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Biochemistry

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Cette méthode décrit le clonage, expression et purification de Nsa1 recombinant pour détermination structurale par diffraction des rayons x et la diffusion des rayons x de petits angles (SAXS) et est applicable pour l’analyse structurale de l’hybride d’autres protéines contenant à la fois ordonnée et désordonnée des domaines.

Abstract

Détermination de la structure pleine longueur de facteur d’assemblage de ribosome Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) est difficile à cause du désordre et de la protéase labile extrémité C-terminale de la protéine. Cet article décrit les méthodes pour purifier recombinant Nsa1 de S. cerevisiae pour l’analyse structurale par diffraction des rayons x et SAXS. Cristallographie aux rayons x a été utilisée pour résoudre la structure du domaine N-terminal WD40 bien ordonnée de Nsa1, et ensuite les SAXS a été utilisée pour résoudre la structure de l’extrémité C-terminale de la Nsa1 en solution. Données de diffusion solution a prélevé la pleine longueur Nsa1 en solution. Les amplitudes de diffusion théoriques sont calculées à partir de la structure cristalline à haute résolution de la domaine de WD40, et une combinaison de corps rigide et ab initio de modélisation révèle alors l’extrémité C-terminale de Nsa1. Grâce à cette approche hybride, la structure quaternaire de la protéine entière a été reconstruite. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la détermination de structure hybride d’autres protéines, composé d’un ensemble de domaines structurées et non structurées.

Introduction

Les ribosomes sont des machines de ribonucléoprotéine grand qui exécutent le rôle essentiel de la traduction des ARNm en protéines dans toutes les cellules vivantes. Les ribosomes sont composées de deux sous-unités qui sont produites dans un processus complexe appelé ribosome biogenèse1,2,3,4. Assemblage du ribosome eucaryote s’appuie sur l’aide de centaines d’Assemblée ribosomique essentiels facteurs2,3,5. Nsa1 (Nop7 associés 1) est un facteur d’assemblage de ribosomes eucaryotes qui est formellement requis pour la production de la grande sous-unité ribosomique6, et est connu comme WD-répétition contenant 74 (WDR74) au plus élevé des organismes7. WDR74 s’est avéré être requis pour la formation du blastocyste en souris8et le promoteur WDR74 est fréquemment muté dans les cellules de cancer9. Cependant, la fonction et des mécanismes précis de Nsa1/WDR74 dans l’assemblage du ribosome sont encore largement inconnus. Pour commencer à découvrir le rôle de Nsa1/WDR74 au cours de la maturation des ribosomes eucaryotes, multiples analyses structurelles ont été effectuées, y compris la cristallographie aux rayons x et petit angle de dispersion (SAXS) rayons x10.

Cristallographie aux rayons x, spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), microscopie électronique et SAXS sont tous importants techniques pour étudier la structure macromoléculaire. Taille, forme, disponibilité et stabilité des influences de macromolécules adaptée de la méthode de biologie structurale pour lesquels une macromolécule particulière sera le meilleure, cependant combinant plusieurs techniques grâce à une approche dite « hybride » devient un outil de plus en plus bénéfique11. En particulier, diffraction et SAXS sont puissants et complémentaires des méthodes pour la détermination de structure des macromolécules12.

Cristallographie fournit la structure atomique haute résolution allant de petites molécules à grande machinerie cellulaire telles que le ribosome et a conduit à de nombreuses percées dans la compréhension des fonctions biologiques de protéines et d’autres 13de macromolécules. En outre, conception de médicaments basée sur la structure exploite la puissance des structures cristallines pour l’amarrage moléculaire par des méthodes de calcul, ajoutant une dimension critique à la drogue découverte et développement14. Malgré son applicabilité large, souples et désordonnées des systèmes sont difficiles à évaluer par cristallographie puisque l’empilement cristallin peut être entravé ou cartes de densité d’électron peuvent être incomplètes ou de mauvaise qualité. À l’inverse, SAXS est une approche structurelle faible résolution et axée sur la solution capable de décrire les systèmes flexibles allant de boucles désordonnées et termini à protéines intrinsèquement désordonnées12,15,16. Vu qu’il est compatible avec un large éventail de tailles de particules12, SAXS peuvent agissent en synergie avec la cristallographie à élargir l’éventail des questions biologiques qui peuvent être traités par des études structurales.

Nsa1 est adapté pour une approche structurelle de l’hybride car il contient un domaine WD40 bien structuré, suivi d’un C-terminus fonctionnel, mais flexible qui n’est pas favorable à des méthodes de diffraction des rayons x. Voici un protocole pour le clonage, expression et purification de Nsa1 de S. cerevisiae pour la détermination de structure hybride par cristallographie aux rayons x et SAXS. Ce protocole peut être adapté pour étudier les structures d’autres protéines qui sont constituées d’une combinaison de régions ordonnées et désordonnées.

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Protocol

1. recombinant Protein Production et Purification de RN 1

  1. Nsa1 Expression plasmide Design et clonage
    1. Obtenir ou acquérir l’ADN génomique de S. cerevisiae .
    2. PCR amplifier les séquences cibles de Nsa1 (Nsa1FL, résidus 1-463) et C-terminal tronqué Nsa1 (Nsa1ΔC, résidus 1-434) avec des amorces appropriées à l’aide de l’ADN génomique isolé de S. cerevisiae et une température de fusion environ 60 ° C avec une prorogation de délai de 1 à 2 min. Les amorces suivantes ont été utilisées pour amplifier les Nsa1 :
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv : GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 dans l’Escherichia coli (e.coli) expression vector pHMBP contenant un N-terminal 6 tag X-Histidine suivie le Maltose Binding Protein (MBP) et un site de protéase tabac Etch Virus (TEV) en utilisant des techniques de clonage standards17 .
    4. Séquençage de l’ADN permet de vérifier que Nsa1 a été cloné en trame avec l’étiquette de son-MBP N-terminale.
  2. Expression de la protéine Nsa1
    1. Transformer l’expression plasmid(s) un convenable e. coli souche d’expression avec un système T7 promoteur. Plaque les transformants sur plaques de gélose LB contenant le 100 µg/mL ampicilline et incuber la plaque inversée pendant une nuit à 37 ° C.
    2. Ensemencer une culture de 50 mL de LB avec de l’ampicilline 100 µg/mL de la plaque de transformation et pousser du jour au lendemain avec agitation à 200 tr/min à 37 ° C.
    3. Inoculer 3 x 1000 mL de LB dans des flacons de Fernbach avec de l’ampicilline 100 µg/mL avec 15 mL de la culture au jour le jour et développez-le en agitant à 200 tr/min à 37 ° C.
      Remarque : Pour solution de structure protéique, incorporation de selenomethionyl (SeMet) peut être obtenue en cultivant des cellules dans un milieu minimal M9 qui est additionné de SeMet et un mélange d’acides aminés pour inhiber la production de méthionine avant induction, par opposition aux médias LB 18.
    4. Induire l’expression de Nsa1 lorsque l' OD600 atteint ~0.8 par addition d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM, suivie d’une incubation à 25 ° C durant la nuit avec la secousse à 200 tr/min.
    5. Récolter les cellules par centrifugation à 4 ° C pendant 15 min à 5 050 x g.
      NOTE : Les cellules peuvent être stockées à long terme à-80 ° C ou utilisés immédiatement pour la purification de la protéine.
  3. Purification des protéines Nsa1
    1. Remettre en suspension les cellules dans 25 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % de glycérol, 10 mM MgCl2) préalablement réfrigérée à 4 ° C, contenant un comprimé inhibiteur de protéase sans EDTA.
    2. Lyse des cellules par sonication à 4 ° C (temps de 7 min, 2 s sur cycle, 2 s hors cycle ; amplitude : 70 %).
    3. Clarifier le lysat par centrifugation à 26 900 g pendant 45 min à 4 ° C.
    4. Appliquer a précisé lysat à une colonne de flux de gravité 10 ml de résine cobalt immobilisée, préalablement équilibrés avec tampon de lyse.
    5. Laisser le liquide surnageant à passer sur la résine par écoulement gravitaire à 4 ° C et laver la résine deux fois avec 100 mL de tampon de lyse.
    6. Éluer Nsa1 avec 20 mL d’un tampon d’élution (50 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl, 5 mM MgCl2, 5 % de glycérol et d’imidazole de 200 mM à 500 mM).
    7. Prendre 15 μl de l’éluat et l’exécuter sur un gel de SDS-PAGE 4-15 % pour vérifier que la protéine est éluée de la résine (Figure 1 a).
    8. Supprimez la balise MBP par digestion protéasique TEV. Ajouter 1 mL de TEV protéase19 (stock 1 mg/mL) à l’élution de résine Nsa1 affinité et il incuber une nuit à 4 ° C.
    9. Concentré de MBP clivée Nsa1 à ~ 5 mL en utilisant un filtre centrifuge avec un poids moléculaire couper hors 10 kDa.
    10. Appliquer Nsa1 clivée MBP à une colonne de gel filtration, pré s’équilibrent dans un tampon (20 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl, 1 mM MgCl2, 5 % de glycérol et β-mercaptoéthanol de 1 mM à 100 mM) (Figure 1 b).
    11. Analyser les fractions de colonne de gel filtration pour vérifier que le MBP est clivé et séparé de Nsa1 en exécutant 15 échantillons μL sur un gel de SDS-PAGE 4-15 % (Figure 1 b).
    12. Combinez les fractions contenant Nsa1 et à 8 mg/mL en utilisant un filtre centrifuge avec un poids moléculaire couper hors 10 kDa.
    13. Déterminer la concentration de la protéine en mesurant l’absorbance à 280 nm sur un spectrophotomètre à l’aide de l’extinction coefficient 42530 M–1cm–1. Utiliser la protéine immédiatement pour les essais de criblage et de cristallisation protéolytiques.

2. la cristallisation et dépistage protéolytique de RN 1

  1. Sparse Matrix cristal projection du Nsa1
    1. Centrifuger à 500 μL de l’encours de 8 mg/mL de Nsa1 à 16 000 x g à 4 ° C pendant 10 min.
    2. Installation d’essais de cristallisation à l’aide d’un robot de cristallisation et des écrans à cristaux matrices creuses. Remplir le réservoir de 96 puits plateaux 30 μl des réactifs écran cristaux individuels à partir des écrans de cristallisation de matrices creuses. Gouttes de la séance d’installation avec le robot en mélangeant 250 nL de la solution bien avec 250 nL de la solution de protéines.
    3. Sceller les plaques de cristallisation avec du ruban adhésif et les incuber à 25 ° C.
    4. Inspecter les plaques tous les deux jours pour les 2-3 premières semaines avec un stéréomicroscope.
    5. Vérifiez que hits potentiels de cristaux contiennent des protéines avec un microscope UV.
      Remarque : Pour Nsa1 deux formes cristalline différente (cubes et orthorhombique, Figure 2 a) ont été obtenues dans la semaine à partir des écrans suivants : JCSG + État B11 (1,6 M sodium citrate tribasique déshydrater, pH 6,5) et Assistant Precipitant synergie écran bloc 2 État C11 (20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) PEG 400, hydroxyde de Tris HEPES/sodium 0,1 M, pH 7,5).
  2. Protéolytique dépistage
    Remarque : Lors de l’optimisation de la cristallisation, on a découvert que les cristaux orthorhombiques de Nsa1 résultent d’un clivage protéolytique et les cristaux n’a pu être reproduites à l’aide de la protéine pleine longueur. En utilisant une combinaison de protéolyse limitée couplée à la spectrométrie de masse, il a été déterminé que l’extrémité C-terminale de Nsa1 était sensible à la protéolyse et retrait de la queue de C-terminal était nécessaire pour reproduction ultérieure de la (forme de cristaux orthorhombiques Nsa1,ΔC).
    1. Préparer 1 mg/mL de protéase solutions des protéases suivant α-chymotrypsine, la trypsine, élastase, papaïne, subtilisine et endoprotéinase Glu-C.
    2. Créer le 01:10, 1/100 et 1/1000 des dilutions de chaque stock de protéase de 1 mg/mL avec le tampon de Dilution (HEPES, pH 7.5, chlorure de sodium 500 mM de 10 mM).
    3. Pipetter 1 μL de stock de la protéase (01:10, 1/100 et 1/1000) dans 9 parties aliquotes μL de protéines (1 mg/mL) pour chaque protéase à être projeté.
    4. Incuber la solution à 37 ° C pendant 1 h.
    5. Arrêter la réaction en ajoutant 10 μL de tampon 2 x SDS-PAGE et la chaleur de la réaction à 95 ° C pendant 5 min.
    6. Analyser les condensés de leur exécution sur un gel de SDS-PAGE 4-15 % (Figure 2 b).
    7. Identifient des domaines résistant à la protéases de la protéine cible par analyse de spectrométrie de masse en gel.
    8. Supprimer les zones protéase labile de la protéine cible en créant des constructions expression tronquée et suite au protocole de clonage, expression et purification décrite ci-dessus.
  3. Optimisation de cristallisation
    1. Préparer ou obtenir des solutions mères des réactifs initiaux cristallisation suivants : 1,6 M sodium citrate tribasique déshydrater 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) 1500 PEG, HEPES/soude de 1 M, pH 6,5, pH 7,5.
    2. Préparer une solution de Nsa1FL et Nsa1ΔC à 8 mg/mL, tel que décrit ci-dessus.
    3. Optimiser les cristaux cubiques de Nsa1 (Nsa1FL).
      1. Préparer un écran 24 puits grille avec puits contenant 500 µL avec une pente de 1 à 1,6 M de citrate de sodium avec pH 6.5 d’une solution mère de 1,6 M sodium citrate tribasique avec pH 6,5.
      2. Mélanger 1 µL de protéine avec 1 µL de solution bien et placer le mélange sur une lame de mastic couverture. Soigneusement inverser la diapositive de couverture sur le dessus au préalable graissé bien et s’assurer qu’il est bien scellé, mais prendre soin de ne pas déranger la goutte ou briser la lame de la couverture. Répétez ce processus jusqu'à ce que le bac est plein et ensuite stocker à 25 ° C.
        NOTE : Petits cristaux cubiques doit apparaître dans les 2 à 7 jours.
      3. Préparation d’un stock de microseed des cristaux cubiques. Utiliser une boucle de nylon monté à transférer environ 10 petits cristaux cubiques dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 mL contenant un petit boudin et 50 µL de 1,6 M citrate de sodium wit tribasique de pH 6,5.
      4. Vortex le tube à centrifuger-micro 1,5 mL à haute vitesse (~ 3000 tr/min) pendant 1 min.
      5. Faire une série de dilutions en série 10 fois le stock de graines avec 1,6 M sodium citrate tribasique et vortex le mélange soigneusement pendant 5 s.
      6. Remplir chaque bien d’une grille de 24 puits, écran avec 500 µL de 1,6 M sodium citrate tribasique pH 6,5.
      7. Optimiser les conditions de microseeding en mettant en place les gouttes avec des proportions variables de la protéine avec les solutions de semences (Figure 3 a). Grands cristaux cubiques de qualité élevée diffraction doit apparaître dans 2 à 5 jours (Figure 3).
    4. Optimiser les cristaux orthorhombiques (Nsa1ΔC)
      1. Préparer un écran de grille avec 500 µL à chaque puits avec 24 différentes conditions (Figure 3 b) de solution mère de 50%(v/v) 1500 PEG et 100%(v/v) PEG 400. Outre des gradients de 1500 PEG et PEG 400, chacun bien devrait contenir 0,1 M HEPES/sodium hydroxyde de pH 7,5.
      2. Mélanger 1 µL de solution de protéine 1 µl de la solution bien sur une lame de mastic couverture. Soigneusement inverser la diapositive de couverture sur le dessus au préalable graissé bien et s’assurer qu’il est bien scellée. Répétez ce processus jusqu'à ce que le plateau entier a été rempli. Stocker les plateaux à 25 ° C.
        Remarque : Nsa1 cristaux orthorhombiques doit apparaître dans les 2 à 7 jours.
      3. Optimisez les cristaux orthorhombiques par microseeding comme pour les cristaux cubiques (étapes 2.3.3.3 à 2.3.3.7) avec 500 µL de 20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) PEG 400 et 0,1 M HEPES/sodium hydroxyde pH 7,5 comme la solution bien.
        Remarque : Nsa1 SeMet cristaux doit être optimisé analogues aux cristaux natives.

3. Nsa 1 Structure Solution et collecte de données de diffraction de rayons x de

  1. Cryo-protection de cristaux et de collecte de données de Diffraction des rayons x
    1. Pour les cristaux orthorhombiques (Nsa1ΔC), préparer une solution de substances cryoprotectrices 1 mL contenant 22.5%(v/v) 1500 PEG, 15%(v/v) PEG 400 et 0,1 M HEPES/sodium hydroxyde de pH 7,5.
    2. Remplir une mousse Dewar à l’azote liquide et refroidir préalablement une rondelle de cristal. Soyez prudent lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide et portez des lunettes et des gants de protection.
    3. Soigneusement inverser la diapositive de la couverture de la cristallisation cupule contenant des cristaux sur la scène d’un stéréomicroscope.
    4. Pipeter 2 µL de la solution cryoprotecteur sur une nouvelle diapositive de couverture.
    5. Attacher une boucle de nylon monté de taille appropriée pour le cristal à une baguette magnétique cryo.
    6. À l’aide de la stéréomicroscope, transférer rapidement un cristal à la solution cryoprotecteur avec la boucle de cryo monté.
    7. Laissez le cristal équilibrer pendant 5 minutes dans la solution cryoprotecteur.
    8. À l’aide de la stéréomicroscope, boucle rapidement le cristal de la solution cryoprotecteur et la plongée-gel dans l’azote liquide.
    9. Attendez que l’azote liquide autour de la boucle pour arrêter l’ébullition, puis relâchez la boucle de la buse dans un emplacement spécifique dans la rondelle de cristal.
    10. Cubes Nsa1FL cristaux n’ont pas besoin d’être cryoprotected et peut être directement flash figé (suite 3.1.8-3.1.9 étapes ci-dessus).
    11. Sceller la rondelle de cristal à l’aide d’outils de cryo et transférer dans une canne de livraison dans un dewar préalablement réfrigérées. Stocker des cristaux dans les rondelles/dewars jusqu'à la collecte de données.
    12. Si la collecte de données à un synchrotron, expédier des cristaux pour le rayonnement synchrotron à l’aide d’un chargeur sec.
    13. Recueillir des données de diffraction des rayons x suivant les techniques standard20.
      Remarque : Pour Nsa1 natif et SAD (dispersion anomale de simple-longueur d’onde) ensembles de données ont été recueillies à 100 K sur les lignes de faisceau de SER-CAT ID 22 et 22-BM de l’Advanced Photon Source Argonne National Laboratory (Chicago, IL). Le dataset SAD Nsa1 ont été recueilli à λ = 0.97911 Å. Données ont été enregistrées à l’aide d’un temps d’exposition 1 s et oscillations de 0,5 °. Le mosaicity de ces cristaux était généralement autour de 0,3 °.
    14. Traiter et mettre à l’échelle les images de diffraction des rayons x pour générer des fichiers de réflexion pour chaque ensemble de données dans le groupe d’espace approprié.
      Remarque : Nsa1 diffraction des ensembles de données ont été traitées avec HKL200021. Les cristaux cubiques de Nsa1 ont été traitées dans l’espace groupe P213 et les cristaux orthorhombiques ont été traitées dans l’espace groupe P212121.
  2. Solution de Nsa1 de Structure.
    Remarque : Il existe plusieurs logiciels de cristallographie qui peuvent servir à résoudre et à affiner les structures cristallines dont Phenix et CCP422,23. Voici le protocole pour la solution de structure Nsa1 en utilisant le Phenix logiciel suite22.
    1. Analyser le natif et SAD mise à l’échelle des groupes de données avec phenix.xtriage22.
    2. Résoudre la structure de Nsa1 avec Phenix.autosol à l’aide de la pointe triste réflexion fichier22,24. Pour exécuter le programme de AutoSol, inscrire le nombre de sites de la sélénométhionine (sites = 9), le fichier de séquence fasta de Nsa1ΔC et la longueur d’onde utilisée pour la collecte de données triste (λ = 0.97911 Å).
      Remarque : Dans le dataset Nsa1 SAD, phenix.autosol devrait être en mesure de déterminer les phases expérimentales et de construire la plus grande partie du modèle.
    3. Faire des ajustements manuels pour le modèle avec Foulque25, suivie de raffinement en phenix.refine22,26.
    4. Résoudre la structure du cristal orthorhombique natif à haute résolution et le cristal cubique de remplacement moléculaire à l’aide de Phaser27,28.
    5. Après solution structure réussie, inspecter le modèle et la densité électronique carte dans Foulque25.
    6. Construire et affiner les structures en exécutant des cycles itératifs de raffinement dans phenix.refine22,26 et modèle de bâtiment dans Foulque25.

4. SAXS collecte, traitement et modélisation

  1. Collecte de données SAXS
    NOTE : SAXS données ont été enregistrées pour le DVD complet de S. cerevisiae Nsa1 à l’Advanced Light Source, sur le haut débit SIBYLLES beamline 12.3.1 au Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Purifier les Nsa1FL suivant le protocole décrit ci-dessus. 24h avant l’expédition de Nsa1FL à la source de rayonnement, exécutez la protéine sur une colonne de gel filtration pré équilibrées dans tampon A.
    2. Piscine des fractions contenant Nsa1 et déterminer la concentration de protéine comme décrit précédemment.
    3. Préparer 30 μl aliquotes d’une série de concentration de Nsa1 de 1 à 6,2 mg/mL, aide mémoire tampon A.
    4. Transférer 20 μl de chaque série de concentration de Nsa1 à une microplaque bien clairement jupe 96 ainsi que les seuls contrôles tampons A.
      NOTE : SAXS données sont recueillies sur des solutions diluées à l’aide de plusieurs concentrations de purifié de l’échantillon afin d’éviter l’agrégation entre particule répulsion et les effets de dommages de rayonnement.
    5. Sceller la microplaque avec un silicone mat et navire durant la nuit à 4 ° C pour la source de rayonnement.
    6. Stocker la microplaque à 4 ° C jusqu'à ce que la collecte de données.
    7. Immédiatement avant la collecte de données, faites tourner la plaque à 3200 x g pendant 10 min à 4 ° C pour enlever les éventuels agrégats et bulles d’air.
    8. Enregistrer des données SAXS.
      Remarque : Pour Nsa1, SAXS données ont été enregistrées pour le buffer avant et après chaque série de concentration protéique. Trente-trois analyses consécutives de 0,3 s ont été recueillis pour Nsa1FL au cours d’une série de concentration (1 à 6,2 mg/mL) à 10 ° C.
    9. Exécuter la soustraction de tampon pour les données SAXS.
      Remarque : Pour Nsa1 soustraction de la mémoire tampon a été effectuée automatiquement à la source de rayonnement, mais soustraction de tampon peut également être effectuée en utilisant le logiciel de réduction de données tels que Scatter30 et la ATSAS suite31. Soustraction de tampon est un élément essentiel de l’analyse des données SAXS et veiller à faire en sorte que la mémoire tampon utilisée pour la soustraction est identique à la solution tampon de protéine.
    10. Moyenne des 33 consécutives scanne pour créer un fichier *ave.dat pour chaque concentration.
      NOTE : Superposer les images consécutives 33 pour comparer les courbes. Changements aux courbes de dispersion au fil du temps est souvent signe de dommages de rayonnement. Exclure ces cadres de moyenne. Étalement des scans consécutifs Nsa1 a été réalisée automatiquement à la source de rayonnement SIBYLLES.
  2. Traitement de données SAXS et comparaison des séries de Concentration
    Remarque : Il existe plusieurs logiciels qui peuvent être utilisés pour analyser les données SAXS. Le rayon de giration et de fonctions de distribution de distance par paires ont été déterminées pour Nsa1 à l’aide de PRIMUS32 et Gnom33 depuis le ATSAS 2.7.2 suite31 et par rapport à travers toutes les concentrations de protéines pour assurer il n’y avait aucun rayonnement les dommages ou les interactions des inter-particules dépendante de la concentration de10.
    1. Ouvrez un shell terminal et allez dans le répertoire qui contient les données SAXS.
    2. Lancer le PRIMUS32 GUI de l’interface de terminal.
    3. L’IUG de PRIMUS, charger les courbes de dispersion (* ave.dat).
    4. AutoRg permet de déterminer le rayon de giration (Rg) et l’intensité de diffusion I(0), pour chaque courbe de diffusion vers l’avant (* ave.dat).
    5. Générer des parcelles Kratky pour chaque courbe de dispersion (* ave.dat), d’évaluer le degré de compacité.
    6. AutoGNOM33 permet de calculer la fonction de distribution par paire (aussi appelé P(r)) pour chaque courbe de dispersion (* ave.dat). Entrez un ≈max de départ D 3 * R,g et optimiser la valeurmax D pour obtenir une courbe p (r). Au cours de l’optimisation des Dmax, s’assurer que la p (r) calculé fonction est conforme à la courbe de diffusion expérimentale en vérifiant la valeur de2 χ signalés et évaluer visuellement l’ensemble apte à la courbe de dispersion.
    7. Calculer le poids moléculaire de Nsa1 partir des courbes de dispersion en utilisant le volume de corrélation34.
    8. Comparez les paramètres structuraux pour chaque concentration pour s’assurer qu’il n’y a aucun dommage rayonnement ou des effets de concentration-dépendante.
      Remarque : Les effets de la Concentration peuvent se manifester par une augmentation Rg et Dmax par rapport à une concentration croissante de la protéine. Avant diffusion I(0) divisée par la concentration de l’échantillon doit aussi rester constante dans l’ensemble de la série de concentration protéique.
  3. Modélisation de SAXS
    Remarque : Pour déterminer la position de l’extrémité C-terminale de Nsa1FL, la Nsa1 crystal structure10 (APB 5SUM) et les courbes de dispersion SAXS ont été utilisés pour réaliser une combinaison de corps rigide et ab initio de modélisation, en utilisant les programmes tas 35 et méthode d’optimisation Ensemble (MOE)36 de la ATSAS logiciel suite31. Le domaine de WD40 de Nsa1 a été traité comme un corps rigide, tandis que le C-terminus de Nsa1 ainsi que de plusieurs boucles désordonnées du domaine WD40 ont été modélisés pour adapter les données expérimentales de SAXS.
    1. Générer les fichiers PDB d’entrée. Le fichier PDB doit être partagé à chaque fois que les résidus ne figurent pas dans la chaîne principale, et le fichier PDB ne peut pas contenir plusieurs conformations, ligands, ou des molécules d’eau.
    2. Exécutez le programme Pre_BUNCH35 pour préparer le fichier PDB d’entrée tas (pre_bunch.pdb). D’entrée de la séquence de la protéine cible (*.seq), le nombre de domaines/PDB générée en 4.3.1, et chacun des fichiers PDB individuels généré ci-dessus.
    3. Calculer les amplitudes de diffusion pour chaque fichier PDB individuel en utilisant le programme CRYSOL37. Pour exécuter CRYSOL entrée le fichier PDB individuel et la courbe expérimentale de diffusion SAXS (*.dat). Ceci va générer un fichier d’amplitudes (* .alm).
    4. Exécutez le programme bouquet35 pour modéliser le domaine WD40 de Nsa1 contre les données SAXS en utilisant une approche combinée de corps et ab initio rigide. D’entrée le fichier PDB de Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), la courbe expérimentale de diffusion SAXS (*.dat) et l’amplitude individuel (* .alm) les fichiers pour chaque fichier PDB partielle généré par CRYSOL.
    5. Comparer la valeur de2 χ de l’APB de départ (5SUM) avec celle du modèle ab initio générés par le tas à l’aide des données expérimentales de SAXS.
      Remarque : Un modèle réussi de tas devrait avoir une valeur de2 χ significativement plus faible que le modèle de départ. La dispersion théorique du modèle tas devrait également décrire ainsi les données expérimentales jugée équivalente par inspection visuelle de la superposition entre la dispersion théorique du modèle aux données SAXS bouquet et sa valeur de2 χ (Figure 4, pipeline de centre).
    6. Inspecter manuellement les fichiers de sortie de tas dans Pymol38 à la structure cristalline de la superposition avec le modèle généré par le tas et l’enveloppe SAXS (Figure 4, pipeline Centre).
    7. Relancez tas 10 - 20 fois pour produire des modèles indépendants pour confirmer que les modèles sont similaires.
      Remarque : Pour Nsa1, il y avait une plage de χ2 valeurs de ~ 1 à 3 de 20 essais indépendants.
    8. Modélisation de l’ensemble
      Remarque : comme une démarche facultative à bouquet exécuter EOM36 ou minime Ensemble recherche39 (MES). Moe et MES recours à des approches d’ensemble, qui sont bien adaptés pour des protéines avec des domaines/régions flexibles qui se trouvent dans plusieurs conformations.
      1. Exécutez le programme Moe36 en utilisant le serveur en ligne ATSAS. Pour exécuter le MOE, entrée les fichiers PDB de 4.3.1, la séquence de la protéine cible (*.seq) et les données expérimentales de SAXS (*.dat).
      2. Comparer les valeurs de2 χ de l’APB de départ (5SUM) avec celle de l’ensemble généré par Moe en utilisant les données expérimentales de SAXS.
        Remarque : Un ensemble de Moe réussi doit avoir une valeur de2 χ significativement plus faible que le modèle de départ. La dispersion théorique de l’ensemble devrait également décrire ainsi les données expérimentales jugée équivalente par inspection visuelle de la superposition entre la dispersion théorique de l’ensemble de données SAXS et sa valeur de2 χ (Figure 4, droit Pipeline). On devrait également comparer les valeurs de2 χ de tas et Moe pour déterminer quel modèle meilleur décrit les données expérimentales de SAXS.
      3. Inspecter manuellement les conformères EOM Pymol38 pour superposer la structure cristalline avec les conformères générés par Moe (Figure 4). Notez le nombre total des conformères et la fraction d’occupation pour chaque conformère qui contribue à la courbe de dispersion. Pour des molécules plus rigides, comme Nsa1, le nombre des conformères doit être faible (1-5) (Figure 4, pipeline droite)36.
      4. Réexécutez le MOE plusieurs fois pour garantir des résultats cohérents.
        Remarque : Pour Nsa1 le nombre des conformères était généralement 3 à 4 avec les valeurs χ2 allant de 0,1 à 0,3.

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Representative Results

Nsa1 était PCR amplification de l’ADN génomique de S. cerevisiae et subcloned dans un vecteur contenant une balise d’affinité N-terminal 6 x-Histidine suivie de MBP et un site de protéase TEV. Nsa1 fut transformé en cellules d’e. coli BL21 (DE3) et des rendements élevés de l’expression de la protéine ont été obtenues suite à induction avec IPTG et croissance à 25 ° C durant la nuit (Figure 1 a). Nsa1 a été purifiés par affinité sur résine cobalt immobilisée, suivie d’un clivage MBP avec protéase TEV et finalement résolu par chromatographie d’exclusion (Figure 1 b). Fractions de chromatographie d’exclusion contenant Nsa1 ont été mis en commun, concentrées à 8 mg/mL et ensuite utilisées pour les essais de cristallisation avec un robot de cristallisation. Écrans à cristaux matrices creuses initiale a produit deux formes cristalline différente de Nsa1, cubiques ou orthorhombique (Figure 2 a).

Au cours de l’optimisation des cristaux cubiques et orthorhombiques, on a découvert que les cristaux orthorhombiques a surgi à la suite d’un clivage protéolytique de la Nsa1. Protéolyse limitée et spectrométrie de masse ont été utilisées pour déterminer la région de Nsa1 qui était sensible à la protéolyse et il a été observé que Nsa1 était sensible à un gradient de concentration de l’élastase protéase (Figure 2 b). Analyse par spectrométrie de masse ultérieures ont confirmé que cette dégradation résulte de la perte de l’extrémité C-terminale de Nsa1. Une série de troncations C-terminal de Nsa1 ont été générés, pour enlever le C-terminus sensible protéolytique (Figure 2). Les cristaux orthorhombiques pourraient être répétées avec la troncature Nsa1ΔC (résidus 1-434), qui a été utilisée en fin de compte pour la détermination de la structure triste. Les cristaux orthorhombiques pourraient aussi être répétées en traitant Nsa1FL avec l’élastase pendant 1 heure à 4 ° C avant la mise en place des plateaux de cristal.

Les cristaux de Nsa1 cubes ont été optimisées à l’aide de Nsa1FL grâce à une combinaison de gradients de citrate de sodium, couplé avec microseeding (Figure 3 a). Cela a donné des cristaux cubiques grands, reproductibles, avec une limite de diffraction d’environ 2,8 Å (Figure 3, gauche) de la résolution. Les cristaux orthorhombiques pourraient seulement être optimisées en utilisant les variantes de troncation de C-terminal de Nsa1, en faisant varier les gradients de concentration de 1500 PEG et PEG 400, combiné avec microseeding, qui a rapporté gros cristaux avec une limite de diffraction d’environ 1,25 Å résolution (Figure 3 a-C). Les phases expérimentales de Nsa1 ont été déterminées par SeMet-SAD de SeMet-dérivé de Nsa1ΔC10.

Le domaine N-terminal de WD40 sept pales β-hélice de Nsa1 était bien résolu dans les deux structures cristallines cubiques et orthorhombique, mais les deux structures n’avaient pas la densité électronique de l’extrémité C-terminale de Nsa1. SAXS a été ensuite utilisé pour déterminer la position du domaine C-terminal manquant de Nsa1 en solution. Après optimisation de la concentration de l’échantillon pour la collecte des données, la structure atomique partielle a été utilisée pour effectuer la modélisation de corps rigides et générer une reconstruction ab initio des composants manquants. Le modèle a été évalué en fonction de la bonté de l’ajustement pour les courbes de dispersion calculée aux données expérimentales (Figure 4, pipeline Centre). Le domaine de WD40 de Nsa1 seul n’est pas un bon ajustement des données expérimentales SAXS, comme en témoigne l’écart entre la courbe de diffusion expérimentale avec la courbe théorique de diffusion, qui provenait de la structure cristalline PDB ID 5SUM (Figure 4, pipeline de gauche). En plus de la modélisation des corps rigides, modélisation de l’ensemble a été également faite. Cela produit un ensemble de 3 ou 4 conformères du Nsa1 et a donné lieu à une valeur inférieure à2 χ (Figure 4, pipeline de droite). La réduction de l’écart de modèle (χ2) grâce à la modélisation de l’ensemble a révélé l’échantillonnage conformationnelle de la queue de Nsa1 C-terminale en solution.

Figure 1
Figure 1. Expression et purification de Nsa1 avec une étiquette de fusion 6 X-His-MBP. (A) analyse de SDS-PAGE de l’expression de protéine dans BL21 (DE3) des cellules à 25 ° C durant la nuit et la première étape de purification à l’aide de résine cobalt. B chromatogramme d’exclusion représentant taille après clivage TEV. Les fractions de chromatographie d’exclusion ont été analysées par SDS-PAGE. Les fractions de pic 1 Nsa1 contenant ont été collectées et utilisées pour l’analyse structurale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. L’extrémité C-terminale de Nsa1 est sensible à la protéolyse. (A) essais de cristallisation initiale de Nsa1 a donné deux formes de cristaux différents : cubiques ou orthorhombique. Microscope UV a été utilisé pour vérifier que les cristaux contiennent des protéines. Vis : La lumière Visible, UV : microscopes UV. Echelle = 50 µm de chaque fenêtre. (B) protéolytique dépistage analysé par SDS-PAGE. Trois dilutions (01:10, 1/100, 1/1000) pour chaque action de la protéase (0,1, 0,01, 0,001 mg/mL) ont été combinées avec des portions de protéines (1 mg/mL) à être projeté. Résistant à la protéases domaines ont été analysés le par SDS-PAGE et spectrométrie de masse après incubation de 37 ° C pendant 60 min. Nsa1-FL : fraîchement purifié de protéine, Nsa1Δ : purifié protéine conservée à 4 ° C pendant 3 semaines, après quoi une forme dégradée de la protéine a été observée. Diagramme schématique (C) de la Nsa1 pleine longueur (partie supérieure) et la troncature de C-terminal construisent (en bas). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Optimisation de cristallisation Nsa1. (A) un stock de semences a été préparé à partir des initiales de petits cristaux et utilisé pour fabriquer une série de dilutions (1 x ~ 1/104x) (microseeding). En mélangeant 1 µL de protéine avec 1 µL du stock de semence dilué, les plus gros monocristaux a grandi dans une semaine. (B) precipitant gradient de concentration pour l’optimisation de cristaux orthorhombiques. (C) optimisé des cristaux cubiques et orthorhombiques utilisés pour la collecte de données. Cercles verts indiquent la région typique des bacs cristal qui offrait la collecte de données, des cristaux de qualité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Schéma d’analyse SAXS Nsa1. Vue d’ensemble du pipeline utilisé pour traiter les données SAXS et générer des modèles avec tas (Centre) et Moe (à droite). Le pipeline de gauche montre l’écart entre la courbe de diffusion expérimentale (cercles rouges, la concentration de protéines : 6 mg/mL) avec la courbe théorique de diffusion (ligne bleue), qui a été générée à partir de la structure cristalline PDB ID 5SUM. Les modèles ont été évalués en comparant la courbe expérimentale de diffusion SAXS (cercles rouges, la concentration de protéines : 6 mg/mL) avec la courbe de diffusion dérivée du modèle de bande de Nsa1 (noir ligne) ou les conformères MOE de Nsa1 (ligne de noir). Dans chaque modèle, le domaine de WD40 est indiquée dans le dessin animé, coloré en vert (PDB ID 5SUM), l’extrémité C-terminale flexible apparaît dans les sphères colorées en rouge pour bouquet et vert, magenta, cyan et jaune pour les conformères Moe individuels. La fraction de chaque conformère dérivé de Moe est étiquetée à côté du modèle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Utilisant ce protocole, recombinant Nsa1 de S. cerevisiae a été généré pour les études structurales par cristallographie aux rayons x et SAXS. Nsa1 s’est bien comporté en solution et cristallise sous plusieurs formes cristallines. Au cours de l’optimisation de ces cristaux, on a découvert que l’extrémité C-terminale de Nsa1 a été sensible à la dégradation de la protéase. La haute résolution, forme cristalline orthorhombique n’a pu être reproduite avec des variantes de troncation de C-terminal de Nsa1, probablement parce que le C-terminus flexible de Nsa1 empêché empilement cristallin. La structure de Nsa1 a été résolue par cristallographie aux rayons x à haute résolution, mais l’extrémité C-terminale pas pu être généré sous forme de cristaux parce qu’il n’a pas ordonné. Cristallographie est la première technique pour la détermination des structures de résolution atomique des macromolécules autour de la taille de Nsa1, mais comme avec n’importe quelle méthode, cristallographie a quelques limitations. Une des principales limites de la cristallographie est l’incapacité à résoudre les régions désordonnées des protéines40,41.

L’extrémité C-terminale de Nsa1 est important pour la bonne localisation nucléolaire de la protéine, soulignant la nécessité d’étudier sa structure10. L’extrémité C-terminale de Nsa1, a été résolu par SAXS, une technique complémentaire de biologie structurale de la cristallographie aux rayons x. SAXS données ont été enregistrées pour l’album Nsa1 à travers une série de concentration. Cette série de concentration, a déterminé la concentration optimale pour la collecte de données Nsa1 SAXS et traitement. SAXS données ont été enregistrées pour Nsa1 au niveau 6, 4,5 et 3,0 mg/mL. La région de Guinier, la fonction p (r) et la masse moléculaire ont été déterminées dans l’ensemble de la série de concentration pour s’assurer que l’échantillon était bien sage et non agrégées dans les conditions expérimentales testées. Pour reconstituer la structure pleine longueur de Nsa1, l’amplitude de diffusion théorique a été déterminée par la structure cristalline partielle et puis ab initio méthodes ont été utilisées pour modéliser l’extrémité C-terminale flexible. Cette approche hybride, on a déterminé que le flexible C-terminus de Nsa1 s’étend vers l’extérieur du domaine de WD40 ordonnée.

Progrès réalisés dans les outils de traitement a entraîné la popularité de SAXS pour les études structurales macromoléculaires. SAXS mesure le modèle de diffusion des rayons x provenant des protéines orientés au hasard en solution pour fournir des informations structurelles basse résolution, dont la masse moléculaire et la forme globale. Par conséquent, SAXS a émergé comme un outil de validation de la structure orthogonale puissante pour la cristallographie. C’est en grande partie due au développement des méthodes de calcul pour calculer la dispersion théorique de la structure atomique et en les comparant à expérimental SAXS données37. En utilisant cette approche, l’état conformationnel, structure quaternaire et Assemblée d’ordre supérieur dans un réseau cristallin peut être comparé aux caractéristiques structurelles de la particule dans la solution. En outre, boucles désordonnées et termini manquant dans les structures à haute résolution déterminées par diffraction des rayons x peut être modélisés à l’aide de données de diffusion de solution. Cette approche structurelle hybride utilise la structure cristalline comme un bloc de construction SAXS-guidé la modélisation des résidus manquants et s’est avéré pour être efficace lors du mappage de l’extrémité C-terminale de la Nsa110, mais aussi d’autres macromolécules biologiques, comme le virus de la grippe A M1 matrice de protéine42et l’ARN morts-boîte accompagnateurs43. Logiciel de modélisation avancées SAXS peut aussi porter sur des systèmes plus complexes, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, en mappant le paysage conformationnel de ces systèmes à l’aide d’une série de conformères qui ensemble contribuent à la diffusion globale potentiel de la particule dans la solution16,,39. Prises ensemble, ces dernières avancées outils de collecte et de traitement de données SAXS contribue au succès des approches de biologie structurale hybride pour s’attaquer aux systèmes biologiques difficiles.

La combinaison de la diffusion de la solution avec les structures de haute résolution est prête à répondre à des questions importantes sur la flexibilité et la dynamique des macromolécules44. Beaucoup de protéines, tels que Nsa1, ont des régions dynamiques qui sont importantes pour la fonction biologique. Dans ce manuscrit un protocole du modèle est fourni qui détaille la combinaison de SAXS avec détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x. En plus de diffraction SAXS peut également servir pour complimenter les autres techniques de biologie structurale, y compris les NMR, paramagnétique énergie de résonance de résonance (EPR) et la fluorescence électron transfert (FRET), plus loin en soulignant l’importance de SAXS comme un complément de biologie structurale technique45,46,47.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Diffraction des données ont été recueillies à Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID et 22-BM faisceaux à l’Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Les données SAXS ont été recueillies sur la ligne de faisceaux SIBYLLES à la Source de lumière avance (SLA), Lawrence Berkeley National Laboratory. Nous tenons à remercier le personnel à la source de rayonnement SIBYLLES pour leur contribution à la collecte de données à distance et le traitement. Nous sommes reconnaissants à la National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) recherche de spectrométrie de masse et le groupe de soutien pour aider à déterminer les limites du domaine protéine. Ce travail a été soutenu par l’U.S. National Institute de santé intra-muros recherche Program ; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 à R. E. S.) et les Instituts canadiens de recherche en santé (du Canada IRSC, 146626 à M.C.P). Utilisation de l’APS a été soutenue par le US Department of Energy, le Bureau de la Science, le Bureau des Sciences de l’énergie base sous le contrat no. W-31-109-Eng-38. Utilisation de l’Advanced Light Source (ALS) a été prise en charge par le directeur, Office of Science, Office de base Sciences de l’Energie, de l’US Department of Energy, sous le contrat no. DE-AC02-05CH11231. Un soutien supplémentaire pour le SIBYLLES SAXS beamline provient de l’Institut National de la santé du projet MINOS (R01GM105404) et un haut de gamme Instrumentation Grant S10OD018483. Nous tenons également à remercier Andrea Moon et Dr. Sara Andres pour leur lecture critique de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biochimie numéro 131 diffraction SAXS méthodes hybrides Purification des protéines domaine de WD40 protéolyse limitée assemblage du Ribosome
Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de <em>S. Cerevisiae</em>
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Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

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