Summary
Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.
Abstract
Un numero crescente di tecniche di microscopia di Super-risoluzione stanno aiutando a scoprire i meccanismi che governano il mondo cellulari su scala nanometrica. Formazione immagine singola molecola sta acquistando slancio in quanto fornisce un eccezionale accesso per la visualizzazione delle singole molecole in cellule viventi. Qui, descriviamo una tecnica che abbiamo sviluppato per eseguire il rilevamento di singola particella microscopia localizzazione foto-attivata (sptPALM) nelle larve di Drosophila . Comunicazione sinaptica si basa su importanti proteine presinaptiche che agiscono docking, adescamento, e promuovendo la fusione di neurotrasmettitore contenenti vescicole con la membrana plasmatica. Una gamma di interazioni proteina-proteina e proteina-lipide strettamente regola questi processi e le proteine presinaptiche pertanto mostrano cambiamenti nella mobilità associata con ognuno di questi eventi chiave. Indagando su come la mobilità di queste proteine correla con la loro funzione fisiologica in un animale vivo intatto è essenziale per comprendere il loro meccanismo preciso di azione. L'estrazione di mobilità della proteina con alta risoluzione in vivo richiede superare le limitazioni quali trasparenza ottica, accessibilità e profondità di penetrazione. Descriviamo come proteine fluorescenti fotoconvertibile etichettate alla proteina presinaptica sintaxina-1A possa essere visualizzati tramite leggera illuminazione obliqua e tracciati al terminale del nervo motore o lungo l'assone del neurone di motore del terzo instar Drosophila della larva.
Introduction
Comunicazione di un neurone si basa sul rilascio di neurotrasmettitori, che avviene attraverso la fusione regolamentata delle vescicole sinaptiche contenenti neurotrasmettitore con la membrana plasmatica1. Questo processo chiamato esocitosi2,3,4,5,6 è altamente dinamico e può essere up - o down-regolati secondo le fluttuazioni del tasso di stimolazione7. Le proteine coinvolte in questi processi sono soggetti a moto browniano e pertanto visualizzato nanoscopica organizzazione capace di sostenere una serie di azioni che sono alla base di queste funzioni fisiologiche vincolanti. Proteine di membrana plasmatica sono altamente dinamici, consentendo laterale dell'intrappolamento di molecole in nanocluster la membrana plasmatica7,8,9,10,11, 12. Come tale, indagando la mobilità di queste proteine contribuisce a delucidare la loro modalità di azione8. Proteine sinaptiche come la N-ethylmaleimide fattore sensibile allegato proteine recettori solubili (trappole), ad esempio sintaxina-1A, ora sono conosciute per esibire mobilità veloce laterale, come pure laterale trapping all'interno di nanocluster che possono servire come molecolare depositi e siti per vescicola fusione9,13,14,15.
Il recente sviluppo di proteine fluorescenti fotoconvertibile, come monomerico (m) Eos16,17 e Kaede18, ha permesso la risoluzione nanoscopica delle proteine di un neurone membrana plasmatica attraverso l'uso di approcci tali come microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) e stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)14,15,19. Questi sviluppi hanno permesso le indagini nella mobilità e nella nanoclustering delle proteine biologiche nelle cellule coltivate dal vivo e nei neuroni. Più recentemente, sono stati condotti studi per delucidare (a risoluzioni elevate simili) le dinamiche e l'organizzazione di queste proteine di membrana nei neuroni di esseri viventi intatti tale Mus musculus, elegans di Caenorhabditis e Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Indagando le dinamiche e l'organizzazione di una proteina in vivo richiede non solo l'uso degli strumenti imaging ad alta super-risoluzione sviluppato di recente (ad esempio di fluorofori PALM, STORM e fotoconvertibile), ma anche la capacità di superare tali ostacoli come l'accessibilità della proteina e la profondità di penetrazione del laser imaging. Le proteine intracellulari in un animale intatto di imaging è intrinsecamente impegnativo quanto è imaging proteine sulle strutture incorporati profondo all'interno di tessuti viventi dell'animale intatto, quale l'ippocampo di un mouse intatto. Quindi, più facilmente sono Imaging proteine su o vicino alla superficie del tessuto. Un'altra difficoltà con imaging in vivo è garantire riproducibilità attraverso gli animali. Come l'anatomia potrebbe differire da un campione a altro, selezionando una struttura con facilità di replica in diversi campioni di animali intatti potrebbe anche rivelarsi difficile. L'utilizzo di strutture stereotipate, come sinapsi, aiutare con superamento di alcune di queste difficoltà.
Studi recenti hanno ripreso la mobilità della proteina negli animali con un'epidermide otticamente trasparente come Caenorhabditis elegans22, mentre altre indagini hanno ripreso la organizzazione della proteina sulla superficie di un tessuto/organo, per esempio formazione immagine di actina in neuroni corticali attraverso il cranio di un topo vivo21. In alcuni casi, gli anestetici sono stati utilizzati per mantenere l'animale immobile; Tuttavia, anestetici specifici possono influenzare negativamente la proteina di interesse. Mezzi alternativi per mantenere gli animali immobile durante l'imaging in vivo dovrebbero pertanto essere esplorati per minimizzare l'errore.
Un altro avvertimento a Super-risoluzione imaging in vivo è che il laser usato per illuminare le proteine di interesse poteva influenzare negativamente il tessuto circostante, e quindi mantenere l'intensità di eccitazione più basso possibile è raccomandato. Illuminazione del tessuto circostante dal laser tende anche ad aumentare il segnale di fondo. L'uso di intensità bassa eccitazione aiuta a ridurre lo sfondo, l'avvertenza che essendo esso potrebbe anche portare ad una diminuzione della resa del fotone di proteina fluorescente. Sottrazione di sfondo durante l'analisi potrebbe essere utilizzato come mezzo alternativo per ridurre il segnale di fondo prima dell'analisi di immagine.
Drosophila presenta un organismo ideale per in vivo imaging poiché fornisce strumenti genetici ben consolidati per l'indagine della funzione della proteina specifica. La sequenza d'attivazione a Monte (UAS)-sistema Gal4 consente l'espressione temporale e spaziale delle proteine e pertanto può essere utilizzato per manipolare la neurotrasmissione23, tale che stimolo termo-genetica usando Drosophila transitoria Sottofamiglia potenziali recettori A1 (dTRPA1)24 o stimolazione opto-genetica usando lontana rosso-spostato CsChrimson25 possa essere combinata con imaging14. Abbiamo superato molte delle complicazioni di effettuazione in vivo imaging di singola molecola in questo sistema e ora descrivere come singola particella di monitoraggio può essere effettuata in Drosophila melanogaster terzo instar larve.
Protocol
1. design di transgenici della drosofila che esprimono le proteine mEos2-etichetta
- Selezionare la proteina per essere contrassegnati con la proteina mEos2. Per aumentare il tasso di successo di imaging, selezionare proteine con un dominio transmembrana della membrana neuronale14 (ad es., sintaxina-1A), proteine delle vescicole sinaptiche o autofagosomi26,27 (ad es., Synaptobrevin-2), o proteine citosoliche con stretta interazione con le proteine di un neurone membrana plasmatica (ad es., Munc18-1).
- Costruire transgeni che codifica per la proteina mEos2-etichetta (Figura 1). Progettare il primer forward e reverse per la proteina e mEos2.
Nota: La sequenza di codificazione di mEos2 può essere amplificata dal plasmide pmEos2-N1, che è stato progettato per fondere al C-terminale della proteina di interesse. Clonazione per esempio può essere eseguita tramite la ricombinazione in vivo in Saccharomyces cerevisiae usando il pFL44S-attB-MCS-w + vector14,28, alternativamente altri metodi di duplicazione potrebbero essere usati come Gibson Assemblea protocollo29.- Linearizzare il vettore con BamHI e XbaI e co-trasformare in cellule di lievito ura3 - insieme i frammenti PCR codifica mEos2 e la proteina di interesse. Iniettare gli embrioni della drosofila con il costrutto per generare una linea di volo transgenici30.
- Posteriore le culture transgeniche volare su standard medio di lievito e melassa o qualche altro sostituto adatto contenuti in fiale di plastica. Per garantire la sana e abbastanza grande boutons sinaptici31, evitare sovraffollamento mosche nelle fiale e capovolgere mosche a new fiale dopo ogni giorno di deposizione delle uova; in questo modo le larve instar terza sono ben nutrite e raggiungono dimensioni adeguate per il momento che cominciare vagare sul mezzo. Sollevare la Mosca transgenica a temperatura ambiente (25 ° C).
Nota: Boutons sinaptici più grandi tendono a produrre grandi quantità di proteine visualizzati durante la formazione immagine.
2. dissezione del terzo Instar Larva
- Fare un ≤20 base cilindrica o semicilindrica sagomato polidimetilsilossano (PDMS) mm di diametro e ≤20 mm di altezza, utilizzando un kit di elastomero di silicone appropriato (Figura 2A). Mescolare elastomero di silicone con un silicone indurente con un rapporto di 10:1.
- Mescolare accuratamente per 5 min, versare il composto in uno stampo con il dimsensions sopra elencato. Lasciare indurire in un forno a 100 ° C per 45 min. La base PDMS servirà come il fondamento su cui effettuare la dissezione. Garantire la base PDMS si adatta nel pozzetto di una piastra di coltura con fondo di vetro.
- Selezionare un'errante terzo instar larva dalla parete flaconcino. Utilizzare un stereo-microscopio ottico a 4,5 ingrandimento per visualizzare la larva posizionata sulla base PDMS cilindrica con il lato dorsale fino.
- Uso curvo e angolati pinzetta a bastone minutien perni sulla testa, sopra i ganci di bocca, tra i due che estende spiracoli anteriori e sulla coda sopra l'ano, tra le due spiracoli posteriori. Aggiungere 40 µ l di terreno dell'insetto di Schneider a temperatura ambiente sulla larva immobilizzata.
Nota: Hemolyph-come soluzioni (HL3 o HL6) possono anche essere utilizzate al posto soluzione32,33 di Schneider. - Fornire l'accesso attraverso il lato dorsale della parete addominale del corpo della larva di utilizzo di un pin di minutien incidere nella linea mediana della parete.
- Uso primavera forbici per tagliare la parete del corpo aprire dal punto di incisione. Tagliare lungo la linea mediana in direzione antero-posteriore34.
- Utilizzare una pinzetta e forbici per sventrare la larva di primavera: rimuovere gli organi interni, tra cui le ghiandole salivari, la trachea e l'intestino. Lavare la larva due volte con il mezzo dell'insetto di Schneider.
- Con una pinzetta, tenere i due lembi di parete del corpo, delicatamente li tratto fuori e bastone due minutien pin su ogni lato. Questo dovrebbe produrre una preparazione a forma di esagono (Figura 2A).
- Staccare il cervello dal cavo ventrale del nervo usando le forbici di primavera per diminuire la possibilità di movimento muscolare durante la formazione immagine; Questo serve anche a tenere la preparazione piatto contro il piatto di imaging. Usare le pinzette curve per spingere tutti i sei minutien pin nella base PDMS.
Nota: Solo una piccola parte dei pin dovrebbe essere incorporata all'interno della parete addominale. - Per confermare che la larva è sopravvissuto la procedura di dissezione, colpire leggermente il cavo ventrale del nervo, questo dovrebbe suscitare una contrazione peristaltica della parete addominale della larva.
3. leggermente obliqua singola particella rilevamento microscopia
- Capovolgere la base della larva-PDMS dissecata su una piastra di coltura con fondo di vetro. Riempire il piatto di imaging con 2 mL di terreno di insetto di temperatura Schneider (Figura 2B).
- Individuare i motoneuroni nei segmenti secondo e il terzi con sinapsi su muscoli addominali 6 e 735 utilizzando la x 63 / 1.2 obiettivo a immersione in acqua NA su un microscopio a fluorescenza (TIRF) fluorescente di riflessione interna totale.
- Utilizzare gli oculari del microscopio per individuare la larva dissecata; identificare muscolo 6 uso di illuminazione in campo chiaro.
- Utilizzare il software di acquisizione del microscopio (Vedi Tabella materiali), in configurazione TIRF; far scorrere l'angolo di ripresa di collimatore 1° per aumentare la profondità di penetrazione, in caso contrario spostare fuori TIRF angolo critico per ottenere illuminazione obliqua.
- Accendere il laser 488 nm per visualizzare mEos2 in verde. Utilizzare un laser a bassa potenza (meno di 5% di 22,8 mW) per evitare lo sbiancamento la fluorescenza verde. Individuare le giunzioni neuromuscolari (che appaiono come perle su una stringa) e acquisire un'immagine TIRF di bassa risoluzione.
- Contemporaneamente, accendere il laser 405 nm (mEos2 di photoconverts da verde a rosso specie) e il 561 nm laser (immagine del mEos2 photoconverted rosso) per localizzare casualmente mEos2 singole proteine fluorescenti.
Nota: È consigliabile uso di bassa potenza di laser 405 nm (0,005 allo 0,9% di 4,78 mW) come questo permette per un tasso di fotoconversione relativamente costante durante l'acquisizione di film. Uso tra il 50 e il 75% del laser 561 nm (20,1 mW), in quanto questo è sufficiente per acquisire fluorescenza dalle specie mEos2 rosso senza alterare la morfologia del tessuto del muscolo che circonda la giunzione neuromuscolare. - Per ogni catena di giunzione neuromuscolare, acquisire un tempo serie composta da 15.000 fotogrammi o più a 33 Hz. as.czi formato di salvataggio al fine di preservare l'accompagnamento meta-dati per eventuale riferimento.
- Utilizzare ImageJ per convertire film '.czi' 'TIFF' file.
- Analizzare i filmati acquisiti con adatta singola molecola tracking software di analisi11,14,36 come TrackMate sul FIJI/ImageJ37 (Vedi Tabella materiali). Individua la 'x' e 'y' le coordinate di ogni localizzazione dalla vestibilità gaussiana del punto di intensità diffuso funzione (PSF).
Nota: risoluzione dei problemi: se fluorescenza verde non è osservato o è troppo debole alla giunzione neuromuscolare sopra l'esposizione al laser 488 nm, accendere brevemente il photoconverting e imaging laser (405 nm e 561 nm), come questo aiuta a produrre più del rosso specie di mEos2. Quindi passare nuovamente alla parte 488 nm laser e prendere un'immagine TIRF.
4. singola molecola localizzazione nelle larve fisse
- Per misurare la dimensione di nanocluster di proteina tramite PALM, è necessario sostituire medio dell'insetto di Schneider dopo dissezione con un fissativo - paraformaldeide 4%, diluito in tampone fosfato salino (PBS).
- Incubare la larva per 30 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la dissezione perni e posizionare la larva fissa in un 1,7 mL trasparente tubo del microcentrifuge Schioccare-serratura.
- Sezionare e difficoltà come molte altre larve come necessario, quindi lavarli tre volte con PBS.
- Sostituire il PBS con mattoncino buffer (una soluzione di PBS, 0,1% Triton X-100 e 3% siero di capra normale).
- Lavare le larve con PBS tre volte, quindi incubare con l'anticorpo primario necessaria (diluito in soluzione tampone per il blocco).
- Incubare per una notte alle 4 oC.
- Lavare le larve tre volte con PBS, poi incubare con l'anticorpo secondario necessaria (diluito in soluzione tampone per il blocco).
- Lavare le larve tre volte con PBS, allegare la larva sul PDMS base e l'immagine come descritto in precedenza per il rilevamento di singola molecola.
Representative Results
Utilizzando il protocollo transgenico elencati sopra, sintaxina-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster sono stati generati (Figura 1). Transgenici terzo instar Drosophila larve sono state sezionate su base cilindrica PDMS (Figura 2A-F). Per visualizzare le singole molecole di sintaxina-1A, abbiamo utilizzato PALM su un microscopio TIRF con leggermente obliquo laser illuminazione14.
Singole molecole di sintaxina-1A sono state rilevate sui terminali presinaptici del nervo motore sul muscolo 6 del secondo segmento addominale. La fluorescenza verde di mEos2 potrebbe essere rilevata come mostrato dall'immagine a bassa risoluzione di sintaxina-1A-mEos2 su boutons 1b di tipo quando eccitato con il laser di 488 nm (Figura 3A). Negli esperimenti imaging, la 405 nm e 561 nm di eccitazione laser imaging profondità erano 133,5 nm e 165,6 nm, rispettivamente. L'immagine verde è stata acquisita come una media di 16 singoli fotogrammi. Questa immagine verde è stata utilizzata per creare la regione di interesse utilizzato per limitare l'analisi delle localizzazioni nel film photoconverted ai terminali presinaptici del nervo motore da solo.
L'analisi dei film sptPALM photoconverted acquisita generato un'intensità Super-risolta, coefficente di diffusione, e traiettoria mappe (Figura 3A). Sintaxina-1A-mEos2 mobilità più ulteriormente è stato quantificato dall'analisi dello spostamento quadratico (MSD) delle traiettorie individuali (Figura 3B). I confronti statistici possono essere fatto utilizzando l'area sotto la curva MSD (Figura 3B). Un'ulteriore analisi della mobilità produce la distribuzione di coefficiente di diffusione di sintaxina-1A-mEos2, e questo può essere valutato statisticamente tramite il confronto del mobile alle popolazioni immobile (Figura 3).
Figura 1 : Generazione di costrutti con tag mEos2. Il pFL44S-attB-MCS-vettore w + è linearizzato con BamHI e XbaI. Frammenti di sovrapposizione reazione a catena della polimerasi (PCR) codifica per la proteina di interesse (PDI) e mEos2, rispettivamente, possono essere clonate, ad esempio, tramite la ricombinazione in vivo in cellule di lievito ura3 - o dall'Assemblea di Gibson. Si noti che per generare il transgene sintaxina-1A-mEos2, abbiamo clonato il costrutto fiancheggiato dalle sequenze di promozione e di terminazione sintaxina-1A endogene. Il costrutto risultante può successivamente essere iniettato negli embrioni della drosofila per creare una linea di volo transgenica esprimenti la proteina di interesse (PDI) fusa a mEos2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Drosophila la dissezione della larva e illuminazione obliqua. Schema (A) risultati dissezione della larva della drosofila effettuata sulla base PDMS semicilindrica. Una larva di filettata era tenuta sul PDMS gel da uso di perni minutien. (B-C) La preparazione della larva-PDMS è stato disposto all'interno di una piastra di coltura con fondo di vetro che contiene il media dell'insetto di Schneider. Un microscopio TIRF in una configurazione leggermente obliqua è stato usato per prevedere sintaxina-1A-mEos2 nei terminali del nervo motore. (D-F) Una base PDMS semicilindrica con dissecata Drosophila larva. La preparazione della larva-PDMS è stato disposto in un piatto di imaging riempito con medie di Schneider e la larva era imaged il microscopio di PALM di Super-risoluzione. Barra di scala, mm. 10 (questa figura è stata modificata da14). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : In vivo traccia la sintaxina-1A-mEos2 presso il terminale presinaptica del nervo motore. (A) A bassa risoluzione immagine TIRF di sintaxina-1A-mEos2 su un terminale nervoso tipo motore 1b. Analisi di fotoconversione film ripreso a 33 Hz generati sptPALM super-risolto intensità, coefficente di diffusione e traiettoria mappe. 5.309 traiettorie individuali erano imaged oltre 16,000 frames film acquisizione. Barra della scala, 3 μm. (B-C) Quadratico medio dislocamento (MSD) di sintaxina-1A-mEos2 è stata tracciata da 6 terminali del nervo motore diverso; area sotto la curva (AUC) di MSD è stato utilizzato per quantificare il livello di mobilità. La distribuzione del coefficiente di diffusione rivela popolazioni sintaxina-1A mobili ed immobili che possono essere quantificati come rapporti uno da altro; una media di ~ 2.400 traiettorie sono stati ottenuti al terminale del nervo motore (n = 3 larve). Dati presentati come media errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive la singola molecola rilevamento delle proteine mEos2-etichettate alla giunzione neuromuscolare della drosofila terzo instar larva. Per evitare la sovra-espressione della proteina transgenica, sintaxina-1A-mEos2 espressione era guidato da promotore endogeno sintaxina-1A. Studi di mobilità della proteina sinaptica sono stati sostanzialmente limitati alle indagini in vitro di cellule coltivate e neuroni corticali9,11,12,13. Se queste proteine presentano firme di mobilità simile a un animale vivo è in gran parte sconosciuto. Per visualizzare mobilità singolo-proteina in vivo, limitazioni quali profondità ottica di trasparenza, accessibilità e penetrazione devono essere superati. La preparazione larvale di dissezione e la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari incorporate sulla superficie del muscolo, si evita il problema di accessibilità e trasparenza ottica. Tentativi di immagine singola molecola mobilità in configurazione normale TIRF avuto successo. Tuttavia, l'uso di illuminazione leggermente obliqua permette per laser di eccitazione maggiore profondità di penetrazione. Inoltre, i perni di minutien utilizzati per immobilizzare la larva ha contribuito a evitare un eventuale effetto negativo di uso anestetico sulla mobilità della proteina. È possibile utilizzare obiettivi di ingrandimento maggiori, ad esempio 100 x obiettivi di immersione di olio, per visualizzare le singole molecole in vivo. Tuttavia, una maggiore ingrandimento può aumentare l'avvenimento di derive fuori fuoco. Inoltre, abbiamo utilizzato un'intensità più bassa (~ 30%) 561 nm laser con successo a singole molecole di immagine presso i terminali del nervo motore. Ulteriori test potrebbe essere necessario utilizzare più bassa potenza del laser.
Questo protocollo è adatto a visualizzare la mobilità di proteine sinaptiche in prossimità della membrana neuronale. Utilizzando questo approccio, la mobilità della proteina SNARE - sintaxina-1A e l'autofagosoma associato proteina Atg18a - sono stati correttamente imaged in vivo14,26. La mobilità delle proteine del neurone di motore assoni possono anche essere studiato27. Tuttavia, indagine della mobilità delle proteine il cervello o del midollo ventrale del nervo può rivelarsi difficile da valutare a causa il segnale elevato rumore di fondo prodotto dal tessuto sottostante; Inoltre, visualizzando la mobilità della proteina sulla stessa struttura del cervello richiederà fluorescente tagging struttura del cervello (per garantire la replicabilità), e uso di formazione immagine doppia fotocamera sarebbe necessaria.
Attuali metodi disponibili per microscopia di Super-risoluzione in Drosophila sono perlopiù limitati agli embrioni imaging, piuttosto che più sviluppato terzo instar larva38,39. Il problema principale di questi protocolli è che produrre un basso numero di traiettorie nell'area imaging e quindi impedire un'analisi approfondita di mobilità stati22,40. I nostri in vivo singola molecola protocollo di rilevamento ha la capacità di generare un elevato numero di traiettorie e pertanto potrebbe essere utilizzata in altri modelli animali come Caenorhabiditis elegans e zebrafish. Infatti, ogni catena NMJ generato ~ 2.400 traiettorie che lo rende adatto per analizzare il mobili diversi Stati e le transizioni tra questi stati14,27. Inoltre, molti in vivo singola molecola strategie di imaging si basano sull'uso di anestetici per immobilizzare gli animali20,22, che potrebbe alterare la funzione fisiologica in cui è fatto l'imaging. Qui abbiamo ottimizzato un protocollo 'anestesia-free' per immobilizzare le larve con perni minutien.
Un uso potenziale di questo protocollo può essere per la visualizzazione la mobilità delle proteine in tre dimensioni. Gli avanzamenti recenti nella microscopia di Super-risoluzione permettono una mobilità di proteina essere visualizzati in vitro a 'x', 'y' e 'z' dimensioni41,42. Il nostro metodo attuale non tiene conto per la mobilità delle proteine nell'asse 'z'. Eppure il terminale del nervo motore Drosophila è una struttura sferica e un valido approccio futuro sarà quello di quantificare la mobilità della proteina in un volume tridimensionale43. L'imaging nella dimensione z è fattibile utilizzando una lente astigmatica. In alternativa, in TIRF modalità44,45, la risoluzione di z è anche aumentata. Tuttavia, nei nostri esperimenti, abbiamo usato leggermente obliqua per visualizzare singole molecole di syntaxin1A-mEos2 senza le lenti astigmatiche.
In conclusione, la disponibilità di entrambi un transgenici Drosophila volare stock che esprimono le proteine taggati con una proteina di fotoconvertibile, una base di PDMS dissezionare la larva transgenica, come pure un microscopio TIRF equipaggiato con la possibilità di cambiare il angolo di illuminazione sono gli strumenti più importanti necessari per visualizzare singole proteine, come descritto in questo protocollo.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jean-Baptiste Sibarita e Daniel Choquet (IINS, CNRS/Università di Bordeaux) per il loro supporto gentile con l'analisi di singola molecola. Ringraziamo in particolare Nick Valmas e Jessica Mcgaw (QBI, Università del Queensland) per il loro aiuto con il video registrazione, Voice-over, nonché figura di disegno grafico. Questo lavoro è stato supportato dal progetto scoperta Consiglio di ricerca australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), l'Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), futuro Fellowship (FT100100725 a B.V.S), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M.) e progetto NHMRC concedere (APP1103923 a B.V.S). F.A.M. è NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |
References
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
