Summary
이 방법은 엑스레이 결정학 및 소 각 x 선 산란 (SAXS), 복제, 표현, 및 구조 결심을 위한 재조합 Nsa1의 정화를 설명 하 고 다른 단백질의 하이브리드 구조 분석에 대 한 적용 둘 다를 포함 하는 주문 하 고 도메인을 난잡.
Abstract
리보솜 어셈블리 요소 Nsa1 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 에서 전체 길이 구조 결정은 무질서 때문에 도전 이다 고 정한 효소 단백질의 C-터미널. 이 원고는 엑스레이 결정학 및 SAXS에 의해 구조 분석에 대 한 S. cerevisiae 에서 재조합 Nsa1 정화 방법을 설명 합니다. X 선 결정학은 Nsa1의 정돈된 N 맨끝 WD40 도메인의 구조를 해결 하기 위해 활용 하 고 있다 그리고 SAXS 솔루션에서 Nsa1의 C-말단의 구조를 해결 하기 위해 사용 되었다. 솔루션 분산 데이터 솔루션에서 전체 길이 Nsa1에서 수집 되었다. 이론적인 산란 진폭 WD40 도메인의 고해상도 결정 구조에서 계산 그리고 경직 된 몸과 ab initio 모델링의 조합 Nsa1의 C-터미널. 이 하이브리드 접근 방식을 통해 전체 단백질의 제 사기 구조 개축 되었다. 여기에 제시 된 방법의 구조화 및 구조화 되지 않은 도메인의 혼합으로 구성 된 다른 단백질의 하이브리드 구조 결정에 대 한 일반적으로 적용 해야 합니다.
Introduction
리보솜 큰 ribonucleoprotein 기계 모든 살아있는 세포에 있는 단백질으로 번역 하는 mRNA의 필수적인 역할을 수행 하는. 리보솜 속1,2,,34나 복잡 한 과정에서 생산 되는 2 개의 소 단위 리보솜 구성 됩니다. 진 핵 리보솜 어셈블리 필수 ribosomal 어셈블리 요소2,,35의 수백의 도움에 의존합니다. Nsa1 (Nop7 관련 1)6큰 ribosomal 소 단위 생산에는 진 핵 리보솜 어셈블리 요소 이며 WD-반복으로 알려진 74 (WDR74) 더 높은 유기 체7에 포함 된입니다. WDR74 쥐8에서 blastocyst 형성에 필요한 것을 보여줘 왔다 그리고 WDR74 발기인은 자주 암 세포9에 돌연변이. 그러나, 함수 및 리보솜 어셈블리에 Nsa1/WDR74의 정확한 메커니즘 여전히 크게 불명 하다. 진 핵 리보솜 성숙 하는 동안 Nsa1/WDR74의 역할을 밝히기 시작, 여러 구조 분석 x 선 결정학 및 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS)10를 포함 하 여 수행 했다.
엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 전자 현미경, 고 SAXS 고분자 구조 공부를 위한 모든 중요 한 기술이 있습니다. 그러나 크기, 모양, 가용성, 및 구조 생물학 메서드는 특정 고분자 최고의 될 것입니다 적합 한 고분자 영향의 안정성, 지 고는 소위 "잡종" 접근 방식을 통해 여러 기술을 결합 한 점점 더 유익한 도구11. 특히 x 선 결정학 및 SAXS 고분자12의 구조 결정에 대 한 강력 하 고 상호 보완적인 방법이 있습니다.
결정학 고해상도 원자 구조 작은 분자에서 리보솜와 같은 큰 셀룰러 기계에 이르기까지 제공 하 고 단백질 등의 생물 학적 기능을 이해에서 수많은 혁신을 주도하 고 있다 고분자13. 또한, 구조 기반 약물 설계 약물 발견과 개발14에 중요 한 차원을 추가 하는 계산 방법으로 분자 도킹을 위한 크리스탈 구조의 힘을 하네스 랑. 그것의 광범위 한 적용에도 불구 하 고 유연 하 고 무질서 시스템은 결정학 크리스탈 패킹을 방해 수 있습니다 또는 전자 밀도 지도 완료 수 있습니다 이후 또는 품질의 평가에 도전. 반대로, SAXS 솔루션 기반 및 저해상도 구조적 접근 무질서 루프와 테르미니에서 본질적으로 무질서 단백질12,,1516에 이르기까지 유연한 시스템을 설명 하 수 이다. 그것은 광범위 한 입자 크기12와 호환을 고려, SAXS 작업할 수 있습니다 synergistically 결정학 구조 연구에 의해 해결 될 수 있는 생물 학적 질문의 범위를 확장.
Nsa1는 기능, 하지만 유연한 C-말단 엑스레이 결정학 방법을 의무가 아니다 뒤 체계적인된 WD40 도메인을 포함 하기 때문에 혼합 구조 방식을 위해 적당 하다. 다음은 복제, 표현, 그리고 하이브리드 구조 결정 엑스레이 결정학에 의해에 대 한 S. cerevisiae Nsa1 및 SAXS의 정화에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜 순서와 무질서 지역 조합 구성 하는 다른 단백질의 구조 연구에 적응 될 수 있다.
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Protocol
1. 재조합 단백질 생산 및 Nsa 1의 정화
- Nsa1 식 플라스 미드 디자인 및 복제
- 얻거나 S. cerevisiae 게놈 DNA를 구입.
- PCR 증폭 Nsa1의 대상 시퀀스 (Nsa1FL, 잔류물 1-463) 고 C 터미널 잘립니다 Nsa1 (Nsa1ΔC, 잔류물 1-434) S. cerevisiae 의 용융 온도에서 분리 하는 genomic DNA를 사용 하 여 적절 한 뇌관으로 약 60 ° C 1-2 분의 연장 시간. 다음 뇌관 했다 Nsa1를 증폭 하는 데 사용 됩니다.
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC - 대장균 (대장균) 식 벡터 pHMBP 포함 하는 N 맨끝으로 Nsa1 subclone 6 X-히스티딘 태그 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 그리고 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 사이트17 표준 복제 기술을 사용 하 여 다음 .
- 연속 DNA를 사용 하 여 확인 Nsa1 N 맨끝 그의 MBP 태그 프레임에서 복제 되었다.
- Nsa1 단백질 표정
- 적당 한 대장균 식 plasmid(s) 변환 식 스트레인 T7 발기인 기반 시스템. 플레이트 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함에 transformants 하 고 37 ° c.에 하룻밤 거꾸로 접시를 품 어
- 변환 플레이트에서 100 µ g/mL 암 피 실린 파운드의 문화 50 mL를 접종 하 고 37 ° c.에서 200 rpm에서 떨고와 하룻밤 성장
- 야간 문화의 15 mL와 100 µ g/mL 암 피 실린과 Fernbach 플라스 크에서 파운드의 3 x 1000 mL를 접종 하 고 37 ° c.에서 200 rpm에서 떨고와 성장
참고: 단백질 구조 솔루션에 대 한 selenomethionyl (SeMet) 설립 얻을 수 있는 세포와 SeMet는 아미노산 혼합물 파운드 미디어 반대로 유도 전에 메티오닌 생산을 억제 하는 보완 M9 최소 매체에 성장 18. - 1mm 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 25 ° C에 외피 다음의 최종 농도에 Nsa1의 표현 OD600 이소프로필 β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG)의 추가 의해 ~0.8에 도달 하면 유도.
- 5,050 x g에서 15 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 세포를 수확.
참고: 셀-80 ° C에서 장기 저장 하거나 단백질 정화에 대 한 즉시 사용 될 수 있습니다.
- Nsa1 단백질 정화
- 세포 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 m m MgCl2) 미리 한 EDTA 무료 protease 억제제 태블릿을 포함 하는 4 ° C에서 냉장의 25 ml resuspend
- 4 ° C에서 쥡니다에 의해 세포를 lyse (7 분, 2 시간 s 주기, 2 주기에서 s; 진폭: 70%).
- 4 ° c.에 45 분 26,900 x g에서 원심 분리에 의해 lysate 명확히
- 중력 흐름 열 고정된 코발트 선호도 수 지의 10 mL 로드에 lysate를 명백 하 게, 세포의 용 해 버퍼 미리 equilibrated 적용 한다.
- 4 ° C에서 중력 흐름에 의해 수 지에 통과 하 여 세포의 용 해 버퍼의 100 mL으로 두 번 수 지 세척 상쾌한을 수 있습니다.
- 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 500 m NaCl, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤과 200mm 이미 m)의 20 mL와 함께 Nsa1을 elute.
- 15 μ는 eluate의 고 하는 단백질은 eluted 선호도 수 지 (그림 1A)에서 확인 하는 4-15 %SDS 페이지 젤에 그것을 실행.
- TEV 프로 테아 제 소화 하 여 MBP 태그를 제거 합니다. Nsa1 선호도 수 지 차입을 TEV 프로 테아 제19 (재고 1 mg/mL) 1 mL를 추가 하 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
- 집중 MBP 죽 습을 Nsa1 ~ 10 kDa의 5 mL는 분자량과 원심 필터를 사용 하 여 잘라.
- MBP 죽 습 Nsa1 적용 젤 여과 열을 미리 equilibrated 버퍼에서 (20 mM Tris HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% 글리세롤과 1 m m β-mercaptoethanol) (그림 1B).
- 젤 여과 MBP 죽 습 이며 4 ~ 15 %SDS 페이지 젤 (그림 1B)에 15 μ 샘플을 실행 하 여 Nsa1에서 분리 확인에서 열 분수를 분석 합니다.
- Nsa1를 포함 하는 분수를 결합 하 고 8 mg/mL 분자량 10 kDa에서 잘라와 원심 필터를 사용 하 여에 집중.
- 280에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정 멸종 계수 42530 M-1cm-1를 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm. 즉시 분해 심사 및 결정 화 실험을 위한 단백질을 사용 합니다.
2. 결정 화 및 Nsa 1의 분해 검사
- Nsa1의 스파스 매트릭스 크리스탈 심사
- 10 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 Nsa1의 8 mg/mL 주식의 500 μ 원심
- 결정 화 실험 결정 화 로봇 및 스파스 매트릭스 크리스탈 스크린을 사용 하 여 설치. 스파스 매트릭스 결정 화면에서 개별 크리스탈 스크린 시 약의 30 μ로 96 잘 쟁반의 저수지를 채우십시오. 250을 혼합 하 여 로봇으로 앉아 방울 설치 250 잘 솔루션의 nL nL 단백질 해결책의.
- 테이프로 화 판 및 25 ° c.에서 그들을 품 어
- 판 검사는 stereomicroscope와 함께 첫 2-3 주 동안 매 2 일.
- 잠재적인 결정 안타 자외선 현미경으로 단백질을 포함 하는 확인 합니다.
참고: Nsa1 2 개의 다른 크리스탈 모양에 대 한 (입방 및 orthorhombic, 그림 2A) 다음 화면에서 1 주일 이내 취득 했다: JCSG + 조건 B11 (1.6 M 나트륨 구 연산 염 tribasic 탈수, pH 6.5)와 마법사 Precipitant 시너지 화면 블록 2 C11 조건 (20.1%(v/v) 말뚝 1500, 13.4%(v/v) 말뚝 400, 0.1 M 수산화 트리 HEPES/나트륨, pH 7.5).
- 분해 검사
참고: 결정 화 최적화 하는 동안 그것은 발견 되었다 Nsa1의 orthorhombic 결정 분해 분열 결과로 발생 및 결정 수 없습니다 중복 될 전장 단백질을 사용 하 여. 질량 분석으로 결합 하는 제한 된 베이스의 조합을 사용 하 여, 결정 했다 Nsa1의 C-말단은 베이스에 민감한 및 C 맨끝 꼬리의 제거 했다 orthorhombic 크리스탈 양식 (의 후속 복제에 필요한 Nsa1ΔC).- 준비 1 mg/mL의 다음 프로 테아 제 α-범용성, 트립 신, elastase, papain, subtilisin, 및 endoproteinase Glu. 효소 재고 솔루션
- 희석 버퍼 (10 mM HEPES, pH 7.5, 염화 나트륨 500 m m) 1시 10분, 1: 100, 그리고 1:1000 각 1 mg/mL 효소의 희석을 만듭니다.
- 1 μ (1시 10분, 1: 100 1:1000) 효소의 단백질 (1 mg/mL) 상영을 각 효소의 9 μ aliquots로 플라스틱.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 솔루션을 품 어.
- 2 x SDS 페이지 샘플 버퍼의 10 μ를 추가 하 여 반응을 중지 하 고 5 분 동안 95 ° C에 반응을 열.
- 4-15 %SDS 페이지 젤 (그림 2B)에 그들을 실행 하 여는 다이제스트를 분석 합니다.
- 젤에 질량 분석 분석 대상 단백질의 효소 저항 도메인을 식별 합니다.
- 잘린된 식 구문을 생성 하 여, 위에서 설명한 복제, 표현, 그리고 정화 프로토콜에 따라 대상 단백질에서 효소 불안정 영역을 제거 합니다.
- 결정 화 최적화
- 준비 하거나 다음과 같은 초기 결정 화 시 약의 재고 솔루션: 1.6 M 나트륨 구 연산 염 tribasic 탈수 pH 6.5, 100%(v/v) 말뚝 400, 50%(v/v) 말뚝 1500, 1 M 수산화 HEPES/나트륨, pH 7.5.
- Nsa1의 재고 솔루션 준비 위에서 설명한 8 mg/mL에서플로리다 와 Nsa1ΔC .
- Nsa1 입방 결정 최적화 (Nsa1FL).
- 1-1.6 m 나트륨 구 연산 염 ph 6.5 tribasic 1.6 M 나트륨 구 연산 염의 재고 솔루션에서 ph 6.5의 그라데이션으로 500 µ L을 포함 하는 웰 스와 24-잘 표 화면을 준비 합니다.
- 믹스 1 µ L 단백질의 1 µ L 잘 솔루션 및 장소 시 커버 슬라이드에 혼합의와 함께. 신중 하 게 반전 커버 슬라이드 위에 미리 기름칠 잘 하 고 그것을 보장 잘 밀봉 하지만 드롭 방해 또는 커버 슬라이드 휴식 알아서. 트레이 채워질 때까지이 과정을 반복 하 고 25 ° c.에 저장
참고: 작은 입방 결정 2-7 일에서 나타납니다. - 입방 결정의 microseed 재고를 준비 합니다. 탑재 된 나일론 루프를 사용 하 여 포함 된 작은 구슬과 1.6 M 나트륨 구 연산 염 tribasic 재치 pH 6.5의 50 µ L 1.5 mL 마이크로 원심 관에 ~ 10 작은 입방 결정을 전송.
- 소용돌이 빠른 속도로 1.5 mL 마이크로 원심 관 (~ 3000 rpm) 1 분.
- 5에 대 한 철저 하 게 혼합 tribasic 1.6 M 나트륨 구 연산 염과 소용돌이 씨앗 주식의 10 직렬 희석의 시리즈를 만들기 s.
- 각 채우기 24 잘 격자의 500 µ L 1.6 M 나트륨 구 연산 염 tribasic pH 6.5의 화면.
- Microseeding 조건 방울 씨 주식 솔루션 (그림 3A)와 단백질의 다양 한 비율을 설정 하 여 최적화 합니다. 회절 높은 품질의 더 큰 입방 결정 2-5 일 (그림 3C)에 표시 됩니다.
- Orthorhombic 결정 최적화 (Nsa1ΔC)
- 그리드 화면에 24 다른 조건 (그림 3B)와 각 잘 500 µ L 던지다 1500, 50%(v/v) 및 100%(v/v) 말뚝 400의 재고 솔루션에서 준비 합니다. 1500 말뚝과 말뚝 400의 그라디언트, 뿐만 아니라 각 잘 포함 해야 합니다 또한 0.1 M HEPES/나트륨 수산화 pH 7.5.
- 단백질 해결책의 1 µ L 1 µ L 시 커버 슬라이드에 잘 솔루션의 믹스. 신중 하 게 반전 커버 슬라이드 위에 미리 기름칠 잘 고 그것은 잘 봉인 됩니다. 전체 트레이 채워질 때까지이 과정을 반복 합니다. 25 ° c.에 쟁반을 저장
참고: Nsa1 orthorhombic 결정 2-7 일에서 나타납니다. - 추가 최적화 orthorhombic 크리스탈 microseeding 입방 결정 (단계 2.3.3.3 2.3.3.7)에 대 한 설명 된 대로 잘 솔루션으로 20.1%(v/v) 말뚝 1500, 13.4%(v/v) 말뚝 400, 및 0.1 M HEPES/나트륨 수산화 pH 7.5의 500 µ L를 사용 하 여.
참고: Nsa1 SeMet 결정 최적화 되어야 합니다 네이티브 결정 비슷합니다.
3. x-선 회절 데이터 수집 및 Nsa 1 구조 솔루션
- 곳을 알아내는-보호 결정 및 x 선 회절 데이터 수집
- Orthorhombic 결정을 위해 (Nsa1ΔC), 22.5%(v/v) 말뚝 1500, 15%(v/v) 말뚝 400 그리고 0.1 M HEPES/나트륨 수산화 pH 7.5 1 mL cryoprotectant 솔루션을 준비.
- 액체 질소로 거품 Dewar를 미리 냉각 크리스탈 퍽. 액체 질소를 작업할 때 주의 사용 하 고 보호 장갑 및 고글을 착용.
- 조심 스럽게 잘 포함 하는 stereomicroscope의 단계에 결정 화의 표지 슬라이드 반전.
- 새로운 커버 슬라이드에 cryoprotectant 솔루션의 2 µ L 플라스틱
- 마그네틱 cryo 지팡이를 크리스탈에 대 한 적절 한 크기의 탑재 된 나일론 루프를 연결 합니다.
- 크리스털 cryoprotectant 솔루션 탑재 cryo 루프와 전송 신속 하 게는 stereomicroscope의 원조를 사용 하 여.
- 크리스탈 cryoprotectant 솔루션에서 5 분 equilibrate 하자.
- 액체 질소로 크리스탈 cryoprotectant 솔루션 및 플런지 동결에서 루프 신속 하 게는 stereomicroscope의 원조를 사용 하 여.
- 끓는 중지 루프 주위 액체 질소에 대 한 기다린 다음 지팡이에서 루프 크리스탈 퍽 내의 특정 위치에 놓습니다.
- 큐빅 Nsa1플로리다 결정 cryoprotected 될 필요가 없습니다 하 고 얼 수 있다 직접 플래시 (다음 위의 단계 3.1.8-3.1.9).
- 곳을 알아내는 도구를 사용 하 여 크리스탈 퍽을 봉인 하 고 미리 냉장된 dewar의 배송 지팡이에 전송. 데이터 수집까지 결정 키/dewars에 저장 합니다.
- 경우에 싱크 로트 론에서 데이터를 수집, 배 건조 발송자를 사용 하 여 싱크 로트 론을 결정.
- 다음과 같은 표준 기술을20x 선 회절 데이터를 수집 합니다.
참고: Nsa1 네이티브 및 슬픈에 대 한 데이터 집합 (단일 파장 변칙 분산) 수집 되었다 100 K에 22-ID와 고급 광자 소스 아르곤 국립 연구소 (시카고, IL)의 22-BM SER 고양이 빔 라인에. Λ에 슬픈 Nsa1 데이터 집합 수집 = 0.97911 Å. 데이터를 1 s 노출 시간 및 0.5 ° 진동 사용 하 여 기록 했다. 이러한 결정의 mosaicity 일반적으로 약 0.3 ° 이었다. - 처리 하 고 적절 한 공간 그룹에서 각 데이터 집합에 대 한 반사 파일을 생성 하는 x 선 회절 이미지를 확장.
참고: HKL200021Nsa1 회절 데이터 집합 처리 했다. 공간 그룹 P213 Nsa1 입방 결정 처리 된 고 orthorhombic 결정 공간 그룹 p 212121에 처리 했다.
- Nsa1 구조 솔루션입니다.
참고: 여러 결정학 소프트웨어 패키지 해결 하 고 피닉스와 CCP4,2223를 포함 한 크리스탈 구조를 수정 하는 데 사용할 수 있습니다. 다음은 피닉스 소프트웨어 스위트22를 사용 하 여 Nsa1 구조 솔루션에 대 한 프로토콜.- 분석 네이티브 및 슬픈 phenix.xtriage22와 데이터 집합을 확장.
- 슬픈 피크 반사 파일22,24를 사용 하 여 Phenix.autosol와 Nsa1의 구조를 해결. AutoSol의 프로그램을 실행 하려면 selenomethionine 사이트의 수를 입력 (사이트 = 9), fasta 시퀀스 파일의 Nsa1ΔC, 그리고 슬픈 데이터 수집에 사용 되는 파장 (λ = 0.97911 Å).
참고: Nsa1 슬픈 dataset에서 phenix.autosol 수 있어야 실험 단계를 결정 하는 대부분의 모델을 구축. - 쿳25, phenix.refine,2226에서 구체화 하 여 다음 모델에 수동 조정을 합니다.
- 분자 교체 페이저27,28을 사용 하 여 고해상도 네이티브 orthorhombic 크리스탈과 큐빅 크리스탈의 구조를 해결.
- 성공적인 구조 솔루션, 후 모델 및 전자 밀도 검사 쿳25에 지도.
- 빌드하고 phenix.refine22,26 에 쿳25건물 모델 구체화의 반복 라운드를 실행 하 여 구조를 수정 합니다.
4. SAXS 데이터 수집, 처리, 및 모델링
- SAXS 데이터 수집
주: 전체 길이 S. cerevisiae SAXS 데이터 기록 높은 처리량 SIBYLS beamline 로렌스 버클리 국립 연구소, 버클리, 캘리포니아2912.3.1에 고급 빛 소스에서 Nsa1.- Nsa1 정화플로리다 다음 위에서 설명한 프로토콜. Nsa1의 선적 전에 24 h 버퍼 A. equilibrated 미리 단백질은 젤 여과 열 실행 beamline에FL
- Nsa1를 포함 하는 분수 풀 하 고 앞에서 설명한 단백질 농도 결정 합니다.
- 6.2 mg/ml 1. 버퍼를 사용 하 여 1에서 Nsa1의 농도 시리즈의 30 μ aliquots 준비
- Nsa1의 각 농도 시리즈의 20 μ 버퍼 A 혼자 컨트롤 함께 분명 풀 스커트 96 잘 microplate에 전송.
참고: SAXS 데이터 집계, 간 입자 반발 작용, 방사선 피해 효과 피하기 위해 순화 된 샘플의 여러 농도 사용 하 여 희석 솔루션에 수집 됩니다. - 실리콘 매트와는 beamline에 4 ° C에서 밤새 배를 바다 표범 어업은 microplate 인감.
- 데이터 수집까지 4 ° C에서 microplate를 저장 합니다.
- 데이터 수집, 직전 잠재적인 집계를 제거 하 고 기포를 4 ° C에서 10 분 동안 3200 x g에서 접시를 회전 합니다.
- 레코드 SAXS 데이터입니다.
참고: Nsa1, SAXS 데이터 했다 기록 버퍼에 대 한 각 단백질 농도 시리즈 전후. 0.3의 Nsa1에 대 한 수집의 30-3 연속 스캔 10 ° c.에서 농도 시리즈 (6.2을 1 mg/mL)를 통해플로리다 - SAXS 데이터 버퍼 빼기를 수행 합니다.
참고: 버퍼 빼기는 beamline에 자동으로 수행 했다 Nsa1에 대 한 하지만 버퍼 빼기도 수행할 수 분산형30 등 ATSAS 스위트31데이터 감소 소프트웨어를 사용 하 여. 버퍼 빼기 SAXS 데이터 분석의 중요 한 부분 이며 주의 빼기 위해 사용 되는 버퍼 단백질 견본 버퍼를 동일 하도록 해야 합니다. - 평균 연속 33 각 농도 대 한 *ave.dat 파일을 검색 합니다.
참고: 오버레이 곡선 비교 33 연속 프레임. 시간이 지남에 따라 분산 곡선 변경 종종 방사선 손상의 나타내는 것입니다. 평균에서 이러한 프레임을 제외 합니다. Nsa1 연속 검사의 평균 SIBYLS beamline에 자동으로 수행 되었다.
- SAXS 데이터 처리 및 농도 시리즈의 비교
참고: 여러 가지 소프트웨어 패키지 SAXS 데이터를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. Nsa1에 대 한 선회 반경 짝 거리 배포 기능 프리머스32 ATSAS 2.7.2에서에서 Gnom33 를 사용 하 여 결정 되었다 스위트31 없었다 아무 방사선 되도록 모든 단백질 농도 걸쳐 비교 손상 또는 농도 종속 간 입자 상호 작용10.- 터미널 쉘 열고 SAXS 데이터가 포함 된 디렉토리로 이동 합니다.
- 프리머스32 에서 GUI 터미널 쉘 내에서 실행 합니다.
- 프리머스 GUI 내에서 로드 분산 곡선 (* ave.dat).
- 저자g 선회 반경 (Rg)를 결정 하 고 각 산란 곡선에 대 한 산란 강도 I(0), 앞으로를 사용 하 여 (* ave.dat).
- 각 산란 곡선에 대 한 Kratky 플롯을 생성 (* ave.dat)의 압축 정도 평가 하.
- AutoGNOM33 짝 분포 함수 계산을 사용 하 여 (각 산란 곡선에 대 한 P(r)) 라고도 (* ave.dat). 입력 시작 D최대 ≈ 3 * Rg 부드러운 P(r) 곡선을 얻기 위해 D최대 값을 최적화 하 고. D최대의 최적화 하는 동안 확인 계산된 P(r) 함수는 보고 χ2 값을 확인 하 고 시각적으로 산란 곡선에 맞게 전체를 평가 하 여 실험 산란 곡선와 일치 합니다.
- 상관 관계34의 볼륨을 사용 하 여 분산 곡선에서 Nsa1의 분자량을 계산 합니다.
- 방사선 손상이 나 농도 의존 효과 되도록 각 농도 대 한 구조 매개 변수를 비교 합니다.
참고: 농도 효과 증가 Rg 및 D최대 증가 단백질 농도 관하여 나타날 수 있습니다. 앞으로 샘플 농도 나눈 I(0)를 비 산 또한 단백질 농도 시리즈에 걸쳐 일정 계속 합니다.
- SAXS 모델링
참고: Nsa1의 C-말단의 위치를 확인 하려면플로리다, Nsa1 크리스탈 구조10 (PDB 5SUM) 및 SAXS 산란 곡선 사용 되었다 강 체와 ab initio 모델링, 무리 프로그램을 사용 하 여 수행 하 35 및 ATSAS 소프트웨어 스위트31에서 앙상블 최적화 방법 (엄)36 . WD40 도메인에서 여러 무질서 루프 함께 Nsa1의 C-말단 실험 SAXS 데이터에 맞게 모델로 했다 하는 동안 Nsa1의 WD40 도메인 강 체로 대우 되었다.- 입력된 PDB 파일을 생성 합니다. 때마다 잔류물에서에서 누락 되는 주요 체인 PDB 파일 여러 conformations, ligands, 포함 될 수 없거나 또는 물 분자 PDB 파일을 분할 해야 합니다.
- 실행 프로그램 Pre_BUNCH35 무리 (pre_bunch.pdb)에 대 한 입력된 PDB 파일을 준비 하. 대상 단백질 (*.seq), 도메인/Pdb 4.3.1, 생성 된 수의 시퀀스를 입력 하 고 각 개별 PDB 파일 위에 생성.
- CRYSOL37프로그램을 사용 하 여 각 개별 PDB 파일에 대 한 산란 진폭을 계산 합니다. CRYSOL를 실행 하려면 개별 PDB 파일 및 실험적인 SAXS 산란 곡선 (*.dat)을 입력 합니다. 이 진폭 파일을 생성 합니다 (*.alm).
- 결합 된 경직 된 신체와 ab initio 접근을 사용 하 여 SAXS 데이터에 대 한 Nsa1의 WD40 도메인 모델링 프로그램 무리35 를 실행 합니다. PDB 파일 Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb)에서 실험적인 SAXS 산란 곡선 (*.dat), 그리고 개별 진폭 입력 (*.alm) CRYSOL에 의해 생성 된 각 부분 PDB 파일에 대 한 파일.
- Ab의 initio 무리 실험적인 SAXS 자료를 사용 하 여 생성 된 모델에서 그 시작 PDB (5SUM)에서 χ2 값을 비교 합니다.
참고: 성공적인 무리 모델 시작 모델 보다 훨씬 낮은 χ2 값이 있어야 합니다. 무리 모델의 이론적인 분산도 설명 해야 잘 실험 데이터 SAXS 데이터 무리 모델의 이론적 뿌리와 χ2 값 (그림 4, 오버레이의 검사에 의해 심판 센터 파이프라인)입니다. - Pymol38 무리, 그리고 SAXS 봉투 (그림 4, 센터 파이프라인)에 의해 생성 된 모델 결정 구조를 중첩을 무리에서 출력 파일을 수동으로 검사 합니다.
- 10-20 배 무리를 다시 실행 모델은 비슷한 것인지 독립 모델을 생성 하.
참고: Nsa1 거기 20 독립적인 실행에서 3 ~ 1에서 χ2 값의 범위를 했다. - 앙상블 모델링
참고:로 무리 엄36 또는 최소한의 앙상블 검색39 (MES) 실행에 선택적인 접근. 엄 및 MES를 사용 하 여 앙상블 접근, 여러 conformations에 유연한 도메인/영역 단백질에 적합.- 엄36 ATSAS 온라인 서버를 사용 하 여 프로그램을 실행 합니다. 엄을 실행, 4.3.1, 대상 단백질 (*.seq), 그리고 실험 SAXS 데이터 (*.dat)의 순서에서에서 PDB 파일을 입력 합니다.
- 그걸로 시작 PDB (5SUM)에서 χ2 값을 비교 하 여 엄 실험적인 SAXS 자료를 사용 하 여 생성 하는 앙상블에서.
참고: 성공적인 엄 앙상블 시작 모델 보다 훨씬 낮은 χ2 값이 있어야 합니다. 앙상블의 이론적인 분산도 설명 해야 잘 실험 데이터 오버레이 SAXS 데이터 앙상블의 이론적인 분산와 χ2 값 (그림 4, 오른쪽의 검사에 의해 심판 파이프라인)입니다. 하나는 또한 실험적인 SAXS 데이터를 설명 하는 최고의 모델 결정 무리 엄에서 χ2 값을 비교 해야 합니다. - 수동으로 검사 엄 (그림 4)에 의해 생성 된 conformers와 결정 구조를 오버레이 Pymol38 엄 conformers. Note conformers의 총 수와 점령의 일부분 각 conformer 산란 곡선에 기여에 대 한. Nsa1와 같은 더 엄밀한 분자에 대 한 작은 되어야 conformers의 수 (1-5) (그림 4, 오른쪽 파이프라인)36.
- 다시 엄 실행 결과를 여러 번.
참고: Nsa1 conformers의 수가 이었다 일반적으로 χ2 값 0.1 ~ 0.3와 3 ~ 4.
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Representative Results
Nsa1 PCR S. cerevisiae genomic DNA에서 증폭 하 고 MBP와 TEV 프로 테아 제 사이트는 N 맨끝 6 x-히스티딘 선호도 태그를 포함 하는 벡터에 subcloned 이었다. Nsa1 대장균 BL21(DE3) 세포로 변형 되었다 고 단백질 식의 높은 수율 IPTG로 유도 및 25 ° C에서 하룻밤 (그림 1A) 성장을 가져온. Nsa1 고정된 코발트 선호도 수 지, TEV protease와 MBP 분열에 의해 그리고 마침내 크기 배제 크로마토그래피 (그림 1B)에 의해 해결에 친 화력 정화 했다. Nsa1를 포함 하는 크기 배제 크로마토그래피에서 분수 풀링, 8 mg/mL에 집중 되었고 결정 화 로봇 결정 화 실험에 대 한 사용. 초기 스파스 매트릭스 크리스탈 스크린의 2 개의 다른 크리스탈 모양 Nsa1, 입방 및 orthorhombic (그림 2A) 나왔고.
입방 및 orthorhombic 결정의 최적화 하는 동안 orthorhombic 크리스탈 Nsa1의 분해 분열의 결과로 발생 했다 발견 했다. 제한 된 베이스와 질량 분석 베이스, 민감한 Nsa1의 영역을 결정 하는 데 사용 했다 그리고 Nsa1는 효소 elastase (그림 2B)의 농도 기온 변화도에 민감한 관찰 되었다. 이후 질량 분석 분석 확인이 저하 Nsa1의 C-말단의 손실에서 유래 했다. 일련의 Nsa1의 C-터미널 잘림 제거를 위하여 중요 한 C-말단 (그림 2C) 생성 되었다. Orthorhombic 결정 궁극적으로 슬픈 구조 결정을 위해 사용 되었다 Nsa1ΔC (잔류물 1-434) 자르기와 반복 될 수 있습니다. Orthorhombic 결정 또한 Nsa1를 치료 하 여 반복 수 크리스탈 트레이를 설정 하기 전에 4 ° C에서 1 시간 동안 elastase와플로리다 .
큐빅 Nsa1 결정 했다 Nsa1를 사용 하 여 최적화 된플로리다 나트륨 시트르산 그라디언트의 결합을 통해 결합 microseeding (그림 3A). 이 나왔고 약 2.8의 회절 한계 대형, 재현할 수 입방 결정, Å의 해상도 (그림 3C, 왼쪽). Orthorhombic 결정만 최적화할 수 1500 말뚝과 말뚝 400, microseeding, 약 1.25의 회절 제한 큰 결정을 굴복과 결합의 농도 기울기 변화 하 여 Nsa1의 C-터미널 잘림 이체를 사용 하 여 Å 해상도 (그림 3A-C). Nsa1의 실험 단계는 SeMet-SeMet-Nsa1ΔC10의 파생에서 슬픈에 의해 결정 되었다.
그러나 Nsa1의 N 맨끝 7 날 β-프로 펠 러 WD40 도메인 두 구조 Nsa1의 C-말단에 대 한 전자 밀도 부족 모두는 입방과 orthorhombic 크리스탈 구조에 잘 해결 되었습니다. SAXS 다음 솔루션에서 Nsa1의 누락 C 터미널 도메인의 위치를 결정 하기 위해 사용 되었다. 데이터 컬렉션에 대 한 샘플 농도의 최적화, 후 부분 원자 구조는 리 짓 바디 모델링을 수행 하 고 누락 된 구성 요소의 ab initio 재건 생성 하 사용 되었다. 모델 실험 데이터 (그림 4, 센터 파이프라인) 계산 된 분산 곡선에 대 한 적합의 미 덕의 점에서 평가 했다. Nsa1 혼자의 WD40 도메인은 이론적인 분산 곡선으로, 결정 구조 PDB ID 5SUM에서에서 생성 된 실험적인 산란 곡선 사이의 불일치에 의해 입증 실험 SAXS 데이터의 좋은 적합 하지 않습니다 (그림 4, 왼쪽된 파이프라인)입니다. 리 짓 바디 모델링, 뿐만 아니라 앙상블 모델링도 이루어졌다. Nsa1의 3 ~ 4 conformers의 앙상블 생산과 낮은 χ2 값 (그림 4, 오른쪽 파이프라인) 귀착되 었 다. 모델 불일치 (χ2) 앙상블 모델링을 사용 하 여 감소 솔루션에서 Nsa1 C 맨끝 꼬리의 구조적 샘플링을 밝혔다.
그림 1입니다. 식 및 6 X 그의 MBP 융합 태그와 Nsa1의 정화. (A) SDS 페이지 분석 BL21에 단백질 식의 하룻밤과 코발트 선호도 수 지를 사용 하 여 첫 번째 정화 단계 (DE3) 25 ° C에서 세포. (B) 대표 크기 배제 크로마 TEV 분열 다음. 크기 배제 크로마토그래피에서 분수 SDS-PAGE로 분석 되었다. 피크 1 포함 Nsa1 수집 되었고 구조 분석을 위한 사용에서 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Nsa1의 C-말단은 베이스에 과민 하다. (Nsa1의 A) 초기 결정 화 실험 나왔고 두 개의 다른 결정 형태: 입방 및 orthorhombic. 자외선 현미경 결정 단백질 포함 확인 사용 되었다. Vi: 가시광선, 자외선: 자외선 현미경. 눈금 막대 각 창에서 50 µ m =. (B) 분해 심사 SDS-PAGE로 분석. 각 효소 주식 (0.1, 0.01, 0.001 mg/mL)에 대 한 3 개의 희석 (1시 10분, 1: 100, 1:1000)는 상영 될 단백질 (1 mg/mL)의 aliquots와 결합 했다. 프로 테아 제 저항 도메인 분석 했다는 SDS 페이지와 60 분 Nsa1-플로리다에 대 한 37 ° C 배양 후 질량 분석: 신선한 정화 단백질, Nsa1Δ: 단백질의 타락된 형태 관찰 후 3 주 동안 4 ° C에서 저장 된 단백질을 정화. Nsa1 전체 길이 (위)의 (C) 도식 다이어그램 및 C 터미널 잘림 (낮은) 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Nsa1 결정 화 최적화. (A) 씨 주식 초기 작은 결정에서 준비 하 고 희석 시리즈를 만드는 데 사용 되었다 (1 x ~ 1/104x) (microseeding). 희석 씨 주식 1 µ L로 단백질의 1 µ L를 혼합 하 여 더 큰 단일 결정 주 내에서 성장 했다. (B) precipitant 농도 그라데이션 orthorhombic 크리스탈 최적화에 대 한. (C) 데이터 수집을 위해 사용 하는 입방 및 orthorhombic 결정 최적화. 녹색 원형 크리스탈 쟁반 굴복 데이터 수집 품질 결정의 일반적인 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Nsa1 SAXS 분석의 회로도 SAXS 데이터를 처리 하 고 무리 (센터)와 엄 (오른쪽) 모델을 생성 하는 데 사용 하는 파이프라인의 개요. 왼쪽된 파이프라인 실험 산란 곡선 사이의 불일치를 보여 줍니다 (빨간색 원, 단백질 농도: 6 mg/mL) 이론적인 분산 곡선 (파란색 선), 결정 구조 PDB ID 5SUM에서에서 생성 했다. 모델 실험 SAXS 산란 곡선을 비교 하 여 평가 했다 (빨간색 원, 단백질 농도: 6 mg/mL) Nsa1의 무리 모델에서 파생 된 산란 곡선 (검은 선) 또는 Nsa1의 엄 conformers (검은 선). 각 모델에 WD40 도메인 유연한 C-말단 개별 엄 conformers 무리 고, 마젠타색, 청록색, 녹색과 노란색에 대 한 빨간색에서 컬러 영역에 표시 됩니다 (PDB ID 5SUM), 녹색의 색깔 만화에 표시 됩니다. 각 conformer 엄에서 파생 된 일부 모델에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜을 사용 하 여, S. cerevisiae 에서 재조합 Nsa1 엑스레이 결정학 및 SAXS에 의해 구조 연구에 대 한 생성 되었습니다. Nsa1은 솔루션에서 품행 되었고 여러 크리스탈 형태로 결정. 이러한 결정의 최적화 하는 동안 Nsa1의 C-말단 효소 저하에 과민 했다 발견 했다. 높은 해상도, orthorhombic 크리스탈 형태로 수만 중복 될 가능성이 Nsa1의 C-터미널 잘림 변형 Nsa1의 유연한 C terminus 크리스탈 패킹을 방해 하기 때문에. Nsa1의 구조는 높은 해상도, 엑스레이 결정학에 의해 해결 되었다 하지만 C-말단 수 하지 빌드할 수 중 크리스탈 형태로 하지 지시 했다. 그러나 결정학으로 어떤 방법으로, 결정학 몇 가지 한계는 Nsa1의 크기 주위 고분자의 원자 해결책 구조를 결정 하기 위한 초연 기술입니다. 결정학의 주요 한계 중 단백질40,41의 무질서 영역을 해결 하는 무 능력 이다.
Nsa1의 C-말단은10의 구조 공부 하는 필요를 강조는 단백질의 적절 한 nucleolar 지역화를 위해 중요 합니다. Nsa1의 C-말단은 SAXS, 보완 구조 생물학 기술 엑스레이 결정학에 의해 해결 되었습니다. SAXS 데이터 농도 시리즈에 걸쳐 전체 길이 Nsa1에 대 한 기록 했다. 이 농도 시리즈에서 Nsa1 SAXS 데이터 수집 및 처리에 대 한 최적의 농도 결정 했다. SAXS 데이터는 Nsa1에 대 한 6, 4.5, 및 3.0 mg/mL에서 기록 되었다. Guinier 지역, P(r) 기능 및 분자량 농도 시리즈에 걸쳐 샘플은 품행 및 하지 테스트 실험 조건 하에서 집계 되도록 결정 되었다. Nsa1의 전체 구조를 재구성, 이론적인 산란 진폭은 부분 결정 구조에서 결정 하 고 ab initio 방법은 유연한 C terminus를 모델링 하는 데 사용 되었다. 이 하이브리드 접근에서 그것은 Nsa1의 유연한 C terminus 정렬된 WD40 도메인에서 바깥쪽으로 확장을 결정 했다.
처리 도구에 진보는 고분자 구조 연구 SAXS의 인기를 주도 했다. SAXS는 분자 질량 및 전반적인 모양을 포함 하 여 저해상도 구조 정보를 제공 하는 솔루션에서 무작위로 지향 단백질에서 x-선 산란 패턴을 측정 합니다. 따라서, SAXS는 결정학에 대 한 강력한 직교 구조 유효성 검사 도구로 떠오르고 있다. 이것은 주로 원자 구조의 이론적인 분산 및 실험적인 SAXS 데이터37비교 계산 계산 방법의 개발. 이 방법은, 구조적 상태, 제 사기 구조와 결정 격자에서 관찰 하는 더 높은 순서 어셈블리를 사용 하 여 솔루션에서 입자의 구조적 특성을 비교할 수 있습니다. 또한, 무질서 루프와 테르미니 엑스레이 결정학에 의해 결정 하는 고해상도 구조에서 누락 된 수 있습니다 모델링 솔루션 분산 데이터를 사용 하 여. 하이브리드 구조 이렇게 누락 된 잔류물의 SAXS 기반 모델링을 위한 빌딩 블록으로 결정 구조를 사용 하 여 및 매핑 Nsa110, 인플루엔자 A 바이러스 m 1 같은 다른 고분자의 C-말단에 효과 입증 했다 매트릭스 단백질42와 죽은 상자 RNA 보호자43. 고급 SAXS 기반 모델링 소프트웨어 또한 함께 전체 산란에 기여 하는 conformers의 시리즈를 사용 하 여 이러한 시스템의 구조적 풍경에 매핑하여 본질적으로 무질서 단백질 같은 더 복잡 한 시스템을 해결할 수 있는 솔루션16,39에서 입자의 잠재력. SAXS 데이터 수집 및 처리 도구에 찍은 함께, 최근 진보 도전 생물 학적 시스템을 태 클을 위한 하이브리드 구조 생물학 접근의 성공에 기여 한다.
고해상도 구조 솔루션 산란의 조합 유연성과 고분자44의 역학에 대 한 중요 한 질문에 대답을 태세 이다. Nsa1, 같은 많은 단백질, 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 동적 영역 있다. 이 원고 서식 파일 프로토콜은 엑스레이 결정학에 의해 어떤 세부 고해상도 구조 결정 SAXS의 함께 되어 제공 됩니다. X 선 결정학 SAXS NMR를 포함 한 다른 구조 생물학 기법을 칭찬 하는 데 사용도 수, 뿐만 아니라 전자 상자성 공명 (EPR), 및 형광 공명 에너지 (무서 워), SAXS의 중요성을 강조 추가 보완 구조 생물학 기술45,,4647.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
회절 데이터 동남 지역 공동 액세스 팀 (SER-고양이) 22-ID와 22-BM beamlines에서 고급 광자 소스 (AP), Argonne 국립 연구소에서 수집 했다. SAXS 데이터 SIBYLS beamline에 사전 빛 소스 (ALS), 로렌스 버클리 국립 연구소에 수집 되었다. 우리는 직원에 대 한 그들의 원격 데이터 수집 및 처리 SIBYLS beamline에 감사 하 고 싶습니다. 우리는 국립 연구소의 환경 건강 과학 (NIEHS) 질량 분석 연구 및 지원 그룹 단백질 도메인 경계를 결정 하는 도움을 위한 감사. 이 작품으로 미국 국립 연구소의 건강 교내 연구 프로그램; 지원 미국 국립 연구소의 환경 건강 과학 (NIEHS)의 (R. E. S. 지아 ES103247)와 건강 연구 (CIHR, M.C.P에 146626)의 캐나다 학회. AP의 사용을 지원 했다 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학 계약 번호에서 W-31-109-잉글랜드-38. 사용 고급 라이트 소스 (ALS)의 감독, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호에서 미국 에너지 부의에 의해 지원 되었다 드-AC02-05CH11231입니다. 추가 지원 SIBYLS SAXS beamline 건강의 국립 연구소에서 유래에 대 한 프로젝트 노스 (R01GM105404)와 하이 엔드 계측 그랜트 S10OD018483. 우리는 또한이 원고에의 그들의 중요 한 독서에 대 한 안드레아 달과 박사 새 라 안 드레를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
References
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