Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Denna metod beskriver kloning, uttryck och rening av rekombinant Nsa1 för strukturella bestämning av röntgenkristallografi och small-angle X-ray scattering (SAXS), och är tillämplig för hybrid strukturell analys av andra proteiner som innehåller både beställde och andningsstörningar domäner.

Abstract

Bestämning av Ribosomen församlingen faktor Nsa1 från Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fullängds struktur är utmanande på grund av den oordnade och proteashämmare labila C-terminus av protein. Detta manuskript beskrivs metoder för att rena rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturanalys av både röntgenkristallografi och SAXS. Röntgenkristallografi utnyttjades för att lösa strukturen av Nsa1 välordnad N-terminala WD40 domän, och sedan SAXS användes för att lösa C-terminus av Nsa1 struktur i lösning. Lösning scattering data samlades in från fullängds Nsa1 i lösning. De teoretiska scattering amplituderna beräknades från högupplösta kristallstrukturen i WD40 domänen, och sedan en kombination av stel kropp och rättsverkan modellering visade C-terminus av Nsa1. Genom denna hybrid strategi rekonstruerades den Kvartära strukturen av hela proteinet. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för hybrid strukturella bestämning av andra proteiner som består av en blandning av strukturerad och ostrukturerad domäner.

Introduction

Ribosomer är stora ribonukleoprotein maskiner som utför viktiga roll att översätta mRNA till proteiner i alla levande celler. Ribosomerna består av två subenheter som produceras i en komplex process som kallas ribosom biogenes1,2,3,4. Eukaryota Ribosomen församling är beroende av hjälp av hundratals väsentliga ribosomal församlingen faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tillhörande 1) är en faktor av eukaryota Ribosomen-församlingen som särskilt krävs för produktionen av den stora ribosomal subunit6, och är känd som WD-repeat som innehåller 74 (WDR74) i högre organismer7. WDR74 har visat sig krävas för blastocyst bildandet i möss8och WDR74 arrangören är ofta muterad i cancer celler9. Funktion och exakta mekanismer av Nsa1/WDR74 i Ribosomen församling är dock fortfarande till stor del okända. Till att börja med att avslöja Nsa1/WDR74 roll under eukaryota Ribosomen mognad utfördes flera strukturella analyser, inklusive röntgenkristallografi och små angle X-ray scattering (SAXS)10.

Röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, elektronmikroskopi och SAXS finns alla viktiga tekniker för att studera makromolekylära struktur. Storlek, form, tillgänglighet och stabilitet av makromolekyler influenser strukturbiologi metoden som en särskild makromolekyl blir bäst lämpade, men kombinerar flera tekniker genom en s.k. ”hybrid” strategi blir en allt mer fördelaktigt verktyg11. Röntgenkristallografi och SAXS är särskilt kraftfull och kompletterande metoder för strukturella bestämning av makromolekyler12.

Kristallografi ger högupplösta atomära strukturer alltifrån små molekyler till stora cellulära maskineriet såsom Ribosomen, och har lett till många genombrott i förståelsen av de biologiska funktionerna av proteiner och andra makromolekyler13. Dessutom utnyttjar strukturbaserad design kraften i kristallen strukturerar för molekylär dockning av beräkningsmetoder, lägga till en kritisk dimension i drug discovery och utveckling14. Trots dess breda tillämplighet är flexibel och oordnade system utmanande att bedöma av kristallografi sedan crystal packning kan hindras eller electron densitet kartor kan vara ofullständig eller av dålig kvalitet. Omvänt, SAXS är en lösning-baserade och lågupplösta strukturell strategi kan beskriva flexibla system alltifrån oordnade loopar och termini till egensäkra oordnade proteiner12,15,16. Med tanke på den är kompatibel med ett brett spektrum av partikel storlekar12, kan SAXS arbeta synergistiskt med kristallografi att öka utbudet av biologiska frågor som kan lösas av strukturella studier.

Nsa1 är lämplig för en hybrid strukturell strategi eftersom det innehåller en väl strukturerad WD40 domän följt av en funktionell, men flexibel C-terminus som inte är mottagliga för röntgenkristallografi metoder. Följande är ett protokoll för kloning, uttryck och rening av S. cerevisiae Nsa1 för hybrid strukturella bestämning av röntgenkristallografi och SAXS. Detta protokoll kan anpassas för att studera strukturerna av andra proteiner som består av en kombination av beställda och störda områden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. rekombinant proteinproduktion och rening av Nsa 1

  1. Nsa1 uttryck Plasmid Design och kloning
    1. Få eller köpa S. cerevisiae genomiskt DNA.
    2. PCR förstärker de mål sekvenserna av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) och C-terminal trunkeras Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med lämplig grundfärg med genomiskt DNA isolerade från S. cerevisiae och en smälttemperatur cirka 60 ° C med en förlängning på 1-2 min. Följande grundfärger användes för att förstärka Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 in den Escherichia coli (E. coli) uttryck vektor pHMBP som innehåller en N-terminal 6 X-histidin tag följt av maltos bindande Protein (MBP) och en tobak Etch Virus (TEV) proteas webbplats med kloning standardtekniker17 .
    4. Använda DNA sekvensering för att verifiera att Nsa1 har klonats i ram med N-terminala hans-MBP etiketten.
  2. Nsa1 proteinuttryck
    1. Omvandla den uttryck plasmid(s) till en lämplig E. coli uttryck stam med en T7 promotorn-baserade system. Tavla av transformants på LB agarplattor som innehåller 100 µg/mL ampicillin och inkubera plattan inverterad över natten vid 37 ° C.
    2. Inokulera en 50 mL kultur av LB med 100 µg/mL ampicillin från omvandling plattan och odla den över natten med skakningar vid 200 rpm vid 37 ° C.
    3. Inokulera 3 x 1000 mL LB i Fernbach kolvar med 100 µg/mL ampicillin med 15 mL av övernattning kultur och odla den med skakningar vid 200 rpm vid 37 ° C.
      Obs: För protein struktur lösning, selenomethionyl (SeMet) införlivandet kan uppnås genom att odla cellerna i M9 minimalmedium som kompletteras med SeMet och en aminosyra blandning för att hämma metionin produktionen före induktion, i motsats till LB media 18.
    4. Inducera uttryck av Nsa1 när OD600 når ~0.8 genom tillsats av isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) med en slutlig koncentration på 1 mM följt av inkubation vid 25 ° C över natten med skakningar vid 200 rpm.
    5. Skörda celler genom centrifugering vid 4 ° C i 15 min på 5 050 x g.
      Obs: Celler kan lagras långsiktigt vid-80 ° C eller användas omedelbart för protein rening.
  3. Nsa1 Protein rening
    1. Att resuspendera cellerna i 25 mL lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM MgCl2) före kyld vid 4 ° C som innehåller en EDTA-fria proteas hämmare tablett.
    2. Lysera celler av ultraljudsbehandling vid 4 ° C (tid 7 min, 2 s på cykel, 2 s off cykel; amplitud: 70%).
    3. Klargöra lysate genom centrifugering vid 26,900 x g i 45 min vid 4 ° C.
    4. Tillämpa förtydligas lysate till en gravitation flöde kolumn laddad med 10 mL av immobiliserade kobolt affinitet harts, pre jämviktas med lyseringsbuffert.
    5. Tillåta supernatanten att passera över kådan av gravitation flöde vid 4 ° C och tvätta kådan två gånger med 100 mL lyseringsbuffert.
    6. Eluera Nsa1 med 20 mL eluering buffert (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol och 200 mM Imidazol).
    7. Ta 15 μL av eluatet och köra det på en 4-15% SDS-PAGE gel att verifiera att proteinet elueras från affinitet kådan (figur 1A).
    8. Ta bort taggen MBP av TEV proteas matsmältning. Tillsätt 1 mL TEV proteas19 (1 mg/mL lager) till Nsa1 affinitet harts eluering och inkubera det vid 4 ° C över natten.
    9. Koncentrat MBP avspjälkar Nsa1 till ~ 5 mL med en centrifugal filter med en molekylvikt skär bort 10 kDa.
    10. Tillämpa MBP-avspjälkar Nsa1 till en kolumn av gelfiltrering pre jämviktas i buffert (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% glycerol och 1 mM β-merkaptoetanol) (figur 1B).
    11. Analysera kolumn fraktioner från gelfiltrering Kontrollera att MBP är klyvs och separerade från Nsa1 genom att köra 15 μL prov på en 4-15% SDS-PAGE gel (figur 1B).
    12. Kombinera fraktioner som innehåller Nsa1 och koncentrera till 8 mg/mL med en centrifugal filter med en molekylvikt som skär bort 10 kDa.
    13. För att bestämma proteinkoncentration genom att mäta absorbansen vid 280 nm på en spektrofotometer som använder utrotning koefficient 42530 M–1cm–1. Använda protein omedelbart för proteolytiska screening och kristallisering prövningar.

2. kristallisation och proteolytiska Screening av Nsa 1

  1. Sparse Matrix Crystal Screening av Nsa1
    1. Centrifugera 500 μL av 8 mg/mL beståndet av Nsa1 vid 16 000 x g vid 4 ° C i 10 min.
    2. Setup kristallisering prövningar med hjälp av en kristallisering robot och gles matris crystal skärmar. Fyll behållaren i 96 väl brickor med 30 μl av enskilda crystal skärm reagenser från gles matris kristallisering skärmar. Setup sittande droppar med roboten genom att blanda 250 nL av väl lösningen med 250 nL protein lösning.
    3. Försegla kristallisering plattorna med tejp och inkubera dem vid 25 ° C.
    4. Inspektera plattorna varannan dag de första 2-3 veckor med ett stereomikroskop.
    5. Kontrollera att eventuella kristaller träffar innehåller protein med UV Mikroskop.
      Obs: För Nsa1 två olika crystal former (kubisk och Ortorombiska, figur 2A) erhölls inom 1 vecka från följande skärmar: JCSG + condition B11 (1.6 M natriumcitrat tribasisk torka, pH 6,5) och guiden fällningsmedel Synergy skärm Block 2 villkor C11 (20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400, 0.1 M Tris HEPES/natriumhydroxid, pH 7.5).
  2. Proteolytiska Screening
    Obs: Under kristallisering optimering, det upptäcktes att de Ortorombiska kristallerna av Nsa1 uppstod till följd av proteolytisk klyvning och kristallerna kan inte dupliceras med fullängds proteinet. Använda en kombination av begränsad proteolys i kombination med masspektrometri, bestämdes det att C-terminus av Nsa1 var känsliga för proteolys och borttagning av C-terminal svansen krävdes för efterföljande reproduktion av Ortorombiska crystal form ( Nsa1ΔC).
    1. Förbereda 1 mg/mL proteas stamlösningar av följande proteaser α-chymotrypsin, trypsin, elastase, papain, subtilisin och endoproteinase Glu-C.
    2. Skapa 1:10, 1: 100 och 1: 1000 utspädningar av varje 1 mg/mL proteas bestånd med förtunningsbuffert (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM natriumklorid).
    3. Pipettera 1 μL av proteashämmare materiel (1:10, 1: 100 och 1: 1000) i 9 μl portioner protein (1 mg/mL) för varje proteas som skall kontrolleras.
    4. Inkubera lösningen vid 37 ° C i 1 h.
    5. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 μL av 2 x SDS-PAGE prov buffert och värme reaktionen vid 95 ° C i 5 min.
    6. Analysera smälter genom att köra dem på en 4-15% SDS-PAGE gel (figur 2B).
    7. Identifiera proteasresistenta domäner av målproteinet genom i-gel masspektrometri analys.
    8. Ta bort proteas-labila regioner från målproteinet genom att skapa trunkerade uttryck konstruktioner och efter kloning, uttryck och rening protokollet beskrivs ovan.
  3. Kristallisering optimering
    1. Förbereda eller erhålla stamlösningar av följande inledande kristallisering reagenser: 1.6 M natriumcitrat tribasisk torkar 100%(v/v) PEG 400, 1 M HEPES/natriumhydroxid, 50%(v/v) PEG 1500, pH 6,5, pH 7,5.
    2. Förbereda en stamlösning av Nsa1FL och Nsa1ΔC på 8 mg/mL enligt ovan.
    3. Optimera de Nsa1 kubiska kristallerna (Nsa1FL).
      1. Förbereda en 24-väl rutnät skärm med brunnar innehållande 500 µL med en lutning av 1-1,6 M av natriumcitrat med pH 6,5 från en stamlösning av 1,6 M natriumcitrat tribasisk med pH 6,5.
      2. Blanda 1 µL av protein med 1 µL väl lösningen och Häll blandningen i en silikoniserad cover bild. Invertera täcka bilden ovanpå den pre smord väl och se till att den försluts noggrant väl men var noga med att inte störa droppen eller bryta täcka bilden. Upprepa denna process tills facket fylls och sedan förvaras vid 25 ° C.
        Obs: Små kubiska kristaller bör visas i 2-7 dagar.
      3. Förbereda ett microseed lager av de kubiska kristallerna. Använda en monterad nylon slinga för att överföra ~ 10 små kubiska kristaller till ett 1,5 mL mikro-centrifugrör som innehållande en liten pärla och 50 µL 1,6 M natriumcitrat tribasisk wit pH 6,5.
      4. Vortex 1,5 mL mikro-centrifugröret med hög hastighet (~ 3000 rpm) för 1 min.
      5. Göra en serie av 10-faldig seriespädningar av utsäde beståndet med 1,6 M natriumcitrat tribasisk och vortex blandningen grundligt i 5 s.
      6. Fylla varje väl av ett 24-väl rutnät, skärm med 500 µL 1,6 M natriumcitrat tribasisk pH 6,5.
      7. Optimera de microseeding villkor genom att ställa in droppar med varierande förhållanden av protein med startkulturer lösningar (figur 3A). Större kubiska kristaller av hög diffraktion kvalitet bör visas i 2-5 dagar (figur 3 c).
    4. Optimera Ortorombiska kristaller (Nsa1ΔC)
      1. Förbereda en grid skärm med 500 µL i varje brunn med 24 olika förutsättningar (figur 3B) från stamlösningar av 50%(v/v) PEG 1500 och 100%(v/v) PEG 400. Utöver lutningar på PEG 1500 och PEG 400, bör var väl också innehålla 0,1 M HEPES, natrium hydroxid pH 7,5.
      2. Blanda 1 µL protein lösning med 1 µL väl lösning på en silikoniserad cover bild. Noggrant är Invertera täcka bilden ovanpå den pre smord väl och se till att den väl förslutna. Upprepa denna process tills hela facket har fyllts. Förvara magasinen vid 25 ° C.
        Obs: Nsa1 Ortorombiska kristaller bör visas i 2-7 dagar.
      3. Ytterligare optimera Ortorombiska kristaller av microseeding som beskrivs för de kubiska kristallerna (steg 2.3.3.3 till 2.3.3.7) med 500 µL av 20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400 och 0,1 M HEPES, natrium hydroxid pH 7.5 som väl lösningen.
        Obs: Nsa1 SeMet kristaller bör optimeras analoga med de infödda kristallerna.

3. röntgendiffraktion datainsamling och Nsa 1 strukturera lösning

  1. Cryo-skydd av kristaller och röntgendiffraktion datainsamling
    1. För de Ortorombiska kristallerna (Nsa1ΔC), förbereda en 1 mL frysskyddmedel lösning innehållande 22.5%(v/v) PEG 1500, 15%(v/v) PEG 400 och 0,1 M HEPES, natrium hydroxid pH 7,5.
    2. Fyll en skum Dewar med flytande kväve och pre cool en crystal puck. Försiktig när du arbetar med flytande kväve och Använd skyddshandskar och skyddsglasögon.
    3. Noggrant Invertera täcka bilden av kristalliseringen brunn innehållande kristaller på scenen av ett stereomikroskop.
    4. Pipettera 2 µL av den frysskyddmedel lösningen på en ny cover bild.
    5. Fäst en monterad nylon slinga av lämplig storlek för kristallen en magnetisk cryo trollstav.
    6. Med hjälp av stereomikroskopet, snabbt överföra en kristall till frysskyddmedel lösningen med monterade cryo slingan.
    7. Låt kristallen låt jämvikta i 5 min i frysskyddmedel lösningen.
    8. Med hjälp av stereomikroskopet, snabbt loop crystal från frysskyddmedel lösning och plunge-frysa i flytande kväve.
    9. Vänta på den flytande kvävgasen runt öglan för att stoppa kokande och släpp sedan slingan från röret till en specifik plats inom crystal pucken.
    10. Kubisk Nsa1FL kristaller behöver inte vara cryoprotected och kan vara direkt blixt fryst (följande steg 3.1.8-3.1.9 ovan).
    11. Försegla crystal pucken med cryo verktyg och överföra till frakt käpp i en pre kylda dewar. Lagra kristaller i de puckar/dewars tills datainsamling.
    12. Om insamling av uppgifter på en synchrotron, leverera kristaller att de synkrotron använder en torr avlastare.
    13. Samla in röntgendiffraktion data efter standardtekniker20.
      Obs: För Nsa1 inföding och SAD (singel-våglängd avvikande dispersion) datamängder samlades på 100 K på raderna SER-CAT beam 22-ID och 22-BM Advanced Photon källan vid Argonne National Laboratory (Chicago, IL). SAD Nsa1 datamängden samlades vid λ = 0.97911 Å. Data spelades in med hjälp av en 1 s exponeringstid och 0,5 ° svängningar. Mosaicity av dessa kristaller var vanligtvis runt 0,3 °.
    14. Bearbeta och skala röntgendiffraktion bilderna för att skapa reflektion-filer för varje datamängd i gruppen lämpligt utrymme.
      Obs: Nsa1 diffraktion datamängder bearbetades med HKL200021. De Nsa1 kubiska kristallerna bearbetades i rymden grupp P213 och Ortorombiska kristaller bearbetades i rymden grupp P212121.
  2. Nsa1 struktur lösning.
    Obs: Det finns flera kristallografi programpaket som kan användas för att lösa och förfina kristallstrukturer inklusive Phenix och CCP422,23. Följande är protokollet för Nsa1 struktur lösning med Phenix programvara suite22.
    1. Analysera de infödda och SAD skalas datamängder med phenix.xtriage22.
    2. Lösa strukturen av Nsa1 med Phenix.autosol med den SORGLIGA peak speglar fil22,24. För att köra programmet för AutoSol, mata in antalet selenometionin webbplatser (webbplatser = 9), fasta sekvens fil Nsa1ΔC, och våglängden används för SORGLIGT datainsamling (λ = 0.97911 Å).
      Obs: Från Nsa1 SAD datamängden, phenix.autosol bör kunna bestämma experimentella faser och bygga de flesta av modellen.
    3. Göra manuella justeringar till modellen med sothöna25, följt av förfining i phenix.refine22,26.
    4. Lösa strukturen för högupplösta infödda Ortorombiska kristallen och kubisk kristall genom molekylär ersätter använder Phaser27,28.
    5. Efter framgångsrika struktur lösning, inspektera modellen och elektrontätheten karta i sothöna25.
    6. Bygga och förfina strukturerna genom att köra iterativ rundor av förfining i phenix.refine22,26 och modellbygge i sothöna25.

4. SAXS datainsamling, bearbetning och modellering

  1. SAXS Data Collection
    Obs: SAXS data registrerades för fullängds S. cerevisiae Nsa1 på avancerade ljuskälla, på den hög genomströmning SIBYLS beamline 12.3.1 vid Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Rena Nsa1FL efter det protokoll som beskrivs ovan. 24 h före transporten av Nsa1FL till den beamline, kör protein över en gel filtrering kolumn före jämviktas i buffert A.
    2. Pool fraktioner som innehåller Nsa1 och bestämma proteinkoncentration som tidigare beskrivits.
    3. Förbereda 30 μl alikvoter av en koncentration serie Nsa1 från 1 6,2 mg/ml med hjälp av buffert A.
    4. Överför 20 μl av varje koncentration Nsa1 till en tydlig full kjol 96 väl mikroplattan tillsammans med buffert A ensam kontroller.
      Obs: SAXS data samlas in på utspädda lösningar med flera koncentrationer av renat provet för att undvika aggregering, mellan partikel repulsion och strålning skada effekter.
    5. Försegla mikroplattan med en silikon tätning matta och fartyget över natten vid 4 ° C till beamline.
    6. Lagra mikroplattan vid 4 ° C tills datainsamling.
    7. Omedelbart före datainsamlingen, snurra plattan vid 3200 x g i 10 minuter vid 4 ° C ta bort potentiella aggregat och luftbubblor.
    8. Registrera SAXS data.
      Obs: För Nsa1, SAXS data registrerades för bufferten före och efter varje protein koncentration serie. Trettiotre på varandra följande skanningar av 0,3 s samlades för Nsa1FL över en koncentration serie (1 till 6,2 mg/mL) vid 10 ° C.
    9. Utföra buffert subtraktion för SAXS data.
      Obs: För Nsa1 buffert subtraktion gjordes automatiskt på beamline men buffert subtraktion kan också utföras med data programvara såsom Scatter30 och den ATSAS Svit31. Buffert subtraktion är en kritisk del av SAXS dataanalys och försiktighet måste iakttas för att säkerställa att den buffert som används för subtraktion är identisk med protein prov bufferten.
    10. Genomsnittliga de på varandra följande 33 File för att skapa en *ave.dat-fil för varje koncentration.
      Obs: Överlagra de 33 bildrutorna för att jämföra kurvorna. Ändringar i scattering kurvorna över tid är ofta tyder på strålskador. Undanta dessa ramar från i genomsnitt. Genomsnitt av Nsa1 på varandra följande skanningar utfördes automatiskt på den SIBYLS beamline.
  2. SAXS databehandling och jämförelse av koncentration-serien
    Obs: Det finns flera programpaket som kan användas för att analysera SAXS data. För Nsa1 radien av gyration och parvisa avstånd distribution funktioner fastställdes med hjälp av PRIMUS32 och Gnom33 från ATSAS 2.7.2 Svit31 och tvärsöver alla protein koncentrationer till att fanns ingen strålning skada eller koncentrationsberoende mellan partikel interaktioner10.
    1. Öppna en terminal skal och gå till den katalog som innehåller SAXS data.
    2. Starta den PRIMUS32 GUI från inom terminal skalet.
    3. Inom PRIMUS GUI, Ladda scattering kurvorna (* ave.dat).
    4. Använda AutoRg att bestämma radien av Gyration (Rg) och vidarebefordra scattering intensitet I(0), för varje scattering kurva (* ave.dat).
    5. Generera Kratky tomter för varje scattering kurva (* ave.dat), för att utvärdera graden av kompakthet.
    6. Använda AutoGNOM33 för att beräkna den parvisa fördelningsfunktionen (även kallad P(r)) för varje scattering kurva (* ave.dat). Ange en start Dmax ≈ 3 * Rg och optimera Dmax värdet för att få en jämn P(r) kurva. Under optimering av Dmax, se till att den beräknade P(r) funktion är förenlig med experimentella scattering kurvan genom att kontrollera värdet rapporterade χ2 och att visuellt bedöma den totala passar scattering kurva.
    7. Beräkna molekylvikt Nsa1 från scattering kurvorna med volymen av korrelation34.
    8. Jämför de strukturella parametrarna för varje koncentration att säkerställa att det finns inga strålskador eller koncentrationsberoende effekter.
      Obs: Koncentration effekter kan manifesteras som en ökande Rg och Dmax i förhållande till en ökande proteinkoncentration. Framåt spridning I(0) dividerat med prov koncentrationen bör också förbli konstant olika protein koncentration serier.
  3. SAXS modellering
    Obs: För att bestämma positionen för C-terminus av Nsa1FL, de Nsa1 kristall struktur10 (PDB 5SUM) och SAXS scattering kurvorna användes att utföra en kombination av stel kropp och rättsverkan modellering, använder programmen gäng 35 och Ensemble optimering metod (EOM)36 från ATSAS software suite31. WD40 domän Nsa1 behandlades som en stel kropp, medan C-terminus av Nsa1 tillsammans med flera oordnade loopar från domänen WD40 var modelleras för att passa den experimentella SAXS data.
    1. Generera de ingående PDB-filerna. PDB-filen måste delas varje gång rester saknas från huvudkedjan och PDB-filen kan inte innehålla flera konformationer, ligander, eller bevattna molekylar.
    2. Kör programmet Pre_BUNCH35 att förbereda PDB indatafilen gäng (pre_bunch.pdb). Ange sekvensen av målproteinet (*.seq), antalet domäner/PDBs genereras i 4.3.1, och var och en av de enskilda PDB-filerna genereras ovan.
    3. Beräkna spridningen amplituderna för varje enskild PDB-fil med hjälp av programmet CRYSOL37. Att köra CRYSOL input enskilda PDB-filen och experimentella SAXS scattering kurvan (*.dat). Detta kommer att generera en fil för amplituder (* .alm).
    4. Kör programmet gäng35 att modellera WD40 domän Nsa1 mot SAXS data med hjälp av ett kombinerat tillvägagångssätt och stela kropp och rättsverkan . Ingång PDB-filen från Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), experimentell SAXS scattering kurvan (*.dat) och enskilda amplituden (* .alm) filer för varje partiell PDB fil som genereras av CRYSOL.
    5. Jämför χ2 värdet från den Start PDB (5SUM) med det från rättsverkan modell genereras av gäng med hjälp av experimentell SAXS data.
      Obs: En framgångsrik gäng modell bör ha en betydligt lägre χ2 värde än start-modellen. Teoretiska spridningen av gäng modellen bör också beskriva bra experimentella data som bedöms av okulärbesiktning av överlägget mellan teoretiska spridningen av gäng modell till SAXS data och dess χ2 -värde (figur 4, Center pipeline).
    6. Inspektera manuellt utdatafiler från gäng Pymol38 radarbild kristallstrukturen med den modell som genereras av gäng och SAXS kuvertet (figur 4, mitten pipeline).
    7. Kör gäng 10 - 20 gånger att generera oberoende modeller för att bekräfta att modellerna är liknande.
      Obs: För Nsa1 fanns ett värdeintervall χ2 från ~ 1 till 3 från 20 oberoende körningar.
    8. Ensemble modellering
      Obs: som ett tillval till gäng som kör antingen EOM36 eller Minimal Ensemble Sök39 (MES). EOM och MES använda ensemble tillvägagångssätt, som är väl lämpade för proteiner med flexibla domäner/regioner som finns i flera konformationer.
      1. Kör programmet EOM36 med hjälp av ATSAS online server. För att köra EOM, ingång PDB filer från 4.3.1, sekvensen av målproteinet (*.seq), och experimentella SAXS data (*.dat).
      2. Jämföra χ2 värden från den Start PDB (5SUM) med det från ensemblen genereras av EOM använder experimentella SAXS data.
        Obs: En framgångsrik EOM ensemble bör ha en betydligt lägre χ2 värde än start-modellen. Teoretiska spridningen av ensemblen bör också beskriva bra experimentella data som bedöms av okulärbesiktning av överlägget mellan teoretiska spridningen av ensemblen till SAXS data och dess χ2 -värde (figur 4, höger pipeline). Man bör också jämföra χ2 värden från gäng och EOM för att avgöra vilken modell som är bästa beskriver experimentella SAXS data.
      3. Manuellt inspektera de EOM konformationer Pymol38 för att överlagra kristallstrukturen med de konformationer som genereras av EOM (figur 4). Observera det totala antalet konformationer och fraktionen av beläggningen för varje conformer som bidrar till spridning kurvan. För styvare molekyler, såsom Nsa1, antalet konformationer bör vara liten (1-5) (figur 4, rätt pipeline)36.
      4. Kör igen EOM flera gånger för att säkerställa konsekventa resultat.
        Obs: För Nsa1 antalet konformationer var vanligtvis 3 till 4 med χ2 värden i intervallet från 0,1 till 0,3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nsa1 var PCR amplifierats från S. cerevisiae genomiskt DNA och subcloned i en vektor innehållande en N-terminal 6 x-histidin affinitet tagg följt av MBP och en TEV proteas webbplats. Nsa1 förvandlades till E. coli BL21(DE3) celler och hög avkastning i proteinuttryck erhölls efter induktion med IPTG och tillväxt vid 25 ° C över natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renat på immobiliserade kobolt affinitet harts, följt av MBP klyvning med TEV proteas och slutligen lösas genom storlek utslagning kromatografi (figur 1B). Fraktioner från storlek utslagning kromatografi innehållande Nsa1 var poolade, koncentrerad till 8 mg/mL och sedan används för kristallisering prövningar med en kristallisering robot. Inledande sparse matrix crystal skärmar gav två olika crystal former av Nsa1, kubisk och Ortorombiska (figur 2A).

Under optimering av kubik och Ortorombiska kristaller upptäcktes det att de Ortorombiska kristallerna uppstod som ett resultat av proteolytisk klyvning av Nsa1. Begränsade proteolys och masspektrometri användes för att bestämma regionen i Nsa1 som var känslig för proteolys och det observerades att Nsa1 var känslig för en koncentration gradient av proteas elastase (figur 2B). Efterföljande masspektrometri analys bekräftat att denna nedbrytning resulterade från förlust av C-terminus av Nsa1. En serie av C-terminal truncations av Nsa1 genererades, ta bort proteolytiska känsliga C-terminus (figur 2 c). Ortorombiska kristaller kunde upprepas med Nsa1ΔC (rester 1-434) avkortas, som användes i slutändan för SORGLIGT strukturbestämning. Ortorombiska kristaller kunde också upprepas genom att behandla Nsa1FL med elastase 1 timme vid 4 ° C före inrättandet av crystal brickor.

De kubiska Nsa1 kristallerna var optimerad använder Nsa1FL genom en kombination av natriumcitrat övertoningar, tillsammans med microseeding (figur 3A). Detta gav stora, reproducerbara kubiska kristaller, med en gräns på cirka 2,8 Å upplösning (figur 3 c, vänster). Ortorombiska kristaller kunde endast optimeras med C-terminal trunkering varianter av Nsa1, genom varierande koncentration Övertoningarna PEG 1500 och PEG 400, kombinerat med microseeding, som gett stora kristaller med en gräns på cirka 1,25 Å upplösning (Figur 3A-C). Experimentella faser av Nsa1 bestämdes genom SeMet-SAD från ett SeMet-derivat av Nsa1ΔC10.

N-terminala sju-bladig β-propeller WD40 domän Nsa1 var väl löst i båda kubik och Ortorombiska kristall strukturerar, men båda strukturer saknade elektrontätheten för C-terminus av Nsa1. SAXS användes sedan för att bestämma positionen för saknas C-terminal domän Nsa1 i lösning. Efter optimering av provets koncentration för datainsamling användes delvis atomens struktur att utföra styv-body modellering och generera en rättsverkan rekonstruktion av de saknade komponenterna. Modellen utvärderades i form av godhet passform för beräknade scattering kurvorna till experimentella data (figur 4, mitten pipeline). WD40 domän Nsa1 ensam inte är en bra passform för experimentella SAXS data, vilket framgår av diskrepans mellan experimentell scattering kurvan med den teoretiska scattering kurvan, som genererades från kristallen strukturerar PDB-ID 5SUM (figur 4, vänstra pipeline). Utöver styv-body modellering utfördes också ensemble modellering. Detta produceras en ensemble av 3 till 4 konformationer av Nsa1 och resulterade i en lägre χ2 -värde (figur 4, rätt pipeline). Minskningen av modell diskrepans (χ2) med hjälp av ensemble modellering avslöjade konfirmerande provtagning av Nsa1 C-terminal svansen i lösning.

Figure 1
Figur 1. Uttryck och rening av Nsa1 med en 6 X-hans-MBP fusion tagg. (A) SDS-PAGE analys av protein uttrycket i BL21 (DE3) celler vid 25 ° C under natten och den första reningssteg använda kobolt affinitet harts. B representativa storlek utslagning kromatogrammet efter TEV klyvning. Fraktionerna från storlek utslagning kromatografi analyserades av SDS-PAGE. Fraktionerna från peak 1 innehållande Nsa1 samlades in och används för strukturanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. C-terminus av Nsa1 är känslig för proteolys. (A) inledande kristallisering prövningar av Nsa1 gav två olika kristaller former: kubik och Ortorombiska. UV Mikroskop användes för att kontrollera att kristallerna innehöll protein. Vis: Synligt ljus, UV: UV Mikroskop. Skalstapeln = 50 µm i varje fönster. (B) proteolytiska screening analyseras av SDS-PAGE. Tre utspädningar (1:10, 1: 100, 1: 1000) för varje proteas bestånd (0,1, 0,01, 0,001 mg/mL) kombinerades med alikvoter av protein (1 mg/mL) som skall kontrolleras. Proteasresistenta domäner analyserades de av SDS-PAGE och masspektrometri efter 37 ° C inkubation i 60 min. Nsa1-FL: färska renat protein, Nsa1Δ: renat protein lagras vid 4 ° C i 3 veckor varefter en försämrad form av proteinet observerades. (C) schematiska diagram över Nsa1 fullängds (övre) och C-terminal trunkering konstruera (nedre). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Nsa1 kristallisering optimering. (A) en startkultur utarbetades från inledande små kristaller och används för att göra en spädningsserien (1 x ~ 1/104x) (microseeding). Genom att blanda 1 µL av protein med 1 µL av den utspädda startkulturer, växte de större enkristaller inom en vecka. (B) fällningsmedel koncentrationsgradient för Ortorombiska crystal optimering. (C) optimerad kubik och Ortorombiska kristaller används för datainsamling. Gröna cirklar visar området typiska crystal fack som gett datainsamling kvalitet kristaller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Schematisk bild av Nsa1 SAXS analys. Översikt över rörledningen används för att behandla SAXS data och generera modeller med gäng (mitten) och EOM (höger). Rörledningen vänster visar skillnaden mellan experimentell scattering kurvan (röda cirklar, proteinkoncentration: 6 mg/mL) med teoretiska scattering curve (blå linje), som har genererats från kristallstrukturen PDB-ID 5SUM. Modellerna har utvärderats genom att jämföra den experimentella SAXS scattering kurvan (röda cirklar, proteinkoncentration: 6 mg/mL) med scattering kurvan härrör från gäng modell av Nsa1 (svart linje) eller de EOM konformationer av Nsa1 (svart linje). I varje modell visas WD40 domänen i tecknad färgade i grönt (PDB-ID 5SUM), flexibla C-terminus visas i kulor färgade i rött för gäng och grön, magenta, cyan och gult för de enskilda EOM konformationer. Fraktionen av varje conformer som härrör från EOM är märkt bredvid modellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användning av detta protokoll, genererades rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturella studier av både röntgenkristallografi och SAXS. Nsa1 var skötsam i lösning och kristalliserade i flera crystal former. Under optimering av dessa kristaller upptäckte att C-terminus av Nsa1 var känsliga för proteas nedbrytning. Den höga upplösningen, ortorombiskt kristallform kunde endast dupliceras med C-terminal trunkering varianter av Nsa1, sannolikt eftersom flexibla C-terminus av Nsa1 hindrade crystal packning. Strukturera av Nsa1 löstes genom röntgenkristallografi till hög upplösning, men C-terminus kunde inte byggas antingen kristalliserat eftersom det inte var beställt. Kristallografi är premiere tekniken för bestämning av makromolekyler runt om storleksanpassa av Nsa1, strukturer på atomär upplösning men som med någon metod, kristallografi har vissa begränsningar. En av de stora begränsningarna av kristallografi är oförmågan att lösa oordnade regioner av proteiner40,41.

C-terminus av Nsa1 är viktigt för korrekt nukleolära lokalisering av proteinet, vilket understryker behovet av att studera dess struktur10. C-terminus av Nsa1, löstes genom SAXS, en kompletterande strukturbiologi teknik till röntgenkristallografi. SAXS data spelades för fullängds Nsa1 över en koncentration-serie. Från denna koncentration serie bestämdes den optimala koncentrationen för Nsa1 SAXS datainsamling och bearbetning. SAXS data registrerades för Nsa1 på 6, 4.5 och 3,0 mg/mL. Guinier regionen, P(r) funktion och molekylvikt fastställdes olika koncentration serier att se till att provet var skötsamma och inte aggregerade på experimentella villkor som testas. För att rekonstruera Nsa1 fullängds struktur, teoretiska scattering amplituden fastställdes från partiell kristallstrukturen och sedan rättsverkan metoder användes för att modellera flexibla C-terminus. Från denna hybrid strategi bestämdes det att flexibla C-terminus av Nsa1 sträcker sig utåt från domänen beställda WD40.

Framsteg inom bearbetning verktyg har drivit SAXS popularitet för makromolekylära strukturella studier. SAXS mäter X-ray scattering mönstret från slumpmässigt orienterade protein i lösningen att ge lågupplösta strukturell information, inklusive molekylärt samlas och den övergripande formen. Följaktligen har SAXS vuxit fram som ett kraftfullt ortogonala struktur valideringsverktyg för crystallography. Detta beror till stor del på utvecklingen av beräkningsvetenskapliga metoder att beräkna teoretiska spridningen av atomära strukturer och jämföra dem med experimentella SAXS data37. Med detta synsätt, konfirmerande staten, Kvartär struktur och högre ordningens församlingen observerats i ett kristallgitter kan jämföras till de strukturella kännetecknen av partikeln i lösning. Dessutom kan oordnade loopar och termini saknas i högupplöst strukturer bestäms av röntgenkristallografi modelleras med hjälp av lösning scattering data. Denna hybrid strukturell strategi använder kristallstrukturen som en byggsten för SAXS-guidad modellering av saknas rester och har visat sig vara effektiva i kartläggning C-terminus Nsa110, samt andra makromolekyler som influensa A virus M1 Matrix protein42och döda-box RNA chaperones43. Avancerade SAXS-baserad modellering programvara kan även lösa mer komplexa system, såsom oupplösligt oordnade proteiner, genom att mappa konfirmerande landskapet i dessa system som använder en rad konformationer som tillsammans bidrar till den övergripande spridningen potentialen av partikeln i lösning16,39. Tas tillsammans, senaste framstegen inom SAXS data insamling och bearbetning verktyg bidrar till framgång för hybrid strukturbiologi strategier för att hantera utmanande biologiska system.

Kombinationen av lösning spridning med högupplöst strukturer är redo för att svara på viktiga frågor om flexibilitet och dynamik av makromolekyler44. Många proteiner, såsom Nsa1, har dynamiska regioner som är viktiga för biologisk funktion. Detta manuskript tillhandahålls ett mall protokoll som specificerar kombinationen av SAXS med högupplösta strukturbestämning av röntgenkristallografi. Utöver röntgenkristallografi SAXS kan också användas som förgyller andra strukturbiologi tekniker inklusive NMR, electron paramagnetiska resonans (EPR) och fluorescens resonans energi överföring (bandet), ytterligare belysa vikten av SAXS som en kompletterande strukturbiologi teknik45,46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Diffraktion data samlades in på southeasten regionala samarbete tillgång Team (SER-CAT) 22-ID och 22-BM linjer på Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. SAXS data samlades in på den SIBYLS beamline på förhand ljus källa (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vill tacka Personalen på den SIBYLS beamline för hjälp med remote datainsamling och bearbetning. Vi är tacksamma för nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry forskning och stödgruppen för hjälp med att avgöra protein domän gränserna. Detta arbete fick stöd av oss nationella institutet för hälsa intramurala forskningsprogrammet; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 till R. E. S.) och kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR, 146626 till M.C.P). Användning av APS stöddes av oss Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38. Användning av avancerade ljus källa (ALS) stöddes av direktören, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231. Ytterligare stöd för den SIBYLS SAXS beamline kommer från National Institute of Health projektet MINOS (R01GM105404) och en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vill också tacka Andrea Moon och Dr Sara Andres för deras kritisk läsning av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

Biokemi fråga 131 röntgenkristallografi SAXS Hybrid metoder Protein rening WD40 domän begränsad proteolys ribosom församling
Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från <em>S. Cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter