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Biochemistry

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Abstract

Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.

Introduction

Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota que especificamente necessária para a produção do grande subunidade ribossomal6, e é conhecido como WD-repetição contendo 74 (WDR74) no maior organismos7. WDR74 tem demonstrado ser necessário para a formação de blastocistos em ratos8e o promotor de WDR74 é frequentemente uma mutação em células de câncer9. No entanto, a função e mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 no assembly do Ribossoma ainda são em grande parte desconhecidos. Para começar a descobrir o papel de Nsa1/WDR74 durante o amadurecimento do Ribossoma eucariota, realizaram-se várias análises estruturais, incluindo cristalografia de raios x e pequeno ângulo de espalhamento (SAXS) de raio-x10.

Cristalografia de raios x, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia eletrônica e SAXS são todos importantes técnicas para estudar a estrutura macromolecular. Tamanho, forma, disponibilidade e estabilidade das influências de macromoléculas, o método de biologia estrutural, para o qual uma macromolécula particular será melhor adequado, no entanto, combinar várias técnicas através de uma abordagem so-called "híbrido" está se tornando um ferramenta cada vez mais benéfico11. Em particular, cristalografia de raios x e SAXS são complementares e poderosos métodos para determinação estrutural de macromoléculas12.

Cristalografia fornece estruturas atômicas de alta resolução, variando de pequenas moléculas a grande maquinaria celular, tais como o ribossoma e levou a inúmeros avanços na compreensão das funções biológicas das proteínas e outros macromoléculas13. Além disso, o design de drogas baseado em estrutura aproveita o poder da estruturas de cristal para encaixe molecular por métodos computacionais, acrescentando uma dimensão crítica a droga descoberta e desenvolvimento de14. Apesar de sua ampla aplicabilidade, sistemas flexíveis e desordenados são difíceis de avaliar por cristalografia, desde que a embalagem de cristal pode ser prejudicada ou mapas de densidade de elétrons podem ser incompletos ou de má qualidade. Por outro lado, SAXS é uma abordagem estrutural baseada em solução e baixa resolução capaz de descrever sistemas flexíveis, variando de loops desordenados e termini a proteínas intrinsecamente desordenado12,15,16. Considerando que é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas12, SAXS pode trabalhar em sinergia com cristalografia para ampliar o leque de questões biológicas que podem ser abordados pelos estudos estruturais.

Nsa1 é apropriado para uma abordagem estrutural de híbrido, porque ele contém um domínio WD40 bem estruturado, seguido de um C-terminal funcional, mas flexível que não é passível de métodos de cristalografia de raios x. A seguir é um protocolo para a clonagem, expressão e purificação de S. cerevisiae Nsa1 para determinação estrutural híbrido por cristalografia de raios x e SAXS. Este protocolo pode ser adaptado para estudar as estruturas de outras proteínas que são compostas por uma combinação de regiões ordenadas e desordenadas.

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Protocol

1. recombinação da proteína produção e purificação da Nsa 1

  1. Design de plasmídeo de expressão Nsa1 e clonagem
    1. Obter ou comprar o DNA genômico de S. cerevisiae .
    2. PCR amplificar sequências alvo de Nsa1 (Nsa1FL, resíduos 1-463) e C-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, resíduos 1-434) com primers apropriados usando o DNA genômico de isolados de S. cerevisiae e uma temperatura de fusão aproximadamente 60 ° C com um tempo de extensão de 1-2 min. Os seguintes primers foram utilizados para amplificar Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 para o pHMBP de vetor de expressão de Escherichia coli (e. coli) contendo um N-terminal 6 tag X-Histidine seguido a proteína de ligação Maltose (MBP) e um site de protease de tabaco Etch vírus (TEV) usando técnicas de clonagem padrão17 .
    4. Use o sequenciamento de DNA para verificar que Nsa1 foi clonado no quadro com a marca de sua-MBP N-terminal.
  2. Expressão de proteínas Nsa1
    1. Transformar a expressão plasmid(s) em um apropriado Escherichia coli estirpe de expressão com um sistema de baseado no promotor T7. O transformants em placas de ágar LB contendo 100 ampicilina µ g/mL a placa e incubar a placa invertida durante a noite a 37 ° C.
    2. Inocular uma cultura de 50 mL de LB com ampicilina 100 de µ g/mL da placa de transformação e cultivá-lo durante a noite, agitando a 200 rpm a 37 ° C.
    3. Inocular 3 x 1000 mL de LB Fernbach frascos com 100 ampicilina µ g/mL com 15 mL de cultura durante a noite e cultivá-lo com agitação a 200 rpm a 37 ° C.
      Nota: Para solução de estrutura de proteínas, incorporação de selenomethionyl (SeMet) pode ser obtida pelo crescimento de células em M9 meio mínimo que é suplementado com SeMet e uma mistura de aminoácidos para inibir a produção de metionina antes da indução, ao contrário de mídia LB 18.
    4. Induzi a expressão de Nsa1 quando o OD600 atinge ~0.8 pela adição de isopropil β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) em uma concentração final de 1 mM, seguido de incubação a 25 ° C durante a noite agitando a 200 rpm.
    5. Recolher as células por centrifugação a 4 ° C por 15 min a 5.050 x g.
      Nota: As células podem ser armazenadas a longo prazo a-80 ° C ou usadas imediatamente para a purificação de proteínas.
  3. Purificação de proteínas Nsa1
    1. Ressuspender as células em 25 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, 10 mM MgCl2) pre-refrigerado a 4 ° C, contendo um comprimido de inibidor de EDTA livre protease.
    2. Lyse pilhas pelo sonication a 4 ° C (tempo de 7 min, 2 s em ciclo, 2 s fora de ciclo; amplitude: 70%).
    3. Clarificar o lisado por centrifugação a 26.900 x g, durante 45 min a 4 ° C.
    4. Aplica esclareceu lisado para uma coluna de fluxo de gravidade carregada com 10 mL de resina de afinidade de cobalto imobilizado, previamente incubado com Lise.
    5. Permitir que o sobrenadante passar sobre a resina por fluxo de gravidade a 4 ° C e lave a resina duas vezes com 100 mL de tampão de Lise.
    6. Eluir Nsa1 com 20 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl, 5 mM MgCl2, 5% de glicerol e imidazol 200 mM).
    7. Pegue 15 μL de eluído e executá-lo em um gel de SDS-PAGE 4-15% para verificar que a proteína é eluída da resina a afinidade (figura 1A).
    8. Remova a marca MBP por digestão de protease TEV. Adicionar 1 mL de TEV protease19 (estoque de 1 mg/mL) para a eluição de resina Nsa1 afinidade e incube-a 4 ° C durante a noite.
    9. Concentrado de MBP clivada Nsa1 para ~ 5ml usando um filtro centrífugo com um peso molecular cortar fora 10 kDa.
    10. MBP-clivada Nsa1 aplicam-se a uma coluna de gel filtração, previamente incubado no buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl, 1 mM MgCl2, 5% de glicerol e β-Mercaptoetanol de 1 mM a 100 mM) (figura 1B).
    11. Analise fracções de coluna de gel filtração para verificar se o MBP é clivada e separado do Nsa1 executando 15 amostras μL em um gel de SDS-PAGE 4-15% (figura 1B).
    12. Combinar as frações que contêm Nsa1 e concentrar a 8 mg/mL, usando um filtro centrífugo com um peso molecular cortar fora 10 kDa.
    13. Determinar a concentração de proteína medindo a absorbância em 280 nm em um espectrofotômetro utilizando o coeficiente de extinção 42530 M–1cm–1. Use a proteína imediatamente para testes de triagem e cristalização proteolíticas.

2. cristalização e triagem proteolítica da Nsa 1

  1. Rastreio de cristal matriz esparsa de Nsa1
    1. Centrifugue 500 μL da unidade populacional de 8 mg/mL de Nsa1 a 16.000 x g a 4 ° C por 10 min.
    2. Configuração de ensaios de cristalização usando um robô de cristalização e telas de cristal matriz esparsa. Encha o reservatório de 96 bandejas bem com 30 μl dos reagentes tela cristal individual de telas de cristalização de matriz esparsa. Gotas de sessão de configuração com o robô pela mistura de 250 nL da solução bem com 250 nL da solução da proteína.
    3. Selar as placas de cristalização com fita e incube-os a 25 ° C.
    4. Inspecione as placas em dois dias nas primeiras 2-3 semanas com um estereomicroscópio.
    5. Verificar se os potenciais hits de cristais contêm proteínas com um microscópio UV.
      Nota: Para Nsa1 duas formas diferentes de cristal (cúbicos e ortorrômbico, Figura 2A) foram obtidos dentro de 1 semana das seguintes telas: condição JCSG + B11 (1,6 M de citrato de sódio tribásico desidratam, pH 6,5) e assistente de precipitantes sinergia tela bloco 2 condição C11 (20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400, 0,1 M Tris HEPES/hidróxido de sódio, pH 7,5).
  2. Proteolítica triagem
    Nota: Durante a otimização de cristalização, foi descoberto que os cristais ortorrômbico de Nsa1 surgiram como resultado de clivagem proteolítica e os cristais não podem ser duplicados usando a proteína completo. Usando uma combinação de proteólise limitada acoplada com espectrometria de massa, foi determinado que o C-terminal da Nsa1 era sensível à proteólise e remoção da cauda C-terminal era necessária para reprodução posterior do (forma de cristal ortorrômbico Nsa1ΔC).
    1. Preparar 1 mg/mL de soluções estoque de protease do seguir proteases α-quimotripsina, tripsina, elastase, papaína, subtilisina e endoproteinase Glu-C.
    2. Crie 01:10, 1: 100 e diluições de 1: 1000 de cada unidade populacional protease de 1 mg/mL com tampão de diluição (10 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM de cloreto de sódio).
    3. Pipete 1 μL de estoque protease (01:10, 1: 100 e 1: 1000) para 9 alíquotas μL de proteína (1 mg/mL) para cada protease a ser rastreada.
    4. Incube a solução a 37 ° C por 1h.
    5. Pare a reação adicionando 10 μL de tampão, amostra 2 x SDS-PAGE e aquecer a reação a 95 ° C por 5 min.
    6. Analise o digere, executando-as em um gel de SDS-PAGE 4-15% (Figura 2B).
    7. Identifica domínios resistente à proteases da proteína alvo por análise de espectrometria de massa em-gel.
    8. Remova as protease-labile regiões da proteína alvo criando expressão truncado construções e seguindo o protocolo de clonagem, expressão e purificação descrito acima.
  3. Otimização de cristalização
    1. Preparar ou obter as soluções dos seguintes reagentes iniciais cristalização: 1,6 M de citrato de sódio tribásico desidratar pH 6.5 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) PEG 1500, 1 M de hidróxido de sódio/HEPES, pH 7,5.
    2. Prepare uma solução stock de Nsa1FL e Nsa1ΔC 8 mg/ml conforme descrito acima.
    3. Otimizar os cristais cúbicos Nsa1 (Nsa1FL).
      1. Prepare uma tela de grade de 24-poço com poços contendo 500 µ l com um gradiente de 1-1.6 M de citrato de sódio com 6.5 de pH de uma solução stock de 1,6 M de citrato de sódio tribásico com pH 6,5.
      2. Misturar 1 µ l de proteína com 1 µ l de solução bem e coloque a mistura em um slide de capa siliconizado. Cuidadosamente invertido o slide de tampa em cima do previamente untado bem e garantir que ele está bem selado, mas tome cuidado para não perturbar a soltar ou quebrar o slide de capa. Repita este processo até que a bandeja é preenchida e em seguida armazenar a 25 ° C.
        Nota: Pequenos cristais cúbicos devem aparecer no 2-7 dias.
      3. Prepare um estoque de microseed dos Cristais cúbicos. Use um loop de nylon montada para transferir ~ 10 cristais cúbicos pequenos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo uma pequena pérola e 50 µ l de pH de sagacidade tribásico de citrato de sódio 1,6 M 6.5.
      4. Vórtice tubo de 1,5 mL de microcentrífuga em alta velocidade (~ 3000rpm) por 1 min.
      5. Fazer uma série de diluições em série 10 vezes das sementes com 1,6 M de citrato de sódio tribásico e vortex mistura completamente por 5 s.
      6. Encha cada um bem de uma grade de 24-poço, tela com 500 µ l de 1,6 M citrato de sódio tribásico pH 6,5.
      7. Otimize as condições de microseeding pela criação de gotas com diferentes proporções de proteína com as soluções estoque de sementes (Figura 3A). Cristais cúbicos maiores de qualidade alta difração devem aparecer em 2-5 dias (Figura 3).
    4. Otimizar os cristais ortorrômbico (Nsa1ΔC)
      1. Prepare uma tela de grade com 500 µ l em cada poço com 24 diferentes condições (Figura 3B) de soluções estoque de 50%(v/v) PEG 1500 e 100%(v/v) PEG 400. Além de gradientes de PEG 1500 e PEG 400, cada um bem também deve conter 0,1 M pH de hidróxido de sódio HEPES 7.5.
      2. Misturar 1 µ l de solução de proteína com 1 µ l de solução bem em um slide de capa siliconizado. Cuidadosamente invertido o slide de tampa em cima do previamente untado bem e garantir que ele está bem selado. Repita este processo até que a bandeja inteira já foi preenchida. Armazenar as bandejas a 25 ° C.
        Nota: Ortorrômbico cristais Nsa1 devem aparecer em 2-7 dias.
      3. Otimizar ainda mais os cristais ortorrômbico por microseeding como descrito para os cristais cúbicos (etapas 2.3.3.3 para 2.3.3.7) usando 500 µ l de 20.1%(v/v) PEG 1500 13.4%(v/v) PEG 400 e 0,1 M pH de hidróxido de sódio HEPES 7.5 como a solução bem.
        Nota: Nsa1 SeMet cristais devem ser otimizadas análogo dos cristais nativos.

3. Nsa 1 estrutura solução e coleta de dados de difração de raios x

  1. Cryo-proteção de cristais e coleta de dados de difração de raios x
    1. Para os cristais ortorrômbico (Nsa1ΔC), preparar uma solução de 1 mL crioprotetoras contendo 22.5%(v/v) PEG 1500, 15%(v/v) PEG 400 e 0,1 M pH de hidróxido de sódio HEPES 7.5.
    2. Encha uma espuma Dewar com nitrogênio líquido e pre-cool um disco de cristal. Tenha cuidado ao trabalhar com nitrogênio líquido e use óculos e luvas protetoras.
    3. Cuidadosamente, inverta o slide de capa da cristalização bem contendo cristais para o palco de um estereomicroscópio.
    4. Pipete 2 µ l da solução crioprotetoras numa lâmina de capa nova.
    5. Anexe um loop de nylon montada de tamanho apropriado para o cristal a uma varinha magnética cryo.
    6. Usando a ajuda do microscópio estereoscópico, rapidamente transferi um cristal para a solução crioprotetoras com o loop crio montado.
    7. Deixe o cristal equilibrar por 5 min na solução crioprotetoras.
    8. Usando a ajuda do microscópio estereoscópico, rapidamente executar um loop o cristal da solução crioprotetoras e mergulho-congelamento em nitrogênio líquido.
    9. Esperar que o nitrogênio líquido em torno do laço para parar de ferver e em seguida, solte o loop do tubo em um local específico dentro do disco de cristal.
    10. Nsa1 cúbicosFL cristais não precisa ser cryoprotected e pode ser diretamente flash congelado (seguindo passos 3.1.8-3.1.9 acima).
    11. Selar o disco de cristal usando ferramentas de cryo e transferir para uma bengala de transporte em um dewar pre-refrigerados. Loja cristais nos discos/dewars até a coleta de dados.
    12. Se a coleta de dados em um síncrotron, navio cristais para o síncrotron usando um carregador seco.
    13. Colete dados de difração de raios x, seguindo as técnicas padrão20.
      Nota: Para Nsa1 nativo e SAD (single-comprimento de onda de dispersão anômala) conjuntos de dados foram coletados no 100K nas linhas de feixe de EMISSAO SERIE-CAT ID 22 e 22-BM da fonte de fótons avançada no Argonne National Laboratory (Chicago, IL). O dataset Nsa1 SAD foi coletado em λ = 0.97911 Å. Dados foi gravados usando um tempo de exposição 1 s e oscilações de 0,5 °. A mosaicity destes cristais era tipicamente em torno de 0,3 °.
    14. Processar e dimensionar as imagens de difração de raios x para gerar arquivos de reflexão para cada conjunto de dados no grupo de espaço adequado.
      Nota: Nsa1 difração conjuntos de dados foram processados com HKL200021. Os cristais cúbicos Nsa1 foram processados no espaço grupo P213 e os cristais ortorrômbico foram processados no espaço grupo P212121.
  2. Solução de estrutura Nsa1.
    Nota: Existem vários pacotes de software de cristalografia que podem ser usados para resolver e aperfeiçoar as estruturas de cristal, incluindo Phenix e CCP422,23. A seguir é o protocolo para a solução de estrutura Nsa1 usando a suíte de software de Phenix22.
    1. Analisar o nativo e SAD dimensionado datasets com phenix.xtriage22.
    2. Resolva a estrutura do Nsa1 com Phenix.autosol usando o pico triste reflexão arquivo22,24. Para executar o programa de AutoSol, introduzir o número de sites de selenometionina (sites = 9), o arquivo de sequência de fasta de Nsa1ΔC e o comprimento de onda utilizado para coleta de dados triste (λ = 0.97911 Å).
      Nota: No conjunto de dados Nsa1 SAD, phenix.autosol deve ser capaz de determinar as fases experimentais e construir a maioria do modelo.
    3. Fazer ajustes manuais para o modelo com Coot25, seguido de refinamento em phenix.refine22,26.
    4. Resolva a estrutura do cristal ortorrômbico nativo de alta resolução e o cristal cúbico por substituição molecular usando Phaser27,28.
    5. Após a solução bem sucedida estrutura, inspecionar o modelo e a densidade de elétrons mapa Coot.25.
    6. Construir e refinar as estruturas executando iterativas rodadas de refinamento no modelo edifício Coot25e phenix.refine22,26 .

4. SAXS coleta de dados, processamento e modelagem

  1. Coleta de dados SAXS
    Nota: Dados SAXS foram gravados para o longa-metragem S. cerevisiae Nsa1 na fonte de luz avançado, sobre a trajetória de SIBILAS do elevado-throughput 12.3.1 no Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Purificar Nsa1FL seguindo o protocolo descrito acima. 24 h antes da expedição de Nsa1FL para a trajetória, atropelar uma coluna de filtração de gel de proteína previamente incubado no buffer A.
    2. Frações que contêm Nsa1 da piscina e determinar a concentração de proteína, como descrito anteriormente.
    3. Prepare 30 μl alíquotas de uma série de concentração de Nsa1 de 1 para 6,2 mg/mL com tampão A.
    4. Transferi 20 μl de cada série de concentração de Nsa1 para uma microplaca bem clara saIão 96 juntamente com controles de tampão A sós.
      Nota: Dados de SAXS são coletados em soluções diluídas, com várias concentrações de amostra purificada para evitar agregação, repulsão entre partícula e efeitos de danos de radiação.
    5. Sele a microplaca com um silicone esteira e navio durante a noite a 4 ° C para a trajetória de vedação.
    6. Armazene a microplaca a 4 ° C até a coleta de dados.
    7. Imediatamente antes da coleta de dados, gire a placa a 3200 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover potenciais agregados e bolhas de ar.
    8. Gravar dados SAXS.
      Nota: Para Nsa1, dados SAXS foram gravados para o buffer antes e após cada série de concentração de proteína. Trinta e três exames consecutivos de 0.3 s foram coletados para Nsa1FL sobre uma série de concentração (1 para 6,2 mg/mL) a 10 ° C.
    9. Execute a reserva para dados SAXS.
      Nota: Para Nsa1 subtração reserva foi feita automaticamente a trajetória mas subtração reserva também pode ser realizada usando software de redução de dados como Scatter30 e a suíte ATSAS31. Subtração de buffer é uma parte fundamental da análise de dados SAXS e deve ter cuidado para assegurar que o buffer usado para subtração é idêntico para o buffer de amostra de proteína.
    10. Média a 33 consecutivos varreduras para criar um arquivo de *ave.dat para cada concentração.
      Nota: Sobrepor os 33 quadros consecutivos para comparar as curvas. Alterações para as curvas de dispersão ao longo do tempo, muitas vezes é indicativo de danos de radiação. Exclua esses quadros em média. Média dos exames consecutivos Nsa1 foi realizada automaticamente na trajetória de SIBILAS.
  2. Processamento de dados SAXS e comparação da série de concentração
    Nota: Existem vários pacotes de software que podem ser usados para analisar dados SAXS. Para Nsa1 o raio de giração e funções de distribuição de distância por pares foram determinados utilizando PRIMUS32 e Gnom33 do ATSAS 2.7.2 suíte31 e comparados através de todas as concentrações de proteína para garantir que não havia nenhuma radiação interações de partículas inter dependente da concentração10ou danos.
    1. Abra um terminal shell e vá para o diretório que contém os dados SAXS.
    2. Lançar o PRIMUS32 GUI de dentro do terminal shell.
    3. Dentro do GUI de PRIMUS, carregar as curvas de espalhamento (* ave.dat).
    4. Use o AutoRg para determinar o raio de giração (Rg) e transmitir a intensidade de espalhamento I(0), para cada curva de espalhamento (* ave.dat).
    5. Gerar Kratky parcelas para cada curva de espalhamento (* ave.dat), para avaliar o grau de compacidade.
    6. Usar AutoGNOM33 para calcular a função de distribuição por pares (também chamado de P(r)) para cada curva de espalhamento (* ave.dat). Insira uma partida D ≈ demáximo 3 * Rg e otimizar o valormáximo de D para obter uma curva de reacionamento suave. Durante a otimização de Dmáximo, garantir que o calculado reacionamento função é consistente com a curva de dispersão experimental por verificando o valor de2 χ relatados e avaliar visualmente global apto para a curva de dispersão.
    7. Calcule o peso molecular de Nsa1 de curvas de espalhamento usando o volume de correlação34.
    8. Compare os parâmetros estruturais para cada concentração garantir que não existem danos de radiação ou efeitos de concentração-dependente.
      Nota: Os efeitos de concentração podem se manifestar como uma crescente Rg e Dmáximo em relação a uma crescente concentração de proteína. Para a frente, espalhar I(0) dividido pela concentração da amostra também deve permanecer constante em toda a série de concentração de proteína.
  3. Modelagem de SAXS
    Nota: Para determinar a posição do C-terminal da Nsa1FL, Nsa1 cristal estrutura10 (PDB 5SUM) e as curvas de espalhamento de SAXS foram usadas para realizar uma combinação de corpo rígido e ab initio de modelagem, utilizando os programas monte 35 e método de otimização de Ensemble (Moe)36 da ATSAS software suite31. O domínio de WD40 de Nsa1 foi tratado como um corpo rígido, enquanto o C-terminal da Nsa1 juntamente com vários loops desordenados do domínio de WD40 foram modelados para ajustar os dados experimentais de SAXS.
    1. Gere os arquivos PDB entrados. O arquivo PDB deve ser dividido, toda vez que resíduos estão ausentes da cadeia principal, e o arquivo PDB não pode conter várias conformações, ligantes, ou moléculas de água.
    2. Execute o programa Pre_BUNCH35 para preparar o arquivo PDB entrado para Monte (pre_bunch.pdb). A sequência da proteína alvo (*.seq), o número de domínios/PDBs gerados em 4.3.1, de entrada e todos os arquivos individuais de PDB gerado acima.
    3. Calcule as amplitudes de espalhamento para cada arquivo PDB individual usando o programa CRYSOL37. Para executar o CRYSOL entrada arquivo PDB individual e a curva de dispersão SAXS experimental (*. dat). Isso irá gerar um arquivo de amplitudes (* .alm).
    4. Execute o programa bando35 para modelar o domínio de WD40 de Nsa1 contra os dados SAXS usando uma abordagem rígida combinada de corpo e ab initio . O arquivo PDB do Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), a curva de dispersão SAXS experimental (*. dat) e a amplitude individual de entrada (* .alm) arquivos para cada arquivo PDB parcial gerado pelo CRYSOL.
    5. Compare o valor de2 χ de partida PDB (5SUM) com isso do modelo ab initio gerado pelo bando usando os dados experimentais de SAXS.
      Nota: Um modelo bem sucedido de grupo deve ter um valor de2 χ significativamente menor do que o modelo inicial. A dispersão teórica do modelo bando deve também descrever bem os dados experimentais como julgados por inspeção visual da sobreposição entre a dispersão teórica do modelo de bando de dados SAXS e seu valor de2 χ (Figura 4, pipeline de centro).
    6. Inspecione manualmente os arquivos de saída do bando em Pymol38 sobrepor a estrutura de cristal com o modelo gerado pelo bando e o envelope SAXS (Figura 4, o pipeline de centro).
    7. Execute novamente o grupo 10 - 20 vezes para gerar modelos independentes para confirmar que os modelos são similares.
      Nota: Para Nsa1 havia uma gama de valores χ2 de ~ 1 para 3 de 20 execuções independentes.
    8. Modelagem de Ensemble
      Nota: como uma abordagem opcional para Monte executar EOM36 ou mínimo Ensemble busca39 (MES). Moe e MES use abordagens ensemble, que são adequadas para as proteínas com domínios flexíveis/regiões que estão em várias conformações.
      1. Execute o programa EOM36 usando o servidor online ATSAS. Para executar o Moe, entrada os arquivos PDB do 4.3.1, a sequência da proteína alvo (*.seq) e os dados experimentais de SAXS (*. dat).
      2. Compare os valores de χ2 de partida PDB (5SUM) com que partir o conjunto gerado pelo Moe utilizando os dados experimentais de SAXS.
        Nota: Um ensemble de Moe bem sucedido deve ter um valor de2 χ significativamente menor do que o modelo inicial. A dispersão teórica do conjunto deve também descrever bem os dados experimentais como julgados por inspeção visual da sobreposição entre a dispersão teórica do conjunto de dados SAXS e seu valor de2 χ (Figura 4, direita gasoduto). Um deve também comparar os valores de2 χ do bando e Moe para determinar qual modelo que melhor descreve os dados experimentais de SAXS.
      3. Inspecione manualmente os conformistas de Moe em Pymol38 para sobrepor a estrutura de cristal com os conformistas gerados pelo Moe (Figura 4). Observe o número total de conformistas e a fração de ocupação para cada conformista que contribui para a curva de dispersão. Para moléculas mais rígidas, tais como Nsa1, o número de conformistas deve ser pequeno (1-5) (Figura 4, certo oleoduto)36.
      4. Execute novamente o Moe várias vezes para garantir resultados consistentes.
        Nota: Para Nsa1 o número de conformistas era tipicamente 3 a 4, com valores χ2 variando de 0,1 a 0,3.

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Representative Results

Nsa1 foi PCR amplificados de DNA genômico de S. cerevisiae e subcloned em um vetor que contém uma marca de afinidade de 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP e um site de protease TEV. Nsa1 transformou-se em células de Escherichia coli BL21(DE3) e rendimentos elevados da expressão da proteína foram obtidos após indução com IPTG e crescimento a 25 ° C durante a noite (figura 1A). Nsa1 foi afinidade-purified na resina de afinidade de cobalto imobilizado, seguido por clivagem MBP com protease do PEV e finalmente resolvido por cromatografia de exclusão (figura 1B). Frações da cromatografia de exclusão contendo Nsa1 foram agrupadas, concentradas para 8 mg/mL e então usadas para ensaios de cristalização com um robô de cristalização. Telas de cristal matriz esparsa inicial renderam duas formas diferentes de cristal de Nsa1, cúbicas e ortorrômbico (Figura 2A).

Durante a otimização dos Cristais cúbicos e ortorrômbico, foi descoberto que os cristais ortorrômbico surgiram como resultado da clivagem proteolítica de Nsa1. Proteólise limitada e espectrometria de massa foram usados para determinar a região de Nsa1 que era sensível à proteólise, e observou-se que Nsa1 era sensível a um gradiente de concentração da elastase a protease (Figura 2B). Análise de espectrometria de massa subsequente confirmou que esta degradação resultou da perda do C-terminal da Nsa1. Uma série de truncamentos de C-terminal da Nsa1 foram gerados, para remover o proteolítica sensível C-terminal (Figura 2). Os cristais ortorrômbico poderiam ser repetidos com o truncamento deΔC (resíduos 1-434) Nsa1, que em última análise, foi utilizado para determinação da estrutura de triste. Os cristais ortorrômbico também podem ser repetidos por tratar Nsa1FL com elastase durante 1 hora a 4 ° C, antes da criação de bandejas de cristal.

Os cristais cúbicos de Nsa1 foram otimizados usando Nsa1FL através de uma combinação de gradientes de citrato de sódio, juntamente com microseeding (Figura 3A). Isto gerou grandes, reprodutíveis Cristais cúbicos, com um limite de difração de cerca de 2,8 Å resolução (Figura 3, à esquerda). Os cristais ortorrômbico só poderiam ser otimizados usando as variantes de truncamento do C-terminal da Nsa1, variando os gradientes de concentração de PEG 1500 e PEG 400, combinado com o microseeding, que rendeu grandes cristais com um limite de difração de cerca de 1,25 Å resolução (Figura 3A-C). Fases experimentais de Nsa1 foram determinadas pela SeMet-SAD de um SeMet-derivado de Nsa1ΔC10.

Domínio N-terminal de WD40 sete lâminas β-hélice de Nsa1 foi bem resolvido em ambas as estruturas de cristal cúbico e ortorrômbico, no entanto, ambas as estruturas carecia de densidade de elétrons para o C-terminal da Nsa1. SAXS foi usado para determinar a posição do desaparecido domínio C-terminal da Nsa1 em solução. Após a otimização da concentração da amostra para coleta de dados, a estrutura atômica parcial foi usada para realizar a modelagem de corpo rígido e gerar uma reconstrução ab initio os componentes ausentes. O modelo foi avaliado em termos de bondade de ajuste para as curvas de dispersão calculada para os dados experimentais (Figura 4, o pipeline de centro). O domínio de WD40 de Nsa1 sozinho não é um bom ajuste dos dados experimentais SAXS, como evidenciado pela discrepância entre a curva de dispersão experimental com a curva teórica de dispersão, que foi gerada a partir da estrutura de cristal 5SUM PDB ID (Figura 4, pipeline de esquerda). Além do corpo rígido modelagem, modelagem de ensemble foi feita também. Isto produziu um conjunto de 3 a 4 conformistas de Nsa1 e resultou em um valor mais baixo de2 χ (Figura 4, gasoduto certo). A redução da discrepância de modelo (χ2) usando a modelagem ensemble revelou a amostragem conformacional da cauda Nsa1 C-terminal em solução.

Figure 1
Figura 1. Expressão e purificação de Nsa1 com um tag de fusão 6 X-His-MBP. (A) análise SDS-PAGE da expressão da proteína em BL21 (DE3) cells a 25 ° C durante a noite e o primeiro passo de purificação usando resina de afinidade de cobalto. (B) cromatograma de exclusão de tamanho representativo após clivagem do PEV. As frações da cromatografia de exclusão foram analisadas por SDS-PAGE. As frações de pico 1 contendo Nsa1 foram coletadas e usadas para análise estrutural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. O C-terminal da Nsa1 é sensível à proteólise. (A) ensaios de cristalização inicial de Nsa1 renderam duas formas diferentes de cristais: cúbicas e ortorrômbico. Microscópio UV foi utilizado para verificar que os cristais continham proteínas. Vis: Luz visível, UV: microscópios de UV. Barra de escala = 50 µm em cada janela. (B) proteolítica triagem analisada por SDS-PAGE. Três diluições (01:10, 1: 100, 1: 1000) para cada unidade populacional protease (0,1, 0,01, 0,001 mg/mL) foram combinadas com alíquotas de proteína (1 mg/mL) para ser exibido. Resistente à proteases domínios foram analisados o por SDS-PAGE e espectrometria de massa, após incubação de 37 ° C por 60 min. Nsa1-FL: fresco purificado da proteína, Nsa1Δ: purificado da proteína armazenada a 4 ° C por 3 semanas, após o qual observou-se uma forma degradada da proteína. (C) diagrama esquemático diagrama de Nsa1 completos (superior) e o truncamento do C-terminal constroem (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Otimização de cristalização Nsa1. (A) um estoque de sementes foi preparado a partir de cristais pequenos iniciais e usado para fazer uma série de diluição (1 x ~ 1/104x) (microseeding). Misturando-se 1 µ l de proteína com 1 µ l do estoque de sementes diluído, os cristais maiores cresceram dentro de uma semana. (B) precipitant gradiente de concentração para a otimização de cristal ortorrômbico. (C) otimizado Cristais cúbicos e ortorrômbico utilizados para coleta de dados. Círculos verdes indicam a área típica das bandejas de cristal que rendeu a coleta de dados cristais de qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Diagrama esquemático da análise SAXS Nsa1. Visão geral do encanamento usado para processar dados SAXS e gerar modelos com bando (centro) e Moe (à direita). O pipeline da esquerda mostra a discrepância entre a curva de dispersão experimental (círculos vermelhos, a concentração de proteína: 6 mg/mL) com a curva de dispersão teórica (linha azul), que foi gerada a partir da estrutura de cristal 5SUM PDB ID. Os modelos foram avaliados comparando a curva de dispersão experimental SAXS (círculos vermelhos, a concentração de proteína: 6 mg/mL) com a curva de espalhamento derivado do modelo de bando de Nsa1 (preto linha) ou os conformistas Moe de Nsa1 (preto de linha). Em cada modelo, o domínio de WD40 é mostrado no desenhos animados coloridos em verde (PDB ID 5SUM), do C-terminal flexível é mostrado nas esferas coloridas em vermelho para o bando e verde, magenta, ciano e amarelo para os conformistas EOM individuais. A fração de cada conformador derivado da Moe é rotulada ao lado do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Nsa1 impediu a embalagem de cristal. A estrutura do Nsa1 foi resolvida por cristalografia de raios x de alta resolução, mas o C-terminal não poderia ser construído em qualquer forma de cristal, porque não foi ordenada. Cristalografia é a técnica de estreia para a determinação de estruturas atômicas resolução de macromoléculas em torno do tamanho de Nsa1, no entanto, tal como acontece com qualquer método, cristalografia tem algumas limitações. Uma das principais limitações de cristalografia é a incapacidade de resolver desordenadas regiões de proteínas40,41.

O C-terminal da Nsa1 é importante para localização nucleolar adequada da proteína, ressaltando a necessidade de estudar sua estrutura10. O C-terminal da Nsa1, foi resolvido por SAXS, uma técnica de biologia estrutural complementar a cristalografia de raios x. Dados SAXS foi gravados para o longa-metragem Nsa1 através de uma série de concentração. Desta série de concentração, determinou-se a concentração ideal para coleta de dados Nsa1 SAXS e processamento. Dados SAXS foram gravados para Nsa1 no 6, 4.5 e 3,0 mg/mL. A região de Guinier, função de reacionamento e peso molecular foram determinadas através da série de concentração para garantir que a amostra era bem comportado e não agregados nas condições experimentais testadas. Para reconstruir a estrutura completo de Nsa1, determinou-se a amplitude teórica de dispersão da estrutura de cristal parcial e então ab initio métodos foram usados para modelar o C-terminal flexível. Com esta abordagem híbrida, foi determinado que o C-terminal flexível de Nsa1 se estende para fora do domínio de WD40 ordenado.

Avanços no processamento de ferramentas tem impulsionado a popularidade de SAXS para estudos estruturais macromoleculares. SAXS mede o padrão de espalhamento de raio-x da proteína aleatoriamente orientado em solução para fornecer informações estruturais baixa resolução, incluindo a massa molecular e forma geral. Consequentemente, SAXS tem emergido como uma ferramenta de validação de poderosa estrutura ortogonal para cristalografia. Isto é principalmente devido ao desenvolvimento de métodos computacionais para calcular a dispersão teórica das estruturas atômicas e comparando-os com experimental SAXS dados37. Usar essa abordagem, o estado conformacional, estrutura quaternária e montagem de ordem superior, observada em um lattice de cristal pode ser comparado com as características estruturais da partícula em solução. Além disso, loops desordenados e termini desaparecidos em estruturas de alta resolução, determinadas por cristalografia de raios x pode ser modelados usando dados de dispersão de solução. Esta abordagem estrutural híbrido usa a estrutura de cristal como um bloco de construção para modelagem orientada por SAXS de resíduos ausentes e tem provado para ser eficaz no mapeamento do C-terminal da Nsa110, bem como outras macromoléculas como o vírus da influenza A M1 matriz de proteína42e RNA mortos-caixa controla43. Software de modelagem avançada baseada em SAXS pode também abordar a sistemas mais complexos, tais como proteínas intrinsecamente desordenados, mapeando a paisagem conformacional destes sistemas usando uma série de conformistas que juntos contribuem para a dispersão global potencial de uma partícula em solução16,39. Tomados juntos, recentes avanços em ferramentas de coleta e processamento de dados SAXS contribui para o sucesso das abordagens de biologia estrutural híbrido para enfrentar desafiantes de sistemas biológicos.

A combinação de dispersão de solução com estruturas de alta resolução está preparada para responder a perguntas importantes sobre a flexibilidade e a dinâmica das macromoléculas44. Muitas proteínas, tais como Nsa1, tem regiões dinâmicas que são importantes para a função biológica. Neste manuscrito um protocolo modelo é fornecido que detalha a combinação de SAXS com determinação de estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x. Além de SAXS também pode ser usado para complementar outras técnicas de biologia estrutural, incluindo NMR de cristalografia de raios x, elétrons paramagnético ressonância (EPR), fluorescência ressonância energia e transferir (FRET), ainda mais destacando a importância de SAXS como uma biologia estrutural complementar técnica45,46,47.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa programa nacional; E.U. Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 de R. E. S.) e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR, 146626 para M.C.P). Uso de APS foi apoiado pelo departamento de energia, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas sob contrato n º W-31-109-Eng-38. Uso da fonte de luz avançado (ALS) foi apoiado pelo Director, Office of Science, escritório de energia ciências básicas, o departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231. Suporte adicional para a trajetória de SIBILAS SAXS vem do Instituto Nacional de saúde do projeto MINOS (R01GM105404) e um high-end instrumentação Grant S10OD018483. Também gostaríamos de agradecer a Andrea Moon e Dr. Sara Andres por sua leitura crítica deste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioquímica questão 131 cristalografia de raios x SAXS métodos híbridos purificação de proteínas domínio WD40 proteólise limitada Ribossoma Assembly
Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de <em>S. Cerevisiae</em>
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Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

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