Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Denne metode beskriver kloning, udtryk og oprensning af rekombinante Nsa1 for Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og små-vinkel X-ray spredning (SAXSA), og er gældende for hybrid strukturel analyse af andre proteiner der indeholder begge bestilt og uordnede domæner.

Abstract

Bestemmelse af fuld længde struktur af ribosomet forsamling faktor Nsa1 af Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er udfordrende på grund af den uorden og protease labile C-terminalen af proteinet. Dette manuskript beskriver metoder til at rense rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturel analyse af både uorganisk kemi og SAXSA. Røntgenkrystallografi blev udnyttet til at løse strukturen af Nsa1 velordnet N-terminale WD40 domæne, og derefter SAXSA blev brugt til at løse strukturen af C-terminus af Nsa1 i løsning. Løsning spredning data blev indsamlet fra gulv til loft Nsa1 i løsning. Teoretisk spredning amplituder blev beregnet ud fra den høje opløsning krystalstruktur af domænet WD40, og derefter en kombination af stiv krop og ab initio modellering afslørede C-terminus af Nsa1. Gennem denne hybrid tilgang blev hele proteinet kvaternære struktur rekonstrueret. De metoder, der præsenteres her bør gælde generelt for hybrid Strukturbestemmelse af andre proteiner består af en blanding af strukturerede og ustrukturerede domæner.

Introduction

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner, der udfører vigtige rolle omsætte mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomes er sammensat af to underenheder, der er produceret i en kompleks proces betegnes ribosomet Biogenese1,2,3,4. Eukaryote ribosomet forsamling bygger på ved hjælp af hundredvis af væsentlige ribosomale forsamling faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 knyttet 1) er en eukaryote ribosomet forsamling faktor, der specifikt kræves til produktion af store ribosomale subunit6, og er kendt som WD-repeat der indeholder 74 (WDR74) i højere organismer7. WDR74 har vist sig at være nødvendig for blastocyst dannelse i mus8og WDR74 promotor er ofte muteret i kræft celler9. Men funktion og præcise mekanismer af Nsa1/WDR74 i ribosomet forsamling er stadig stort set ukendt. For at begynde at afsløre rollen, som Nsa1/WDR74 i eukaryote ribosomet modning, blev flere strukturelle analyser udført, herunder røntgenkrystallografi og lille vinkel X-ray spredning (SAXSA)10.

Røntgenkrystallografi, Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, Elektron Mikroskopi og SAXSA er alle vigtige teknikker til at studere makromolekylære struktur. Størrelse, form, tilgængelighed og stabilitet af makromolekyler påvirkninger metoden strukturel biologi som en særlig makromolekyle vil være bedst egnet, men kombinerer flere teknikker gennem en såkaldt "hybrid" tilgang er at blive en i stigende grad gavnlig værktøj11. Især er røntgenkrystallografi og SAXSA kraftfulde og komplementære metoder for Strukturbestemmelse af makromolekyler12.

Krystallografi giver høj opløsning atomic strukturer spænder fra små molekyler til store cellulære maskiner såsom ribosomet, og har ført til mange gennembrud i forståelsen af de biologiske funktion af proteiner og andre makromolekyler13. Derudover udnytter struktur-baseret drug design styrken af krystal strukturer til molekylær docking af beregningsmetoder, tilføje en kritisk dimension til narkotikamisbrug opdagelse og udvikling af14. Trods sit brede anvendelighed er fleksibel og uordnede systemer udfordrende at vurdere krystallografi da crystal pakning kan hæmmes eller electron density maps kan være ufuldstændige eller af dårlig kvalitet. Omvendt er SAXSA en løsning-baseret og lav opløsning strukturelle tilgang i stand til at beskrive fleksible systemer spænder fra uordnede sløjfer og termini til uløseligt uordnede proteiner12,15,16. I betragtning af det er kompatibel med en bred vifte af partikel størrelser12, kan SAXSA arbejde synergistisk med krystallografi at udvide viften af biologiske spørgsmål, der kan adresseres af strukturelle undersøgelser.

Nsa1 er egnet til en hybrid strukturelle tilgang, fordi det indeholder et velstruktureret WD40 domæne efterfulgt af en funktionel, men fleksibel C-terminus, som ikke er indstillet til røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokol til kloning, udtryk og rensning af S. cerevisiae Nsa1 for hybrid Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og SAXSA. Denne protokol kan tilpasses for at studere strukturerne af andre proteiner, der består af en kombination af bestilte og uordnede regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. rekombinante Protein produktion og rensning af Nsa 1

  1. Nsa1 udtryk Plasmid Design og kloning
    1. Få eller købe S. cerevisiae genomisk DNA.
    2. PCR forstærke target sekvenser af Nsa1 (Nsa1FL, restkoncentrationer 1-463) og C-terminale afkortet Nsa1 (Nsa1ΔC, restkoncentrationer 1-434) med passende primere ved hjælp af genomisk DNA isoleret fra S. cerevisiae og smeltepunktet af omtrent 60 ° C med en forlængelse tid på 1-2 min. De følgende primere blev brugt til at forstærke Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 i Escherichia coli (E. coli) udtryk vektor pHMBP der indeholder en N-terminale 6 X-histidin tag efterfulgt af Maltose bindende Protein (MBPS) og en tobak Etch Virus (TEV) protease websted ved hjælp af kloning standardteknikker17 .
    4. Bruge DNA-sekventering til at kontrollere, at Nsa1 er klonet i ramme med N-terminalen hans MBP tag.
  2. Nsa1 Protein udtryk
    1. Omdanne en egnet E. coli udtryk plasmid(s) udtryk stamme med en T7 promotor-baseret system. Plade transformants på LB agar plader der indeholder 100 µg/mL ampicillin og inkuberes pladen inverteret natten over ved 37 ° C.
    2. Podes en 50 mL kultur af LB med 100 µg/mL ampicillin fra transformation plade, og dyrke det natten over med rysten på 200 rpm ved 37 ° C.
    3. Podes 3 x 1000 mL LB i Fernbach kolber med 100 µg/mL ampicillin med 15 mL af den overnight kultur og dyrke det med rysten på 200 rpm ved 37 ° C.
      Bemærk: For protein struktur løsning, selenomethionyl (SeMet) iblanding kan opnås ved at dyrke celler i M9 minimal medium, der er suppleret med SeMet og en aminosyre blanding til at hæmme methionin produktion før induktion, i modsætning til LB medier 18.
    4. Inducere udtryk af Nsa1 når OD600 når ~0.8 ved tilsætning af isopropylalkohol β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) i en endelig koncentration på 1 mM efterfulgt af inkubation ved 25 ° C natten over med rysten på 200 rpm.
    5. Høste celler ved centrifugering ved 4 ° C i 15 min. ved 5,050 x g.
      Bemærk: Celler kan gemmes langsigtede ved-80 ° C eller anvendes straks for protein oprensning.
  3. Nsa1 Protein oprensning
    1. Resuspend celler i 25 mL af lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM MgCl2) pre nedkølet ved 4 ° C, der indeholder et EDTA-fri protease hæmmer tablet.
    2. Lyse celler ved hjælp af sonikering ved 4 ° C (tid 7 min, 2 s på cyklus, 2 s off cycle; amplitude: 70%).
    3. Afklare lysate ved centrifugering ved 26,900 x g i 45 min. ved 4 ° C.
    4. Anvende afklaret lysate til en tyngdekraft flow kolonne fyldt med 10 mL af immobiliserede kobolt affinitet harpiks, pre ekvilibreres med lysisbuffer.
    5. Tillad supernatanten at passere over harpiksen af tyngdekraften flow ved 4 ° C og vask harpiks to gange med 100 mL lysisbuffer.
    6. Elueres Nsa1 med 20 mL af eluering buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol og 200 mM imidazol).
    7. Tage 15 μl af eluatet og køre det på en 4-15% SDS-PAGE gel til at kontrollere, at proteinet er elueret fra affinitet harpiks (figur 1A).
    8. Fjern MBP tag af TEV protease fordøjelsen. Der tilsættes 1 mL af TEV protease19 (1 mg/mL stock) til Nsa1 affinitet harpiks eluering og inkuberes det ved 4 ° C natten over.
    9. Koncentrat MBP kløvet Nsa1 til ~ 5 mL ved hjælp af en centrifugal filter med en molekylevægt skåret ud af 10 kDa.
    10. Anvende MBP-kløvet Nsa1 til en kolonne med gel-filtrering, pre ekvilibreres i buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% glycerol og 1 mM β-mercaptoethanol) (figur 1B).
    11. Analysere kolonne fraktioner fra gel filtrering til kontrollere, at MBP er kløvet og adskilt fra Nsa1 ved at køre 15 μl prøver på en 4-15% SDS-PAGE gel (figur 1B).
    12. Kombinere fraktioner der indeholder Nsa1 og koncentrere sig til 8 mg/mL ved hjælp af en centrifugal filter med en molekylvægt, skåret ud af 10 kDa.
    13. Bestemme proteinkoncentration ved måling af absorbans ved 280 nm på et spektrofotometer ved hjælp af udryddelse koefficient 42530 M-1cm-1. Bruge protein umiddelbart for proteolytisk screening og krystallisering forsøg.

2. krystallisering og proteolytiske Screening af Nsa 1

  1. Sparsomme Matrix krystal Screening af Nsa1
    1. Der centrifugeres 500 μL af 8 mg/mL bestanden af Nsa1 på 16.000 x g ved 4 ° C i 10 min.
    2. Setup krystallisering forsøg ved hjælp af en krystallisering robot og sparsom matrix krystal skærme. Fyld reservoir af 96 godt bakker med 30 μl af enkelte crystal raster reagenser fra sparsom matrix krystallisering skærme. Setup mødet dråber med robot ved at blande 250 nL af godt løsningen med 250 nL af protein løsning.
    3. Forsegle krystallisering plader med tape og inkuberes ved 25 ° C.
    4. Inspicere pladerne hver to dage for de første 2-3 uger med et stereomikroskop.
    5. Kontroller, at potentielle krystaller hits indeholder protein med en UV mikroskop.
      Bemærk: For Nsa1 to forskellige krystal former (kubik og ændres, figur 2A) blev opnået inden for 1 uge fra følgende skærmbilleder: JCSG + betingelse B11 (1,6 M natriumcitrat tribasisk dehydrere, pH 6,5) og guiden fældningsmiddel synergi skærmen blok 2 betingelse C11 (20.1%(v/v) PLØK 1500, 13.4%(v/v) PLØK 400, 0,1 M Tris HEPES/natriumhydroxid, pH 7,5).
  2. Proteolytisk Screening
    Bemærk: Under krystallisering optimering, blev det opdaget at de ændres krystaller af Nsa1 opstået som følge af proteolytiske kavalergang og krystallerne kan ikke duplikeres ved hjælp af den fulde længde protein. Ved hjælp af en kombination af begrænset proteolyse kombineret med massespektrometri, blev det fastslået, at C-terminus af Nsa1 var følsomme over for proteolyse og fjernelse af C-terminale halen var påkrævet for efterfølgende reproduktion af ændres krystal form ( Nsa1ΔC).
    1. Forberede 1 mg/mL protease stamopløsninger af følgende proteaser α-chymotrypsin, trypsin, elastase, papain, subtilisin og endoproteinase Glu-C.
    2. Oprette 1:10, 1: 100 og 1:1000 fortyndinger af hver 1 mg/mL protease bestand med fortynding Buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM natriumchlorid).
    3. Tilsæt 1 μl af protease stock (1:10, 1: 100 og 1:1000) til 9 μL delprøver af protein (1 mg/mL) for hver protease skal screenes.
    4. Inkuber løsning ved 37 ° C i 1 time.
    5. Reaktionen standses ved at tilføje 10 μL af prøvebuffer 2 x SDS-PAGE og varme reaktion på 95 ° C i 5 min.
    6. Analysere fordøjer ved at køre dem på en 4-15% SDS-PAGE gel (figur 2B).
    7. Identificere protease resistent domæner af target proteinet i-gel massespektrometri analyse.
    8. Fjerne de protease-labile regioner fra target proteinet, ved at skabe afkortet udtryk konstruktioner og efter kloning, -proteinekspression og -oprensning protokollen beskrevet ovenfor.
  3. Krystallisering optimering
    1. Forberede eller få stamopløsninger af følgende indledende krystallisering reagenser: 1,6 M natriumcitrat tribasisk dehydrere pH 6,5 100%(v/v) PLØK 400, 50%(v/v) PLØK 1500, 1 M HEPES/natriumhydroxid, pH 7,5.
    2. Forberede en stamopløsning af Nsa1FL og Nsa1ΔC på 8 mg/mL som beskrevet ovenfor.
    3. Optimere Nsa1 kubiske krystaller (Nsa1FL).
      1. Forberede en 24-godt gitter skærmen med wells indeholdende 500 µL med en gradient af 1-1,6 M af natrium citrat med pH 6,5 fra en stamopløsning af 1,6 M natriumcitrat tribasisk med pH 6,5.
      2. Mix 1 µL af protein med 1 µL af godt løsning og sted blandingen på en Silikoniseret dække dias. Omhyggeligt inverter dække dias oven på den pre-smurt godt og sikre, at det er godt forseglet men passe på at ikke forstyrre drop eller bryde det dække dias. Gentag denne proces, indtil bakken er fyldt og derefter gemme på 25 ° C.
        Bemærk: Små kubiske krystaller skal vises i 2-7 dage.
      3. Forberede en microseed bestand af de kubiske krystaller. Bruge en monteret nylon sløjfe til at overføre ~ 10 små kubiske krystaller at et 1.5 mL micro-centrifugerør indeholdende en lille perle og 50 µL af 1,6 M natriumcitrat tribasisk wit pH 6,5.
      4. Vortex 1,5 mL micro-centrifugerør ved høj hastighed (~ 3000 rpm) for 1 min.
      5. Lave en serie af 10-fold serielle fortyndinger af stamkultur med 1,6 M natriumcitrat tribasisk og vortex blandingen grundigt i 5 s.
      6. Fyld hver godt af en 24-godt gitter, skærm med 500 µL af 1,6 M natriumcitrat tribasisk pH 6,5.
      7. Optimere microseeding betingelser ved at oprette dråber med varierende forhold mellem protein med stamkultur løsninger (figur 3A). Større kubiske krystaller af høj diffraktion kvalitet bør vises i 2-5 dage (figur 3 c).
    4. Optimere de ændres krystaller (Nsa1ΔC)
      1. Forberede et gitter skærmen med 500 µL i hver brønd med 24 forskellige betingelser (figur 3B) fra stamopløsninger af 50%(v/v) PLØK 1500 og 100%(v/v) PLØK 400. Ud over forløb af PLØK 1500 og PLØK 400, bør hver godt også indeholde 0,1 M HEPES/natrium hydroxid pH 7,5.
      2. Mix 1 µL af protein løsning med 1 µL af godt løsning på et Silikoniseret dække dias. Omhyggeligt er inverter dække dias oven på den pre-smurt godt og sikre, at det godt lukkede. Gentag denne proces, indtil hele magasinet er blevet udfyldt. Gemme bakker ved 25 ° C.
        Bemærk: Nsa1 ændres krystaller skal vises i 2-7 dage.
      3. Yderligere optimere ændres krystaller af microseeding som beskrevet for de kubiske krystaller (trin 2.3.3.3 til 2.3.3.7) ved hjælp af 500 µL af 0,1 M HEPES/natrium hydroxid pH 7,5 20.1%(v/v) PLØK 1500 og 13.4%(v/v) PLØK 400 som godt-løsning.
        Bemærk: Nsa1 SeMet krystaller bør optimeres analog med de indfødte krystaller.

3. røntgen diffraktion dataindsamling og Nsa 1 struktur løsning

  1. Cryo-beskyttelse af krystaller og røntgen diffraktion dataindsamling
    1. For de ændres krystaller (Nsa1ΔC), forberede en 1 mL kryoprotektant løsning indeholdende 22.5%(v/v) PLØK 1500, 15%(v/v) PLØK 400 og 0,1 M HEPES/natrium hydroxid pH 7,5.
    2. Fyld en skum Dewar med flydende kvælstof, og pre-afkøle en krystal puck. Vær forsigtig, når du arbejder med flydende kvælstof og slid beskyttende handsker og beskyttelsesbriller.
    3. Omhyggeligt invertere diasset dækning af krystallisering godt indeholdende krystaller på scenen af et stereomikroskop.
    4. Der afpipetteres 2 µL af den kryoprotektant løsning på et nyt cover dias.
    5. Tillægge en magnetisk cryo wand en monteret nylon sløjfe af en passende størrelse for krystal.
    6. En crystal bruger ved hjælp af stereomikroskopet, hurtigt overføre til kryoprotektant løsning med monteret cryo loop.
    7. Lad krystal Blandingen henstår i 5 min i kryoprotektant-løsningen.
    8. Bruger ved hjælp af stereomikroskopet, hurtigt loop krystal fra kryoprotektant løsning og springet-freeze i flydende kvælstof.
    9. Vente på de flydende kvælstof omkring løkke til at holde op med kogende og derefter slippe loop fra tryllestaven i en bestemt placering inden for crystal pucken.
    10. Kubisk Nsa1FL krystaller behøver ikke at være cryoprotected og kan være direkte flash frosset (efter trin 3.1.8-3.1.9 ovenfor).
    11. Forsegle krystal pucken ved hjælp af cryo værktøjer og overføre til en forsendelse stok i en pre kølet dewar. Gemme krystaller i puck/dewars indtil dataindsamling.
    12. Hvis indsamling af data på en synchrotron, skibet krystaller til synkrotron ved hjælp af en tør afskiber.
    13. Indsamle røntgen diffraktion data efter standard teknikker20.
      Bemærk: For Nsa1 indfødte og SAD (single-bølgelængde anormal dispersion) datasæt blev indsamlet på 100 K på linjerne SER-kat beam 22-ID og 22-BM af avancerede Photon kilde ved Argonne National Laboratory (Chicago, IL). SAD Nsa1 dataset blev indsamlet ved λ = 0.97911 Å. Data blev registreret ved hjælp af gangen 1 s eksponering og 0,5 ° svingninger. Mosaicity af disse krystaller var typisk omkring 0,3 °.
    14. Behandle og skalere røntgen diffraktion billeder for at skabe refleksion filer for hvert datasæt i gruppen passende plads.
      Bemærk: Nsa1 diffraktion datasæt blev behandlet med HKL200021. Nsa1 kubiske krystaller blev behandlet i rummet gruppe P213 og ændres krystallerne er behandlet i rummet gruppe P212121.
  2. Nsa1 struktur løsning.
    Bemærk: Der er flere krystallografi software-pakker, der kan bruges til at løse og forfine krystal strukturer herunder Phenix og CCP422,23. Følgende er protokol til Nsa1 struktur løsning ved hjælp af Phenix software suite22.
    1. Analysere de indfødte og SAD skaleret datasæt med phenix.xtriage22.
    2. Løse strukturen af Nsa1 med Phenix.autosol ved hjælp af den TRISTE højdepunkt refleksion fil22,24. Hvis du vil køre programmet for AutoSol, input antallet af selenomethionin sites (sites = 9), filen fasta sekvens af Nsa1ΔC, og bølgelængde bruges til TRIST dataindsamling (λ = 0.97911 Å).
      Bemærk: Fra Nsa1 SAD datasæt, skal phenix.autosol være stand til at bestemme de eksperimentelle faser og opbygge de fleste af modellen.
    3. Foretage manuelle justeringer af modellen med Blishøne25, efterfulgt af raffinement i phenix.refine22,26.
    4. Løse strukturen af høj opløsning indfødte ændres krystal og kubisk krystal af molekylære udskiftning ved hjælp af Phaser27,28.
    5. Efter vellykket struktur løsning, inspicere modellen og electron density kort i Blishøne25.
    6. Opbygge og raffinere strukturerne ved at køre iterativ runder af raffinement i phenix.refine22,26 og model bygning i Blishøne25.

4. SAXSA indsamling, behandling, og modellering

  1. SAXSA dataindsamling
    Bemærk: SAXSA data blev registreret for fuld længde S. cerevisiae Nsa1 på den avanceret lyskilde, på høj overførselshastighed SIBYLS beamline 12.3.1 ved Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Rense Nsa1FL efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. 24 timer inden afsendelse af Nsa1FL til beamline, køre protein over en gel filtrering kolonne pre ekvilibreres i buffer A.
    2. Pool fraktioner der indeholder Nsa1 og bestemme proteinkoncentration som beskrevet tidligere.
    3. Forberede 30 μl delprøver af en koncentration serie af Nsa1 fra 1 til 6,2 mg/mL ved hjælp af buffer A.
    4. Overføre 20 μl af hver koncentration serie af Nsa1 til en klar fuld nederdel 96 godt mikrotiterplade sammen med buffer A alene kontrollerer.
      Bemærk: SAXSA data er indsamlet på fortyndede opløsninger ved hjælp af flere koncentrationer af renset prøve for at undgå sammenlægning, Inter partikel frastødning og stråling skader effekter.
    5. Forsegle mikrotiterplade med en silikone tætning mat og skibet natten over ved 4 ° C til beamline.
    6. Gemme mikrotiterplade ved 4 ° C indtil dataindsamling.
    7. Umiddelbart før dataindsamling, dreje pladen ved 3200 x g i 10 min. ved 4 ° C for at fjerne potentielle aggregater og luft bobler.
    8. SAXSA postdataene.
      Bemærk: For Nsa1, SAXSA data blev registreret for bufferen før og efter hvert protein koncentration serien. Tredive-tre på hinanden følgende scanninger af 0,3 s blev indsamlet til Nsa1FL over en koncentration serie (1 til 6.2 mg/mL) på 10 ° C.
    9. Udføre buffer subtraktion for SAXSA data.
      Bemærk: For Nsa1 buffer subtraktion blev gjort automatisk på beamline men buffer subtraktion kan også udføres ved hjælp af data reduktion software som Scatter30 og ATSAS suite31. Buffer subtraktion er en kritisk del af SAXSA dataanalyse og man skal sikre, at den buffer, der bruges til subtraktion er identisk med prøvebuffer protein.
    10. Gennemsnitlige 33 på hinanden følgende scanninger for at oprette en *ave.dat fil for hver koncentration.
      Bemærk: Overlay 33 på hinanden følgende frames for at sammenligne kurver. Ændringer til spredning kurver over tid er ofte udtryk for strålingsskader. Udelukke disse rammer fra i gennemsnit. Gennemsnit af Nsa1 på hinanden følgende scanninger blev udført automatisk på SIBYLS beamline.
  2. SAXSA databehandling og sammenligning af koncentration serie
    Bemærk: Der er flere software-pakker, der kan bruges til at analysere SAXSA data. For Nsa1 radius af gyration og parvise afstand distribution funktioner blev bestemt ved hjælp af PRIMUS32 og Elementarånder33 fra ATSAS 2.7.2 suite31 og sammenlignes på tværs af alle protein koncentration skal sikre, at der var ingen stråling skader eller koncentration-afhængige Inter partikel interaktioner10.
    1. Åbn en terminal shell og gå til den mappe, der indeholder SAXSA data.
    2. Lancere PRIMUS32 GUI fra indenfor den terminal shell.
    3. Inden for PRIMUS GUI, indlæse spredning kurver (* ave.dat).
    4. Bruge forfatterg bestemme Radius Gyration (Rg) og videresende spredning intensitet I(0), for hver spredning kurve (* ave.dat).
    5. Generere Kratky parceller for hver spredning kurve (* ave.dat), til at vurdere graden af kompakthed.
    6. Bruge AutoGNOM33 til at beregne den parvise fordelingsfunktion (også kaldet P(r)) for hver spredning kurve (* ave.dat). Angiv en start Dmax ≈ 3 * Rg og optimere Dmax værdien for at opnå en jævn P(r) kurve. Under optimering af Dmax, sikre, at den beregnede P(r) funktion er i overensstemmelse med den eksperimentelle spredning kurve ved at markere den rapporterede χ2 værdi og visuelt vurdere den samlede passer til spredning kurve.
    7. Beregn Molekylærbiologisk vægt af Nsa1 fra spredning kurver ved hjælp af volumen af korrelation34.
    8. Sammenligne de strukturelle parametre for hver koncentration for at sikre, at der er ingen strålingsskader eller koncentration-afhængige effekter.
      Bemærk: Koncentration virkninger kan manifestere sig som en stigende Rg og Dmax i forbindelse med en stigende proteinkoncentration. Videre spredning I(0) divideret med den prøve koncentration bør også forblive konstante på tværs af protein koncentration serierne.
  3. SAXSA modellering
    Bemærk: For at bestemme placeringen af C-terminus af Nsa1FL, Nsa1 krystal struktur10 (FBF 5SUM) og SAXSA spredning kurver blev brugt til at udføre en kombination af stiv krop og ab initio modellering, ved hjælp af programmer flok 35 og Ensemble optimering metode (EOM)36 fra ATSAS software suite31. Domænet WD40 af Nsa1 blev behandlet som en stiv krop, mens C-terminalen af Nsa1 sammen med flere uordnede loops fra domænet WD40 blev modelleret passer SAXSA forsøgsdata.
    1. Generere input FBF fil(er). PDB-filen skal opdeles hver gang rester er forsvundet fra de største kæde, og PDB-fil kan ikke indeholde flere konformationer, ligander, eller vand molekyler.
    2. Kør programmet Pre_BUNCH35 at udarbejde FBF inputfilen for flok (pre_bunch.pdb). Input sekvens af target proteinet (*.seq), antallet af domæner/udhuling genereret i 4.3.1, og hver af de enkelte FBF filer genereret ovenfor.
    3. Beregne spredning amplituder for hver enkelte FBF fil ved hjælp af programmet CRYSOL37. At køre CRYSOL input filen individuelle FBF og den eksperimentelle SAXSA spredning kurve (*.dat). Dette vil generere en amplituder fil (* .alm).
    4. Kør programmet flok35 til model WD40 domæne Nsa1 mod SAXSA data ved hjælp af en kombineret stiv krop og ab initio tilgang. Input PDB-filen fra Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), den eksperimentelle SAXSA spredning kurve (*.dat) og den enkelte amplitude (* .alm) filer til hvert delvise PDB-fil genereret af CRYSOL.
    5. Sammenlign værdien χ2 fra start FBF (5SUM) med at fra ab initio modellen genereret af flok ved hjælp af forsøgsdata SAXSA.
      Bemærk: En vellykket flok model bør have en betydeligt lavere χ2 værdi end den første model. Den teoretiske spredning af flok modellen bør også beskrive godt eksperimentelle data som bedømmes ved besigtigelse af overlay mellem den teoretiske spredning af flok modellen til SAXSA data og dens χ2 værdi (figur 4, Center pipeline).
    6. Manuelt inspicere outputfiler fra klase i Pymol38 til overlay krystalstruktur med den model, der er genereret af flok, og SAXSA kuvert (figur 4, center pipeline).
    7. ReRun flok 10 - 20 gange til at oprette uafhængige modeller for at bekræfte, at modellerne er ens.
      Bemærk: For Nsa1 var der en række χ2 værdier fra ~ 1 til 3 fra 20 uafhængige kører.
    8. Ensemble modellering
      Bemærk: som en valgfri tilgang til flok køre enten EOM36 eller Minimal Ensemble Søg39 (MES). EOM og MES bruge ensemble tilgange, som er velegnet til proteiner med fleksible domæner/regioner, der er i flere konformationer.
      1. Køre programmet EOM36 ved hjælp af ATSAS online server. Hvis du vil køre EOM, input FBF filer fra 4.3.1, rækkefølgen af target proteinet (*.seq), og den eksperimentelle SAXSA data (*.dat).
      2. Sammenligne χ2 værdier fra start FBF (5SUM) med at fra ensemblet genereret af EOM ved hjælp af forsøgsdata SAXSA.
        Bemærk: En vellykket EOM ensemble bør have en betydeligt lavere χ2 værdi end den første model. Den teoretiske spredning af ensemblet bør også beskrive godt eksperimentelle data som bedømmes ved besigtigelse af overlay mellem den teoretiske spredning af ensemble til SAXSA data og dens χ2 værdi (figur 4, højre pipeline). Man skal også sammenligne χ2 værdier fra flok og EOM til at bestemme, hvilken model der bedst beskriver SAXSA forsøgsdata.
      3. Manuelt inspicere EOM konformere i Pymol38 for at overlejre krystalstruktur med konformere genereret af EOM (figur 4). Bemærk det samlede antal konformere og fraktion brugsret for hver konformer, der bidrager til spredning kurve. For mere stive molekyler, såsom Nsa1, antallet af konformere bør være små (1-5) (figur 4, højre pipeline)36.
      4. Kør igen EOM flere gange for at sikre ensartede resultater.
        Bemærk: Nsa1 antallet af konformere var typisk 3 til 4 med χ2 værdier spænder fra 0,1 til 0,3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nsa1 var PCR forstærket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor, der indeholder en N-terminale 6 x-histidin affinitet tag efterfulgt af MBP og en TEV protease site. Nsa1 blev omdannet til E. coli BL21(DE3) celler og høje udbytter af protein udtryk blev opnået efter induktion med IPTG og vækst ved 25 ° C natten over (figur 1A). Nsa1 var affinitet renset på immobiliserede kobolt affinitet harpiks, efterfulgt af MBP kavalergang med TEV protease, og endelig løst ved størrelse udstødelse kromatografi (figur 1B). Fraktioner fra størrelse udstødelse kromatografi indeholdende Nsa1 blev samlet, koncentreret til 8 mg/mL og derefter bruges til krystallisering forsøg med en krystallisering robot. Indledende sparsomme matrix krystal skærme givet to forskellige former for Nsa1, cubic og ændres (figur 2A).

Under optimering de krystaller, cubic og ændres, blev det opdaget, at de ændres krystaller opstod som følge af proteolytiske spaltning af Nsa1. Begrænset proteolyse og massespektrometri blev brugt til at bestemme Nsa1, som var følsomme over for proteolyse-regionen, og det blev observeret, at Nsa1 var følsomme over for en koncentration graduering af protease elastase (figur 2B). Efterfølgende massespektrometri analyse bekræftet, at denne forringelse skyldes tab af C-terminus af Nsa1. En serie af C-terminale udeladelser af Nsa1 blev genereret for at fjerne de proteolytiske følsomme C-terminus (figur 2 c). De ændres krystaller kan gentages med Nsa1ΔC (rester 1-434) trunkering, som i sidste ende blev brugt til bestemmelse af TRIST struktur. De ændres krystaller kan også gentages ved at behandle Nsa1FL med elastase i 1 time ved 4 ° C forud for oprettelsen af krystal bakker.

Kubisk Nsa1 krystaller var optimeret ved hjælp af Nsa1FL gennem en kombination af natriumcitrat forløb, kombineret med microseeding (figur 3A). Dette gav store, reproducerbare kubiske krystaller, med en diffraktion grænse på omkring 2,8 Å opløsning (figur 3 c, venstre). De ændres krystaller kan kun optimeres ved hjælp af C-terminale trunkering varianter af Nsa1, af varierende koncentration forløb af PLØK 1500 og PLØK 400, kombineret med microseeding, som viste store krystaller med en diffraktion grænse på omkring 1,25 Å opløsning (Fig. 3A-C). Eksperimentelle faser af Nsa1 blev bestemt af SeMet-SAD fra en SeMet-afledt Nsa1ΔC10.

Den N-terminale syv-blade β-propel WD40 domæne Nsa1 blev godt løst i både kubiske og ændres krystal strukturer, men begge strukturer manglede electron density for C-terminus af Nsa1. SAXSA blev derefter brugt til at bestemme placeringen af manglende C-terminale domæne Nsa1 i løsning. Efter optimering af prøven koncentration for indsamling af data, blev delvis atomare struktur brugt til at udføre kroppen stiv modellering, og generere en ab initio rekonstruktion af de manglende komponenter. Modellen blev evalueret i form af egnet til de beregnede spredning kurver til forsøgsdata (figur 4, center pipeline) godhed. Domænet WD40 af Nsa1 alene er ikke en god pasform af forsøgsdata SAXSA, som det fremgår af uoverensstemmelse mellem den eksperimentelle spredning kurve med den teoretiske spredning kurve, som blev genereret fra krystalstruktur PDB ID 5SUM (fig. 4, venstre pipeline). Ud over kroppen stiv modellering, blev ensemble modellering også gjort. Dette produceret et ensemble af 3 til 4 konformere af Nsa1 og resulterede i en lavere χ2 værdi (figur 4, højre pipeline). Reduktion i model uoverensstemmelse (χ2) ved hjælp af ensemble modellering afslørede konformationelle prøveudtagning af Nsa1 C-terminale halen i løsning.

Figure 1
Figur 1. Proteinekspression og -oprensning af Nsa1 med en 6 X-hans-MBP fusion tag. (A) SDS-PAGE analyse af protein udtryk i BL21 (DE3) celler ved 25 ° C natten over og den første oprensning trin ved hjælp af kobolt affinitet harpiks. (B) repræsentative størrelse udstødelse kromatogrammet efter TEV kavalergang. Fraktioner fra størrelse udstødelse chromatografi blev analyseret af SDS-PAGE. Fraktioner fra peak 1 indeholdende Nsa1 blev indsamlet og brugt til strukturel analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. C-terminus af Nsa1 er følsom overfor proteolyse. A indledende krystallisering forsøg med Nsa1 gav to forskellige krystaller former: kubik og ændres. UV mikroskop blev brugt til at kontrollere, at krystallerne indeholdt protein. Vis: Synligt lys, UV: UV mikroskoper. Skalalinjen = 50 µm i hvert vindue. B proteolytiske screening analyseret af SDS-PAGE. Tre fortyndinger (1:10, 1: 100, 1:1000) for hver protease bestand (0,1, 0,01, 0,001 mg/mL) var kombineret med delprøver af protein (1 mg/mL) skal screenes. Protease resistent domæner blev analyseret den af SDS-PAGE og massespektrometri efter 37 ° C inkubation i 60 min. Nsa1-FL: frisk renset protein, Nsa1Δ: renset protein opbevares ved 4 ° C i 3 uger hvorefter en forringet form af protein blev observeret. C skematisk diagram over den Nsa1 fuld længde (øverste) og C-terminale trunkering konstruere (lavere). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Nsa1 krystallisering optimering. (A) en stamkultur blev forberedt fra første små krystaller og bruges til at lave en fortyndingsrække (1 x ~ 1/104x) (microseeding). Ved at blande 1 µL af protein med 1 µL af de fortyndede stamkultur, voksede de større enkelt krystaller inden for en uge. B fældningsmiddel koncentration hældning over ændres krystal optimering. (C) optimeret kubik og ændres krystaller bruges til dataindsamling. Grønne cirkler angiver området typisk krystal bakker, der gav dataindsamling kvalitet krystaller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Skematisk af Nsa1 SAXSA analyse. Oversigt over den rørledning, der bruges til at behandle SAXSA data og generere modeller med flok (center) og EOM (til højre). Den venstre pipeline viser misforholdet mellem den eksperimentelle spredning kurve (røde cirkler, proteinkoncentration: 6 mg/mL) med den teoretiske spredning kurve (blå linje), som blev genereret fra krystalstruktur PDB ID 5SUM. Modellerne blev evalueret ved at sammenligne den eksperimentelle SAXSA spredning kurve (røde cirkler, proteinkoncentration: 6 mg/mL) med spredning kurven stammer fra flok modellen af Nsa1 (sort linje) eller EOM konformere af Nsa1 (sort linje). I hver model, er domænet WD40 vist i tegneserie farvede i grøn (PDB ID 5SUM), den fleksible C-terminus er vist i kugler farvet i rødt for flok og grøn, magenta, cyan og gul for de enkelte EOM konformere. Brøkdel af hver konformer stammer fra EOM er mærket ved siden af modellen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjælp af denne protokol, blev rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae genereret for strukturelle undersøgelser af både uorganisk kemi og SAXSA. Nsa1 var velopdragen i løsning og krystalliseret i flere krystal formularer. Under optimering af disse krystaller, blev det opdaget, at C-terminus af Nsa1 var følsomme over for protease nedbrydning. Den høje opløsning, ændres krystalform kunne kun være duplikeres med C-terminale trunkering varianter af Nsa1, sandsynligvis fordi den fleksible C-terminus af Nsa1 forhindrede krystal pakning. Strukturen i Nsa1 blev løst af røntgenkrystallografi til høj opløsning, men C-terminus kan ikke bygges i enten krystalform, fordi det ikke var bestilt. Krystallografi er den premiere teknik til bestemmelse af atomic opløsning strukturer af makromolekyler omkring størrelsen af Nsa1, men som med enhver metode, krystallografi har nogle begrænsninger. En af de store begrænsninger i krystallografi er den manglende evne til at løse uordnede regioner af proteiner40,41.

C-terminus af Nsa1 er vigtigt for ordentligt nucleolar lokalisering af protein, hvilket understreger behovet for at studere dens struktur10. C-terminus af Nsa1, blev løst af SAXSA, en supplerende strukturbiologi teknik til røntgenkrystallografi. SAXSA data var registreret for fuld længde Nsa1 på tværs af en fusion serien. Fra denne koncentration serie, blev den optimale koncentration for Nsa1 SAXSA indsamling og forarbejdning fastsat. SAXSA data blev registreret for Nsa1 på 6, 4.5 og 3,0 mg/mL. Guinier region, P(r) funktion og Molekylær vægt blev fastsat på tværs af rækken koncentration til at sikre, at stikprøven var velopdragne og ikke samlet de eksperimentelle betingelser testet. For at rekonstruere den fuld længde struktur af Nsa1, teoretiske spredning amplitude blev bestemt ud fra den delvise krystalstruktur og derefter ab initio metoder blev brugt til at modellere den fleksible C-terminus. Denne hybrid tilgang, blev det fastslået, at den fleksible C-terminus af Nsa1 strækker sig udad fra domænet bestilte WD40.

Fremskridt i behandlingen af værktøjer har drevet SAXSA popularitet for makromolekylære strukturelle studier. SAXSA måler X-ray spredning mønster fra tilfældigt orienterede protein i løsning med lav opløsning strukturelle oplysninger, herunder molekylmasse og overordnet form. Derfor fremstod SAXSA som en kraftfuld ortogonale struktur efterprøvelse værktøj for krystallografi. Dette skyldes i høj grad udviklingen af beregningsmetoder til at beregne teoretiske spredningen af atomare strukturer og sammenligne dem med eksperimentelle SAXSA data37. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, konformationelle staten, kvaternære struktur og højere-ordens forsamling observeret i en krystalgitter kan sammenlignes med de strukturelle karakteristika af partiklen i løsning. Derudover kan uordnede sløjfer og termini mangler i høj opløsning strukturer bestemmes af røntgenkrystallografi modelleres med løsning spredning data. Denne hybrid strukturelle tilgang bruger krystalstruktur som en byggesten for SAXSA-styrede modellering af manglende restkoncentrationer og har vist sig for at være effektiv i kortlægning af C-terminus Nsa110, samt andre makromolekyler såsom influenza A virus M1 matrix protein42og døde-kasse RNA chaperoner43. Avanceret SAXSA-baseret modellering software kan også behandle mere komplekse systemer, som uløseligt uordnede proteiner, ved at knytte disse systemer ved hjælp af en række konformere, der sammen bidrager til den samlede spredning konformationelle landskab potentiale for partikel i løsning16,39. Taget sammen, de seneste fremskridt i SAXSA data indsamling og forarbejdning tools bidrager til succes for hybride strukturbiologi tilgange til at løse udfordrende biologiske systemer.

Kombinationen af løsning spredning med høj opløsning strukturer er klar til at besvare vigtige spørgsmål om fleksibilitet og dynamik af makromolekyler44. Mange proteiner, såsom Nsa1, har dynamiske regioner, der er vigtige for biologiske funktion. I dette manuskript er en skabelon-protokollen fastsat som beskriver kombinationen af SAXSA med høj opløsning struktur bestemmelse af røntgenkrystallografi. Ud over røntgenkrystallografi SAXSA kan også bruges til at komplimentere andre strukturbiologi teknikker herunder NMR, elektron paramagnetisk resonans (EPR) og fluorescens resonans energi overføre (FRET), yderligere fremhæve betydningen af SAXSA som en supplerende strukturbiologi teknik45,46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Diffraktion data blev indsamlet på sydøst regionale samarbejdsprojekter adgang Team (SER-kat) 22-ID og 22-BM beamlines på avanceret Photon kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXSA data blev indsamlet på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vil gerne takke personalet på SIBYLS beamline for deres hjælp med remote dataindsamling og forarbejdning. Vi er taknemmelige for den nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjælp fastsættelse af protein domæne grænser. Dette arbejde blev støttet af os National Institute for sundhed murene forskningsprogram; Amerikanske National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR, 146626 til M.C.P). Brug af APS blev støttet af os Department of Energy, Office of Science, Office of grundlæggende energi Sciences under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Brug af avanceret lys kilde (ALS) blev støttet af direktør, Office of Science, Office af energi Grundvidenskab, af det amerikanske Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Yderligere støtte til SIBYLS SAXSA beamline kommer fra National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) og en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vil også gerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritiske læsning af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

Biokemi sag 131 røntgenkrystallografi SAXSA Hybrid metoder Protein oprensning WD40 domæne begrænset proteolyse ribosomet forsamling
Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra <em>S. Cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter