Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एक्स-रे क्रि छोटे कोण एक्स-रे के साथ Nsa1 के मॉडल unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों को तितर बितर के साथ संयोजन एस Cerevisiae से

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

यह विधि एक्स-रे क्रि और छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS) द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए संयोजक Nsa1 की क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, और शुद्धि का वर्णन करता है, और अन्य प्रोटीन के संकर संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लागू है जिसमें आदेश दिया और परिक्रमा डोमेन दोनों शामिल हैं ।

Abstract

Saccharomyces cerevisiae (एस. cerevisiae) से ribosome असेंबली फैक्टर Nsa1 की पूर्ण लंबाई संरचना का निर्धारण, प्रोटीन की परिक्रमा और चिढ़ाने labile सी-टर्मिनस की वजह से चुनौतीपूर्ण है । इस पांडुलिपि में एक्स-रे क्रि और SAXS दोनों द्वारा संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एस cerevisiae से संयोजक Nsa1 को शुद्ध करने के तरीकों का वर्णन है । एक्स-रे क्रि Nsa1 के अच्छी तरह से आदेश दिया एन टर्मिनल WD40 डोमेन की संरचना को हल करने के लिए उपयोग किया गया था, और फिर SAXS समाधान में Nsa1 के सी-टर्मिनस की संरचना को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । समाधान कैटरिंग डेटा पूर्ण-लंबाई Nsa1 से समाधान में एकत्रित किया गया था । सैद्धांतिक कैटरिंग आयाम WD40 डोमेन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रिस्टल संरचना से परिकलित किए गए थे, और फिर कठोर शरीर और ab initio मॉडलिंग का संयोजन Nsa1 के सी-टर्मिनस से पता चला । इस संकर दृष्टिकोण के माध्यम से पूरे प्रोटीन की चतुर्धातुक संरचना को खंगाला गया । यहां प्रस्तुत तरीकों आमतौर पर संकर संरचनात्मक निर्धारण के लिए लागू किया जाना चाहिए अंय प्रोटीन संरचित और unस्ट्रक्चर्ड डोमेन का मिश्रण से बना ।

Introduction

Ribosomes बड़े ribonucleoprotein मशीनों है कि सभी जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन में mRNA अनुवाद की आवश्यक भूमिका को पूरा कर रहे हैं । Ribosomes एक जटिल प्रक्रिया में उत्पादित कर रहे हैं जो दो उपइकाईयों से बना रहे हैं ribosome उत्पत्ति1,2,3,4. युकेरियोटिक ribosome विधानसभा आवश्यक राइबोसोमल विधानसभा कारकों में से सैकड़ों की सहायता पर निर्भर करता है2,3,5। Nsa1 (Nop7 जुड़े 1) एक युकेरियोटिक ribosome विधानसभा कारक है कि विशेष रूप से बड़े राइबोसोमल उपइकाई6के उत्पादन के लिए आवश्यक है, और WD-दोहराने युक्त ७४ (WDR74) उच्च जीवों में7के रूप में जाना जाता है । WDR74 चूहों में ब्लास्टोसिस्ट गठन के लिए आवश्यक हो दिखाया गया है8और WDR74 प्रमोटर अक्सर कैंसर कोशिकाओं में रूपांतरित हो जाता है9. हालांकि, समारोह और ribosome विधानसभा में Nsa1/WDR74 के सटीक तंत्र अभी भी काफी हद तक अनजान हैं । युकेरियोटिक ribosome परिपक्वता के दौरान Nsa1/WDR74 की भूमिका को उजागर करने के लिए शुरू करने के लिए, कई संरचनात्मक विश्लेषण एक्स-रे क्रि और छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS)10सहित प्रदर्शन किया गया था, ।

एक्स-रे क्रि, नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और SAXS macromolecular संरचना के अध्ययन के लिए सभी महत्वपूर्ण तकनीक हैं । आकार, आकार, उपलब्धता, और अणुओं की स्थिरता के लिए संरचनात्मक जीवविज्ञान पद्धति है जो एक विशेष macromolecule सबसे अच्छा अनुकूल हो जाएगा प्रभावित करता है, लेकिन एक तथाकथित "संकर दृष्टिकोण" के माध्यम से कई तकनीकों के संयोजन होता जा रहा है तेजी से लाभकारी उपकरण11. विशेष रूप से एक्स-रे क्रि और SAXS अणुओं12के संरचनात्मक निर्धारण के लिए शक्तिशाली और पूरक तरीके हैं ।

क्रि छोटे अणुओं से इस तरह के ribosome के रूप में बड़े सेलुलर मशीनरी को लेकर उच्च संकल्प परमाणु संरचनाओं प्रदान करता है, और प्रोटीन और अन्य के जैविक कार्यों की समझ में कई सफलताओं के लिए नेतृत्व किया है अणुओं१३। इसके अलावा, संरचना आधारित दवा डिजाइन अभिकलनी तरीकों से आणविक डॉकिंग के लिए क्रिस्टल संरचनाओं की शक्ति का दोहन, दवा की खोज और विकास के लिए एक महत्वपूर्ण आयाम जोड़ने14। अपनी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, लचीला और परिक्रमित प्रणालियों के बाद से क्रि द्वारा आकलन करने के लिए चुनौती दे रहे है क्रिस्टल पैकिंग या रुकावट हो सकता है इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे अधूरा या खराब गुणवत्ता का हो सकता है । इसके विपरीत, SAXS एक समाधान आधारित और कम संकल्प संरचनात्मक दृष्टिकोण को परिक्रमा छोरों और टर्मिनी से आंतरिक रूप से परिक्रमित प्रोटीन12,15,16से लेकर प्रणालियों का वर्णन करने में सक्षम है । विचार यह कण आकार12की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है, SAXS क्रि के साथ synergistically काम करने के लिए जैविक प्रश्न है कि संरचनात्मक अध्ययन द्वारा संबोधित किया जा सकता है की सीमा का विस्तार कर सकते हैं ।

Nsa1 एक संकर संरचनात्मक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त है क्योंकि यह एक अच्छी तरह से संरचित WD40 एक कार्यात्मक द्वारा पीछा डोमेन शामिल है, लेकिन लचीला सी-टर्मिनस जो एक्स-रे क्रि तरीकों के लिए उत्तरदायी नहीं है । निंनलिखित एक्स-रे क्रि और SAXS द्वारा संकर संरचनात्मक निर्धारण के लिए क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, और एस cerevisiae Nsa1 के शोधन के लिए एक प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल का आदेश दिया और परिक्रमा क्षेत्रों का एक संयोजन के शामिल हैं कि अन्य प्रोटीन की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. संयोजक प्रोटीन उत्पादन और एनएसए 1 का शुद्धिकरण

  1. Nsa1 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड डिजाइन और क्लोनिंग
    1. एस. cerevisiae जीनोमिक डीएनए प्राप्त या खरीद ।
    2. पीसीआर Nsa1 के लक्ष्य दृश्यों (Nsa1FL, अवशेषों 1-463) और सी-टर्मिनल कटा हुआ Nsa1 (Nsa1ΔC, अवशेषों 1-434) जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर उपयुक्त प्राइमरों के साथ एस cerevisiae और एक पिघलने तापमान से अलग 1-2 मिनट के एक एक्सटेंशन समय के साथ लगभग ६० डिग्री सेल्सियस । निंनलिखित प्राइमरों Nsa1 बढ़ाना इस्तेमाल किया गया:
      SC_Nsa1_FLFw: CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv: AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1Δcपरिवार कल्याण: GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. ई कोलाई में उपक्लोन Nsa1 (ई. कोलाई) अभिव्यक्ति वेक्टर pHMBP एक एन-टर्मिनल 6X-Histidine माल्टोज़ बंधन प्रोटीन (MBP) और एक तंबाकू खोदना वायरस (टीईवी) के बाद टैग युक्त मानक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर साइट17 .
    4. डीएनए अनुक्रमण का प्रयोग करें सत्यापित करें कि Nsa1 एन-टर्मिनल अपने-MBP टैग के साथ फ्रेम में क्लोन किया गया था ।
  2. Nsa1 प्रोटीन एक्सप्रेशन
    1. एक T7 प्रवर्तक आधारित प्रणाली के साथ एक उपयुक्त ई. कोलाई अभिव्यक्ति तनाव में अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (ओं) रूपांतरण । १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेट पौंड आगर पर transformants प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात औंधा प्लेट गर्मी ।
    2. लगाना १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पौंड की ५० मिलीलीटर संस्कृति परिवर्तन थाली से, और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर झटकों के साथ रातोंरात बढ़ने ।
    3. लगाना 3 x १००० मिलीलीटर Fernbach कुप्पी में १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ रातोंरात संस्कृति की 15 मिलीलीटर के साथ और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर मिलाते के साथ हो जाना ।
      नोट: प्रोटीन संरचना समाधान के लिए, selenomethionyl (SeMet) निगमन M9 कम माध्यम है कि SeMet और एक एमिनो एसिड मिश्रण के साथ पूरक है में बढ़ती कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है प्रेरण से पहले मिथीयोनाईन उत्पादन को बाधित करने के लिए, के रूप में पौंड मीडिया का विरोध 18.
    4. Nsa1 की अभिव्यक्ति प्रेरित जब आयुध डिपो६०० ~ ०.८ isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) के अतिरिक्त द्वारा 1 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता पर पहुंचता है 25 डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर मिलाते के साथ रात भर के बाद ।
    5. 15 मिनट के लिए 4 ° c पर ५,०५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं
      नोट: कोशिकाओं को लंबे समय तक संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c या प्रोटीन शोधन के लिए तुरंत इस्तेमाल किया ।
  3. Nsa1 प्रोटीन शुद्धि
    1. Lysis बफर के 25 मिलीलीटर (५० mm Tris-HCl, पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 10 mm MgCl2) में कोशिकाओं को पुनः निलंबित 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा एक EDTA-मुक्त छेड़ने अवरोधक गोली युक्त ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर sonication द्वारा लाइसे कोशिकाओं (समय 7 मिनट, चक्र पर 2 एस, 2 साइकिल से एस; आयाम: ७०%) ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए २६,९०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा lysate स्पष्ट ।
    4. लागू करने के लिए स्पष्ट lysate एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के साथ भरी हुई कॉलम के 10 मिलीलीटर के साथ भरा कोबाल्ट संबध राल, पूर्व equilibrated Lysis बफर के साथ ।
    5. supernatant 4 डिग्री सेल्सियस पर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा राल पर पारित करने के लिए अनुमति दें और Lysis बफर की १०० मिलीलीटर के साथ दो बार राल धो लो ।
    6. Elute Nsa1 20 एमएल के रेफरेंस बफर (५० एमएम Tris-एचसीएल नं० ७.५, ५०० एमएम NaCl, 5 एमएम MgCl2, 5% ग्लिसरॉल और २०० एमएम imidazole) के साथ ।
    7. eluate की 15 μL लें और यह पुष्टि करने के लिए 4-15% एसडीएस-PAGE gel पर चलाएं कि प्रोटीन संबधी राल (figure 1a) से eluted है ।
    8. टीईवी द्वारा MBP टैग निकालें पाचन को छेड़ो । टीईवी के 1 मिलीलीटर में जोड़ें19 (1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) Nsa1 संबध राल रेफरेंस के लिए और यह 4 ° c रातोंरात पर मशीन ।
    9. ध्यान MBP एक आणविक वजन के साथ एक केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर ~ 5 मिलीलीटर के लिए Nsa1 सट 10 केडीए के कट ।
    10. MBP-सट Nsa1 को एक जेल-निस्पंदन कॉलम में लागू करें, बफर ए में पूर्व equilibrated (20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, १०० मिमी NaCl, 1 मिमी MgCl2, 5% ग्लिसरॉल और 1 मिमी β-mercaptoethanol) (चित्र 1b) ।
    11. MBP सट और Nsa1 से एक 4-15% एसडीएस-पृष्ठ जेल (चित्र 1b) पर 15 μL नमूने चलाकर अलग है कि यह सत्यापित करने के लिए जेल निस्पंदन से स्तंभ अंशों का विश्लेषण करें ।
    12. Nsa1 युक्त भागों गठबंधन और 8 मिलीग्राम/एमएल एक आणविक वजन के साथ एक केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर 10 केडीए के कट ।
    13. विलुप्त होने गुणांक ४२५३० एम-1सेमी-1का उपयोग कर एक spectrophotometer पर २८० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण । proteolytic स्क्रीनिंग और क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए तुरंत प्रोटीन का प्रयोग करें ।

2. एनएसए 1 की क्रिस्टलीकरण और Proteolytic स्क्रीनिंग

  1. विरल मैट्रिक्स Nsa1 के क्रिस्टल स्क्रीनिंग
    1. केंद्रापसारक ५०० μL के 8 मिलीग्राम/एमएल Nsa1 के १६,००० एक्स जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्टॉक ।
    2. सेटअप क्रिस्टलीकरण परीक्षण एक क्रिस्टलीकरण रोबोट और विरल मैट्रिक्स क्रिस्टल स्क्रीन का उपयोग कर । विरल मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से व्यक्तिगत क्रिस्टल स्क्रीन रिएजेंट के 30 μl के साथ ९६ अच्छी तरह से ट्रे के जलाशय भरें । सेटअप बैठे प्रोटीन समाधान के २५० nL के साथ अच्छी तरह से समाधान के २५० nL मिश्रण से रोबोट के साथ चला जाता है ।
    3. टेप के साथ क्रिस्टलीकरण प्लेटों को सील और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    4. एक stereomicroscope के साथ पहली 2-3 सप्ताह के लिए हर दो दिन प्लेटों का निरीक्षण ।
    5. सत्यापित करें कि संभावित क्रिस्टल हिट एक यूवी माइक्रोस्कोप के साथ प्रोटीन होते हैं ।
      नोट: Nsa1 के लिए दो अलग क्रिस्टल रूपों (घन और orthorhombic, चित्रा 2a) निम्नलिखित स्क्रीन से 1 सप्ताह के भीतर प्राप्त किया गया था: JCSG + हालत B11 (१.६ एम सोडियम साइट्रेट tribasic निर्जलीकरण, पीएच ६.५) और जादूगर Precipitant सिनर्जी स्क्रीन ब्लॉक 2 शर्त C11 (20.1% (v/v) खूंटी १५००, 13.4% (v/v) खूंटी ४००, ०.१ M Tris HEPES/सोडियम हीड्राकसीड, पीएच ७.५).
  2. Proteolytic स्क्रीनिंग
    नोट: क्रिस्टलीकरण अनुकूलन के दौरान, यह पता चला था कि Nsa1 के orthorhombic क्रिस्टल proteolytic दरार का एक परिणाम के रूप में उठी और क्रिस्टल पूर्ण लंबाई प्रोटीन का उपयोग कर दोहराया नहीं जा सकता है । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर सीमित प्रोटियोलिसिस का एक संयोजन का उपयोग करना, यह निर्धारित किया गया था कि Nsa1 के सी-टर्मिनस प्रोटियोलिसिस के प्रति संवेदनशील था और सी-टर्मिनल पूंछ को हटाने orthorhombic क्रिस्टल रूप के बाद के प्रजनन के लिए आवश्यक था ( Nsa1ΔC) ।
    1. तैयार करें 1 मिलीग्राम/एमएल निम्न के स्टॉक समाधान को छेड़ने वाली α-chymotrypsin, trypsin, elastase, papain, subtilisin, और endoproteinase Glu-सी.
    2. 1:10, 1:100, और प्रत्येक 1 मिलीग्राम/एमएल कमजोर पड़ने बफर (10 मिमी HEPES, पीएच ७.५, ५०० मिमी सोडियम क्लोराइड) के साथ शेयर की कमजोर पड़ने की ।
    3. पिपेट 1 μL को छेड़ने वाले शेयर (1:10, 1:100 और 1:1000) के 9 μL aliquots में प्रोटीन (1 mg/एमएल) के लिए प्रत्येक को चिढ़ाने के लिए दिखलाई पड़ता है ।
    4. 1 एच के लिए ३७ ° c पर समाधान की मशीन ।
    5. 2x एसडीएस-पृष्ठ नमूना बफर के 10 μL जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर प्रतिक्रिया गर्मी ।
    6. उंहें 4-15% एसडीएस-PAGE gel (figure b) पर चलाकर डाइजेस्टर का विश्लेषण करें ।
    7. जेल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा लक्ष्य प्रोटीन की चिढ़ा प्रतिरोधी डोमेन की पहचान ।
    8. ऊपर वर्णित क्लोनिंग, व्यंजक और शुद्धि प्रोटोकॉल का अनुसरण करते हुए, लक्ष्य प्रोटीन से labile क्षेत्रों को काटें व्यंजक बना कर निकालें ।
  3. क्रिस्टलीकरण अनुकूलन
    1. तैयार या निम्न प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण के स्टॉक समाधान प्राप्त करें रिएजेंटों: १.६ एम सोडियम साइट्रेट tribasic निर्जलीकरण पीएच ६.५, 100% (v/v) खूंटी ४००, 50% (v/v) खूंटी १५००, 1 M HEPES/सोडियम हीड्राकसीड, पीएच ७.५ ।
    2. ऊपर वर्णित के रूप में 8 मिलीग्राम/एमएल पर Nsa1FL और Nsa1ΔC के शेयर समाधान तैयार करें ।
    3. Nsa1 घन क्रिस्टल (Nsa1FL) का अनुकूलन ।
      1. 1 के एक ढाल के साथ ५०० µ l युक्त कुओं के साथ एक 24-अच्छी तरह से ग्रिड स्क्रीन तैयार-1.6 पीएच ६.५ के साथ १.६ मीटर सोडियम साइट्रेट tribasic के एक शेयर समाधान से ph ६.५ के साथ सोडियम साइट्रेट के एम ।
      2. अच्छी तरह से समाधान के 1 µ एल के साथ प्रोटीन के 1 µ एल मिश्रण और एक सिलिकॉन कवर स्लाइड पर मिश्रण जगह है । ध्यान से पूर्व अच्छी तरह से चिकना के शीर्ष पर कवर स्लाइड पलटना और यह अच्छी तरह से बंद है, लेकिन ध्यान रखना ड्रॉप परेशान नहीं है या कवर स्लाइड को तोड़ने के लिए सुनिश्चित करें । इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक ट्रे भर न जाए और फिर 25 ° c पर स्टोर करें ।
        नोट: छोटे घन क्रिस्टल 2-7 दिनों में प्रकट होना चाहिए ।
      3. घन क्रिस्टल के एक microseed शेयर तैयार करते हैं । एक घुड़सवार नायलॉन पाश का प्रयोग करें स्थानांतरण करने के लिए ~ 10 छोटे घन क्रिस्टल एक छोटे मनका और ५० µ l १.६ एम सोडियम साइट्रेट tribasic बुद्धि पीएच ६.५ से युक्त एक १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए ।
      4. भंवर १.५ मिलीलीटर सूक्ष्म उच्च गति पर ट्यूब (~ ३००० rpm) 1 मिनट के लिए ।
      5. १.६ एम सोडियम साइट्रेट tribasic और भंवर के साथ 5 एस के लिए अच्छी तरह से मिश्रण के साथ बीज शेयर के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला बनाओ ।
      6. एक 24 अच्छी तरह से ग्रिड, १.६ एम सोडियम साइट्रेट tribasic पीएच ६.५ के ५०० µ एल के साथ स्क्रीन के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें ।
      7. बीज स्टॉक समाधान (चित्र 3ए) के साथ प्रोटीन के अनुपात में बदलती के साथ बूंदें की स्थापना करके microseeding शर्तों का अनुकूलन । उच्च विवर्तन गुणवत्ता के बड़े घन क्रिस्टल 2-5 दिनों (चित्रा 3सी) में दिखाई देना चाहिए ।
    4. orthorhombic क्रिस्टल का अनुकूलन (Nsa1ΔC)
      1. ५०० µ एल के साथ एक ग्रिड स्क्रीन के साथ एक अच्छी तरह से 24 विभिन्न स्थितियों (चित्र) 50% (v/v) खूंटी १५००, और 100% (v/v) खूंटी ४०० के स्टॉक समाधान से (. खूंटी १५०० और ४०० खूंटी की ढाल के अलावा, प्रत्येक अच्छी तरह से भी शामिल होना चाहिए ०.१ M HEPES/सोडियम हीड्राकसीड पीएच ७.५ ।
      2. एक सिलिकॉन कवर स्लाइड पर अच्छी तरह से समाधान के 1 µ एल के साथ प्रोटीन समाधान के 1 µ एल मिक्स । ध्यान से पूर्व अच्छी तरह से तेल के शीर्ष पर कवर स्लाइड उलटा और यह अच्छी तरह से बंद है सुनिश्चित करें । इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक पूरी ट्रे भर न गई हो । 25 डिग्री सेल्सियस पर ट्रे स्टोर ।
        नोट: Nsa1 orthorhombic क्रिस्टल 2-7 दिनों में प्रकट होना चाहिए ।
      3. इसके अलावा घन क्रिस्टल के लिए वर्णित के रूप में microseeding द्वारा orthorhombic क्रिस्टल का अनुकूलन (2.3.3.7 के लिए कदम 2.3.3.3) 20.1% के ५०० µ एल का उपयोग (v/v) खूंटी १५००, 13.4% (v/v) खूंटी ४००, और ०.१ एम HEPES/सोडियम हीड्राकसीड पीएच ७.५ अच्छी तरह से समाधान के रूप में ।
        नोट: Nsa1 SeMet क्रिस्टल मूल क्रिस्टल के अनुरूप अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

3. एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह और एनएसए 1 संरचना समाधान

  1. क्रायो-क्रिस्टल और एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह की सुरक्षा
    1. orthorhombic क्रिस्टल (Nsa1ΔC) के लिए, 22.5% (v/v) खूंटी १५००, 15% (v/v) खूंटी ४०० और ०.१ M HEPES/सोडियम हीड्राकसीड पीएच ७.५ युक्त 1 मिलीलीटर cryoprotectant समाधान तैयार करें ।
    2. तरल नाइट्रोजन के साथ एक फोम देवर भरें, और पूर्व एक क्रिस्टल पक ठंडा । उपयोग सावधानी जब तरल नाइट्रोजन के साथ काम करने और सुरक्षात्मक दस्ताने और काले चश्मे पहनते हैं ।
    3. ध्यान से क्रिस्टल के कवर स्लाइड अच्छी तरह से एक stereomicroscope के मंच पर कण से युक्त उलटा ।
    4. पिपेट एक नई कवर स्लाइड पर cryoprotectant समाधान के 2 µ एल ।
    5. एक चुंबकीय क्रायो छड़ी करने के लिए क्रिस्टल के लिए उपयुक्त आकार की एक घुड़सवार नायलॉन पाश देते हैं ।
    6. stereomicroscope की सहायता का उपयोग करना, जल्दी से घुड़सवार क्रायो लूप के साथ cryoprotectant समाधान के लिए एक क्रिस्टल हस्तांतरण ।
    7. cryoprotectant समाधान में 5 मिनट के लिए क्रिस्टल equilibrate दें ।
    8. stereomicroscope की सहायता का उपयोग करना, जल्दी से लूप क्रिस्टल cryoprotectant समाधान और डुबकी से तरल नाइट्रोजन में फ्रीज ।
    9. लूप के आसपास तरल नाइट्रोजन के लिए रुको उबलते रोकने के लिए और फिर छड़ी से क्रिस्टल पक भीतर एक विशिष्ट स्थान में पाश रिहाई ।
    10. घन Nsa1FL क्रिस्टल cryoprotected होने की जरूरत नहीं है और सीधे जमे हुए फ़्लैश (ऊपर कदम 3.1.8-3.1.9 के बाद) किया जा सकता है ।
    11. एक पूर्व ठंडा देवर में एक शिपिंग बेंत को क्रायो उपकरण और हस्तांतरण का उपयोग कर क्रिस्टल पक सील । डेटा संग्रह तक पक में क्रिस्टल की दुकान/
    12. यदि एक सिंक्रोट्रॉन पर डेटा का संग्रह, सिंक्रोट्रॉन एक सूखी वणिक का उपयोग करने के लिए क्रिस्टल जहाज ।
    13. मानक तकनीक20के बाद X-ray विवर्तन डेटा एकत्रित करें ।
      नोट: Nsa1 देशी और उदास (एकल-तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव) डेटासेट के लिए १०० K पर एकत्र किए गए थे SER-CAT बीम लाइंस 22-आईडी और 22-Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला (शिकागो, आईएल) में उंनत फोटॉन स्रोत के बीएम । उदास Nsa1 डेटासेट λ = ०.९७९११ å पर एकत्र किया गया था । डेटा एक 1 एस जोखिम समय और ०.५ ° दोलनों का उपयोग कर दर्ज किया गया था । इन क्रिस्टल की पच्चीकारी ०.३ डिग्री के आसपास आम तौर पर किया गया था ।
    14. उपयुक्त स्थान समूह में प्रत्येक डेटा सेट के लिए प्रतिबिंब फ़ाइलें जनरेट करने के लिए X-ray विवर्तन छवियों को संसाधित और स्केल करें ।
      नोट: Nsa1 विवर्तन datasets HKL200021के साथ संसाधित किए गए थे । Nsa1 घन क्रिस्टल अंतरिक्ष समूह p213 और orthorhombic क्रिस्टल में संसाधित किया गया अंतरिक्ष समूह p212121में संसाधित किया गया ।
  2. Nsa1 संरचना समाधान ।
    नोट: कई क्रि सॉफ्टवेयर संकुल है कि Phenix और CCP422,23सहित क्रिस्टल संरचनाओं को सुलझाने और परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । निंनलिखित Nsa1 संरचना समाधान के लिए प्रोटोकॉल Phenix सॉफ्टवेयर सुइट का उपयोग कर रहा है22।
    1. phenix. xtriage22के साथ नेटिव और SAD स्केल्ड डेटासेट का विश्लेषण करें ।
    2. उदास चोटी प्रतिबिंब फ़ाइल का उपयोग कर Phenix. autosol के साथ Nsa1 की संरचना का समाधान22,24। AutoSol के कार्यक्रम को चलाने के लिए, इनपुट selenomethionine साइटों की संख्या (साइटें = 9), Nsa1 ΔC के फसता अनुक्रम फ़ाइल, और तरंग दैर्ध्य दुखद डेटा संग्रह (λ = ०.९७९११ å) के लिए इस्तेमाल किया ।
      नोट: Nsa1 से दुखी डेटासेट, phenix. autosol प्रयोगात्मक चरणों का निर्धारण और मॉडल के सबसे निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए.
    3. कूट के साथ मॉडल के लिए मैनुअल समायोजन करें25, phenix में शोधन के बाद.22,26को परिष्कृत करें ।
    4. उच्च संकल्प देशी orthorhombic क्रिस्टल की संरचना का समाधान और आणविक प्रतिस्थापन27,28का उपयोग करके घन क्रिस्टल ।
    5. सफल संरचना समाधान के बाद, कूट25में मॉडल और इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा का निरीक्षण किया ।
    6. phenix में जनकल्याण के चलने फेरे चलाकर संरचनाओं का निर्माण और परिशोधित करें. कूट25में22,26 और मॉडल बिल्डिंग को परिष्कृत करें ।

4. SAXS डेटा संग्रह, प्रसंस्करण, और मॉडलिंग

  1. SAXS डेटा संग्रह
    नोट: SAXS डेटा उंनत प्रकाश स्रोत पर पूर्ण लंबाई एस cerevisiae Nsa1 के लिए रिकॉर्ड किया गया, उच्च प्रवाह SIBYLS beamline 12.3.1 पर लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला, बर्कले, CA29पर ।
    1. ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद Nsa1FL शुद्ध. 24 एच beamline करने के लिए Nsa1FL के लदान से पहले, एक जेल निस्पंदन स्तंभ पूर्व equilibrated में बफर ए पर प्रोटीन चलाने
    2. पूल Nsa1 युक्त अंशों और निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता के रूप में पहले वर्णित है ।
    3. 1 से Nsa1 की एकाग्रता श्रृंखला के 30 μl aliquots तैयार करने के लिए ६.२ मिलीग्राम/
    4. एक स्पष्ट पूर्ण स्कर्ट के लिए Nsa1 के प्रत्येक एकाग्रता श्रृंखला के 20 μl हस्तांतरण ९६ अच्छी तरह से बफर एक अकेले नियंत्रण के साथ साथ microplate ।
      नोट: SAXS डेटा एकत्रीकरण, अंतर-कण प्रतिकारक, और विकिरण क्षति प्रभाव से बचने के लिए शुद्ध नमूना के कई सांद्रता का उपयोग कर समाधान को पतला पर एकत्रित किया जाता है ।
    5. एक सिलिकॉन सील चटाई और beamline के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात जहाज के साथ microplate सील ।
    6. डेटा संग्रह तक 4 ° c पर microplate को संग्रहीत करना ।
    7. डेटा संग्रह से पहले तुरंत, क्षमता समुच्चय और हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३२०० x g पर थाली स्पिन ।
    8. रिकॉर्ड SAXS डेटा ।
      नोट: Nsa1 के लिए, SAXS डेटा बफ़र के लिए पहले और प्रत्येक प्रोटीन एकाग्रता श्रृंखला के बाद दर्ज किए गए थे । ३३ ०.३ एस के लगातार स्कैन एक एकाग्रता श्रृंखला पर Nsa1FL के लिए एकत्र किए गए थे (1 से ६.२ मिलीग्राम/एमएल) 10 डिग्री सेल्सियस पर ।
    9. SAXS डेटा के लिए बफ़र घटाव निष्पादित करें ।
      नोट: के लिए Nsa1 बफर घटाव स्वचालित रूप से beamline पर किया गया था, लेकिन बफर घटाव भी ऐसे तितर बितर30 और ATSAS सुइट31के रूप में डेटा कमी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । बफर घटाव SAXS डेटा विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और यह सुनिश्चित करें कि घटाव के लिए प्रयोग किया जाता बफर प्रोटीन नमूना बफर के समान है के लिए लिया जाना चाहिए देखभाल ।
    10. औसत ३३ लगातार स्कैन प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक * ave. dat फ़ाइल बनाने के लिए ।
      नोट: curves तुलना करने के लिए ३३ लगातार फ्रेम ओवरले । समय के साथ छितराई घटता में परिवर्तन अक्सर विकिरण क्षति का संकेत है । औसत से इन फ़्रेंस को छोड़ दें । Nsa1 लगातार स्कैन का औसत SIBYLS beamline में स्वचालित रूप से प्रदर्शन किया गया था ।
  2. SAXS डेटा प्रोसेसिंग और एकाग्रता श्रृंखला की तुलना
    नोट: SAXS डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता कई सॉफ़्टवेयर पैकेज़ हैं । Nsa1 के लिए परिचलन और जोड़ी वार दूरी वितरण कार्यों के त्रिज्या प्राइमस३२ और Gnom३३ ATSAS 2.7.2 suite31 से और सभी प्रोटीन सांद्रता भर की तुलना में सुनिश्चित करने के लिए वहां कोई विकिरण था का उपयोग कर निर्धारित किया गया क्षति या एकाग्रता पर निर्भर अंतर कण बातचीत10।
    1. कोई टर्मिनल शेल खोलें और SAXS डेटा वाली निर्देशिका पर जाएं ।
    2. टर्मिनल शेल के भीतर से प्राइमस३२ GUI लॉंच ।
    3. प्राइमस जीयूआई के भीतर, कैटरिंग घटता लोड (* ave. dat) ।
    4. AutoRg का उपयोग परिचलन (Rg) और आगे कैटरिंग तीव्रता I (0), प्रत्येक कैटरिंग वक्र (* ave. dat) के लिए त्रिज्या निर्धारित करने के लिए करें ।
    5. प्रत्येक तितर बितर वक्र के लिए Kratky भूखंडों उत्पंन (* ave. dat), कॉंपैक्ट की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए ।
    6. उपयोग AutoGNOM३३ जोड़ी-वार वितरण समारोह की गणना करने के लिए (भी कहा जाता P (r)) प्रत्येक कैटरिंग वक्र के लिए (* ave. dat) । एक प्रारंभिक डीमैक्स ≈ 3 * rg दर्ज करें और एक चिकनी पी (आर) वक्र प्राप्त करने के लिए डीअधिकतम मूल्य का अनुकूलन । डीमैक्सके अनुकूलन के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि परिकलित P (r) फ़ंक्शन प्रयोगात्मक स्कैटरिंग वक्र के साथ रिपोर्टेड χ2 मान की जांच करके और नेत्रहीन को कैटरिंग वक्र के लिए समग्र फ़िट का आकलन करने के अनुरूप है ।
    7. Nsa1 के आणविक वजन की गणना से कैटरिंग curves३४सहसंबंध की मात्रा का उपयोग कर ।
    8. प्रत्येक एकाग्रता के लिए संरचनात्मक मापदंडों की तुलना करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई विकिरण क्षति या एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव हैं ।
      नोट: एकाग्रता प्रभाव एक बढ़ती प्रोटीन एकाग्रता के संबंध में एक बढ़ती आरजी और डीमैक्स के रूप में प्रकट कर सकते हैं । आगे कैटरिंग मैं (0) नमूना एकाग्रता से विभाजित भी प्रोटीन एकाग्रता श्रृंखला में निरंतर रहना चाहिए.
  3. SAXS मॉडलिंग
    नोट: Nsa1FLके सी-टर्मिनस की स्थिति निर्धारित करने के लिए, Nsa1 क्रिस्टल संरचना10 (PDB 5SUM) और SAXS कैटरिंग घटता कठोर शरीर और एबी initio मॉडलिंग का एक संयोजन बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, प्रोग्राम गुच्छा का उपयोग ३५ और पहनावा अनुकूलन विधि (EOM)३६ ATSAS सॉफ्टवेयर सुइट31से । Nsa1 के WD40 डोमेन एक कठोर शरीर के रूप में इलाज किया गया था, जबकि WD40 डोमेन से कई विक्रमित छोरों के साथ Nsa1 के सी-टर्मिनस प्रयोगात्मक SAXS डेटा फिट करने के लिए मॉडलिंग कर रहे थे.
    1. इनपुट PDB फ़ाइल (फ़ाइलें) जनरेट करें । PDB फ़ाइल विभाजित किया जाना चाहिए हर बार अवशेषों मुख्य श्रृंखला से लापता हैं, और PDB फ़ाइल एकाधिक संरचनाओं, लाइगैंडों, या पानी के अणुओं को शामिल नहीं कर सकते ।
    2. (Pre_BUNCH. PDB) बंच के लिए इनपुट PDB फ़ाइल तैयार करने के लिए प्रोग्राम Pre_BUNCH३५ चलाएं । इनपुट लक्ष्य प्रोटीन के अनुक्रम (*. seq), 4.3.1 में उत्पंन डोमेन/PDBs की संख्या, और प्रत्येक व्यक्ति PDB ऊपर उत्पंन फ़ाइलों की ।
    3. CRYSOL३७प्रोग्राम का उपयोग कर प्रत्येक व्यक्ति PDB फ़ाइल के लिए कैटरिंग आयाम परिकलित करें । CRYSOL इनपुट व्यक्तिगत PDB फ़ाइल और प्रयोगात्मक SAXS कैटरिंग वक्र (*. dat) चलाने के लिए । यह एक आयाम फ़ाइल (*. एएलएम) जनरेट करेगा ।
    4. भागो कार्यक्रम गुच्छा३५ SAXS डेटा के खिलाफ Nsa1 के WD40 डोमेन मॉडल एक संयुक्त कठोर शरीर और अटल बिहारी initio दृष्टिकोण का उपयोग कर । इनपुट PDB फ़ाइल से Pre_BUNCH (Pre_BUNCH. PDB), प्रयोगात्मक SAXS कैटरिंग वक्र (*. dat), और व्यक्तिगत आयाम (*. एएलएम) फ़ाइलें PDB द्वारा उत्पन्न प्रत्येक आंशिक CRYSOL फ़ाइल के लिए.
    5. χ2 मूल्य से शुरू PDB (5SUM) के साथ कि अटल बिहारी initio से प्रयोगात्मक SAXS डेटा का उपयोग कर गुच्छा द्वारा उत्पंन मॉडल से तुलना करें ।
      नोट: एक सफल गुच्छा मॉडल शुरू मॉडल की तुलना में एक काफी कम χ2 मान होना चाहिए । गुच्छा मॉडल के सैद्धांतिक कैटरिंग भी अच्छी तरह से SAXS डेटा और उसके χ2 मूल्य (चित्रा 4के लिए गुच्छा मॉडल के सैद्धांतिक कैटरिंग के बीच ओवरले के दृश्य निरीक्षण द्वारा ंयाय के रूप में प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करना चाहिए, केंद्र पाइपलाइन) ।
    6. मैंयुअल रूप से पयमोल३८ में गुच्छा से उत्पादन फ़ाइलों का निरीक्षण करने के लिए गुच्छा द्वारा उत्पंन मॉडल के साथ क्रिस्टल संरचना ओवरले, और SAXS लिफाफा (चित्रा 4, केंद्र पाइपलाइन) ।
    7. फिर से दौड़ना गुच्छा 10-20 बार स्वतंत्र मॉडल उत्पंन करने के लिए पुष्टि करते है कि मॉडल समान हैं ।
      नोट: Nsa1 के लिए वहां से χ2 मानों की एक श्रेणी थी ~ 1 से 3 के लिए 20 स्वतंत्र रन ।
    8. पहनावा मॉडलिंग
      नोट: गुच्छा चलाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में या तो EOM३६ या ंयूनतम पहनावा खोज३९ (एमईएस) । EOM और एमईएस पहनावा दृष्टिकोण का उपयोग करें, जो लचीला डोमेन के साथ प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं/
      1. ATSAS ऑनलाइन सर्वर का उपयोग कर EOM३६ प्रोग्राम चलाएं । EOM चलाने के लिए, इनपुट 4.3.1 से PDB फ़ाइलें, लक्ष्य प्रोटीन के अनुक्रम (*. seq), और प्रयोगात्मक SAXS डेटा (*. dat) ।
      2. प्रारंभिक PDB (5SUM) से χ2 मानों की तुलना प्रयोगात्मक SAXS डेटा का उपयोग करके EOM द्वारा जेनरेट की गई पहनावे से करें ।
        नोट: एक सफल EOM पहनावा शुरू मॉडल से एक काफी कम χ2 मान होना चाहिए । पहनावा के सैद्धांतिक कैटरिंग भी अच्छी तरह से SAXS डेटा और उसके χ2 मूल्य (चित्रा 4, सही करने के लिए पहनावा के सैद्धांतिक कैटरिंग के बीच ओवरले के दृश्य निरीक्षण द्वारा ंयाय के रूप में प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करना चाहिए पाइपलाइन) । एक भी गुच्छा और EOM से χ2 मूल्यों की तुलना करने के लिए जो मॉडल सबसे अच्छा प्रायोगिक SAXS डेटा का वर्णन का निर्धारण करना चाहिए ।
      3. EOM (चित्रा 4) द्वारा उत्पंन EOM के साथ क्रिस्टल संरचना ओवरले के लिए पयमोल३८ में मैंयुअल रूप से निरीक्षण करें । अनुरूपण की कुल संख्या और प्रत्येक अनुरूप है कि कैटरिंग वक्र के लिए योगदान के लिए अधिभोग के अंश ध्यान दें । अधिक कठोर अणुओं के लिए, जैसे Nsa1, क्षेऽ की संख्या छोटी होनी चाहिए (1-5) (चित्रा 4, दायां पाइपलाइन)३६।
      4. लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए EOM कई बार पुनः चलाएँ.
        नोट: Nsa1 के लिए अनुरूपता की संख्या आमतौर पर 3 करने के लिए 4 χ2 मान ०.१ से लेकर ०.३ के साथ था ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nsa1 पीसीआर एस cerevisiae जीनोमिक डीएनए से परिवर्धित और एक N-टर्मिनल 6x-Histidine संबध टैग MBP और एक टीईवी चिढ़ा साइट के बाद युक्त सदिश में उपक्लोन किया गया । Nsa1 ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं और प्रोटीन अभिव्यक्ति की उच्च पैदावार में तब्दील हो गया था IPTG के साथ प्रेरण निंनलिखित प्राप्त किया गया और 25 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (चित्रा 1a) में वृद्धि । Nsa1 था समानता-मैटीरियल कोबाल्ट संबध राल पर शुद्ध, टीईवी के साथ MBP दरार द्वारा पीछा किया, और अंत में आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (चित्र 1b) द्वारा हल । आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी युक्त Nsa1 से भिंन, परित थे 8 मिलीग्राम/एमएल और फिर एक क्रिस्टलीकरण रोबोट के साथ क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया । प्रारंभिक स्पार्स मैट्रिक्स क्रिस्टल स्क्रीन Nsa1, घन और orthorhombic (चित्रा 2a) के दो अलग क्रिस्टल रूपों झुकेंगे ।

घन और orthorhombic क्रिस्टल के अनुकूलन के दौरान, यह पता चला था कि orthorhombic क्रिस्टल Nsa1 के proteolytic दरार के परिणाम के रूप में पैदा हुई । सीमित प्रोटियोलिसिस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री Nsa1 कि प्रोटियोलिसिस के प्रति संवेदनशील था के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह Nsa1 की एक एकाग्रता ढाल के प्रति संवेदनशील था कि देखा गया था elastase (चित्र बी) । बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की पुष्टि की है कि यह गिरावट सी Nsa1 के टर्मिनस के नुकसान से हुई । proteolytic संवेदनशील सी-टर्मिनस (चित्र 2c) को दूर करने के लिए, Nsa1 के सी-टर्मिनल जनचेतना की एक श्रृंखला उत्पन्न की गई. orthorhombic क्रिस्टल Nsa1ΔC (अवशेषों 1-434) जनचेतना है, जो अंततः दु: खी संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ दोहराया जा सकता है । orthorhombic क्रिस्टल भी 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए elastase के साथ Nsa1FL के इलाज से पहले क्रिस्टल ट्रे की स्थापना के लिए दोहराया जा सकता है ।

घन Nsa1 क्रिस्टल सोडियम साइट्रेट ढाल का एक संयोजन के माध्यम से Nsa1FL का उपयोग कर अनुकूलित किया गया, microseeding (चित्रा 3) के साथ युग्मित । यह लगभग २.८ Å संकल्प की एक विवर्तन सीमा के साथ बड़े, प्रतिलिपि घन क्रिस्टल, उपज (चित्रा 3सी, बाएं) । orthorhombic क्रिस्टल केवल Nsa1 के C-टर्मिनल जनचेतना वेरिएंट का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है, खूंटी १५०० और ४०० खूंटी की एकाग्रता ढाल अलग से, microseeding, जो लगभग १.२५ Å की एक विवर्तन सीमा के साथ बड़े क्रिस्टल उपज के साथ संयुक्त संकल्प (चित्र 3 ए सी) । Nsa1 के प्रायोगिक चरणों SeMet द्वारा निर्धारित किया गया-एक SeMet से उदास-Nsa1ΔCके व्युत्पंन10।

एन टर्मिनल सात-ब्लेडर β-प्रोपेलर WD40 डोमेन Nsa1 के दोनों घन और orthorhombic क्रिस्टल संरचनाओं में अच्छी तरह से हल किया गया था, लेकिन दोनों संरचनाओं सी के लिए इलेक्ट्रॉन घनत्व का अभाव-Nsa1 के टर्मिनस । SAXS तो समाधान में Nsa1 के लापता सी टर्मिनल डोमेन की स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डेटा संग्रह के लिए नमूना एकाग्रता के अनुकूलन के बाद, आंशिक परमाणु संरचना कठोर शरीर मॉडलिंग प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और लापता घटकों के एक एबी initio पुनर्निर्माण उत्पन्न करते हैं । मॉडल की गणना के लिए फिट की भलाई के संदर्भ में मूल्यांकन किया गया था कैटरिंग curves प्रयोगात्मक डेटा के लिए (चित्रा 4, केंद्र पाइपलाइन) । अकेले Nsa1 के WD40 डोमेन प्रयोगात्मक SAXS डेटा की एक अच्छी फिट नहीं है, के रूप में सैद्धांतिक कैटरिंग वक्र, जो क्रिस्टल संरचना PDB आईडी 5SUM से उत्पंन किया गया था के साथ प्रयोगात्मक बिखरने वक्र के बीच विसंगति का सबूत (चित्रा 4, बायां पाइपलाइन) । इसमें कठोर बॉडी मॉडलिंग के अलावा पहनावा मॉडलिंग भी किया गया । यह Nsa1 के 3 से 4 क्षेऽ के एक पहनावा का उत्पादन किया और एक कम χ2 मूल्य (चित्रा 4, सही पाइपलाइन) के परिणामस्वरूप । मॉडल विसंगति में कमी (χ2) पहनावा मॉडलिंग का उपयोग कर समाधान में Nsa1 सी के टर्मिनल पूंछ के गठन के नमूने से पता चला ।

Figure 1
चित्र 1. अभिव्यक्ति और एक 6X-His-MBP संलयन टैग के साथ Nsa1 की शुद्धि । (क) एसडीएस-BL21 में प्रोटीन अभिव्यक्ति के पृष्ठ विश्लेषण (DE3) कोशिकाओं पर 25 ° c रातोंरात और पहली शुद्धि कदम कोबाल्ट संबध राल का उपयोग कर । (ख) प्रतिनिधि आकार बहिष्करण वर्णलेख निम्न टीईवी क्लीवेज. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी से भिंन एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया-पृष्ठ । पीक 1 युक्त Nsa1 से भिंन एकत्र और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Nsa1 की सी-टर्मिनस प्रोटियोलिसिस के प्रति संवेदनशील है. घन और orthorhombic: (एक) Nsa1 के प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण परीक्षण दो अलग क्रिस्टल रूपों उपज । यूवी माइक्रोस्कोप सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि क्रिस्टल प्रोटीन निहित. विज़: दृश्य प्रकाश, यूवी: यूवी सूक्ष्मदर्शी । स्केल पट्टी = प्रत्येक विंडो में ५० µm । (ख) Proteolytic स्क्रीनिंग एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ । तीन कमजोर पड़ने (1:10, 1:100, 1:1000) प्रत्येक को छेड़ने वाले शेयर के लिए (०.१, ०.०१, ०.००१ मिलीग्राम/एमएल) प्रोटीन के aliquots के साथ संयुक्त थे (1 मिलीग्राम/एमएल) के लिए जांच की । चिढ़ाने के लिए प्रतिरोधी डोमेन एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया-पृष्ठ और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद ३७ ° c मशीन ६० min. Nsa1-FL: ताजा शुद्ध प्रोटीन, Nsa1Δ: शुद्ध प्रोटीन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित 3 सप्ताह जिसके बाद प्रोटीन का एक नीचा रूप मनाया गया था । (ग) Nsa1 पूर्ण लंबाई के योजनाबद्ध आरेख (ऊपरी) और सी टर्मिनल जनचेतना का निर्माण (कम). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. Nsa1 क्रिस्टलीकरण अनुकूलन । (क) एक बीज स्टॉक प्रारंभिक छोटे क्रिस्टल से तैयार किया गया था और एक कमजोर पड़ने श्रृंखला (1x ~ 1/104x) (microseeding) बनाने के लिए इस्तेमाल । पतला बीज स्टॉक के 1 µ एल के साथ प्रोटीन के 1 µ एल मिश्रण से, एक सप्ताह के भीतर बड़ा एकल क्रिस्टल बढ़ी । (ख) Precipitant orthorhombic क्रिस्टल अनुकूलन के लिए एकाग्रता ढाल । (ग) अनुकूलित घन और orthorhombic क्रिस्टल डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया । हरी हलकों क्रिस्टल ट्रे जो डेटा संग्रह गुणवत्ता क्रिस्टल उपज के ठेठ क्षेत्र से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. योजनाबद्ध Nsa1 SAXS विश्लेषण. SAXS डेटा की प्रक्रिया और गुच्छा (केंद्र) और EOM (दाएँ) के साथ मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल पाइप लाइन का अवलोकन. बाईं पाइप लाइन प्रयोगात्मक तितर बितर वक्र (लाल हलकों, प्रोटीन एकाग्रता: 6 मिलीग्राम/एमएल) सैद्धांतिक कैटरिंग वक्र (नीली रेखा) है, जो क्रिस्टल संरचना PDB आईडी 5SUM से उत्पंन किया गया था के बीच विसंगति से पता चलता है । मॉडल प्रयोगात्मक SAXS कैटरिंग वक्र की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया (लाल हलकों, प्रोटीन एकाग्रता: 6 मिलीग्राम/एमएल) Nsa1 (काली रेखा) या Nsa1 के EOM अनुरूपता के गुच्छा मॉडल से व्युत्पंन तितर बितर वक्र के साथ (काली रेखा) । प्रत्येक मॉडल में, WD40 डोमेन हरे रंग में कार्टून में दिखाया गया है (PDB आईडी 5SUM), लचीला सी-टर्मिनस गुच्छा और हरे, रानी, सियान के लिए लाल रंग में रंगीन क्षेत्रों में दिखाया गया है, और व्यक्तिगत EOM क्षेऽ के लिए पीले । प्रत्येक EOM से व्युत्पंन अनुरूप के अंश मॉडल के बगल में लेबल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, संयोजक Nsa1 से एस cerevisiae दोनों एक्स-रे क्रि और SAXS द्वारा संरचनात्मक अध्ययन के लिए उत्पंन किया गया था । Nsa1 समाधान में अच्छी तरह से व्यवहार किया गया था और कई क्रिस्टल रूपों में सघन । इन क्रिस्टल के अनुकूलन के दौरान, यह पता चला था कि Nsa1 के सी टर्मिनस गिरावट को छेड़ने के लिए संवेदनशील था । उच्च संकल्प, orthorhombic क्रिस्टल फार्म केवल सी-टर्मिनल Nsa1 के जनचेतना वेरिएंट के साथ दोहराया जा सकता है, की संभावना है क्योंकि Nsa1 के लचीले सी-टर्मिनस क्रिस्टल पैकिंग को रोका । Nsa1 की संरचना एक्स-रे क्रि द्वारा उच्च संकल्प को हल किया गया था, लेकिन सी-टर्मिनस या तो क्रिस्टल रूप में नहीं बनाया जा सकता है क्योंकि यह आदेश नहीं था । क्रि Nsa1 के आकार के आसपास अणुओं के परमाणु संकल्प संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए प्रीमियर तकनीक है, लेकिन किसी भी विधि के साथ के रूप में, क्रि कुछ सीमाएं है । क्रि की प्रमुख सीमाओं में से एक प्रोटीन के विक्रमित क्षेत्रों को हल करने में असमर्थता है४०,४१।

Nsa1 की सी-टर्मिनस प्रोटीन के उचित nucleolar स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण है, इसकी संरचना का अध्ययन करने की जरूरत को रेखांकित10. Nsa1 के सी-टर्मिनस को SAXS, एक्स-रे क्रि को पूरक संरचनात्मक जीवविज्ञान तकनीक का समाधान किया गया । SAXS डेटा एक एकाग्रता श्रृंखला भर में पूर्ण लंबाई Nsa1 के लिए दर्ज किया गया था । इस एकाग्रता श्रृंखला से, Nsa1 SAXS डेटा संग्रह और प्रसंस्करण के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित किया गया था । SAXS डेटा 6, ४.५, और ३.० मिलीग्राम/एमएल में Nsa1 के लिए दर्ज किया गया । Guinier क्षेत्र, पी (आर) समारोह और आणविक वजन एकाग्रता श्रृंखला में निर्धारित करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना अच्छी तरह से व्यवहार किया गया था और प्रायोगिक शर्तों के तहत एकत्रित नहीं परीक्षण किया गया । Nsa1 की पूरी लंबाई संरचना को फिर से संगठित करने के लिए, सैद्धांतिक कैटरिंग आयाम आंशिक क्रिस्टल संरचना से निर्धारित किया गया था और फिर अब initio तरीकों को लचीला सी-टर्मिनस मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया । इस संकर दृष्टिकोण से, यह निर्धारित किया गया था कि लचीला सी Nsa1 के टर्मिनस का आदेश दिया WD40 डोमेन से जावक फैली हुई है ।

प्रसंस्करण उपकरण में अग्रिम macromolecular संरचनात्मक अध्ययन के लिए SAXS की लोकप्रियता संचालित है । SAXS समाधान में बेतरतीब ढंग से उंमुख प्रोटीन से एक्स-रे बिखरने पैटर्न उपायों आणविक जन और समग्र आकार सहित कम संकल्प संरचनात्मक जानकारी, प्रदान करने के लिए । नतीजतन, SAXS क्रि के लिए एक शक्तिशाली ओर्थोगोनल संरचना सत्यापन उपकरण के रूप में उभरा है । यह मुख्यतः गणना पद्धतियों के विकास के कारण परमाणु संरचनाओं के सैद्धांतिक कैटरिंग की गणना और उन्हें प्रायोगिक SAXS डेटा३७से तुलना करने में है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, चतुर्धातुक संरचना, और उच्च क्रम में एक क्रिस्टल जाली में मनाया विधानसभा समाधान में कण की संरचनात्मक विशेषताओं की तुलना में किया जा सकता है । इसके अलावा, आदेश दिया छोरों और टर्मिनी एक्स-रे क्रि द्वारा निर्धारित उच्च संकल्प संरचनाओं में लापता समाधान कैटरिंग डेटा का उपयोग कर मॉडलिंग की जा सकती. इस संकर संरचनात्मक दृष्टिकोण SAXS के लिए एक इमारत ब्लॉक के रूप में क्रिस्टल संरचना का उपयोग करता है लापता अवशेषों की मॉडलिंग निर्देशित और सी के मानचित्रण में प्रभावी साबित हो गया है-Nsa110के टर्मिनस, साथ ही साथ अंय अणुओं जैसे इंफ्लूएंजा के रूप में एक वायरस एम 1 मैट्रिक्स प्रोटीन४२और मृत बॉक्स आरएनए chaperones४३. उंनत SAXS आधारित मॉडलिंग सॉफ्टवेयर भी इस तरह के आंतरिक रूप से परिक्रमित प्रोटीन के रूप में अधिक जटिल प्रणालियों, पता कर सकते हैं, इन प्रणालियों के गठन के परिदृश्य मानचित्रण द्वारा अनुरूप है कि एक साथ समग्र कैटरिंग के लिए योगदान की एक श्रृंखला का उपयोग समाधान में कण की क्षमता16,३९। एक साथ लिया, SAXS डेटा संग्रह और प्रसंस्करण उपकरण में हाल ही में प्रगति चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों से निपटने के लिए संकर संरचनात्मक जीवविज्ञानी दृष्टिकोण की सफलता के लिए योगदान देता है ।

समाधान के संयोजन उच्च संकल्प संरचनाओं के साथ बिखरने लचीलापन और अणुओं४४की गतिशीलता के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए तैयार है । कई प्रोटीन, जैसे Nsa1, गतिशील क्षेत्रों है कि जैविक समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस पांडुलिपि में एक टेम्पलेट प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जो एक्स-रे क्रि द्वारा उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के साथ SAXS के संयोजन विवरण । एक्स-रे क्रि SAXS के अलावा भी एनएमआर, इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR), और प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) सहित अन्य संरचनात्मक जीवविज्ञान तकनीक की तारीफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आगे SAXS के महत्व पर प्रकाश डाला एक पूरक संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक के रूप में४५,४६,४७।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

विवर्तन डेटा दक्षिण पूर्व क्षेत्रीय सहयोगी का उपयोग टीम (SER-कैट) 22 आईडी और 22-बीएम beamlines उंनत फोटॉन स्रोत (ए पी एस), Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला में एकत्र किए गए । SAXS डेटा अग्रिम प्रकाश स्रोत (एस), लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला में SIBYLS beamline पर एकत्र किया गया था । हम दूरदराज के डेटा संग्रह और प्रसंस्करण के साथ उनकी मदद के लिए SIBYLS beamline पर कर्मचारियों को धंयवाद देना चाहूंगा । हम राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) जन स्पेक्ट्रोमेट्री अनुसंधान और सहायता समूह के लिए आभारी है प्रोटीन डोमेन सीमाएं निर्धारित करने में मदद के लिए । इस काम को अमेरिका के नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था; अमेरिका के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) (जिया ES103247 को आर. ई. एस.) और स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थान (CIHR, १४६६२६ को एम. सी. पी.). ए पी एस का उपयोग अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान कार्यालय, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय के तहत अनुबंध सं द्वारा समर्थित किया गया था । डब्ल्यू-31-109-अभियांत्रिकी-३८ । उंनत प्रकाश स्रोत (एस) का उपयोग निदेशक, विज्ञान के कार्यालय, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अनुबंध सं के तहत ऊर्जा विभाग के अमेरिका के द्वारा समर्थित था । DE-AC02-05CH11231 । SIBYLS SAXS beamline के लिए अतिरिक्त सहायता राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान परियोजना MINOS (R01GM105404) और एक उच्च अंत इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान S10OD018483 से आता है । हम भी इस पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Andrea चंद्रमा और डॉ सारा एंड्रेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

जैव रसायन अंक १३१ एक्स-रे क्रि SAXS संकर तरीके प्रोटीन शुद्धिकरण WD40 डोमेन सीमित प्रोटियोलिसिस Ribosome विधानसभा
एक्स-रे क्रि छोटे कोण एक्स-रे के साथ Nsa1 के मॉडल unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों को तितर बितर के साथ संयोजन <em>एस Cerevisiae</em> से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter