Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

Abstract

קביעת המבנה באורך מלא של ריבוזום הרכבה גורם Nsa1 של האפייה (cerevisiae ס) הוא מאתגר בגלל סדר, פרוטאז יציב קרבוקסילי של החלבון. כתב יד זה מתאר את השיטות לטיהור Nsa1 רקומביננטי של cerevisiae ס עבור ניתוח מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והן SAXS. קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היה מנוצל כדי לפתור את המבנה של המחשבים N-מסוף WD40 ומסודרת של Nsa1 ולאחר מכן SAXS שימש כדי לפתור את המבנה של C-הסופית של Nsa1 בתמיסה. פתרון פיזור הנתונים נאספו מ- Nsa1 באורך מלא בתמיסה. Amplitudes פיזור תיאורטי חושבו מתוך מבנה הגביש ברזולוציה גבוהה של התחום WD40 ולאחר מכן שילוב של גוף קשיח ומודלים ab initio חשף את קצה קרבוקסילי של Nsa1. באמצעות גישה זו היברידית שוחזר המבנה רבעוני של החלבון כולו. השיטות המובאות כאן צריך להיות חלים באופן כללי מצפני היברידית מבניים לחלבונים אחרים מורכבת תערובת של תחומים מובנים ולא מובנים.

Introduction

הריבוזומים הם מכונות ribonucleoprotein גדול לבצע את התפקיד החיוני של mRNA לתרגם חלבונים בתאים חיים לכל. הריבוזומים מורכבים subunits שני המיוצרים בתהליך מורכב כינה ריבוזום להן1,2,3,4. ריבוזום האיקריוטים הרכבה מסתמך על הסיוע של מאות הרכבה ribosomal חיוני גורמים2,3,5. Nsa1 (Nop7 הקשורים 1) הוא גורם הרכבה ריבוזום האיקריוטים נדרשת במיוחד עבור ההפקה של יחידת משנה ribosomal גדול6, הוא ידוע כ/כפי WD-חזור המכילה 74 (WDR74) באורגניזמים גבוה7. WDR74 הוכח הדרושות הבלסטוציסט היווצרות עכברים8, יזם WDR74 הוא לעתים קרובות מוטציה בתאי סרטן9. עם זאת, תפקוד ואת מנגנוני מדויק של Nsa1/WDR74 בהרכבה ריבוזום הם עדיין אינו מודע לקיומם. כדי להתחיל לחשוף את התפקיד של Nsa1/WDR74 במהלך ההבשלה האיקריוטים ריבוזום, בוצעו מספר ניתוחים מבניים, לרבות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, זווית קטנה רנטגן פיזור (SAXS)10.

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, מיקרוסקופ אלקטרוני, ו SAXS הם כולם חשובים טכניקות לימוד מבנה macromolecular. גודל, צורה, זמינות, יציבות של מקרומולקולות השפעות שיטת ביולוגיה מבנית אשר מקרומולקולה מסוים יהיה עדיף מתאים, אולם שילוב טכניקות מרובות באמצעות גישה כביכול "היברידי" הופכת כלי מועיל יותר ויותר11. בפרט קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- SAXS הם חזקים משלימים שיטות לקביעת מבנית של מקרומולקולות12.

קריסטלוגרפיה מספק הבראבה ברזולוציה גבוהה, מולקולות קטנות ועד מכונות הסלולר גדול כגון הריבוזום, הוביל לפריצות רבות בהבנה של פונקציות ביולוגיות של חלבונים ועוד מקרומולקולות13. יתר על כן, תכנון תרופות מבוססות-מבנה רתמות הכוח של קריסטל מבנים עבור עגינה מולקולרית על ידי שיטות חישובית, הוספת ממד ביקורתי סמים בגילוי ופיתוח14. למרות את תחולתן רחבה, מערכות גמיש ומבולבלת הן מאתגרות כדי להעריך על-ידי קריסטלוגרפיה מאז קריסטל האריזה יכול להיות יופרע או מפות צפיפות אלקטרונים עשוי להיות חלקי או באיכות ירודה. לעומת זאת, SAXS היא פתרון ומבוססי ברזולוציה נמוכה מבניים גישה מסוגל לתאר את מערכות גמיש החל לולאות המתוסבכים טרמיני חלבונים ממהותם המתוסבכים12,15,16. בהתחשב שהוא תואם למגוון רחב של חלקיקים גדלים12, SAXS יכולות לפעול בסינרגיה עם קריסטלוגרפיה כדי להרחיב את טווח השאלות הביולוגיות זה ניתן לטפל על ידי מחקרים מבנית.

Nsa1 מתאים לגישה המבנית היברידית מכיוון שהוא מכיל תחום WD40 בנוי היטב ואחריו פונקציונלי, אך גמיש קרבוקסילי אשר אינה נוטה שיטות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הבא הוא פרוטוקול עבור שכפול, ביטוי, טיהור של cerevisiae ס Nsa1 לקביעת מבנה היברידי על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, SAXS. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד את מבנה של חלבונים אחרים המורכב מעובדים בשילוב של אזורים מסודרת ומבולבלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור חלבון רקומביננטי ולטיהור אס 1

  1. Nsa1 ביטוי פלסמיד עיצוב, שיבוט
    1. לקבל או לרכוש DNA גנומי cerevisiae ס .
    2. PCR להגביר את רצפי היעד של Nsa1 (Nsa1חליל, שאריות 1-463) ו- C-מסוף נחתך Nsa1 (Nsa1ΔC, שאריות 1-434) עם תחל המתאים באמצעות DNA גנומי מבודד cerevisiae ס ו טמפרטורת ההיתוך של כ 60 ° C עם מועד הארכה של 1-2 דקות. תחל הבאה שימשו כדי להגביר את Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 לתוך pHMBP וקטור ביטוי Escherichia coli (e. coli) המכיל N-מסוף 6 X-היסטידין תג ואחריו את מלטוז מחייב חלבון (MBP), אתר פרוטאז וירוס לחרוט טבק (אס), תוך שימוש בטכניקות שיבוט רגיל17 .
    4. להשתמש רצפי DNA כדי לוודא כי Nsa1 היה לשכפל מסגרת עם התג שלו-MBP N-מסוף.
  2. ביטוי חלבון Nsa1
    1. להפוך את plasmid(s) ביטוי מתאים e. coli ביטוי המתח עם מערכת מבוססת-יזם T7. צלחת של transformants על פלטות אגר LB המכיל אמפיצילין µg/mL 100, דגירה של צלחת הפוכה בין לילה ב 37 º C.
    2. לחסן תרבות 50 מ של ליברות עם 100 אמפיצילין µg/mL מהצלחת טרנספורמציה, לגדל את זה בן לילה ברעידות-200 סל ד ב 37 º C.
    3. לחסן 3 x 1000 מ ל LB ב Fernbach מבחנות עם 100 אמפיצילין µg/mL 15 מ של התרבות לילה ולגדול זה ברעידות-200 סל ד ב 37 º C.
      הערה: חלבון מבנה הפתרון, התאגדות selenomethionyl (SeMet) יכולה להיות מושגת על ידי גדל התאים בינונית מזערי M9 זה השלים עם SeMet, תערובת חומצות אמינו כדי לעכב את ייצור מתיונין לפני אינדוקציה, בניגוד LB מדיה 18.
    4. זירוז הביטוי של Nsa1 כאשר ה OD600 מגיע ~0.8 על ידי תוספת של thiogalactopyranoside β-D-1 איזופרופיל (IPTG)-ריכוז סופי של 1 מ מ ואחריו הדגירה 25 ° c בלילה ברעידות-200 סל ד.
    5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 5,050 x g.
      הערה: תאים יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס או להשתמש מיד לטיהור חלבון.
  3. Nsa1 חלבון טיהור
    1. Resuspend התאים 25 מ של פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 10% גליצרול, 10 מ מ MgCl2) טרום מקורר ב 4 ° C המכיל אחד לוח מעכב פרוטאז נטולת EDTA.
    2. Lyse תאים על-ידי sonication ב 4 ° C (time 7 דקות, 2 s על מחזור, 2 s את מחזור; משרעת: 70%).
    3. להבהיר lysate על ידי צנטריפוגה ב g x 26,900 למשך 45 דקות ב 4 º C.
    4. החל הבהיר lysate על עמודה זרימת הכבידה טעון עם 10 מ"ל של קובלט קיבוע זיקה שרף, equilibrated מראש באמצעות מאגר פירוק.
    5. לאפשר את תגובת שיקוע לעבור מעל השרף על ידי זרימת הכבידה ב 4 ° C. ולשטוף את השרף פעמיים עם 100 מ של פירוק מאגר.
    6. Elute Nsa1 עם 20 מ של מאגר • תנאי (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 5 מ מ MgCl2, 5% גליצרול ו-200 מ מ imidazole).
    7. לקחת 15 μL של eluate ולהפעיל אותו על ג'ל מרחביות-דף 4-15% כדי לוודא כי החלבון הוא eluted מן השרף זיקה (איור 1 א').
    8. להסיר את התג MBP על ידי אס פרוטאז עיכול. להוסיף 1 מ"ל, פרוטאז אס19 (מניות 1 מ"ג/מ"ל) • שרף תנאי Nsa1 זיקה, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    9. תתרכז MBP ביקע Nsa1 ל ~ 5 מ"ל באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי לחתוך את 10 kDa.
    10. החל Nsa1 ביקע MBP לעמודה ג'ל-סינון, מראש equilibrated במאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ מ NaCl, 1 מ MgCl2, 5% גליצרול ו- 1 מ מ β-mercaptoethanol) (איור 1B).
    11. מנתחים את הטור שברים של ג'ל סינון כדי לוודא כי MBP ביקע, הופרדו Nsa1 על-ידי הפעלת 15 דוגמאות μL-ג'ל מרחביות-דף 4-15% (איור 1B).
    12. לשלב שברים המכיל Nsa1, להתרכז כדי להשתמש בפילטר צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי לחתוך את 10 kDa 8 מ"ג/מ"ל.
    13. לקבוע ריכוז החלבון על ידי מדידת את ספיגת ב 280 ננומטר על ספקטרופוטומטרים באמצעות הכחדה מקדם M 42530–1ס מ–1. השתמש חלבון מיד לניסויים הפרוטאוליטי ההקרנה וגיבוש.

2. התגבשות והקרנת הפרוטאוליטי אס 1

  1. מטריצה דלילה קריסטל הקרנת Nsa1
    1. צנטריפוגה μL 500 על מלאי 8 מ"ג/מ"ל Nsa1 ב g x 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. תוכנית ההתקנה התגבשות ניסויים באמצעות רובוט התגבשות ומסכי קריסטל מטריצה דלילה. למלא המאגר מגשי טוב 96 μl 30 של ריאגנטים מסך קריסטל בודדים מטריצה דלילה התגבשות המסכים. הגדרת טיפות ישיבה עם הרובוט על ידי ערבוב 250 nL של הפתרון טוב עם 250 nL של הפתרון חלבון.
    3. לאטום את הצלחות התגבשות עם קלטת, דגירה אותם ב 25 º C.
    4. לבדוק את הצלחות בכל יומיים במשך השבועות הראשונים 2-3 עם stereomicroscope.
    5. ודא להיטים פוטנציאלים קריסטלים מכילות חלבון עם מיקרוסקופ UV.
      הערה: עבור Nsa1 בשתי צורות שונות קריסטל (מעוקב, האורתורומבית, איור 2A) התקבלו בתוך שבוע 1 מ המסכים הבאים: JCSG + תנאי B11 (מ' 1.6 סודיום ציטרט tribasic מייבשים, pH 6.5) ו- 2 בלוק של מסך סינרגיה של אשף Precipitant תנאי C11 (20.1%(v/v) 1500 פג, 13.4%(v/v) 400 פג, טריס HEPES 0.1 M/סודה קאוסטית, pH 7.5).
  2. ההקרנה הפרוטאוליטי
    הערה: במהלך המיטוב התגבשות, התגלה כי הקריסטלים האורתורומבית של Nsa1 התעוררו כתוצאה הפרוטאוליטי המחשוף, הקריסטלים יכול לא יהיה לשכפל בעזרת החלבון באורך מלא. באמצעות שילוב של proteolysis מוגבלת בשילוב עם ספקטרומטר מסה, נקבע כי קצה קרבוקסילי של Nsa1 היה רגיש proteolysis, הסרה של הזנב C-מסוף נדרשה מקול עוקבות (טופס המערכת הגבישית האורתורומבית Nsa1ΔC).
    1. להכין 1 מ"ג/מ"ל, פרוטאז פתרונות מניות של α פרוטאזות הבאים-כימוטריפסין, טריפסין, elastase, פפאין, סבטיליזין, endoproteinase Glu-סי
    2. צור 1:10, בטחונות ו דילולים 1:1000 של כל מניה פרוטאז 1 מ"ג/מ"ל עם מאגר דילול (10 מ מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ נתרן כלוריד).
    3. פיפטה μL 1 של מניות פרוטאז (1:10, בטחונות ו- 1:1000) לתוך aliquots 9 μL של חלבון (1 מ"ג/מ"ל) עבור כל פרוטאז שיוקרנו.
    4. דגירה הפתרון ב 37 ° C עבור 1 h.
    5. לעצור את התגובה על-ידי הוספת 10 μL 2 x מרחביות-דף לדוגמה מאגר וחום התגובה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    6. לנתח את מעכל על-ידי הפעלת אותם על ג'ל מרחביות-דף 4-15% (איור 2B).
    7. לזהות תחומים עמיד פרוטאז של החלבון היעד על-ידי ניתוח בג'ל ספקטרומטר מסה.
    8. הסר את האזורים פרוטאז-יציב חלבון המטרה על ידי יצירת ביטוי קטום בונה ובעקבות פרוטוקול שיבוט, הביטוי ואת טיהור שתוארו לעיל.
  3. התגבשות אופטימיזציה
    1. להכין או לקבל פתרונות מניות של ריאגנטים הבאים התגבשות ראשונית: מ' 1.6 סודיום ציטרט tribasic מייבשים pH 6.5, 100%(v/v) 400 פג, 50%(v/v) 1500 פג, 1 מ' HEPES/נתרן הידרוקסידי, pH 7.5.
    2. להכין פתרון מניות של Nsa1פל ו- Nsa1ΔC -8 מ"ג/מ"ל כפי שתואר לעיל.
    3. למטב את הקריסטלים מעוקבים Nsa1 (Nsa1חליל).
      1. להכין מסך 24-ובכן רשת עם בארות המכיל 500 µL עם שיפוע של 1-1.6 M של סודיום ציטרט עם pH 6.5 מ פתרון מניות של 1.6 מ' סודיום ציטרט tribasic עם pH 6.5.
      2. לערבב 1 µL של חלבון עם µL 1 פתרון טוב ומקום התערובת על שקופית siliconized כיסוי. בזהירות ' היפוך ' השקופית כיסוי על גבי שמנונית מראש טוב ולהבטיח זה טוב אטומה אך לטפל כדי לא להפריע המסירה או לשבור את השקופית כיסוי. חזור על תהליך זה עד המגש מלא ולאחר מכן אחסן ב 25 º C.
        הערה: גבישים קטנים אמור להופיע ב- 2-7 ימים.
      3. להכין מלאי microseed של הקריסטלים מעוקב. להשתמש לולאת ניילון הנטען כדי להעביר גבישים קטנים ~ 10 שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 1.5 mL המכילה חרוז קטן, µL 50 של 1.6 מ' סודיום ציטרט השנינות tribasic pH 6.5.
      4. מערבולת הצינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL במהירות גבוהה (~ 3000 סל ד) עבור 1 דקות.
      5. להפוך סדרת דילולים טורי 10-fold של המניה זרע עם 1.6 מ' סודיום ציטרט tribasic ו מערבולת את התערובת היטב עבור 5 s.
      6. למלא כל אחד טוב של רשת 24-ובכן, מסך 500 µL של 1.6 מ' סודיום ציטרט tribasic pH 6.5.
      7. למטב את התנאים microseeding על-ידי הגדרת טיפות עם יחס בדרגות שונות של חלבון עם הפתרונות מלאי הזרע (איור 3 א). גבישים גדולים של איכות גבוהה עקיפה אמור להופיע ב- 2-5 ימים (איור 3C).
    4. למטב את הקריסטלים האורתורומבית (Nsa1ΔC)
      1. להכין מסך רשת עם 500 µL כל היטב עם תנאים שונים 24 (איור 3B) מפתרונות מניות 50%(v/v). פג 1500, 100%(v/v) 400 פג. בנוסף מעברי צבע של 1500 פג ו 400 פג, אחד טוב צריך להכיל גם 0.1 M HEPES/נתרן הידרוקסידי pH 7.5.
      2. לערבב 1 µL של חלבון פתרון עם µL 1 של פתרון טוב בשקופית siliconized כיסוי. בזהירות ' היפוך ' השקופית כיסוי על גבי שמנונית מראש טוב ולהבטיח זה טוב אטומה. חזור על תהליך זה עד המגש כולו כבר תפוסה. לאחסן את המגשים ב 25 º C.
        הערה: גבישים האורתורומבית Nsa1 אמור להופיע ב- 2-7 ימים.
      3. בהמשך למטב הקריסטלים האורתורומבית על-ידי microseeding כמתואר הקריסטלים מעוקב (שלבים 2.3.3.3 כדי 2.3.3.7) באמצעות µL 500 20.1%(v/v) 1500 פג, 13.4%(v/v) פג 400 ו 0.1 M HEPES/נתרן הידרוקסידי pH 7.5 כפתרון טוב.
        הערה: גבישים Nsa1 SeMet צריך להיות מוטבת מקביל הקריסטלים מקורית.

3. איסוף נתונים רנטגן עקיפה והפתרון 1 מבנה הסוכנות לביטחון לאומי

  1. הקפאה-הגנה של הקריסטלים, איסוף נתונים של קרני רנטגן
    1. עבור הקריסטלים האורתורומבית (Nsa1ΔC), להכין פתרון 1 מ"ל cryoprotectant המכיל 22.5%(v/v) 1500 פג, 15%(v/v) פג 400 ו- 0.1 M HEPES/נתרן הידרוקסידי pH 7.5.
    2. מילוי קצף דיואר עם חנקן נוזלי, מראש מגניב דיסקית קריסטל. באמצעי זהירות כאשר עובדים עם חנקן נוזלי, ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
    3. בזהירות היפוך השקופית הכיסוי של התגבשויות טוב המכיל קריסטלים לבמה של stereomicroscope.
    4. פיפטה 2 µL של הפתרון cryoprotectant לשקופית כיסוי חדש.
    5. לצרף לולאת ניילון הנטען של הגודל המתאים על הקריסטל שרביט הקפאה מגנטי.
    6. באמצעות הסיוע של stereomicroscope, להעביר במהירות גביש הפתרון cryoprotectant עם הלולאה הקפאה הנטען.
    7. תן את הקריסטל equilibrate במשך 5 דקות בפתרון cryoprotectant.
    8. במהירות באמצעות הסיוע של stereomicroscope, לולאה הקריסטל פתרון cryoprotectant, מים עמוקים-הקפאת לתוך חנקן נוזלי.
    9. לחכות החנקן הנוזלי סביב הלולאה להפסיק רותחים ולאחר מכן שחרר הלולאה של המטה לתוך מיקום ספציפי בתוך הדיסקית קריסטל.
    10. Nsa1 מ קפל קריסטלים לא צריך להיות cryoprotected, שיכול להיות ישירות פלאש קפוא (בעקבות צעדים 3.1.8-3.1.9 לעיל).
    11. לאטום את הדיסקית קריסטל באמצעות כלים הקפאה ולהעביר מקל משלוח ב דיואר מראש צוננת. לאחסן גבישים דיסקיות/וויסקי עד איסוף נתונים.
    12. אם אוסף נתונים סינכרוטרון, ספינת גבישים סינכרוטרון באמצעות מחסנית יבש.
    13. איסוף נתונים קרני רנטגן בעקבות טכניקות תקן20.
      הערה: יליד Nsa1, סאד (פיזור חריג יחיד באורך הגל) datasets נאספו ב 100 K על הקווים קרן SER-חתול 22-ID ו- 22-מוניטור של מקור הפוטון מתקדם ב Argonne National Laboratory (שיקגו). ערכת הנתונים Nsa1 סאד נאסף-λ = 0.97911 Å. נתונים הוקלט באמצעות זמן חשיפה 1 s ו- 0.5° תנודות. Mosaicity של גבישים אלו היה בדרך כלל כ- 0.3 מעלות.
    14. לעבד ולשנות את קנה המידה של תמונות קרני רנטגן כדי ליצור השתקפות קבצים עבור כל ערכת נתונים בקבוצה שטח המתאים.
      הערה: Nsa1 עקיפה datasets עובדו עם HKL200021. הקריסטלים מעוקבים Nsa1 עובדו שטח קבוצה P213, הקריסטלים האורתורומבית עובדו שטח קבוצה P212121.
  2. Nsa1 מבנה פתרון.
    הערה: ישנם מספר חבילות תוכנה קריסטלוגרפיה יכול לשמש כדי לפתור ולמקד מבנים קריסטל כולל22,Phenix, CCP423. הבא הוא פרוטוקול Nsa1 מבנה הפתרון באמצעות חבילת תוכנה22Phenix.
    1. לנתח מקורי וגם עצוב קנה המידה datasets עם phenix.xtriage22.
    2. לפתור את המבנה של Nsa1 עם Phenix.autosol באמצעות22,24קובץ השתקפות שיא עצוב. כדי להפעיל את התוכנית של AutoSol, קלט מספר האתרים selenomethionine (אתרי = 9), קובץ רצף fasta של Nsa1ΔC, ואת אורך הגל המשמש לאיסוף נתונים עצוב (λ = 0.97911 Å).
      הערה: על מ ערכת הנתונים Nsa1 סאד, phenix.autosol אמור להיות מסוגל לקבוע את שלבי הניסוי ולבנות ביותר של הדגם.
    3. לבצע התאמות ידנית הדגם עם הקרסול25, ואחריו עידון22,phenix.refine26.
    4. לפתור את מבנה הגביש האורתורומבית יליד ברזולוציה גבוהה הגבישית הקובייתית של באמצעות החלפת מולקולרית הפייזר27,28.
    5. לאחר פתרון מוצלח מבנה, לבדוק את המודל ואת צפיפות אלקטרונים מפה הנרגן25.
    6. לבנות ולשפר את המבנים על-ידי הפעלת סיבובים איטרטיביים של עידון22,phenix.refine26 , מודל בבניין הנרגן25.

4. SAXS איסוף נתונים, עיבוד, מידול

  1. איסוף נתונים SAXS
    הערה: הנתונים SAXS הוקלטו באורך מלא cerevisiae ס Nsa1 למקור אור מתקדם, על תפוקה גבוהה SIBYLS הפרעות לקרן החלקיקים 12.3.1-המעבדה הלאומית לורנס ברקלי, ברקלי, קליפורניה29.
    1. לטהר Nsa1פל בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. 24 שעות לפני משלוח Nsa1פל הפרעות לקרן החלקיקים, לדרוס חלבון ג'ל עמודה סינון מראש equilibrated במאגר א
    2. בריכה שברים המכיל Nsa1 וקבע את ריכוז החלבון כפי שהוסבר קודם.
    3. להכין aliquots 30 μl של ריכוז סדרת Nsa1 מ- 1 עד 6.2 mg/mL באמצעות מאגר א
    4. העברת μl 20 של כל סדרה ריכוז של Nsa1 microplate טוב חצאית מלאה ברור 96 יחד עם מאגר של פקדים לבד.
      הערה: SAXS נתונים נאספים על תמיסות באמצעות כמה ריכוזים של מדגם מטוהרים כדי למנוע צבירת, הבין-החלקיקים דחיה ואפקטים נזק הקרינה.
    5. לאטום את microplate סיליקון איטום והתכרבלו הספינה בין לילה ב 4 ° C הפרעות לקרן החלקיקים.
    6. לאחסן את microplate ב 4 ° C עד איסוף נתונים.
    7. מיד לפני איסוף נתונים, לסובב את הצלחת ב 3200 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר אגרגטים פוטנציאליים, בועות אוויר.
    8. נתוני הרשומה SAXS.
      הערה: עבור Nsa1, SAXS נתונים נרשמו עבור המאגר לפני ואחרי כל סדרה ריכוז חלבון. שלושים ושלוש סריקות רציפות של 0.3 s נאספו עבור Nsa1פל . בסדרה ריכוז (1 ל 6.2 mg/mL) ב- 10 מעלות צלזיוס.
    9. לבצע חיסור מאגר נתונים SAXS.
      הערה: עבור Nsa1 מאגר חיסור בוצע באופן אוטומטי הפרעות לקרן החלקיקים אלא מאגר חיסור יכול גם להתבצע באמצעות תוכנה הפחתת נתונים כגון פיזור30 ו- סוויטת ATSAS31. מאגר חיסור היא חלק קריטי של ניתוח נתונים של SAXS, יש לנקוט על מנת להבטיח כי המאגר המשמש עבור חיסור זהים למאגר דגימה חלבון.
    10. ממוצע ה-33 רצופים סורק כדי ליצור קובץ *ave.dat עבור כל הריכוז.
      הערה: כיסוי המסגרות רצופים 33 להשוות. את העקומות. שינויים העקומות פיזור לאורך זמן היא לעתים קרובות מעידה על נזק הקרינה. אל תכלול מסגרות אלה בממוצע. חישוב ממוצע של הסריקות ברציפות Nsa1 בוצע באופן אוטומטי הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS.
  2. SAXS עיבוד נתונים, השוואה של ריכוז סדרת
    הערה: ישנם מספר חבילות תוכנה ניתן להשתמש כדי לנתח נתונים SAXS. עבור Nsa1 הרדיוס של רגע ופונקציות הפצה מרחק pair-wise נקבעו באמצעות פרימוס32 ו Gnom33 מ ATSAS 2.7.2 סוויטת31 ו בהשוואה על-פני כל ריכוז חלבון כדי להבטיח היה אין קרינה נזק או אינטראקציות בין חלקיקים תלויי-ריכוז10.
    1. פתח פגז מסוף, ללכת לספרייה המכילה את הנתונים SAXS.
    2. הפעל את הפרימוס32 GUI מ בתוך הקליפה מסוף.
    3. בתוך GUI פרימוס, לטעון את עקומות פיזור (* ave.dat).
    4. השתמש AutoRg כדי לקבוע רדיוס של רגע (Rg) והעבירו פיזור עוצמת I(0), עבור כל עקומת פיזור (* ave.dat).
    5. צור Kratky המגרשים לבניית כל עקומת פיזור (* ave.dat), כדי להעריך את מידת הקומפקטיות.
    6. השתמש ב- AutoGNOM33 לחישוב פונקציית ההתפלגות pair-wise (נקרא גם P(r)) עבור כל עקומת פיזור (* ave.dat). הזן ≈max D ההתחלתי של 3 * Rg לייעל את הערךהמרבי של D להשגת עקומה חלקה P(r). במהלך אופטימיזציה של Dmax, ודא את P(r) מחושבת הפונקציה עולה בקנה אחד עם עקומת פיזור ניסיוני על-ידי בדיקת הערך2 χ שדווחה והערכה באופן חזותי הכולל שיתאים את עקומת פיזור.
    7. לחשב את המשקל המולקולרי של Nsa1 מן העקומות פיזור שימוש באמצעי האחסון של המתאם34.
    8. להשוות את הפרמטרים מבניים עבור כל ריכוז על מנת להבטיח כי אין נזק הקרינה או אפקטים תלויי-ריכוז.
      הערה: ריכוז אפקטים יכול להתבטא כמו הגדלת Rg ו- Dmax ביחס הגדלת ריכוז חלבון. קדימה פיזור I(0) מחולק על ידי ריכוז מדגם צריך גם נשארת קבועה לאורך הסדרה ריכוז חלבון.
  3. מידול SAXS
    הערה: כדי לקבוע את המיקום של C-הסופית של Nsa1חליל, Nsa1 קריסטל מבנה10 (PDB 5SUM) את עקומות פיזור SAXS שימשו כדי לבצע שילוב של גוף קשיח ו ab initio מידול, משתמש בתוכניות חבורה 35 שיטת אופטימיזציה אנסמבל (לבחירות)36 מ חבילת תוכנות ATSAS31. תחום WD40 של Nsa1 היה כאל גוף נוקשה, ואילו קצה קרבוקסילי של Nsa1 יחד עם מספר לולאות המתוסבכים מהתחום WD40 עוצבו לפי הדגם כדי להתאים לנתונים SAXS ניסיוני.
    1. צור את הקבצים PDB קלט. יש לפצל את הקובץ PDB בכל פעם שאריות חסרים השרשרת העיקרית, או קובץ ה-PDB לא יכול להכיל מספר הייצורים החיים, ליגנדים, או מולקולות המים.
    2. הפעל את התוכנית Pre_BUNCH35 להכין קובץ PDB הקלט עבור חבורה (pre_bunch.pdb). קלט את הרצף של החלבון היעד (*.seq), מספר תחומים/PDBs שנוצר ב 4.3.1, ועורר כל אחד מהקבצים PDB בודדים מעל.
    3. לחשב את amplitudes פיזור עבור כל קובץ PDB באמצעות התוכנית CRYSOL37. כדי להפעיל את CRYSOL קלט את קובץ PDB בודדים והן את עקומת פיזור ניסיוני SAXS (*.dat). פעולה זו תיצור קובץ amplitudes (* .alm).
    4. הפעל חבורה תוכנית35 לדגם המחשבים WD40 של Nsa1 נגד SAXS נתונים באמצעות משולב נוקשה הגוף, ab initio בגישה. קלט את הקובץ PDB Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb) את עקומת פיזור ניסיוני SAXS (*.dat), את משרעת בודדים (* .alm) קבצים עבור כל קובץ PDB חלקית שנוצרו על-ידי CRYSOL.
    5. השווה את הערך2 χ מן ה-PDB המוצא (5SUM) עם זה מהמודל ab initio שנוצר על ידי חבורה באמצעות הנתונים SAXS ניסיוני.
      הערה: דוגמנית מצליחה החבורה צריך ערך2 χ נמוך משמעותית מאשר הדגם ההתחלתי. פיזור תיאורטי של המודל חבורה צריך גם לתיאור טוב ניסיוני הנתונים כפי נשפטת על ידי בדיקה ויזואלית הכיסוי בין פיזור תיאורטי של המודל חבורה על הנתונים SAXS ערכו2 χ (איור 4, מרכז צבר).
    6. לבדוק ידנית את קבצי הפלט של חבורת Pymol38 לערוך בשכבות את מבנה גבישי עם המודל שנוצר על ידי חבורה, המעטפה SAXS (איור 4, מרכז צבר).
    7. הפעל מחדש את קבוצה 10 - 20 פעמים כדי ליצור מודלים עצמאית לאשר כי הדגמים דומים.
      הערה: עבור Nsa1 היה טווח של ערכים χ2 ~ 1 עד 3 מ 20 פועל עצמאית.
    8. אנסמבל דוגמנות
      הערה: כפי גישה אופציונלית חבורה לרוץ לבחירות36 או חיפוש אנסמבל מינימלי39 (MES). לבחירות, MES להשתמש אנסמבל גישות, אשר מתאימים היטב חלבונים עם גמישות תחומים/אזורים הנמצאים מרובים הייצורים החיים.
      1. הפעל את התוכנית לבחירות36 באמצעות שרת באינטרנט ATSAS. לרוץ לבחירות, קלט את הקבצים PDB 4.3.1, הרצף של החלבון היעד (*.seq), ונתוני ניסיוני SAXS (*.dat).
      2. השווה את הערכים2 χ מן ה-PDB המוצא (5SUM) עם זה מן ההרכב שנוצר על ידי לבחירות תוך שימוש בנתונים SAXS ניסיוני.
        הערה: אנסמבל לבחירות מוצלח צריך ערך2 χ נמוך משמעותית מאשר הדגם ההתחלתי. פיזור תיאורטי של ההרכב צריך גם לתיאור טוב ניסיוני הנתונים כפי נשפטת על ידי בדיקה ויזואלית הכיסוי בין פיזור תיאורטי של ההרכב על הנתונים SAXS ערכו2 χ (איור 4, נכון צינור). אחד צריך גם להשוות את הערכים2 χ חבורה, לבחירות כדי לקבוע איזה מודל הטוב ביותר מתאר את הנתונים SAXS ניסיוני.
      3. לבדוק ידנית את conformers לבחירות Pymol38 לערוך בשכבות את מבנה גבישי עם conformers שנוצר על ידי לבחירות (איור 4). הערה המספר הכולל של conformers לבין השבר של תפוסת עבור כל conformer אשר תורם עקומת פיזור. עבור מולקולות נוקשה יותר, כגון Nsa1, המספר של conformers צריכה להיות קטנה (1-5) (איור 4, צינור נכון)36.
      4. הפעל מחדש את משימת מספר פעמים כדי להבטיח תוצאות עקביות.
        הערה: עבור Nsa1 מספר conformers היה בדרך כלל 3 עד 4 עם χ2 ערכים ועד 0.1 0.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nsa1 היה PCR מוגבר מ- DNA גנומי cerevisiae ס ו subcloned לתוך וקטור המכיל תג קירבה x 6-היסטידין N-מסוף ואחריו MBP, אתר פרוטאז ' אס '. Nsa1 הפך לתוך e. coli BL21(DE3) כדוריות, תפוקה גבוהה של חלבון ביטוי התקבלו בעקבות אינדוקציה עם IPTG וצמיחה 25 ° c בלילה (איור 1 א'). Nsa1 הייתה זיקה-מטוהרת על קיבוע קובלט זיקה שרף, ואחריו MBP מחשוף עם אס פרוטאז, סוף סוף נפתרה על-ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (איור 1B). שברים של גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה המכיל Nsa1 היו איחדו, מרוכז 8 מ"ג/מ"ל, ואז השתמש לניסויים התגבשות עם רובוט התגבשות. מטריצה דלילה הראשונית קריסטל מסכי הניבו שתי צורות שונות קריסטל של Nsa1, קוב, האורתורומבית (איור 2 א).

במהלך אופטימיזציה של הקריסטלים מעוקב, האורתורומבית, התגלה כי הקריסטלים האורתורומבית התעוררו כתוצאה של פצילות הפרוטאוליטי של Nsa1. Proteolysis מוגבלת ספקטרומטר מסה שימשו כדי לקבוע את האזור של Nsa1 זה היה רגיש proteolysis, זה היה ציין כי Nsa1 היה רגיש הדרגתי ריכוז של elastase פרוטאז (איור 2B). ניתוח ספקטרומטר מסה עוקבות אישר את ההשפלה הזו נבעה אובדן קצה קרבוקסילי של Nsa1. סדרת C-טרמינל truncations של Nsa1 נוצרו, כדי להסיר את הפרוטאוליטי רגיש קרבוקסילי (איור 2C). הקריסטלים האורתורומבית יכול לחזור עם העיגולΔC (שאריות 1-434) Nsa1, אשר בסופו של דבר שימש לקביעת מבנה עצוב. הקריסטלים האורתורומבית יכול לחזור גם על ידי טיפול Nsa1חליל עם elastase למשך שעה ב 4 ° C לפני הגדרת מגשי קריסטל.

הקריסטלים Nsa1 מעוקבים אופטימציה באמצעות Nsa1פל באמצעות שילוב של סודיום ציטרט מעברי צבע, בשילוב עם microseeding (איור 3 א). זה הניב גדול, לשחזור גבישים, עם מגבלה עקיפה של 2.8 בסביבות Å רזולוציה (איור 3C, משמאל). הקריסטלים האורתורומבית יכול רק ניתן למטב באמצעות חיתוך C-מסוף וריאנטים של Nsa1, על ידי שינוי של מעברי צבע ריכוז של 1500 פג ו 400 פג, בשילוב עם microseeding, אשר הניבו גבישים גדולים עם מגבלה עקיפה של 1.25 Å רזולוציה (איור 3 א-ג). שלבי הניסוי של Nsa1 נקבעו על ידי SeMet-SAD מ נגזרת SeMet של Nsa1ΔC10.

N-מסוף β שבעה להבים-מדחף WD40 בתחום Nsa1 נפתרה טוב שני המבנים קריסטל קוב ו האורתורומבית, אולם בשני מבנים לא חסרו צפיפות אלקטרונים קצה קרבוקסילי של Nsa1. SAXS שימש אז כדי לקבוע את המיקום של תחום C-מסוף חסר של Nsa1 בתמיסה. לאחר אופטימיזציה של ריכוז לדוגמה עבור איסוף נתונים, מבנה האטום חלקית שימש כדי לבצע דוגמנות מכניקה של גוף קשיח ולהפיק של שחזור ab initio הרכיבים החסרים. המודל הוערך מבחינת מטיב ההתאמה על העיקולים הפיזור מחושב על הנתונים ניסיוני (איור 4, מרכז צבר). התחום WD40 של Nsa1 לבד הוא לא מתאים של הנתונים SAXS ניסיוני, כפי שמעידים הפער בין עקומת פיזור ניסיוני עם עקומת פיזור התיאורטית, אשר נוצר מתוך מבנה גבישי PDB מזהה 5SUM (איור 4, צינור השמאלי). בנוסף דוגמנות מכניקה של גוף קשיח, אנסמבל דוגמנות גם נעשה. זה מיוצר הרכב של 3-4 conformers של Nsa1 וכתוצאה ערך2 χ נמוך (איור 4, צינור נכון). הירידה מודל הפער (χ2) באמצעות מידול אנסמבל חשף הדוגמאות הסתגלותי של הזנב Nsa1 C-מסוף בפתרון.

Figure 1
איור 1. ביטוי וטיהור של Nsa1 עם תג פיוז'ן 6 X-שלו-MBP. (א) מרחביות-דף ניתוח של הביטוי חלבון ב- BL21 (DE3) תאים 25 ° c בלילה והצעד הראשון טיהור באמצעות שרף זיקה קובלט. (ב) נציג גודל הדרה chromatogram בעקבות אס המחשוף. השברים של גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה נותחו על ידי עמודים מרחביות. שברים מפסגת Nsa1 המכיל 1 היו נאסף ומשומשים עבור ניתוח מבנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. קצה קרבוקסילי של Nsa1 הוא רגיש proteolysis. (א) התגבשות ראשונית ניסויים של Nsa1 הניבו שתי צורות גבישים שונים: מעוקב, האורתורומבית. מיקרוסקופ UV שימש כדי לוודא כי הקריסטלים הכיל חלבון. מול: האור הנראה, UV: מיקרוסקופים UV. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל חלון. (ב) הפרוטאוליטי הקרנת נותחו על ידי עמודים מרחביות. דילולים שלוש (1:10, בטחונות, 1:1000) עבור כל מניה פרוטאז (0.1, 0.01, 0.001 מ"ג/מ"ל) משולב עם aliquots של חלבון (1 מ"ג/מ"ל) שיוקרנו. תחומים עמיד פרוטאז נותחו עמודים מרחביות, ספקטרומטר מסה לאחר דגירה 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דק Nsa1-FL: טריים מטוהרים חלבון, Nsa1Δ: לטהר החלבון מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שבועות לאחר מכן נצפתה צורת החלבון מפורק. (ג) מפרטים טכניים תרשים של Nsa1 באורך מלא (העליון), העיגול C-מסוף לבנות (נמוך יותר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. אופטימיזציה התגבשות Nsa1. (א) מלאי הזרע היה המוכנים מהגבישים קטן הראשונית, נהגה להכין סדרה דילול (1 x ~ 1/104x) (microseeding). על ידי ערבוב 1 µL של חלבון עם µL 1 של המניה זרע מדולל, הקריסטלים יחיד גדול גדל בתוך שבוע. (ב) ריכוז precipitant מעבר צבע עבור מיטוב המערכת הגבישית האורתורומבית. (ג) אופטימיזציה קריסטלים מעוקב, האורתורומבית המשמש לאיסוף נתונים. עיגולים ירוקים מציינים אזור טיפוסי של המגשים קריסטל אשר הניב איסוף נתונים איכות קריסטלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. תיאור סכמטי של ניתוח SAXS Nsa1. סקירה של הצינור משמש כדי לעבד נתונים SAXS ולהפיק דגמים עם חבורה (מרכז), לבחירות (מימין). הצינור השמאלי מציג את הפער בין עקומת פיזור ניסיוני (עיגולים אדומים, ריכוז חלבון: 6 מ"ג/מ"ל) עם עקומת פיזור תיאורטי (קו כחול), אשר נוצר מתוך מבנה הגביש 5SUM מזהה PDB. הדגמים הוערכו על-ידי השוואת עקומת פיזור SAXS ניסיוני (עיגולים אדומים, ריכוז חלבון: 6 מ"ג/מ"ל) עם עקומת פיזור נגזר מהמודל חבורה של Nsa1 (קו שחור) או את משימת conformers של Nsa1 (קו שחור). בכל מודל, התחום WD40 מוצג קריקטורה שצבוע בירוק (מזהה PDB 5SUM), גמישות קצה קרבוקסילי מוצג בתחומים בצבע אדום עבור חבורה, ירוק, אדום-ארגמן, ציאן וצהוב עבור conformers לבחירות בודדים. השבר של כל conformer נגזר לבחירות מסומן בצמוד לדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות פרוטוקול זה, Nsa1 רקומביננטי של cerevisiae ס נוצר ללימודי מבניים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והן SAXS. Nsa1 ומנומסת בתמיסה, גיבש בצורות קריסטל מרובים. במהלך אופטימיזציה של גבישים אלו, התגלה כי קצה קרבוקסילי של Nsa1 היה רגיש פרוטאז השפלה. הרזולוציה הגבוהה, טופס הגבישית האורתורומבית יכול רק להיות משוכפל עם C-מסוף משתנים לחיתוך של Nsa1, סביר כיוון C גמיש-הסופית של Nsa1 מנעו קריסטל אריזה. המבנה של Nsa1 נפתר על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן לרזולוציה גבוהה, אך קצה קרבוקסילי לא ניתן לבנות טופס קריסטל או כי לא נעשתה. קריסטלוגרפיה היא הטכניקה בכורה לקביעת ברזולוציה אטומית מבנים של מקרומולקולות סביב בגודל של Nsa1, אולם כמו עם כל שיטה, קריסטלוגרפיה יש מספר מגבלות. אחת המגבלות הגדולות של קריסטלוגרפיה היא חוסר היכולת לזהות אזורים המתוסבכים של חלבונים40,41.

קצה קרבוקסילי של Nsa1 חשוב עבור נאות nucleolar לוקליזציה של החלבון, דבר המלמד את הצורך בלימוד שלו מבנה10. קצה קרבוקסילי של Nsa1, נפתרה על-ידי SAXS, טכניקה משלימה ביולוגיה מבנית קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. SAXS נתונים הוקלט עבור Nsa1 באורך מלא על פני סדרה ריכוז. מסדרה זו ריכוז, ריכוז אופטימלי עבור איסוף נתונים Nsa1 SAXS ועיבוד היה נחוש. SAXS הנתונים נרשמו עבור Nsa1-6, 4.5 ו- 3.0 מ"ג/מ"ל. Guinier, P(r) פונקציה והאזור משקל מולקולרי היו נחושים הסדרות ריכוז על מנת להבטיח כי המדגם היה ומנומסת צבור לא תחת התנאים ניסיוני נבדק. לשחזר את המבנה באורך מלא של Nsa1, משרעת פיזור תיאורטי נקבע מתוך מבנה הגביש חלקית, ואז ab initio שיטות שימשו להדגמת קרבוקסילי גמיש. גישה זו היברידית, נקבע גמישות קרבוקסילי של Nsa1 משתרע כלפי חוץ מהתחום WD40 מסודרות.

ההתקדמות בעיבוד כלים הוביל את הפופולריות של SAXS ללימודי מבנית macromolecular. SAXS מודד את התבנית פיזור קרני רנטגן מונחה באופן אקראי החלבון בתמיסה כדי לספק מידע מבניים ברזולוציה נמוכה, כולל מסה מולקולרית והצורה הכללית. כתוצאה מכך, SAXS התפתחה ככלי אימות חזק מבנה אורתוגונלית קריסטלוגרפיה. זאת בעיקר בשל פיתוח שיטות לחישוב פיזור תיאורטי של הבראבה, משווה אותם נתונים ניסיוני SAXS37. באמצעות גישה זו, המדינה הסתגלותי, מבנה רבעוני ו הרכבה מסדר גבוה נצפו בשריג גבישי ניתן להשוות את מאפיינים מבניים של החלקיק בפתרון. יתר על כן, טרמיני חסר במבנים ברזולוציה גבוהה נקבע על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ללופים המתוסבכים שניתן למדל באמצעות פתרון פיזור נתונים. גישה מבנית זו היברידית משתמש את מבנה גבישי אבן בניין עבור מידול מונחה SAXS של שאריות נעדר והוא הוכיח כיעיל מיפוי את קצה קרבוקסילי של Nsa110, כמו גם מקרומולקולות אחרות כגון נגיף שפעת A M1 מטריקס חלבון42ו- RNA המלח-box מתלווה לשמור43. תוכנת מידול מתקדמים מבוססי SAXS יכול גם לתת מענה מערכות מורכבות יותר, כגון חלבונים המתוסבכים מהותית, על-ידי מיפוי בנוף הסתגלותי של מערכות אלה באמצעות סדרה של conformers שתורמים יחד הפיזור הכללית הפוטנציאל של החלקיק ב פתרון16,39. ההתקדמות ביחד, האחרונות לקח כלי איסוף ועיבוד נתונים SAXS תורם להצלחת היברידית ביולוגיה מבנית גישות להתמודדות עם מערכות ביולוגיות מאתגר.

השילוב של פתרון פיזור במבנים ברזולוציה גבוהה צפוי לענות על שאלות חשובות על גמישות ועל הדינמיקה של מקרומולקולות44. חלבונים רבים, כגון Nsa1, יש דינמיים באזורים החשובים לתפקוד הביולוגי. כתב יד זה פרוטוקול תבנית מסופק איזה פרטים השילוב של SAXS עם מכשור לקביעת קשיות ומבנה ברזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. בנוסף ניתן להשתמש SAXS גם להחמיא טכניקות אחרות ביולוגיה מבנית כולל NMR קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, אלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR), קרינה פלואורסצנטית תהודה ואנרגיה העברה (סריג), יותר הדגשת חשיבות SAXS כמו ביולוגיה מבנית משלימים טכניקה45,46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עקיפה הנתונים נאספו ב דרום מזרח אזוריים שיתופי גישה צוות (SER-חתול) 22-ID ו- 22-מוניטור beamlines-מתקדם הפוטון מקור (APS), Argonne National Laboratory. הנתונים SAXS נאספו על הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS-מראש אור מקור (ALS), המעבדה הלאומית לורנס ברקלי. ברצוננו להודות לצוות-הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS על עזרתם עם איסוף נתונים מרחוק ועיבוד. אנחנו אסירי תודה הלאומית המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) מסה ספקטרומטר המחקר, קבוצת תמיכה כדי לברר את גבולות התחום חלבון עבודה זו נתמכה על ידי לנו מכון של בריאות מגזר מחקר התכנית הלאומית; המכון הלאומי האמריקאי למדעי בריאות וסביבה (NIEHS) (ZIA ES103247 ל ר א ס) ומכונים הקנדית לחקר בריאות (CIHR, 146626 כדי M.C.P). השימוש APS נתמכה על ידי לנו משרד האנרגיה, משרד המדע, משרד בסיסי אנרגיה למדעים תחת חוזה מס W-31-109-Eng-38. שימוש של מקור אור מתקדם (ALS) נתמכה על ידי מנהל, משרד המדע, משרד בסיסי אנרגיה למדעים, של מחלקת האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה מס דה-AC02-05CH11231. תמיכה נוספת עבור הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS SAXS נובע המכון הלאומי לבריאות פרוייקט מינוס (R01GM105404), יוקרתי מכשור גראנט S10OD018483. כן נרצה להודות אנדריאה הירח ואת ד ר שרה אנדרס. בקריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

ביוכימיה גיליון 131 קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן SAXS שיטות היברידית חלבון טיהור תחום WD40 Proteolysis מוגבלת הרכבה ריבוזום
שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של <em>Cerevisiae ס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter