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Neuroscience

Vivo में एकल अणु Drosophila Presynaptic मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर ट्रैकिंग

Published: January 14, 2018 doi: 10.3791/56952

Summary

यहाँ हम कैसे एक अणु तस्वीर सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी एक जीवित Drosophila melanogaster तीसरे instar लार्वा के मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर किया जा सकता है वर्णन.

Abstract

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक की बढ़ती संख्या तंत्र है कि नेनो सेलुलर दुनिया को नियंत्रित करने के लिए उजागर करने के लिए मदद कर रहे हैं । एकल अणु इमेजिंग गति प्राप्त करने के रूप में यह जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत अणुओं के दृश्य के लिए असाधारण उपयोग प्रदान करता है । यहाँ, हम Drosophila लार्वा में एकल-कण ट्रैकिंग फ़ोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (sptPALM) निष्पादित करने के लिए विकसित एक तकनीक का वर्णन करते हैं । Synaptic संचार कुंजी presynaptic प्रोटीन है कि डॉकिंग, भड़काना, और प्लाज्मा झिल्ली के साथ न्यूरोट्रांसमीटर युक्त बुलबुले के विलय को बढ़ावा देने के द्वारा कार्य पर निर्भर करता है । प्रोटीन की एक सीमा प्रोटीन और प्रोटीन लिपिड बातचीत कसकर इन प्रक्रियाओं और presynaptic प्रोटीन इसलिए इन प्रमुख घटनाओं में से प्रत्येक के साथ जुड़े गतिशीलता में परिवर्तन प्रदर्शित नियंत्रित करता है । इन प्रोटीन की गतिशीलता की जांच कैसे एक बरकरार रहते जानवर में उनके शारीरिक समारोह के साथ संबंधित है उनके कार्रवाई की सटीक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है । vivo में उच्च संकल्प के साथ प्रोटीन गतिशीलता निकालने जैसे ऑप्टिकल पारदर्शिता, पहुंच, और पैठ गहराई के रूप में सीमाओं पर काबू पाने की आवश्यकता है । हम वर्णन कैसे photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन presynaptic प्रोटीन Syntaxin के लिए टैग-1a थोड़ा टेढ़ा रोशनी के माध्यम से कल्पना की जा सकती है और मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर नज़र रखी है या मोटर के साथ ंयूरॉन तीसरे instar के axon Drosophila माथ.

Introduction

ंयूरॉन संचार न्यूरोट्रांसमीटर जारी है, जो न्यूरोट्रांसमीटर के विनियमित संलयन के माध्यम से होता है पर निर्भर करता है-प्लाज्मा झिल्ली के साथ synaptic बुलबुले1युक्त. यह प्रक्रिया2exocytosis बुलाया,3,4,5,6 अत्यधिक गतिशील है और अप कर सकते है या नीचे-उत्तेजना7की दर में उतार चढ़ाव के अनुसार विनियमित । इन प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन Brownian गति के अधीन हैं, और इसलिए nanoscopic संगठन प्रदर्शन बाध्यकारी कार्यों की एक श्रृंखला है कि इन शारीरिक कार्यों underpin बनाए रखने में सक्षम है । प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन अत्यधिक गतिशील, प्लाज्मा झिल्ली पर nanoclusters में अणुओं के पार्श्व फँसाने की अनुमति है7,8,9,10,11, 12. जैसे, इन प्रोटीन की गतिशीलता की जांच की कार्रवाई के अपने मोड स्पष्ट करने में मदद करता है8। Synaptic प्रोटीन जैसे घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन रिसेप्टर्स (जाल), उदाहरण के लिए Syntaxin-1a, अब पार्श्व तेजी से गतिशीलता प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है, साथ ही साथ nanoclusters के भीतर फंसाना पार्श्व फँसाना है कि आणविक के रूप में सेवा कर सकते हैं डिपो और पुटिका फ्यूजन9,13,14,15के लिए साइटें ।

इस तरह के monomeric (एम) Eos16,17 और Kaede18के रूप में photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन, के हाल के विकास के दृष्टिकोण के उपयोग के माध्यम से ंयूरॉन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के nanoscopic संकल्प की अनुमति दी है ऐसे फोटो के रूप में सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)14,15,19. इन घटनाओं की गतिशीलता और nanoclustering में जैविक प्रोटीन के प्रसंस्कृत रहते कोशिकाओं और ंयूरॉंस में जांच सक्षम है । हाल ही में, अध्ययन किया गया है स्पष्ट करने के लिए (इसी तरह उच्च प्रस्तावों पर) की गतिशीलता और संगठन इन झिल्ली प्रोटीन के न्यूरॉन्स में रहते बरकरार जीवों के ऐसे मस musculus, Caenorhabditis एलिगेंस, और Drosophila melanogaster14,20,21,22.

vivo में एक प्रोटीन की गतिशीलता और संगठन की जांच (जैसे पाम, स्टॉर्म, और photoconvertible fluorophores) के रूप में हाल ही में विकसित सुपर संकल्प इमेजिंग उपकरणों के न केवल उपयोग की आवश्यकता है, लेकिन यह भी बाधा को दूर करने की क्षमता ऐसे के रूप में प्रोटीन की पहुंच और इमेजिंग लेजर के प्रवेश गहराई । इमेजिंग एक बरकरार पशु में intracellular प्रोटीन स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण है संरचनाओं पर इमेजिंग प्रोटीन बरकरार पशुओं के जीवित ऊतकों के भीतर गहरी एंबेडेड है, ऐसे एक बरकरार माउस के हिप्पोकैंपस के रूप में । इसलिए, प्रोटीन पर या ऊतक की सतह के करीब अधिक आसानी से imaged हैं । vivo में इमेजिंग के साथ एक और कठिनाई जानवरों के पार reproducibility सुनिश्चित करने में है । के रूप में शरीर रचना विज्ञान एक नमूना से दूसरे के लिए अलग हो सकता है, अलग बरकरार पशु नमूनों में पुनरावृत्ति की आसानी के साथ एक संरचना का चयन भी चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है । ऐसे synapses के रूप में टकसाली संरचनाओं के उपयोग, इन कठिनाइयों में से कुछ पर काबू पाने के साथ मदद ।

हाल के अध्ययनों से इस तरह के Caenorhabditis एलिगेंसके रूप में एक ऑप्टिकली पारदर्शी एपिडर्मिस के साथ पशुओं में प्रोटीन गतिशीलता imaged है, जबकि अंय जांचों एक ऊतक की सतह पर छवि प्रोटीन संगठन/ actin एक जीवित माउस की खोपड़ी के माध्यम से cortical न्यूरॉन्स में इमेजिंग21. कुछ मामलों में, पशु निश्चेतक रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, विशिष्ट निश्चेतक प्रतिकूल ब्याज की प्रोटीन को प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक का अर्थ है vivo इमेजिंग में के दौरान पशुओं के मोबाइल रखने के लिए इसलिए त्रुटि को कम करने के लिए पता लगाया जाना चाहिए ।

vivo में सुपर संकल्प इमेजिंग करने के लिए एक और चेतावनी है कि लेजर के लिए ब्याज की प्रोटीन को उजागर इस्तेमाल प्रतिकूल आसपास के ऊतकों को प्रभावित कर सकता है, और इसलिए कम के रूप में संभव के रूप में उत्तेजना तीव्रता रखने की सिफारिश की है । लेजर द्वारा आसपास के ऊतकों की रोशनी भी पृष्ठभूमि संकेत को बढ़ाने के लिए जाता है । कम उत्तेजना तीव्रता के उपयोग में मदद करता है पृष्ठभूमि को कम करने, चेतावनी जा रहा है यह भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन फोटॉन उपज में कमी के लिए नेतृत्व कर सकता है । विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि घटाव छवि विश्लेषण करने से पहले पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए एक वैकल्पिक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Drosophila vivo इमेजिंग में के लिए एक आदर्श जीव प्रस्तुत के रूप में यह विशिष्ट प्रोटीन समारोह की जांच के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक उपकरण प्रदान करता है । ऊपर अनुक्रम सक्रिय (यूएएस)-Gal4 प्रणाली प्रोटीन के लौकिक और स्थानिक अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है और इसलिए neurotransmission में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है23, इस तरह के कि थर्मामीटरों आनुवंशिक उत्तेजना Drosophila क्षणिक का उपयोग कर रिसेप्टर संभावित उप परिवार A1 (dTRPA1)24 या ऑप्टो-आनुवंशिक दूर लाल स्थानांतरित CsChrimson25 इमेजिंग14के साथ जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर उत्तेजना । हम इस प्रणाली में vivo एकल-अणु इमेजिंग में प्रदर्शन की जटिलताओं के कई दूर है और अब का वर्णन कैसे एकल कण ट्रैकिंग Drosophila melanogaster तीसरे instar लार्वा में किया जा सकता है ।

Protocol

1. ट्रांसजेनिक Drosophila mEos2 व्यक्त की डिजाइन-प्रोटीन टैग की गईं

  1. प्रोटीन mEos2 के साथ टैग किया जा करने के लिए का चयन करें । इमेजिंग सफलता दर में वृद्धि करने के लिए, का चयन करें प्रोटीन के साथ एक transmembrane डोमेन में न्यूरॉन प्लाज्मा झिल्ली14 (जैसे, Syntaxin-1a), प्रोटीन पर synaptic बुलबुले या autophagosomes26,27 (उदा, Synaptobrevin-2), या cytosolic प्रोटीन के साथ निकट संपर्क के साथ न्यूरॉन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन (उदा, Munc18-1).
  2. निर्माण transgenes mEos2-टैग की गईं प्रोटीन (चित्रा 1) एंकोडिंग । प्रोटीन और mEos2 के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों डिजाइन ।
    नोट: mEos2 कोडिंग अनुक्रम pmEos2-N1 प्लाज्मिड से परिलक्षित किया जा सकता है, जो सी के लिए फ्यूज करने के लिए बनाया गया है-ब्याज की प्रोटीन की टर्मिनस । क्लोनिंग उदाहरण के लिए vivo संयोजन में Saccharomyces cerevisiae में द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है pFL44S-attB-MCS-w + वेक्टर14,28, वैकल्पिक रूप से अंय क्लोनिंग विधियों का उपयोग कर ऐसे गिब्सन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है असेंबली प्रोटोकॉल29
    1. Linearize BamHI और XbaI और सह के साथ वेक्टर में बदलना ura3- खमीर कोशिकाओं को एक साथ पीसीआर टुकड़े एंकोडिंग mEos2 और ब्याज के प्रोटीन के साथ । निर्माण के साथ Drosophila भ्रूण इंजेक्षन एक ट्रांसजेनिक मक्खी लाइन30उत्पन्न करने के लिए.
  3. रियर ट्रांसजेनिक मानक खमीर और गुड़ मध्यम या प्लास्टिक शीशियों में निहित कुछ अंय उपयुक्त विकल्प पर फ्लाई संस्कृतियों । स्वस्थ और काफी बड़े synaptic बूटोंस31सुनिश्चित करने के लिए, शीशियों में भीड़ मक्खियों से बचने के लिए, और पलटें अंडे बिछाने के प्रत्येक दिन के बाद नई शीशियों के लिए मक्खियों; यह सुनिश्चित करता है तीसरे instar लार्वा अच्छी तरह से खिलाया और समय वे माध्यम पर भटक शुरू द्वारा उचित आकार तक पहुंचने । कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर ट्रांसजेनिक मक्खी उठाएं ।
    नोट: बड़ा synaptic बूटोंस इमेजिंग के दौरान visualized प्रोटीन की बड़ी मात्रा में उपज करते हैं ।

2. तीसरे Instar लार्वा का विच्छेदन

  1. एक बेलनाकार या semicylindrical आकार का polydimethylsiloxane (PDMS) बेस ≤ 20 मिमी व्यास में और ≤ 20 मिमी ऊंचाई में एक उपयुक्त सिलिकॉन elastomer किट (चित्रा 2a) का उपयोग कर । 10:1 के अनुपात में एक सिलिकॉन सख्त एजेंट के साथ सिलिकॉन elastomer मिश्रण ।
    1. मिश्रण के लिए अच्छी तरह से हिलाओ 5 min. dimsensions ऊपर सूचीबद्ध के साथ एक सांचे में ढालना में मिश्रण डालो । यह ४५ मिनट के लिए १०० ° c पर एक ओवन में सख्त करते हैं । PDMS आधार नींव है जिस पर विच्छेदन के लिए बाहर ले जाने के रूप में सेवा करेंगे । PDMS आधार सुनिश्चित करने के एक गिलास तली हुई संस्कृति पकवान के कुआं में फिट बैठता है ।
  2. शीशी दीवार से एक घूमते हुए तीसरे instar लार्वा का चयन करें । ४.५ आवर्धन पर एक ऑप्टिकल स्टीरियो माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें पृष्ठीय पक्ष के साथ PDMS बेलनाकार आधार पर रखा लार्वा कल्पना ।
  3. मुंह पर सिर पर minutien पिन छड़ी करने के लिए घुमावदार और angled चिमटी का उपयोग करें हुक, दोनों के बीच पूर्वकाल spiracles विस्तार, और पूंछ पर गुदा पर, दो पीछे spiracles के बीच. मैटीरियल लार्वा पर कमरे के तापमान पर Schneider के कीट मध्यम से ४० µ एल जोड़ें ।
    नोट: Hemolyph समाधान (HL3 या HL6) भी Schneider के समाधान के स्थान पर उपयोग किया जा सकता है३२,३३
  4. दीवार के midline में काटकर करने के लिए एक minutien पिन के उपयोग द्वारा लार्वा के उदर के शरीर की दीवार के पृष्ठीय पक्ष के माध्यम से पहुँच प्रदान करें ।
  5. उपयोग स्प्रिंग कैंची शरीर की दीवार को काटने के लिए चीरा बिंदु से खुला । पूर्वकाल में midline के साथ कट-पीछे दिशा३४
  6. लार्वा को disembowel करने के लिए फाइन संदंश और स्प्रिंग कैंची का प्रयोग करें: लार ग्रंथियों, श्वासनली और आंत सहित आंतरिक अंगों को हटा दें । Schneider के कीट मध्यम से दो बार लार्वा को धोएं ।
  7. ठीक संदंश के साथ, दो शरीर की दीवार फ्लैप पकड़, धीरे से उन्हें बाहर खिंचाव, और प्रत्येक पक्ष पर दो minutien पिन छड़ी. यह एक षट्कोण के आकार का तैयारी (चित्र 2a) का उत्पादन करना चाहिए ।
  8. इमेजिंग के दौरान मांसपेशी आंदोलन की संभावना को कम करने के लिए वसंत कैंची का उपयोग ventral तंत्रिका गर्भनाल से मस्तिष्क अलग; यह भी इमेजिंग डिश के खिलाफ तैयारी फ्लैट पकड़ करने के लिए कार्य करता है । PDMS बेस में सभी छह minutien पिन पुश करने के लिए घुमावदार चिमटी का प्रयोग करें ।
    नोट: केवल पिन का एक छोटा सा हिस्सा पेट की दीवार के भीतर एंबेडेड किया जाना चाहिए ।
  9. लार्वा विच्छेदन प्रक्रिया से बच गया है कि पुष्टि करने के लिए, थोड़ा ventral तंत्रिका कॉर्ड प्रहार, यह लार्वा पेट की दीवार के एक सिकुड़नेवाला संकुचन में लाना चाहिए ।

3. थोड़ा टेढ़ा रोशनी एकल कण पर नज़र रखने माइक्रोस्कोपी

  1. एक गिलास तली हुई संस्कृति पकवान पर PDMS आधार-विच्छेदित लार्वा को पलटना । इमेजिंग डिश को कमरे के तापमान के 2 मिलीलीटर के साथ भरें Schneider के कीट मध्यम (चित्रा 2 बी) ।
  2. एक फ्लोरोसेंट कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोप पर 63x/1.2 NA पानी-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर पेट की मांसपेशियों 6 और 7३५ पर synapses के साथ दूसरे और तीसरे क्षेत्रों में मोटर न्यूरॉन्स का पता लगाएँ ।
  3. विच्छेदित लार्वा का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप के eyepieces का प्रयोग करें; उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के उपयोग से मांसपेशी 6 की पहचान ।
  4. माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें), TIRF विंयास में; संधानक कैमरा कोण 1 ° स्लाइड करने के लिए प्रवेश गहराई बढ़ाने के लिए, अंयथा TIRF महत्वपूर्ण कोण से बाहर ले जाने के लिए टेढ़ा रोशनी हासिल ।
  5. हरे रंग में mEos2 कल्पना पर ४८८ एनएम लेजर स्विच करें । ब्लीचिंग ग्रीन प्रतिदीप्ति से बचने के लिए कम लेजर पावर (२२.८ मेगावाट से कम 5%) का प्रयोग करें । neuromuscular जंक्शनों का पता लगाएँ (जो एक स्ट्रिंग पर मोतियों की तरह दिखते हैं) और एक कम संकल्प TIRF छवि प्राप्त.
  6. इसके साथ ही ४०५ एनएम लेजर पर स्विच (हरे रंग से लाल प्रजातियों के लिए photoconverts mEos2) और ५६१ एनएम लेजर (छवि photoconverted लाल mEos2) stochastically स्थानीयकृत एकल mEos2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए ।
    नोट: कम ४०५ एनएम लेजर पावर का उपयोग (०.००५ ४.७८ मेगावाट के ०.९%) की सिफारिश की है के रूप में यह फिल्म अधिग्रहण के दौरान एक अपेक्षाकृत स्थिर photoconversion दर के लिए अनुमति देता है । ५६१ एनएम लेजर (२०.१ मेगावाट) के ५० और ७५% के बीच का उपयोग करें, के रूप में यह प्रतिकूल neuromuscular जंक्शन आसपास के मांसपेशी ऊतक की आकृति विज्ञान को प्रभावित किए बिना लाल mEos2 प्रजातियों से प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
  7. प्रत्येक neuromuscular जंक्शन श्रृंखला के लिए, १५,००० फ्रेम या ३३ हर्ट्ज पर अधिक से बना एक समय श्रृंखला प्राप्त. czi प्रारूप के रूप में बचाने के क्रम में संभव संदर्भ के लिए साथ मेटा डेटा के संरक्षण के लिए ।
  8. '. czi ' चलचित्र फ़ाइलों को '. tiff ' फ़ाइलों में कनवर्ट करने के लिए ImageJ का उपयोग करें ।
  9. उपयुक्त एकल अणु ट्रैकिंग विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत फिल्मों का विश्लेषण11,14,३६ जैसे फिजी पर TrackMate/ImageJ३७ ( सामग्री की तालिकादेखें) । तीव्रता बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) के गाऊसी फिट द्वारा प्रत्येक स्थानीयकरण के ' एक्स ' और ' y ' निर्देशांक रेखांकित ।
    नोट: समस्या निवारण: यदि ग्रीन प्रतिदीप्ति नहीं मनाया जाता है या ४८८ एनएम लेजर के लिए जोखिम पर neuromuscular जंक्शन पर बहुत मंद है, संक्षेप में photoconverting और इमेजिंग पराबैंगनीकिरण (४०५ एनएम और ५६१ एनएम) पर स्विच, के रूप में इस के लिए और अधिक उत्पादन में मदद करता है लाल mEos2 की प्रजातियों । फिर ४८८ एनएम लेजर करने के लिए वापस स्विच और एक TIRF छवि ले ।

4. फिक्स्ड लार्वा में एकल अणु स्थानीयकरण

  1. पाम के माध्यम से प्रोटीन nanocluster आकार को मापने के लिए, Schneider के कीट मध्यम को एक निर्धारण-4% paraformaldehyde फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में पतला के साथ विच्छेदन के बाद बदलें ।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए लार्वा की मशीन ।
  3. विच्छेदन पिन निकालें और एक १.७ मिलीलीटर स्पष्ट स्नैप-लॉक microcentrifuge ट्यूब में निश्चित लार्वा रखें ।
  4. टुकड़े और आवश्यकतानुसार कई अन्य लार्वा ठीक करें, फिर उन्हें तीन बार पंजाबियों से धोएं ।
  5. ब्लॉक बफर के साथ पंजाबियों की जगह (पंजाब के समाधान, ०.१% ट्राइटन एक्स-१००, और 3% सामान्य बकरी सीरम).
  6. तीन बार पंजाबियों के साथ लार्वा धो, तो आवश्यक प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉक बफर समाधान में पतला) के साथ गर्मी ।
  7. 4 सी पर रात भर मशीन ।
  8. तीन बार पंजाबियों के साथ लार्वा धो लें, फिर आवश्यक द्वितीयक एंटीबॉडी (ब्लॉक बफ़र समाधान में पतला) के साथ मशीन ।
  9. पंजाबियों के साथ लार्वा को तीन बार धोएं, लार्वा को PDMS आधार पर वापस लाएं, और पहले एकल-अणु ट्रैकिंग के लिए वर्णित छवि ।

Representative Results

ऊपर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, Syntaxin-1a-mEos2 ट्रांसजेनिक Drosophilamelanogaster (चित्रा 1) उत्पन्न किया गया. ट्रांसजेनिक तीसरे instar Drosophila लार्वा को PDMS बेलनाकार आधार (चित्रा 2a-F) पर विच्छेदित किया गया. Syntaxin के एक अणु-1a कल्पना, हम थोड़ा टेढ़ा लेजर रोशनी14के साथ एक TIRF माइक्रोस्कोप पर हथेली का इस्तेमाल किया ।

Syntaxin के एकल अणुओं-1a presynaptic मोटर तंत्रिका टर्मिनलों पर दूसरे उदर खंड के 6 मांसपेशी पर नज़र रखी गई । mEos2 की हरी प्रतिदीप्ति का पता लगाया जा सकता है के रूप में कम संकल्प छवि Syntaxin-1a-mEos2 प्रकार 1b बूटोंस पर जब ४८८ एनएम लेजर (चित्र 3ए) का उपयोग कर उत्साहित द्वारा दिखाया गया है । इमेजिंग प्रयोगों में क्रमशः ४०५ एनएम और ५६१ एनएम उत्तेजना लेजर इमेजिंग गहराई १३३.५ एनएम और १६५.६ एनएम थे । हरे रंग की छवि 16 व्यक्तिगत फ्रेम के एक औसत के रूप में अधिग्रहीत किया गया था । इस हरे रंग की छवि के लिए photoconverted फिल्म में स्थानीयकरण के विश्लेषण की सीमा presynaptic मोटर तंत्रिका टर्मिनलों के लिए इस्तेमाल किया ब्याज के क्षेत्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था अकेले ।

अधिग्रहीत photoconverted sptPALM फिल्मों के विश्लेषण से एक सुपर संकल्पित तीव्रता, प्रसार गुणांक, और पथ मानचित्र (चित्रा 3) उत्पन्न हुआ । Syntaxin-1a-mEos2 गतिशीलता और अर्थ वर्ग विस्थापन (एमएसडी) के व्यक्तिगत पथ (चित्र बी) के विश्लेषण से आगे मात्रा था । सांख्यिकीय तुलना एमएसडी वक्र (चित्र बी) के तहत क्षेत्र का उपयोग कर किया जा सकता है । इसके अलावा गतिशीलता के विश्लेषण Syntaxin-1a-mEos2 के प्रसार गुणांक वितरण पैदावार, और यह सांख्यिकीय मोबाइल आबादी के लिए की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्र 3सी) ।

Figure 1
चित्र 1 : mEos2-tagged construction जनरेट कर रहा है । pFL44S-attB-MCS-w + वेक्टर BamHI और XbaI के साथ रैखिक है । अतिव्यापी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ब्याज के प्रोटीन एंकोडिंग (POI) और mEos2, क्रमशः, क्लोन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, vivo में संयोजन से ura3- खमीर कोशिकाओं या गिब्सन विधानसभा द्वारा । ध्यान दें कि Syntaxin-1a-mEos2 transgene उत्पंन करने के लिए, हम अंतर्जात Syntaxin-1a प्रवर्तक और टर्मिनेटर दृश्यों द्वारा पार्श्व निर्माण क्लोन । परिणामस्वरूप निर्माण बाद में Drosophila भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है एक ट्रांसजेनिक मक्खी ब्याज के प्रोटीन (POI) व्यक्त mEos2 से जुड़े लाइन बनाने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Drosophila लार्वा विच्छेदन और परोक्ष रोशनी। () Drosophila लार्वा विच्छेदन दिखाने वाली स्कीमा को अर्ध-बेलनाकार PDMS आधार पर किया जाता है. एक पट्टिका लार्वा minutien पिन के उपयोग द्वारा PDMS जेल पर आयोजित किया गया था । (B-C) लार्वा-PDMS की तैयारी एक गिलास तली हुई संस्कृति Schneider के कीट के माध्यम से युक्त पकवान के अंदर रखा गया था । एक थोड़ा टेढ़ा रोशनी विंयास में एक TIRF माइक्रोस्कोप मोटर तंत्रिका टर्मिनलों में Syntaxin-1a-mEos2 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (D-F) विच्छेदित Drosophila लार्वा के साथ एक आधा बेलनाकार PDMS आधार । लार्वा-PDMS तैयारी Schneider के माध्यम से भरा एक इमेजिंग डिश में रखा गया था, और लार्वा सुपर संकल्प पाम माइक्रोस्कोप पर imaged था । स्केल बार, 10 मिमी. (यह आंकड़ा14से संशोधित किया गया है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : vivo में presynaptic मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर Syntaxin-1a-mEos2 की ट्रैकिंग। () एक प्रकार 1b मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर Syntaxin-1a-mEos2 की एक कम संकल्प TIRF छवि । photoconversion फिल्मों के विश्लेषण ३३ हर्ट्ज पर छवि बनाई sptPALM सुपर संकल्पित तीव्रता, प्रसार गुणांक, और पथ नक्शे । ५,३०९ व्यक्तिगत पथ १६,००० फ्रेम फिल्म अधिग्रहण पर छवि थे । स्केल बार, 3 माइक्रोन । (B-C) मतलब स्क्वायर विस्थापन (एमएसडी) Syntaxin-1a-mEos2 6 अलग मोटर तंत्रिका टर्मिनलों से साजिश रची थी; एमएसडी वक्र (ईमेज) के अंतर्गत क्षेत्र का उपयोग गतिशीलता के स्तर को बढ़ाता है । प्रसार गुणांक वितरण मोबाइल और मोबाइल Syntaxin-1a आबादी है कि एक दूसरे के अनुपात के रूप में मात्रा किया जा सकता है पता चलता है; एक औसत ~ २,४०० पथ मोटर तंत्रिका टर्मिनल (एन = 3 लार्वा) प्रति प्राप्त किया गया । माध्य के माध्य मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत डेटा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एकल-अणु mEos2 की ट्रैकिंग-टैग प्रोटीन के neuromuscular जंक्शन पर Drosophila तृतीय instar लार्वा । ट्रांसजेनिक प्रोटीन की अधिक से अधिक अभिव्यक्ति से बचने के लिए, Syntaxin-1a-mEos2 अभिव्यक्ति अंतर्जात Syntaxin-1a प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था । synaptic प्रोटीन गतिशीलता के अध्ययन ज्यादातर इन विट्रो में सीमित किया गया है प्रसंस्कृत कोशिकाओं और cortical न्यूरॉन्स के9,11,12,13. क्या इन प्रोटीन एक जीवित जानवर में इसी तरह की गतिशीलता हस्ताक्षर प्रदर्शन काफी हद तक अज्ञात है । vivo मेंएकल प्रोटीन गतिशीलता कल्पना करने के लिए, ऑप्टिकल पारदर्शिता, पहुंच, और पैठ गहराई जैसे सीमाओं को दूर किया जाना है । लार्वा तैयार करने और मांसपेशी की सतह पर एंबेडेड neuromuscular जंक्शनों visualizing द्वारा, हम ऑप्टिकल पारदर्शिता और पहुंच के मुद्दे से बचें । सामांय TIRF विंयास में छवि एकल अणु गतिशीलता के प्रयास असफल साबित हुआ । हालांकि, थोड़ा परोक्ष रोशनी का उपयोग बढ़ा उत्तेजना लेजर मर्मज्ञ गहराई के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, लार्वा को स्थिर करने के लिए प्रयुक्त minutien पिन प्रोटीन गतिशीलता पर संवेदनाहारी उपयोग के किसी भी संभावित प्रतिकूल प्रभाव से बचने में मदद करता है । यह 100x तेल विसर्जन उद्देश्यों के रूप में उच्च आवर्धन उद्देश्यों, का उपयोग करने के लिए संभव है, vivo मेंएकल अणुओं कल्पना । हालांकि, वृद्धि हुई इज़ाफ़ा ध्यान से बाहर बहाव की हो सकती है । इसके अलावा, हम एक कम तीव्रता का इस्तेमाल किया है (~ 30%) ५६१ एनएम लेजर सफलतापूर्वक मोटर तंत्रिका टर्मिनलों पर छवि एकल अणुओं के लिए । अतिरिक्त परीक्षण के लिए कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है ।

इस प्रोटोकॉल synaptic प्रोटीन की गतिशीलता को न्यूरॉन प्लाज्मा झिल्ली की निकटता के भीतर कल्पना करने के लिए उपयुक्त है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, जाल प्रोटीन की गतिशीलता-Syntaxin-1a और autophagosome बाउंड प्रोटीन Atg18a-सफलतापूर्वक vivo14,26 मेंimaged किया गया है । मोटर न्यूरॉन axons पर प्रोटीन की गतिशीलता की भी जांच की जा सकती है27. हालांकि, मस्तिष्क या ventral तंत्रिका गर्भनाल पर प्रोटीन की गतिशीलता की जांच के लिए अंतर्निहित ऊतक द्वारा उत्पादित उच्च पृष्ठभूमि संकेत के कारण का आकलन करने के लिए मुश्किल साबित हो सकता है; इसके अलावा, एक ही मस्तिष्क संरचना पर प्रोटीन गतिशीलता visualizing फ्लोरोसेंट मस्तिष्क संरचना टैगिंग की आवश्यकता होगी (replicability सुनिश्चित करने के लिए), और दोहरे कैमरा इमेजिंग के उपयोग की जरूरत होगी ।

वर्तमान Drosophila में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए उपलब्ध तरीकों ज्यादातर इमेजिंग भ्रूण को सीमित कर रहे हैं, बजाय अधिक विकसित तीसरे instar लार्वा३८,३९। इन प्रोटोकॉल के साथ मुख्य मुद्दा यह है कि वे imaged क्षेत्र में पथ की एक कम संख्या में उपज है, और इसलिए गतिशीलता राज्यों की गहराई से विश्लेषण को रोकने के22,४०। हमारे vivo एकल अणु ट्रैकिंग प्रोटोकॉल में पथ की एक उच्च संख्या उत्पंन करने की क्षमता है, और इसलिए Caenorhabiditis एलिगेंस और zebrafish जैसे अंय पशु मॉडलों में इस्तेमाल किया जा सकता है । दरअसल, हर NMJ श्रृंखला उत्पंन ~ २,४०० यह अलग मोबाइल राज्यों और इन राज्यों के बीच संक्रमण14,27का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त बनाने पथ । इसके अतिरिक्त, vivo एकल अणु इमेजिंग रणनीतियों में कई जानवरों को20,22, जो शारीरिक समारोह के तहत इमेजिंग किया जाता है बदल सकता है स्थिर करने के लिए निश्चेतक के उपयोग पर भरोसा करते हैं । यहाँ हम minutien पिन का उपयोग लार्वा स्थिर करने के लिए एक ' संज्ञाहरण मुक्त ' प्रोटोकॉल अनुकूलित.

इस प्रोटोकॉल का एक संभावित उपयोग तीन आयामों में प्रोटीन की गतिशीलता visualizing के लिए हो सकता है । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में हाल ही में प्रगति प्रोटीन गतिशीलता में ' एक्स ', ' y ', और ' जेड आयाम४१,४२में इन विट्रो में visualized किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । हमारे वर्तमान पद्धति ' जेड ' धुरी में प्रोटीन की गतिशीलता के लिए खाते में नहीं है । अभी तक Drosophila मोटर तंत्रिका टर्मिनल एक गोलाकार संरचना और एक मूल्यवान भविष्य के दृष्टिकोण के लिए एक तीन आयामी मात्रा४३में प्रोटीन गतिशीलता बढ़ाता होगा । z में इमेजिंग-आयाम एक astigmatic लेंस का उपयोग कर व्यवहार्य है । वैकल्पिक रूप से, TIRF मोड में४४,४५, z-समाधान भी बढ़ जाती है । हालांकि, हमारे प्रयोगों में, हम astigmatic लेंस के बिना syntaxin1A-mEos2 के एकल अणुओं कल्पना करने के लिए थोड़ा टेढ़ा रोशनी का इस्तेमाल किया है ।

अंत में, दोनों एक ट्रांसजेनिक Drosophila मक्खी शेयर व्यक्त प्रोटीन एक photoconvertible प्रोटीन के साथ टैग की उपलब्धता, टुकड़े लार्वा ट्रांसजेनिक करने के लिए एक PDMS आधार, साथ ही साथ एक TIRF माइक्रोस्कोप बदलने की संभावना से सुसज्जित रोशनी के कोण सबसे महत्वपूर्ण इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एकल प्रोटीन कल्पना उपकरण की जरूरत है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम एकल-अणु विश्लेषण के साथ अपनी तरह के समर्थन के लिए जीन बपतिस्मा देनेवाला Sibarita और डैनियल Choquet (IINS, CNRS/बोर्डो के विश्वविद्यालय) धंयवाद । हम विशेष रूप से निक Valmas और जेसिका Mcgaw (QBI, क्वींसलैंड के विश्वविद्यालय) वीडियो रिकॉर्डिंग, आवाज के साथ उनकी मदद के लिए धंयवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चित्र ग्राफिक डिजाइन । यह काम ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (एआर) डिस्कवरी प्रोजेक्ट (DP170100125 to F.A.M.), ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (राहत ग्रांट LE0882864 टू F.A.M.), फ्यूचर फेलोशिप (FT100100725 टू B.V.S.), ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल (राहत ग्रांट) द्वारा समर्थित किया गया था । LE130100078 को F.A.M.) और NHMRC परियोजना अनुदान (APP1103923 to B.V.S.) । F.A.M. एक NHMRC सीनियर रिसर्च फेलो (ONT1060075) हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) Dow Corning Corporation 000000000001064291
Glass-bottomed Culture Dish In Vitro Scientific D29-20-1.5-N
Optical Stereo-microscope Olympus SZ51
Curved Tweezers (Style 5/45) Electron Microscopy Sciences 0208-5AC-PO
Minutien Pins (0.1mm) Fine Science Tools 26002-10
Schneider's Insect Medium Sigma, Life Sciences S0146
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11254-20
ELYRA PS.1 Microscope Zeiss PS.1
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-515Q
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Normal Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) Axygen MCT-175-C
Zen Black acquisition software Carl Zeiss, 2012
Metamorph software Molecular Devices 7.7.8 PALM Tracer Plugin
Fly strain w1118; HA-Sx1A-mEos2

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एकल कण ट्रैकिंग फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी Drosophila melanogaster लार्वा Syntaxin-1a
<em>Vivo में</em> एकल अणु Drosophila Presynaptic मोटर तंत्रिका टर्मिनल पर ट्रैकिंग
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Bademosi, A. T., Lauwers, E., Amor,More

Bademosi, A. T., Lauwers, E., Amor, R., Verstreken, P., van Swinderen, B., Meunier, F. A. In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal. J. Vis. Exp. (131), e56952, doi:10.3791/56952 (2018).

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