Summary
该方法描述了用 x 射线晶体学和小角 x 射线散射 (SAXS) 进行结构测定的重组 Nsa1 的克隆、表达和纯化, 适用于其他蛋白质的混合结构分析包含有序和无序的域。
Abstract
从酿酒酵母 (酵母)中 Nsa1 核糖体组装因子的全长结构的测定是有挑战性的, 因为蛋白质紊乱和蛋白酶不稳定的 c-末端。本文介绍了从酿酒酵母中纯化重组 Nsa1 的方法, 通过 x 射线晶体学和 SAXS 进行结构分析。利用 X 射线晶体学的方法求解了 Nsa1 的有序 N 端 WD40 域的结构, 然后利用 SAXS 解决了 Nsa1 的 c-末端结构。溶液散射数据是从全长 Nsa1 中收集的。从 WD40 域的高分辨率晶体结构计算了理论散射振幅, 然后结合刚体和从头算模型揭示了 Nsa1 的 c-终点. 通过这种混合方法, 重建了整个蛋白质的第四纪结构。这里提出的方法应该是一般适用于混合结构确定的其他蛋白质组成的混合结构和非结构化领域。
Introduction
核糖体是大型的核糖机器, 它能在所有活细胞中实现将 mRNA 转化为蛋白质的重要作用。核糖体是由两个亚基组成的一个复杂的过程中, 称为核糖体生物1,2,3,4。真核核糖体组装依赖于数百个必要的核糖体组装因子2,3,5。Nsa1 (Nop7 相关的 1) 是一个真核核糖体组装因子, 是专门为生产大核糖体亚基6, 并称为 WD 重复包含 74 (WDR74) 在较高的生物体7。WDR74 已被证明是需要的囊胚形成在小鼠8和 WDR74 启动子经常突变的癌细胞9。然而, Nsa1/WDR74 在核糖体组装中的作用和精确机制仍然是未知数。为了开始揭示 Nsa1/WDR74 在真核核糖体成熟过程中的作用, 进行了多种结构分析, 包括 x 射线晶体学和小角 x 射线散射 (SAXS)10。
x-射线结晶学、核磁共振 (NMR) 光谱学、电子显微镜和 SAXS 都是研究大分子结构的重要技术。大分子的大小、形状、可用性和稳定性影响到一种特定的大分子最适合的结构生物学方法, 然而通过 so-called "混合" 方法将多种技术结合起来, 正成为日益受益的工具11。特别是 x 射线结晶学和 SAXS 是强有力和补充的方法为大分子的结构决心12。
晶体学提供了高分辨率的原子结构, 从小分子到大型蜂窝机械, 如核糖体, 并在理解蛋白质和其他生物功能方面取得了许多突破。大分子13。此外, 结构药物设计利用计算方法为分子对接提供了晶体结构的能量, 为药物发现和开发14增添了一个关键的维度。尽管它具有广泛的适用性, 但由于晶体包装可以被阻碍或电子密度图可能不完整或质量较差, 因此, 由晶体学来评估的灵活性和无序系统具有挑战性。相反, SAXS 是一种解决和低分辨率结构方法, 能够描述从无序循环和总站到固有无序的蛋白质的灵活系统12,15,16。考虑到它与范围广泛的粒子大小12兼容, SAXS 可以与晶体学协同工作, 以扩大可以通过结构研究解决的生物问题的范围。
Nsa1 是适合混合结构的方法, 因为它包含一个合理的 WD40 域, 其次是一个功能, 但灵活的 C 总站, 这是不服从 X 射线晶体学方法。以下是S. 酿酒酵母Nsa1 的克隆、表达和纯化的协议, 用于 X 射线晶体学和 SAXS 的混合结构测定。本协议可用于研究其他蛋白质的结构, 它们由有序和无序区域的组合组成。
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Protocol
1. 重组蛋白的生产和纯化1
- Nsa1 表达质粒的设计与克隆
- 获取或购买S. 酿酒酵母基因组 DNA。
- PCR 放大的目标序列 Nsa1 (Nsa1FL, 残留 1-463) 和 c-终端截断 Nsa1 (Nsa1ΔC, 残留物 1-434) 与适当的底漆使用基因组 DNA 分离从S. 酿酒酵母和熔化温度大约60° c 以延长时间 1-2 min。以下引物用于放大 Nsa1:
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw: GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC - 克隆 Nsa1 到大肠杆菌(大肠杆菌)表达载体 pHMBP 含有 n-端 6 x 组氨酸标签, 其次是麦芽糖结合蛋白和烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶网站使用标准克隆技术17.
- 使用 DNA 测序来验证 Nsa1 是在与 N 端的他的标签的框架内克隆的。
- Nsa1 蛋白表达
- 用 T7 promoter-based 系统将表达质粒转化为合适的大肠杆菌表达应变。将转化板放在含有100µg/毫升氨苄西林的 LB 琼脂板上, 在37° c 的夜间孵育盘。
- 接种50毫升的 LB 与100µg/毫升氨苄西林从转换板, 并在夜间增长, 在 200 rpm 在37° c。
- 接种 3 x 1000 毫升的 LB 在 Fernbach 烧瓶与100µg/毫升氨苄西林与15毫升的隔夜培养和增长与晃动在200转每分钟在37° c。
注: 对于蛋白质结构溶液, selenomethionyl (SeMet) 的结合可以通过生长在 M9 最小培养基中的细胞来实现, 辅以 SeMet 和氨基酸混合物来抑制蛋氨酸的生产, 而不是 LB 培养基18。 - 诱导表达 Nsa1 当 OD600到达 ~ 0.8 由加法异丙β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) 在最后的集中1毫米跟随了孵化在25° c 隔夜以震动在200转每分钟。
- 收获细胞由离心在4° c 为15分钟在 5050 x g。
注: 细胞可以长期储存在-80 ° c 或立即用于蛋白质纯化。
- Nsa1 蛋白纯化
- 重细胞在25毫升的裂解缓冲液 (50 毫米三盐酸, pH 7.5, 500 毫米氯化钠, 10% 甘油, 10 毫米氯化镁2) pre-chilled 在4° c 含有一个无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂。
- 溶解细胞由超声在4° c (时间7分钟, 2 s 在周期, 2 s 关闭周期; 振幅: 70%)。
- 在4° c 时, 用离心法澄清 26900 x g 的45分钟的裂解液。
- 将澄清的裂解物应用于载有10毫升固定化钴亲和树脂的重力流柱, pre-equilibrated 与裂解缓冲液。
- 允许上清液通过重力流在4° c 以上的树脂, 并用100毫升的裂解缓冲剂清洗两次树脂。
- 洗 Nsa1 与20毫升洗脱缓冲器 (50 毫米三盐酸 pH 7.5, 500 毫米氯化钠, 5 毫米氯化镁2, 5% 甘油和200毫米咪唑)。
- 采取15μ l 的洗和运行它在 4-15% SDS 页凝胶, 以验证该蛋白是洗从亲和树脂 (图 1A)。
- 通过 TEV 蛋白酶消化去除碱性蛋白标签。添加1毫升的 TEV 蛋白酶19 (1 毫克/毫升的库存) 到 Nsa1 亲和树脂洗脱和孵化它在4° c 过夜。
- 用离心过滤器将 Nsa1 的5毫升浓缩, 用 10 kDa 的分子量切断。
- 将 Nsa1 应用于凝胶过滤柱, pre-equilibrated 在缓冲器 a (20 毫米的三盐酸 pH 7.5, 100 毫米氯化钠, 1 毫米氯化镁2, 5% 甘油和1毫米β-基) (图 1B)。
- 从凝胶过滤中分析柱状成分, 通过在 4-15% SDS 页凝胶上运行15μ l 样品 (图 1B), 验证其是否被劈开并与 Nsa1 分离。
- 将含有 Nsa1 的分数和浓缩到8毫克/毫升的离心过滤器结合在一起, 分子量减少 10 kDa。
- 使用消光系数42530米-1cm1, 通过测量分光光度计上 280 nm 的吸光度来确定蛋白质浓度。立即使用蛋白质进行蛋白酶筛选和结晶试验。
2. 国家安全局1的结晶和蛋白酶筛选
- Nsa1 的稀疏矩阵晶体筛选
- 离心机500μ l 的8毫克/毫升的 Nsa1 在 1.6万 x g, 在4° c 为10分钟。
- 使用结晶机器人和稀疏矩阵晶体屏幕进行结晶试验。用30μ l 的单个晶体屏幕试剂从稀疏矩阵结晶屏中填充96井塔板。设置坐下降与机器人混合 250 nl 的井液与 250 nl 的蛋白质溶液。
- 用胶带封住结晶板, 在25° c 下孵育。
- 头2-3 周每两天检查一次显微镜。
- 验证潜在的水晶命中含有蛋白质与紫外线显微镜。
注: 对于 Nsa1 两种不同的晶体形式 (立方和正交,图 2A) 在1周内从以下屏幕获得: JCSG + 条件 B11 (1.6 米柠檬酸钠硫酸脱水, pH 6.5) 和向导沉淀协同屏幕块2条件 C11 (20.1% (v/v) peg 1500, 13.4% (v/五) peg 400, 0.1 米三 HEPES/氢氧化钠, pH 7.5)。
- 蛋白酶筛选
注意: 在结晶优化过程中, 发现 Nsa1 的正交晶体是由于蛋白水解而产生的, 不能用全长的蛋白质来复制晶体。利用有限的蛋白水解结合质谱的组合, 确定 Nsa1 的 c 端对蛋白质水解很敏感, 在随后的正交晶体形态的复制中需要去除 c 末端的尾部 (Nsa1ΔC)。- 准备1毫克/毫升蛋白酶库存溶液的以下蛋白酶α-蛋白酶, 胰蛋白酶, 弹性蛋白酶, 木瓜蛋白酶, 枯草杆菌, 和 endoproteinase 谷氨酸 C。
- 创建 1:10, 1:100, 1:1000 稀释的每1毫克/毫升蛋白酶存量与稀释缓冲 (10 毫米 HEPES, pH 7.5, 500 毫米氯化钠)。
- 将1μ l 的蛋白酶储存 (1:10、1:100 和 1:1000) 转化为9μ l 等分蛋白 (1 毫克/毫升), 用于筛选每种蛋白酶。
- 孵育溶液在37° c 为 1 h。
- 停止反应, 加入10μ l 2x SDS 页样品缓冲和热反应在95° c 5 分钟。
- 通过在 4-15% SDS 页凝胶 (图 2B) 上运行它们来分析摘要。
- 用凝胶质谱分析法鉴定靶蛋白的蛋白酶抗性域。
- 通过创建截断表达式构造并遵循上述的克隆、表达和纯化协议, 从目标蛋白中移除蛋白酶不稳定区域。
- 结晶优化
- 准备或获得以下初始结晶试剂的库存溶液: 1.6 m 柠檬酸钠硫酸脱水 ph 6.5, 100% (v/v) peg 400, 50% (v/v) peg 1500, 1 米 HEPES/氢氧化钠, ph 7.5。
- 如上文所述, 准备8毫克/毫升的 Nsa1FL和 Nsa1ΔC的库存解决方案。
- 优化 Nsa1 立方晶体 (Nsa1FL)。
- 准备一个24井网格屏幕, 含500µL 的水井, 坡度为 1-1. 6 米的柠檬酸钠与 ph 6.5 从一个1.6 米柠檬酸钠硫酸的股票溶液的 ph 6.5。
- 混合1µL 的蛋白质与1µL 的井液, 并将混合物放在硅盖幻灯片上。小心地翻转顶部的 pre-greased 井, 确保它是良好的密封, 但注意不要打扰的下降或打破了封面幻灯片。重复此过程, 直到托盘填满, 然后存储在25° c。
注: 小立方晶体应在2-7 天内出现。 - 准备一 microseed 的立方晶体的股票。使用一个安装的尼龙环转移〜10小立方晶体1.5 毫升微离心管包含一个小珠和50µL 1.6 米柠檬酸钠硫酸机智 pH 6.5。
- 涡流1.5 毫升微离心管在高速 (〜 3000 rpm) 1 分钟。
- 用1.6 米枸橼酸钠硫酸, 用10倍的稀释对种子进行连续的混合, 将混合物彻底涡旋5秒。
- 填充24井网格中的每一个井, 屏幕上有500µL 1.6 米的柠檬酸钠硫酸 pH 值6.5。
- 通过设置不同比例的蛋白质与种子库解决方案 (图 3A) 来优化 microseeding 条件。高衍射质量的较大立方晶体应在2-5 天内出现 (图 3C)。
- 优化正交晶体 (Nsa1ΔC)
- 准备一个网格屏幕与500µL 在每个井与24不同的情况 (图 3B) 从股票解答 50% (v/v) peg 1500 和 100% (v/v) peg 400。除了 peg 1500 和 peg 400 的梯度外, 每个井还应包含0.1 米 HEPES/氢氧化钠 pH 值7.5。
- 混合1µL 的蛋白质溶液与1µL 的井液在硅盖幻灯片。小心地将盖板滑动到 pre-greased 的顶部, 确保其密封性好。重复此过程, 直到填满整个纸盒。将托盘存放在25° c。
注: Nsa1 正交晶体应在2-7 天内出现。 - 进一步优化正交晶体的 microseeding 描述为立方晶体 (步骤 2.3.3.3 2.3.3.7) 使用500µL 20.1% (v/v) peg 1500, 13.4% (v/五) peg 400, 和0.1 米 HEPES/氢氧化钠 pH 7.5 作为井液。
注: Nsa1 SeMet 晶体的优化应与原生晶体相似。
3. x 射线衍射数据收集和 Nsa 1 结构解决方案
- 晶体的低温保护与 x 射线衍射数据的采集
- 对于正交晶体 (Nsa1ΔC), 准备一个包含 22.5% (v/v) peg 1500、15% (v/v) peg 400 和 0.1 M HEPES/氢氧化钠 pH 7.5 的1毫升剂溶液。
- 用液氮填充泡沫杜瓦, 然后 pre-cool 一个水晶冰球。使用液氮时要小心, 戴上防护手套和护目镜。
- 在显微镜的舞台上, 小心地将结晶井的盖子滑动到含有晶体的上。
- 吸管2µL 的剂溶液到一个新的封面幻灯片。
- 将合适尺寸的尼龙环安装在一个磁性冰棒上。
- 使用显微镜的援助, 迅速转移晶体的剂解决方案与安装的低温循环。
- 让水晶在剂溶液中平衡5分钟。
- 利用显微镜的帮助, 迅速将晶体从剂溶液中循环, 并将其浸入液氮中。
- 等待循环中的液氮停止沸腾, 然后从魔杖中释放出循环, 进入水晶冰球的特定位置。
- 立方 Nsa1FL晶体不需要 cryoprotected, 可以直接冻结 (以下步骤 3.1. 8-3. 1.9)。
- 密封的水晶冰球使用冷冻工具和转移到一个 pre-chilled 杜瓦的运输甘蔗。在冰球/杜瓦中存储晶体直到数据收集。
- 如果在同步加速器上收集数据, 则使用干燥的托运人将晶体运送到同步加速器。
- 按照标准技术20收集 x 射线衍射数据。
注: 对于 Nsa1 本机和 SAD (单反常色散) 数据集是收集在 100 K 的 SER CAT 光束线 22 ID 和 22-BM 的先进光子源在阿贡国家实验室 (芝加哥, IL)。可悲的 Nsa1 数据集是收集在λ = 0.97911 å。使用1秒曝光时间和0.5 振荡记录数据。这些晶体的 mosaicity 通常在0.3°。 - 处理和缩放 x 射线衍射图像, 为适当的空间组中的每个数据集生成反射文件。
注: Nsa1 衍射数据集是用 HKL200021处理的。Nsa1 立方晶体处理在空间组 P213 和正交晶体处理在空间组 P212121。
- Nsa1 结构解决方案。
注: 有几个结晶学软件包, 可用于解决和细化晶体结构, 包括凤凰和 CCP422,23。以下是使用凤凰软件套件22的 Nsa1 结构解决方案的协议。- 分析与凤凰 xtriage 的本地和 SAD 比例数据集.22。
- 用凤凰解决 Nsa1 的结构. autosol 使用 SAD 峰值反射文件22,24。要运行 AutoSol 的程序, 请输入硒站点的数量 (站点 = 9)、Nsa1ΔC的 fasta 序列文件和用于 SAD 数据收集的波长 (λ = 0.97911 å)。
注意: 从 Nsa1 悲伤的数据集, 凤凰. autosol 应该能够确定实验阶段并建立大部分模型。 - 使用顶25对模型进行手动调整, 然后在凤凰中进行细化. 优化22,26。
- 使用相位27,28, 通过分子置换解决高分辨率本机正交晶体和立方晶体的结构。
- 在成功的结构解决方案之后, 检查顶25中的模型和电子密度图。
- 建立和完善的结构, 在凤凰运行迭代循环. 优化22、26和顶25中的模型构建。
4. SAXS 数据的收集、处理和建模
- SAXS 数据收集
注: SAXS 数据记录了完整的酿酒酵母Nsa1 在先进的光源, 高通量女巫光束12.3.1 在劳伦斯伯克利国家实验室, 伯克利, CA29。- 按照上面所述的协议净化 Nsa1FL 。24 h 在将 Nsa1FL装运到光束之前, 在缓冲区 a 中的凝胶过滤柱 pre-equilibrated 上运行蛋白质。
- 包含 Nsa1 的池分数, 并确定前面描述的蛋白质浓度。
- 使用缓冲器 a 从1到6.2 毫克/毫升制备30μ l 等分浓度系列 Nsa1。
- 转移20μ l 每个浓度系列的 Nsa1 到一个明确的完整的裙子96井微连同缓冲一个单独的控制。
注: SAXS 数据是收集在稀溶液中使用几个浓度的纯化样品, 以避免聚集, 颗粒排斥, 和辐射损伤的影响。 - 密封微与硅胶密封垫和船舶过夜在4° c 光束。
- 储存微在4° c, 直到数据收集。
- 在数据收集之前, 在4° c 的10分钟旋转板在 3200 x g, 以消除潜在的聚集和气泡。
- 记录 SAXS 数据。
注: 对于 Nsa1, SAXS 数据记录在每个蛋白质浓度系列前后的缓冲液中。三十三连续扫描 0.3 s 被收集了为 Nsa1FL在集中系列 (1 到6.2 毫克/毫升) 在10° c。 - 对 SAXS 数据执行缓冲区减法。
注意: 对于 Nsa1 的缓冲区减法是在光束自动完成的, 但也可以使用数据缩减软件 (如散布30和 ATSAS 套件31) 来执行缓冲减法。缓冲减法是 SAXS 数据分析的关键部分, 必须注意确保用于减法的缓冲区与蛋白质样本缓冲区相同。 - 平均33连续扫描为每个浓度创建一个 * ave.dat 文件。
注: 叠加33连续帧来比较曲线。随着时间的推移, 散射曲线的变化往往表明辐射的损害。将这些帧从平均值中排除。Nsa1 连续扫描的平均值在女巫光束上自动执行。
- SAXS 数据处理及浓度序列比较
注意: 有几个软件包可以用来分析 SAXS 数据。对于 Nsa1 的回旋半径和对距离分布函数是确定使用博智32和 Gnom33从 ATSAS 2.7.2 套件31和比较所有的蛋白质浓度, 以确保没有辐射损伤或浓度依赖性的颗粒相互作用10。- 打开一个终端外壳, 转到包含 SAXS 数据的目录。
- 从终端 shell 中启动32 GUI。
- 在博智的 GUI 中, 加载散射曲线 (* ave.dat)。
- 使用奥托g确定旋转半径 (Rg) 和向前散射强度 I (0), 为每个散射曲线 (* ave.dat)。
- 为每个散射曲线生成 Kratky 图 (* ave.dat), 以评估压实度。
- 使用 AutoGNOM33计算每个散射曲线 (* ave.dat) 的对分布函数 (也称为 P (r))。输入起始 dmax ≈ 3 * Rg , 并优化 d最大值以获得平滑的 P (r) 曲线。在优化 Dmax期间, 通过检查报告的χ2值并直观地评估与散射曲线的总体拟合, 确保计算出的 P (r) 函数与实验散射曲线一致。
- 使用相关量34计算散射曲线中 Nsa1 的分子量。
- 比较每个浓度的结构参数, 以确保没有辐射损伤或浓度依赖性的影响。
注意: 浓度效应可以表现为一个增加的 Rg和 Dmax相对于增加的蛋白质浓度。前向散射 I (0) 除以样品浓度也应保持恒定的整个蛋白质浓度系列。
- SAXS 建模
注意: 要确定 Nsa1FL的 C 端的位置, Nsa1 晶体结构10 (PDB 5SUM) 和 SAXS 散射曲线用于执行刚体和从头计算建模的组合, 使用程序群 35和集成优化方法 (EOM)36从 ATSAS 软件套件31。Nsa1 的 WD40 域被视为刚体, 而 Nsa1 的 C 端与 WD40 域中的几个无序回路一起被建模, 以适应实验 SAXS 数据。- 生成输入 PDB 文件。每次从主链中丢失剩余时, pdb 文件都必须被拆分, pdb 文件不能包含多个构象、配体或水分子。
- 运行程序 Pre_BUNCH35 , 以便为堆 (Pre_BUNCH. pdb) 准备输入 PDB 文件。输入目标蛋白 (*. seq) 的序列、在4.3.1 中生成的域/pdb 的数目以及上面生成的每个 PDB 文件。
- 使用程序 CRYSOL37计算各个 PDB 文件的散射振幅。运行 CRYSOL 输入单个 PDB 文件和实验 SAXS 散射曲线 (*. dat)。这将生成一个振幅文件 (*. alm)。
- 运行程序束35 , 使用合并的刚体和从头到下方法对 SAXS 数据的 WD40 域进行建模. 输入 Pre_BUNCH (Pre_BUNCH. pdb) 的 pdb 文件、实验 SAXS 散射曲线 (*. dat) 以及由 CRYSOL 生成的每个部分 PDB 文件的单个振幅 (*. alm) 文件。
- 将起始 PDB (5SUM) 的χ2值与从使用实验 SAXS 数据的一组生成的从头开始模型中的数值进行比较.
注意: 成功的一组模型的χ2值应比起始模型低得多。束模型的理论散射还应能很好地描述实验数据, 如通过对 SAXS 数据的理论散射和其χ2值 (图 4) 之间的叠加进行目视检查判断。中心管线)。 - 手动检查 Pymol38中的一组输出文件, 以叠加由束生成的模型和 SAXS 信封 (图 4, 中心管线) 的晶体结构。
- 重新运行束10-20 次以生成独立模型, 以确认模型是否相似。
注意: 对于 Nsa1, 有一个范围的χ2值从 ~ 1 到3从20独立的运行。 - 集成建模
注意: 作为一组可选的方法, 可以运行 EOM36或最小集成搜索39 (MES)。EOM 和 MES 使用集成方法, 这是非常适合的蛋白质与灵活的领域/地区, 在多个构象。- 使用 ATSAS 在线服务器运行 EOM36的程序。要运行 EOM, 请输入4.3.1 的 PDB 文件、目标蛋白序列 (*. seq) 和实验 SAXS 数据 (*. dat)。
- 将起始 PDB (5SUM) 中的χ2值与 EOM 使用实验 SAXS 数据生成的集合中的数值进行比较。
注意: 成功的 EOM 集成应该比起始模型具有显著较低的χ2值。集合的理论散射也应该描述的实验数据, 通过对 SAXS 数据的理论散射和χ2值 (图 4, 右管道)。还应将χ的2值与组和 EOM 进行比较, 以确定哪个模型最能描述实验 SAXS 数据。 - 手动检查 Pymol38中的 EOM 构象, 以覆盖由 EOM 生成的构象 (图 4) 的晶体结构。注意构象的总数和每个 conformer 的占地比例, 这有助于散射曲线。对于更硬的分子, 如 Nsa1, 构象的数量应该是小的 (1-5) (图 4, 右管道)36。
- 重新运行 EOM 几次, 以确保结果一致。
注: 对于 Nsa1, 构象的数量通常是3到 4, χ2值从0.1 到0.3 不等。
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Representative Results
Nsa1 是 PCR 扩增从酿酒酵母基因组 DNA 和亚成一个载体, 其中含有 n-端 6 x-氨酸的亲和标记, 其次是碱性蛋白和 TEV 蛋白酶的网站。Nsa1 被转化成了大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞, 在诱导与 IPTG 和生长25° c (图 1A) 后获得了高的蛋白质表达率。Nsa1 在固定化钴亲和树脂上进行亲和纯化 , 其次是 TEV 蛋白酶的碱性蛋白 , 最后通过大小排斥色谱 (图 1B) 解决。将含有 Nsa1 的大小排斥色谱的分数汇集在一起, 浓缩为8毫克/毫升, 然后用结晶机器人进行结晶试验。初始稀疏矩阵晶体屏幕产生了两种不同的晶体形式的 Nsa1, 立方和正交 (图 2A)。
在立方和正交晶体的优化过程中, 发现正交晶体是由 Nsa1 的蛋白水解裂解产生的。有限的蛋白质水解和质谱法被用来确定 Nsa1 的区域是敏感的蛋白质水解, 并指出, Nsa1 是敏感的浓度梯度蛋白酶弹性酶 (图 2B)。随后的质谱分析证实, 这种降解是由于 Nsa1 C 终点的损失造成的。生成了一系列的 c-端截断 Nsa1, 以去除蛋白水解敏感的 c-末端 (图 2C)。正交晶体可以重复的 Nsa1ΔC (残滓 1-434) 截断, 这是最终用于 SAD 结构的决心。正交晶体也可以重复治疗 Nsa1FL与弹性蛋白酶1小时在4° c 之前, 设置水晶托盘。
立方 Nsa1 晶体的优化使用 Nsa1FL通过混合柠檬酸钠梯度, 加上 microseeding (图 3A)。这产生了大的, 可再生的立方晶体, 衍射极限约2.8 Å分辨率 (图 3C, 左)。正交晶体只能使用 C 终端的 Nsa1 的截断变种进行优化, 通过改变 peg 1500 和 peg 400 的浓度梯度, 再加上 microseeding, 产生的大晶体的衍射极限约1.25 Å分辨率 (图 3 a-c)。Nsa1 的实验阶段是由 Nsa1ΔC10的 SeMet 衍生物 SeMet-SAD 确定的。
Nsa1 的 N 端七叶β螺旋桨 WD40 域在立方和正交晶体结构中都得到了很好的解决, 但两种结构在 Nsa1 的 c-末端都缺乏电子密度。然后用 SAXS 确定了 Nsa1 在溶液中缺失 c-端域的位置。在对数据采集样品浓度进行优化后, 采用了部分原子结构进行刚体建模, 并对缺失分量进行了从头计算重建. 该模型是根据计算所得的散射曲线与实验数据 (图 4, 中心管线) 的拟合的优点来评估的。单 Nsa1 的 WD40 域不是一个很好的实验 SAXS 数据, 证明了实验散射曲线与理论散射曲线之间的差异, 这是由晶体结构 PDB ID 5SUM (图 4产生的,左管道)。除了刚体建模外, 还进行了集成建模。这产生了一个3到4构象的 Nsa1 的合奏, 并导致一个较低的χ2值 (图 4, 右管道)。模型差异的减少 (χ2) 使用集成建模揭示了 Nsa1 c-末端尾在溶液中的构象抽样。
图1。Nsa1 的表达和纯化与 6 x 他的髓鞘融合标记.(A) 对25° c BL21 (DE3) 细胞中的蛋白质表达进行 SDS-页分析, 第一次使用钴亲和树脂纯化步骤。( B ) 具有代表性的大小排斥色谱 TEV 。用 SDS-页分析了大小排斥色谱的组分。收集了含 Nsa1 峰1的分数, 并用于结构分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。Nsa1 的 C 末端对蛋白质水解很敏感.(A) Nsa1 的初始结晶试验产生了两种不同的晶体形式: 立方和正交。紫外显微镜用于验证晶体中是否含有蛋白质。可见光, uv: uv 显微镜。缩放条形图 = 每个窗口中的50µm。(B) 用 SDS 页分析蛋白水解筛查。三稀释 (1:10, 1:100, 1:1000) 为每一个蛋白酶的股票 (0.1, 0.01, 0.001 毫克/毫升) 结合了等分蛋白 (1 毫克/毫升) 将筛选。在37° c 孵育60分钟后, 用 SDS-page 和质谱法对蛋白酶抗性域进行了分析, Nsa1-FL: 新鲜纯化蛋白, Nsa1Δ: 在4° c 下贮存的纯化蛋白3周后, 观察到蛋白质的降解形态。(c) Nsa1 全长 (上部) 和 C 端子截断构造示意图 (下)。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。Nsa1 结晶优化.(a) 从最初的小晶体中制备种子, 用于制作稀释系列 (1x ~ 1/104x) (microseeding)。通过混合1µL 的蛋白质与1µL 稀释的种子库存, 更大的单晶生长在一周内。(B) 沉淀浓度梯度正交晶体优化。(C) 用于数据收集的优化立方和正交晶体。绿色圆圈表示水晶托盘的典型面积产生了数据收集质量晶体。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。Nsa1 SAXS 分析示意图。用于处理 SAXS 数据的管线概述, 并使用束 (中心) 和 EOM (右) 生成模型。左管道显示了实验散射曲线 (红圈, 蛋白质浓度: 6 毫克/毫升) 与理论散射曲线 (蓝线), 这是从晶体结构 PDB ID 5SUM 生成的差异。通过对实验 SAXS 散射曲线 (红圈、蛋白质浓度: 6 毫克/毫升) 与 Nsa1 (黑线) 或 Nsa1 (黑线) EOM 构象的散射曲线的比较, 对模型进行了评价。在每个模型中, WD40 域都显示在绿色的卡通中 (PDB ID 5SUM), 灵活的 C 端显示在红色的球体和绿色, 洋红, 青色, 黄色为个人 EOM 构象。从 EOM 派生的每个 conformer 的分数都标记在模型旁边。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
使用这个协议, 重组 Nsa1 从S. 酿酒酵母是由 X 射线晶体学和 SAXS 的结构研究产生的。Nsa1 在溶液中表现良好, 并以多种晶体形式结晶。在这些晶体的优化过程中, 发现 Nsa1 的 C 端对蛋白酶的降解非常敏感。高分辨率, 正交晶体的形式, 只能与 c 终端的 Nsa1 的截断变种, 可能是因为灵活的 c 总站 Nsa1 防止晶体包装。Nsa1 的结构由 x-射线结晶学解决以高分辨率, 但 C 末端不可能被修造在二者之一水晶形式, 因为它没有被定购。晶体学是在 Nsa1 的大小附近确定大分子的原子解析结构的首放技术, 然而与任何方法一样, 晶体也有一些局限性。晶体学的主要局限性之一是无法解决蛋白质的无序区域40,41。
Nsa1 的 c-终点对于适当核仁蛋白质的定位非常重要, 强调需要研究其结构10。Nsa1 的 c-终点, 是由 SAXS, 一个互补的结构生物学技术, 以 X 射线晶体。SAXS 数据记录了全长 Nsa1 在一个浓度系列。从该浓度序列中确定了 Nsa1 SAXS 数据收集和处理的最佳浓度。SAXS 数据记录为 Nsa1 在 6, 4.5, 和3.0 毫克/毫升。吉尼尔区, P (r) 函数和分子量确定跨浓度系列, 以确保样品是良好的, 而不是聚集在实验条件测试。为了重建 Nsa1 的全长结构, 从部分晶体结构中确定了理论散射振幅, 然后用从头计算方法对柔性 C 末端进行了建模. 从这种混合的方法, 它被确定 Nsa1 的灵活的 C 末端延伸向外从被定购的 WD40 领域。
加工工具的进步推动了 SAXS 在大分子结构研究中的普及。SAXS 测量随机定向蛋白在溶液中的 X 射线散射模式, 提供低分辨率的结构信息, 包括分子质量和整体形状。因此, SAXS 已成为一个强大的正交结构验证工具的结晶学。这主要是由于计算方法的发展计算原子结构的理论散射, 并将它们与实验 SAXS 数据37进行比较。利用这种方法, 可以将晶体晶格中观察到的构象态、第四纪结构和高阶装配与溶液中的粒子结构特征进行比较。此外, X 射线晶体学所确定的高分辨率结构中的无序回路和终点也可以用溶液散射数据进行建模。这种混合结构方法使用晶体结构作为一个构造块, 为 SAXS 引导的失踪残留物的建模, 并已证明是有效的映射的 c-总站的 Nsa110, 以及其他大分子, 如甲型流感病毒 M1基质蛋白42和死盒 RNA 陪护43。先进的 SAXS-based 建模软件也可以解决更复杂的系统, 如内在紊乱的蛋白质, 通过映射这些系统的构象景观使用一系列的构象, 共同贡献的整体散射粒子在溶液中的电位16,39。综合起来, SAXS 的数据收集和处理工具的最新进展有助于成功的混合结构生物学方法, 以对付具有挑战性的生物系统。
解决方案散射与高分辨率结构的结合准备回答有关大分子44的灵活性和动态性的重要问题。许多蛋白质, 例如 Nsa1, 有动态区域是重要的为生物作用。在这份手稿中提供了一个模板协议, 其中详细介绍了 SAXS 与高分辨率结构确定 X 射线晶体学的组合。除了 x 射线晶体学之外, SAXS 还可以用来赞美其他的结构生物学技术, 包括核磁共振、电子顺磁共振 (EPR) 和荧光共振能量转移 (烦恼), 进一步突出 SAXS 的重要性作为一种互补结构生物学技术45,46,47。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
在先进的光子源 (APS), 阿贡国家实验室, 在东南区域协作访问组 (SER CAT) 22 ID 和 22 BM 光束收集了衍射数据。SAXS 数据是收集在女巫光束在先进的光源 (ALS), 劳伦斯伯克利国家实验室。我们要感谢女巫光束的工作人员对远程数据收集和处理的帮助。我们感谢国家环境健康科学研究所 (NIEHS) 质谱研究和支持小组帮助确定蛋白质领域的边界。这项工作得到了美国国立卫生研究院的校内研究项目的支持;美国国家环境健康科学研究所 (NIEHS) (齐亚 ES103247 至 r.e.s.) 和加拿大卫生研究所 (研究院, 146626 至. P)。APS 的使用得到了美国能源部, 科学办公室, 基础能源科学办公室的支持, 合同 No。W-31-109-Eng-38使用先进光源 (ALS) 的支持下, 美国能源部科学办公室, 基础能源科学办公室, 根据合同 No。DE-AC02-05CH11231对女巫 SAXS 光束的额外支持来自国家卫生研究院项目米诺斯 (R01GM105404) 和高端仪器补助金 S10OD018483。我们还要感谢安德里亚. Dr. 和萨拉. 安德斯对这份手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
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