fosfat tamponlu tuz (PBS) seyreltilmiş %4 paraformaldehyde ile Schneider'ın böcek orta yerine.
- Larva, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Diseksiyon pimleri ve sabit larva 1.7 mL içinde yer Kaldır ek kilit microcentrifuge tüp temizleyin.
- İncelemek ve birçok diğer larvalar gerektiği gibi o zaman onları üç kez PBS ile yıkamak gibi düzeltin.
- PBS blok arabellek (PBS, %0.1 Triton X-100 ve % 3 normal keçi serum bir çözüm) ile değiştirin.
- Larvalar PBS ile üç kez yıkayın, sonra gerekli birincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.
- Gecede 4 EyC. kuluçkaya
- Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, sonra gerekli ikincil antikor (blok arabellek çözümde seyreltilmiş) ile kuluçkaya.
- Larvalar üç kez PBS ile yıkayın, larva geri PDMS Bankası ve daha önce açıklanan tek molekül izleme için görüntü üzerine ekleyin.
Representative Results
Yukarıda listelenen, sözdiziminin-1A-mEos2 transgenik Drosophilamelanogaster vardı protokolü kullanılarak oluşturulan (şekil 1). Transgenik üçüncü Drosophila biçim larva PDMS silindirik Bankası (şekil 2A-F) disseke. Sözdiziminin-1a tek molekülleri görselleştirmek için PALM üzerinde hafifçe eğik lazer aydınlatma14TIRF mikroskopla kullandık.
Sözdiziminin-1a tek molekülleri kas 6 ikinci karın parçasının presynaptic motor sinir terminalde üzerinde takip. MEos2 yeşil Floresans sözdiziminin-1A-mEos2 düşük çözünürlüklü görüntü 488 nm lazer (şekil 3A) kullanarak heyecanlı zaman tip 1b boutons üzerinde görüldüğü gibi tespit edilemedi. Görüntüleme deneylerde, 405 nm ve 561 nm uyarma lazer görüntüleme derinliklerinde idi 133.5 nm ve 165.6 nm, anılan sıraya göre. Yeşil resim 16 tek tek kare ortalama satın alınmıştır. Bu yeşil görüntü bölge presynaptic motor sinir terminallere yalnız photoconverted filmi yerelleştirmeler analizini sınırlamak için kullanılan ilgi oluşturmak için kullanılan.
Çözümleme alınan photoconverted sptPALM film süper çözümlenmiş bir yoğunluk, difüzyon katsayısı, oluşturulan ve yörünge (şekil 3A) eşler. Sözdiziminin-1A-mEos2 hareketlilik daha fazla bireysel yörüngeler (şekil 3B) ortalama kare deplasman (MSD) analizi ile sayısal. İstatistiksel karşılaştırmalar yapılabilir (şekil 3B) MSD eğri altındaki alan kullanarak. Hareketlilik daha fazla çözümleme sözdiziminin-1A-mEos2 Difüzyon katsayısı dağılımı verir ve bu istatistiksel olarak hareketsiz nüfus (şekil 3 c) mobil karşılaştırma tarafından değerlendirilir.
Resim 1 : MEos2 öğesini yapıları oluşturuluyor. PFL44S-attB-MCS-w + vektör doğrusallaştırılmış BamHI ve XbaI ile. Faiz (POI) protein kodlama örtüşen Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) parçaları ve mEos2, sırasıyla, örneğin, in vivo rekombinasyon ura3 - Maya hücrelerinde veya Gibson derleme klonlanmış. Sözdiziminin-1A-mEos2 transgene üretmek için biz endojen sözdiziminin-1A organizatörü ve Sonlandırıcı dizileri tarafından çevrili yapı klonlanmış olduğunu unutmayın. Elde edilen yapı daha sonra mEos2 için erimiş protein (POI) ilgi ifade transgenik bir sinek satır oluşturmak için Drosophila embriyo içine enjekte edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Drosophila larva diseksiyon ve eğik aydınlatma. Yarım silindirik PDMS üste yürütülen Drosophila larva diseksiyon gösteren(a)şema. Filetoların larva üzerine düzenlenen PDMS minutien iğne kullanımı ile jel. (B-C) Larva PDMS hazırlık Schneider'ın böcek orta içeren bir kültür cam popolu çanak yerleştirilmiştir. TIRF mikroskop hafifçe eğik aydınlatma yapılandırmasında sözdiziminin-1A-mEos2 motor sinir terminallerine görselleştirmek için kullanıldı. (D-F) Yarım silindirik PDMS Bankası disseke Drosophila larva ile. Larva PDMS hazırlık Schneider'ın orta ile dolu bir görüntüleme tabağına yerleştirildi ve larva süper çözünürlük PALM mikroskobunun görüntüsü. Ölçek çubuğu, 10 mm. (bu rakam14değiştirildi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Vivo sözdiziminin-1A-mEos2 presynaptic motor sinir terminal, bir izleme. (A) A düşük çözünürlüklü TIRF görüntü sözdiziminin-1A-mEos2 üzerinde bir tip 1b motor sinir terminal. Photoconversion film analizi 33 oluşturulan Hz sptPALM süper çözümlenmiş yoğunluğu, difüzyon katsayısı ve yörünge haritalar görüntüsü. 5,309 bireysel yörüngeleri görüntülü üzerinde 16.000 kare film satın alma olduğunu. Ölçek çubuğu, 3 mikron. (B-C) Ortalama kare deplasman (MSD) sözdiziminin-1A-mEos2 6 farklı motor sinir terminallerine çizildi; (AUC) MSD eğri altındaki alan hareketlilik düzeyini ölçmek için kullanıldı. Difüzyon katsayısı dağıtım birbirlerinin oranları sayısal telefon ve hareketsiz sözdiziminin-1A nüfus ortaya koymaktadır; ~ 2400 yörüngeleri ortalama motor sinir terminal elde (n = 3 larva). Ortalama ortalama standart hatası sunulan veri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı tek molekül izleme Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromusküler kavşakta mEos2 öğesini proteinlerin açıklar. Transgenik proteinin aşırı ifade önlemek için sözdiziminin-1A-mEos2 ifade endojen sözdiziminin-1A düzenleyici tarafından tahrik edildi. Sinaptik protein hareketlilik çalışmalar çoğunlukla kültürlü hücrelerin ve kortikal nöronlar9,11,12,13 vitro araştırmalar için sınırlı olmuştur. Bu proteinler canlı hayvan benzer hareketlilik imzalarında sergi büyük ölçüde bilinmiyor. Tek-protein hareketlilik içinde vivogörselleştirmek için aşılması gereken optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi kısıtlamalar bulunmaktadır. Larva hazırlık anatomi ve kas yüzeyinde gömülü nöromüsküler kavşak görüntülenmesi, optik şeffaflık ve erişilebilirlik sorunu kaçının. Görüntü tek molekül hareketlilik normal TIRF yapılandırma girişimleri başarısız oldu. Ancak, hafifçe eğik aydınlatma için artan uyarma lazer derinlemesine nüfuz sağlar. Ayrıca, larva hareketsiz için kullanılan minutien iğne anestezik kullanım mümkün herhangi bir olumsuz etkisi protein hareketliliği üzerine önlemek için yardımcı oldu. Tek molekül içinde vivogörselleştirmek için 100 x yağı daldırma hedefleri, gibi daha yüksek büyütme hedefleri kullanmak mümkündür. Ancak, artan büyütme sürüklenir yak²n oluşumu artabilir. Buna ek olarak, biz-si olmak kullanılmış daha düşük yoğunluklu (~ %30) 561 nm lazer motor sinir terminallerinde görüntü tek moleküller için başarılı bir şekilde. Ek sınama daha düşük lazer güç kullanmak için gerekli.
Bu iletişim kuralı nöronal plazma zarı yakınlık içinde sinaptik proteinler hareketliliğini görselleştirmek uygundur. Bu yaklaşımı kullanarak, SNARE proteini - sözdiziminin-1A ve protein Atg18a bağlı autophagosome - hareketliliğini başarıyla görüntülü içinde vivo14,26olmuştur. Motor nöron aksonlar da olabilir proteinler hareketliliğini27araştırıldı. Ancak, soruşturma beyin veya ventral sinir kordonu proteinlerin hareketlilik nedeniyle temel doku tarafından üretilen yüksek arka plan sinyal değerlendirmek zor olabilir; Buna ek olarak, protein hareketlilik aynı beyin yapısı üzerinde görüntülenmesi fluorescently etiketleme (Yinelenebilirlik) sağlamak için beyin yapısı gerektirir ve çift-kamera görüntüleme kullanımını gerekli olacaktır.
Yerine daha üçüncü INSTAR larva38,39geliştirilen Drosophila süper çözünürlük mikroskopi için kullanılabilen geçerli yöntemleri çoğunlukla görüntüleme embriyolar için sınırlıdır. Bu protokoller ile ana konu onlar yörüngeleri görüntüsü alan az sayıda verim ve dolayısıyla hareketlilik Birleşik22,40derinlemesine analiz önlemek olduğunu. İletişim kuralı izleme bizim vivo içinde tek molekül yörüngeleri yüksek bir sayı üretmek için kapasitesine sahiptir ve bu nedenle Caenorhabiditis elegans ve Zebra balığı gibi diğer hayvan modellerinde kullanılabilir. Gerçekten de, her NMJ zinciri farklı mobil durumları ve geçişleri bu Birleşik14,27arasında analiz etmek için uygun hale ~ 2400 yörüngeleri oluşturulur. Ayrıca, birçok vivo içinde tek molekül görüntüleme stratejileri olan altında görüntüleme yapılır fizyolojik işlevi değiştirmek hayvan20,22, hareketsiz anestezi kullanımını güveniyor. Burada minutien iğne kullanarak larvaları hareketsiz bir 'anestezi-ücretsiz' protokolü optimize.
Bu iletişim kuralı bir potansiyel kullanımı proteinler üç boyutlu hareketliliğini görüntülenmesi için olabilir. Süper çözünürlük mikroskobu son gelişmeler izin görüntülenmeyecektir vitro 'x', içinde olmak protein hareketlilik 'y' ve 'z' boyutları41,42. Geçerli yöntem için hareket eden 'z' ekseninde proteinlerin hesaba katmaz. Henüz Drosophila motor sinir terminal küresel bir yapıdır ve protein hareketlilik bir üç boyutlu ses43ölçmek için değerli bir gelecek yaklaşım olacaktır. Z-boyut görüntüleme astigmatik bir lens ile mümkün olabilir. Alternatif olarak, TIRF modu44,45' z-çözünürlük da arttırılır. Ancak, bizim deneyler, syntaxin1A-mEos2 astigmatik lens olmadan tek molekülleri görselleştirmek için hafifçe eğik aydınlatma kullandık.
Sonuç olarak, proteinler ifade hem de bir transgenik Drosophila sinek stok kullanılabilirliğini değiştirme imkanı ile donatılmış TIRF mikroskop yanı sıra transgenik larva incelemek için bir photoconvertible protein, bir PDMS temel ile etiketlendi aydınlatma açısını tek proteinler bu protokol için açıklandığı gibi görselleştirmek için gerekli en önemli araç vardır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Jean-Baptiste Sibarita ve Daniel Choquet (IINS, CNRS/Bordeaux Üniversitesi) tek molekül analizi ile tür destek için teşekkür ederiz. Nick Valmas özellikle teşekkür ediyoruz ve Jessica Mcgaw (QBI, Queensland Üniversitesi) video ile onların yardım için kayıt, ses hem de grafik tasarım rakam. Bu eser Avustralya Araştırma Konseyi (AR) keşif project tarafından desteklenmiştir (F.A.M. DP170100125), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE0882864, F.A.M.) gelecek arkadaş grubu (B.V.S. FT100100725), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE130100078 F.A.M için.) ve NHMRC Projesi (B.V.S. APP1103923) verin. F.A.M. NHMRC üst düzey araştırma görevlisi (ONT1060075) olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |
References
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
