Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

Published: May 29, 2018 doi: 10.3791/56955

Summary

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Abstract

Bir çaba ES Hücre metodolojileri ile genetik fareler oluşturulmasında verimliliğini artırmak için biz bir uyum geçerli blastosist enjeksiyon protokolü için mevcut. Burada basit bir rotasyon embriyo ve sızdırma Trans-iç hücre kütlesi (TICM) yoluyla chimeric % %31 50'si, hiçbir ek donanımları ile fareler yüzdesi arttı ya da daha fazla eğitim uzman raporu. 26 farklı klonlar yakın akraba evliliğinden doğan ve 35 toplam klonlar bir 9 ay boyunca enjekte edildi. Geleneksel enjeksiyon teknikleri ve TICM arasında anlamlı bir fark gebelik oranı veya embriyo iyileşme oranı oldu. Bu nedenle, enjeksiyon süreci ve blastosist basit bir konumlandırma ve ICM enjekte herhangi bir önemli değişiklik, ES Hücre blastocoel boşluğa bırakmadan potansiyel chimeric üretim ve sonraki miktar artırabilir germline iletim.

Introduction

Yaklaşık 25 yıl için genetik olarak hedeflenen fareler oluşturulması genellikle bir darboğaz tarafından blastokistlerin ES Hücre mikroenjeksiyon aşamada chimeras verici germline üretimi için engel yavaş bir süreç olmuştur. Son gelişmeler, ES hücre ve yüksek üretilen iş ES hedefleme CRISPR/Cas91,2 de dahil olmak üzere hücre üretimi konsorsiyumlar KOMP gibi genetik olarak değiştirilmiş ES hücre üretimi/durumu düzeldi. Ancak, genetik olarak değiştirilmiş fare bu ES hücreleri3,4den oluştururken bir darboğaz germline chimeras nesil kalır. Yüksek işlem hacmi ES hücre üretimi projeleri germline chimeras başarılı oluşturulması için önemlidir ES Hücre kalitesi yüksek değişkenlik tarafından rahatsız olması. Ayrıca, yaygın olarak kullanılan ES Hücre satırlarından bazıları yüksek anöploidi ve germline yetkili chimeras5zor üretim için bilinir.

Fare ya da daha yüksek bir chimera oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiştir veya tamamen ES Hücre fareler6,7,8,9,10türetilmiş. Bu sistemlerin her biri kendi yararları olsa da, onlar da kendi eksiklikleri var. Verimsiz ve outbred satırları 5,6sınırlı iken % 100 ES Hücre üretme fareler, türetilmiş tetraploid chimeras kuşağıdır. Morula enjekte ederek yeni yöntemleri yüksek oranda chimeras, % 100, yaklaşan verim ama genel olarak önemli ek donanımları (lazerler ya da piezos) ve eğitim10,11gerektirir. Nerede bu teknikler zaten yerde laboratuvarlarda, bu yeni yöntem gerek kalmayabilir.

Bu çalışmanın amacı chimera üretme, sonraki fare koloni kurmak için mutant gen aktarımını germline olasılığını artırma oranı artırmak için ortak teknikleri ve hazır ekipman kullanan bir yöntem bulmak oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm işlemleri fare çekirdek dışarı NIEHS Knock tesisin normal çalışma kapsamında yapıldı. Bütün fareler bir 12:12 tarihinde tutulan s açık: koyu döngüsü ve bir diyet NIH-31 ve su besleme ad libitum. Tüm deneylerin hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü uygun olarak yapıldı.

1. hayvan hazırlık

  1. Doğurmak donör fareler, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, 8-10 hafta-in yaş B6 için doğal olarak (Cg)-Tyr < c-2J > /J erkek fareler arasında 8 ve 26 hafta-in yaş. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.
  2. Alıcı fareler, İsviçreli kadın fareler 6 ve 9 hafta-in yaş arasında doğal olarak vasectomized İsviçre Webster erkek fareler için yetiştirilmiş Webster doğurmak. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.

2. ES Hücre hazırlık

  1. 129-derieved AB2.2 ES hücreler için 15 ile desteklenmiş DMEM hücrelerde kültür % FBS, % 1 glutamin, %1 Penn/strep ve % 0.1 β-mercaptoethanol. ES Hücre tedarikçinin yönergeler, onların önerilen protokolleri kullanarak başına diğer tüm ES hücre kültür.

3. embriyo koleksiyonu

  1. Hayvan diseksiyon
    1. Birkaç 60 mm yemekleri, yaklaşık 1 5 fare artı 10 mL patlama koleksiyonu medya (BCM) ile 3 ekstra hazırlamak (% 10 FBS inç DMEM), ve iyi bir 4 çanak ile 0.5 mL BCM de başına. 37 ° C, % 5 CO2equilibrate.
    2. B6 ötenazi (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, CO2 boğulma, % 10 debi ile kullanarak E3.5.
    3. Ötenazi sonra fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karın % 70 etanol ile iyice ıslak.
    4. Sadece, deri yoluyla ilk kesi kadar geniş açılış yapma karın, orta noktasını yaptırın. Sonraki yeniden yapım belgili tanımlık kesme mümkün olduğu kadar geniş karın duvarından açın.
      Not: iki adımda bunu azaltmak veya kürk kirlenme ortadan kaldırmak yardımcı olur.
    5. Yumurtalık, ovidukt ve rahim, yağ dokusu minimumda tutmak için ekstra bakım alarak bir yumurtalık başlangıç ve yumurtalık yağ yastığı künt forseps ile tutarak dikkatle çıkarın. Rahim bir tek birim olarak veya aşağıdaki yöntemde bir değişiklik ile bireysel boynuzları olarak kaldırın.
    6. Kaldırıldıktan sonra rahim patlama toplama ortamı içeren bir 60 mm çanak yerleştirin.
  2. Embriyo kaldırma
    1. BCM ile dolu bir 10 mL şırınga hazırlamak ve bir 25 G iğne ile uygun.
    2. Her seferinde bir rahim BCM holding çanak çıkarıp, onları aşırı kan kaldırmak ve düşük bir büyütme diseksiyon mikroskop altında 60 mm tabak içinde yerleştirmek için bir doku üzerinde leke.
    3. Dikkatlice ve yavaşça rahim distal sonuna (ovidukt) hemen altında tutarak forseps diseksiyon ile paralel bir uçak mümkün olduğunca olarak iğnede rahmine ortasına yerleştirin. Forseps ipuçları ötesinde iğne yerleştirin.
    4. İğne için rahim tutulacağı pensler biraz baskı uygulamak ve yaklaşık 1 mL BCM ile rahim boynuz sınırdışı.
      Not: şırınga üzerinde çok fazla baskı medya, kontrol edilemeyen bir akışı neden olur bu adımda kez çanak bırakarak özen göstermelidir.
    5. Rahim, 60 mm çanak, başına en fazla 5 bütün uteri kızarma sonra çanak koleksiyonu kadar da kuluçka makinesine koyun.
  3. Embriyo koleksiyonu
    1. Bir el çekilmiş Cam Pipet ve ağzını pipet cihazlar kullanarak, blastokistlerin 25 X ve 35 X arasında parçalanmış bir kapsam altında toplamak. (Şekil 1).
      Not: Ağız pipet aparatı 30-40 cm esnek boru oluşur, 5 mm altında kimlik eklemek bir 1 000 µL pipet ucu, ilk tek bir amaç için nokta ve içindeki Cam Pipet yapıştırmayın. Bir ekli 1 cc şırınga varil, bir ağız parçası hareket etmek hiçbir pistonu ile diğer ucunu bir şırınga filtre ekleyin.
    2. Bulaşık kuluçka makinesi--dan kaldırma ve bir ızgara deseni kullanılarak yemek embriyolar için her bölümünü inceleyin. Embriyo aldı tek tek yukarı ve yer üstünde BCM ikincil bir tabak içinde damla.
    3. Tüm yemekler toplama sonra embriyo bir kez daha taze BCM bir düşüş yıkama ve enjeksiyon beklemek üzere 4 iyi çanak içinde yerleştirin.

4. embriyo enjeksiyon

  1. ES hücreleri tek tek enjeksiyon iğneyi onayı ile seç.
    1. 5-7 mL enjeksiyon medya ekleyerek bir enjeksiyon yemek hazırlamak (DMEM, %10 FBS ve 20 mM HEPES) bir cam alt enjeksiyon yemek için. İğne oda sıcaklığında yapılır.
    2. Bir hava veya yağ microinjector kullanarak, ES Hücre çizmek için enjeksiyon iğne vakum uygulanır. Hücreler arasında mümkün olduğunca az yer olarak tutmak için dikkat ediniz. Burada ya da enjeksiyon adım ES hücreleri saymak.
    3. Orta ve küçük boyutlu hücreler, pürüzsüz bir yüzey ile boşluklar gibi bariz hataları olmadan genel nüfusa göre ES hücreleri seçin.
      Not: ES Hücre popülasyonlarının büyük ölçüde morfolojik kalitesinde değişir ve kullanılan standartlar onlarla ayarlamanız gerekebilir.
  2. Embriyo yaklaşık 15 ES hücrelerle (Şekil 1) enjekte.
    1. Holding pipet eklemek ipucu için ikinci bir hava microinjector ve açılış sahibinin yakınındaki bir embriyo konumlandırın. Embriyo sahibi için güvenli için vakum uygulanır.
    2. Z ekseni için böylece embriyo sadece iyi zona üzerinde odaklanarak takip slayt, dokunuyor holding pipet yukarı veya aşağı taşıyarak ayarlayın. Ardından, ES hücrelerdir ucuna yakın odak enjeksiyon iğne Z ekseni ayarlayın.
    3. Embriyo şimdi hafifçe üst veya alt, ICM istediğiniz konuma koymak için dönen enjeksiyon iğne iterek ayarlayın.
    4. Zona ve ICM veya firma ama kontrollü push kullanarak trofoblast, enjeksiyon iğne yerleştirin. Microinjector enjeksiyon iğne blastocoel çöken düşük tutmak için hafif bir basınç uygulayın.
    5. Bir kez iğne blastocoel nüfuz, ES Hücre embriyo blastocoel için aktarmak için microinjector gelen basınç uygulayın. Basınç embriyo hücreleri tutarken, normale dönmek için izin vermek için embriyo çıkmak Duraklat kısaca iğne eğimi olarak başlar.
      Not: Başvuru grubu ES hücreleri normalde enjekte edildi, geleneksel bir ES takip enjeksiyon Protokolü9ICM dokunmamaya dikkat çekici, hücre. ES hücreleri de iğne doğrudan aracılığıyla ICM (TICM) (Şekil 2Tamamlayıcı film) iterek ICM yoluyla enjekte edildi.

5. eEmbryos devri

  1. Transfer embriyoların İsviçre Webster farelere, E2.5, üretim prosedürleri başına bir cerrahi olmayan embriyo transferi aygıtı kullanarak. Cerrahi olmayan bu yordam herhangi bir anestezi veya özel ameliyat sonrası bakım gerektirir. Tek tek embriyo ve teslim ve sonraki sütten kesme yoluyla transferden sonra evi fareler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre kültürünü rasgele etkisi olarak tedavi, karışık etkileri Doğrusal model (örneğin SAS (sürüm 9.2)) yazılımında verileri çözümlemek için kullanıldı. Her analiz embriyo transfer ve hücre sayısı için kontrollü. İkinci analiz de hayatta yavru sayısı için kontrol.

Bu çalışma için her ES hücre kültürünü ve klon her ikisi ile geleneksel enjekte ettiler ve TICM teknikleri, her embriyo sonra iki yöntem arasında geçiş yapma. Enjeksiyon sonra embriyo çanak üzerinde ayrılmış ve genellikle arasında alıcı erkek başına 12 ve 15 embriyo transferi göre gruplandırılmış. Açıkça görünür bir blastocoel yoktu embriyolar Zona pelusida yoksun veya nerede microinjected ES hücreleri blastocoel girmek başarısız oldu bu deneyden elendi.

İncelendiğinde ilk veri gebelik oranı oldu. Şekil 3' te gösterildiği gibi gebelik oranları kontrol grubundan TICM grubunda değiştirilmemiş. Ayrıca, bir eşit oranda ve yavrularını hayatta sütten kesmek için (P = 0,50, Şekil 4). En önemlisi, değişmeden kalır numarası ve yavrularını sütten kesme, fareler sayısı ise kat renk chimerism görüntüleme %31 TICM grubu için % 50 artış (p = 0,005, Şekil 5). Ceket renk chimerism derecesini çok subjektif Bu çalışmada değerlendirilecek ve gerçekten germline chimerism ilgili olarak kabul edildi.

Figure 1
Şekil 1: uzman ekipman. (Sol) Enjeksiyon mikroskop Kur, (A) mikro manipülatörler ve (B) hücre tramvay hava gibi. (Sağ) Ağzını pipet aparatı, (C) çizilmiş cam pipet, (D) 1000µL pipet ucu, (E) boru, (F) filtre ve (G) şırınga ile namlu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Blastokist embriyo enjeksiyon örneği. (A, B) Geleneksel enjeksiyon yöntemi, nerede ICM ile herhangi bir etkileşim kaçınarak ICM, karşısında enjeksiyon iğne girer. (C, D) TICM yöntemi, nerede enjeksiyon iğne ICM aracılığıyla doğrudan blastocoel için girer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: gebelik oranı. Gebelik oranı geleneksel (39/50) ve TICM (64/76) arasında anlamlı bir fark gösterdi. Ortalamalar artı standart hata ortalamaya (SEM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Survival oranı. Sağkalım oranı sütten kesmek için hayatta pups sayısıdır olduğu yere vazgeçirmek için bir çöp. Yavrular sütten kesmek için hayatta değildi ve nerede hiçbir yavrular sütten kesmek için hayatta çöp bu verilerde dahil değildi. Ortalamalar artı standart hata ortalamaya (SEM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Chimerism oranı. Chimeras üretilen ve chimerism kalitesini gidermez bu veriler sadece numarasını temsil eder. Geleneksel grubunda, % 31'i (34/110) belgili tanımlık çoluk çocuk chimerism, nerede TICM grup ortalama % 50 oranında (79/158) vardı gösterdi. Ortalama artı standart hata ortalamaya (SEM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uzun ICM herhangi bir rahatsızlık ölüm, aslında, Şu anki blastosist mikroenjeksiyon protokolleri hala bu12,13uyarmak yol açabileceğini zannedildiği. Biz burada göstermiştir ne olduğunu mikroenjeksiyon ICM ile embriyo için zararlı değildir ve chimeras verimini artırır.

Böyle bir sonuç kesin mekanizması tanımlanmamış. Ancak, ICM ve eşlik eden hypoblast, mekanik bozulma ES Hücre entegrasyon mikroenjeksiyon takip yeni kurulan ICM insidansı artırmalıdır. İPSCs alanında son iş mekanik stimülasyon insan IPSC14kişi yeniden programlama yardımcı olduğunu göstermiştir. Mekanik işleme fare embriyo ICM içinde benzer bir etki varsa, bir potansiyel 'Başlangıç' blastosist donör kaldırma, pluripotent durumuna geri, ayırt etmek için potansiyel olarak başlayan ICM hücrelerinin dönme etkisi olabilir embriyonik doku oluşturan türetilmiş hücreler. Son olarak, ICM sonuçları enjeksiyon hücrelerde genetik olarak microinjected için rekabet düzeyini düşürücü ICM, sayısı bilinmeyen ölümüyle ES hücreleri değiştiren mümkündür.

Bu yöntem değişikliği birincil faydaları yok yeni öğrenme, sorun giderme veya ekipman gerekir vardır. Tüm teknikler standart blastosist enjeksiyon taşımak. En kritik adımlar da değişmeden kalır; embriyo ve öncesinde, sırasında ve sonra enjeksiyon embriyolar için uygun kültür koşulları uygun ve zamanında koleksiyonu. Ameliyatsız embriyo transferi tekniği kullanırken, uygun alıcı fare seçmek için daha kritik hale gelir. Cerrahi transferler ile cerrah uygun üreme devlet, doğrulamak için fareyi inceleyin fırsatınız oldu nerede ameliyatsız transferler ile bu mümkün değildir. Fareler ana üreme Çağı (6-9 hafta) olmalı ve sadece fare görünür fişleri ile kullanılmalıdır. Bu teknik en önemli unsuru ve tüm ES Hücre enjeksiyonları, ES Hücre kalitesidir.

Yüksek kaliteli, sağlam hücre hatları, ilgili bu teknik yalnızca en az fark verim, ancak satırları ile suboptimal ES hücre veya zor hatları ile çalışır, herhangi, hatta küçük iyileştirmeler önemli ve proje başarı arasındaki fark ve başarısızlık. Bu çalışma boyunca, birden fazla piyasada bulunan ES hücre satır germline chimeras oluşturulan ve neredeyse tüm germline chimeras üretilen ticari ES satırları TICM enjeksiyonları olduğunu belirtmek gerekirse da sağlar. Burada basit bir değişiklik tekniğinde önemli bir iyileşme verimlilik artışı, yeni ekipman için herhangi bir ek maliyetler üstlenmeden, eğitim veya hayvan kullanımı artan neden göstermiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Acknowledgments

Bu araştırma [kısmen] Intramural araştırma NIH, Ulusal Enstitüsü Çevre Sağlık Bilimleri Program tarafından desteklenmiştir. İstatistiksel analiz için özel Shyamal Peddada teşekkürler. Biz de Humphrey Yao, Gary kuş ve Yuki Arao incelenmesi bu el yazması ve Franco St onun sürekli destek ve tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ES Cell injection needle Humagen MSC-20-0
NSET device Paratechs 60010
DMEM Gibco (life technologies) 11965-092
FBS Gibco (life technologies) 10439-024 lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES Sigma H0887
β-mercaptoethanol Sigma M7522
Micro manipulator Leica Micro manipulator
micro injector Eppendorf AG Cell Tram Air 5176
Microscope Leica DM IRB
4 well dish Thermo Scientific 176740
60 mm dish Sarstedt 83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA 000058
Swiss Webster mice Taconic, USA Tac:SW
Injection Dish MatTek Corp. P50G-0-30-F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
  3. Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
  4. Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
  5. Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
  6. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  7. Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
  8. Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
  9. Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
  10. Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
  11. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
  12. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
  13. Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
  14. Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).

Tags

Biyoloji sorunu 135 Chimera iç hücre kütlesi ICM embriyonik kök hücre ES hücre blastosist embriyo transgenik nakavt
Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, G. J., Gruzdev, A., Hagler,More

Scott, G. J., Gruzdev, A., Hagler, T. B., Ray, M. K. Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates. J. Vis. Exp. (135), e56955, doi:10.3791/56955 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter