Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.
Abstract
In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.
Introduction
Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas91,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen3,4. Hochdurchsatz-ES Zelle stromerzeugungsprojekte haben durch hohe Variabilität in ES-Zellen-Qualität, die entscheidend für die erfolgreiche Erstellung der Keimbahn Chimären ist geplagt. Darüber hinaus sind einige der häufig verwendeten ES-Zelllinien für hohe Aneuploidie und schwierige Produktion der Keimbahn zuständigen Chimären5bekannt.
Viele Methoden wurden entwickelt für die Erstellung von Mäusen mit entweder eine höhere Chimäre oder komplett ES Zelle abgeleitet Mäuse6,7,8,9,10. Während jedes dieser Systeme seine eigenen Vorzüge hat, haben sie auch ihre Schwächen. Die Generation der tetraploiden Chimären, während generieren 100 % ES Zelle Mäuse, abgeleitet ist ineffizient und in der Regel beschränkt auf fremd-Linien 5,6. Neuere Methoden der Morula Injektion können Ausbeute hohen Prozentsatz Chimären, annähernd 100 %, aber erfordern in der Regel erhebliche zusätzliche Ausrüstung (Laser oder Piezos) und Training10,11. Im Labor, wo diese Techniken bereits vorhanden sind, kann diese neue Methode nicht erforderlich sein.
Ziel dieser Studie war es, eine Methode zu finden, die gängige Techniken und leicht verfügbare Ausrüstung zur Erhöhung der Chimäre-Generation, die Chance der Keimbahn Übertragung des mutierten Allels, die anschließende Maus Kolonie zu erhöhen verwendet.
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Protocol
Alle Arbeiten erfolgten im Rahmen des normalen Betriebs des NIEHS Knock Out Maus Core Facility. Alle Mäuse blieben auf einem 12:12 h Licht: Dunkel-Zyklus, und waren eine Diät von NIH-31 und Wasser ernähren ad libitum. Alle Versuche wurden im Einklang mit der Animal Care und Gebrauch von dem National Institute of Environmental Health Sciences durchgeführt.
(1) tierische Vorbereitung
- Züchten Spender Mäuse, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 8-10 Wochen alt natürlich bis B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j männliche Mäuse zwischen 8 und 26 Wochen alt. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).
- Züchten Sie Empfänger Mäuse, Schweizer Webster weibliche Mäuse zwischen 6 und 9 Wochen alt natürlich vasektomierten Schweizer Webster männlichen Mäusen gezüchtet werden. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).
2. ES Handy Vorbereitung
- Kultur für 129-Derieved-AB2.2 ES-Zellen, Zellen in DMEM ergänzt mit 15 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penn/Strep und 0,1 % β-Mercaptoethanol. Andere ES-Zellen pro ES Zelle Lieferant Anweisungen, ihre empfohlene Protokolle mit Kultur.
(3) Embryo Collection
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Tierische Dissektion
- Bereiten Sie mehrere 60 mm Schalen, ca. 1 pro 5 Mäusen plus 3 Extra, mit 10 mL Sammlung Strahlmittel (BCM) (10 % FBS IN DMEM), und einem 4 Schüssel gut mit 0,5 mL BCM pro Bohrloch. Equilibrate bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Einschläfern B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 3,5 mit CO2 Erstickung, mit einer Flussrate von 10 %.
- Legen Sie nach euthanizing die Mäuse in der Rückenlage und nass des Bauches gründlich mit 70 % Ethanol.
- Den erste Schnitt durch die Haut nur, in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung so weit wie möglich zu machen. Als nächstes öffnen Sie durch die Bauchdecke wieder den Schnitt so weit wie möglich zu machen.
Hinweis: Dabei in zwei Schritten hilft, verringern oder beseitigen Fell Verschmutzungen. - Ein Eierstock ab und hält die Fettpolster des Eierstocks mit stumpfen Pinzette entfernen Sie vorsichtig die Eierstöcke, Eileiter und Gebärmutter, wobei besonders vorsichtig, um das Fettgewebe auf ein Minimum zu reduzieren. Die Gebärmutter zu entfernen, als eine einzelne Einheit oder als einzelne Hörner, ohne Änderung in der folgenden Prozedur.
- Legen Sie nach der Entfernung die Gebärmutter in eine 60 mm Schale mit Strahlmittel Sammlung
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Embryo-Entfernung
- Bereiten Sie eine 10 mL Spritze mit BCM gefüllt und mit einer 25 G Nadel passen.
- Eine Gebärmutter in einer Zeit, entfernen Sie sie aus der Schale der Abhaltung von BCM, Tupfen Sie sie auf ein Gewebe zu entfernen überschüssiges Blut, und legen Sie in einer 60 mm Petrischale unter einer niedrigen Vergrößerung Mikroskop seziert.
- Halten Sie vorsichtig und sanft die Gebärmutter direkt unter dem distalen Ende (in der Nähe der Eileiter) mit Zange sezieren, fügen Sie die Nadel in der Mitte der Gebärmutter in als Parallel ein Flugzeug wie möglich. Stechen Sie die Nadel direkt hinter den Spitzen der Zange.
- Einigen Druck auf die Zange, die Gebärmutter, die Nadel zu halten, und etwa 1 mL der BCM durch das Horn des Uterus zu vertreiben.
Hinweis: Bei diesem Schritt Vorsicht ist da zu viel Druck auf die Spritze einen unkontrollierbaren Stream Medien, führt oft verlassen das Gericht. - Nach dem Spülen der Gebärmutter bis zu 5 ganze Uteri pro 60 Millimeter-Teller, legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator bis zur Abholung.
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Embryo-Sammlung
- Mit einer Hand gezeichnete Glaspipette und einen Mund Pipette Apparat, sammeln Sie Blastozysten einen sezierenden Rahmen bis 25 X 35 X festgelegt. (Abbildung 1).
Hinweis: Mund Pipette Apparatur besteht aus 30-40 cm Schlauch, unter 5 mm I.D. Legen Sie ein 1 000 µL PIPETTENSPITZE, zuerst in an einem Ende und befestigen Sie die Glaspipette drin. Fügen Sie an das andere Ende mit einer angehängten 1 cc Spritzenzylinder, keine Kolben, als ein Mundstück handeln Spritze Filter hinzu. - Gerichte aus dem Inkubator zu entfernen und mit einem gittermuster untersuchen Sie jeden Teil der Schale für Embryonen. Embryonen werden gepflückt, einzeln auf und legen Sie auf die Tropfen BCM in eine zweite Schüssel.
- Nach dem Sammeln von allen Gerichten, waschen Sie die Embryonen noch einmal in einem Tropfen frisch BCM, und platzieren Sie die 4 gut Gericht Injektion zu erwarten.
- Mit einer Hand gezeichnete Glaspipette und einen Mund Pipette Apparat, sammeln Sie Blastozysten einen sezierenden Rahmen bis 25 X 35 X festgelegt. (Abbildung 1).
4. Embryo Injektion
- ES-Zellen holen Sie einzeln mit der Injektionsnadel basierend auf Bestätigung ab.
- Bereiten Sie eine Injektion Gericht durch Zugabe von 5-7 mL Injektion Medien (DMEM, 10 % FBS und 20 mM HEPES) zur Injektion Glasschale unten. Injektionen sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Verwenden entweder eine Luft oder Öl Microinjector, Vakuum auf der Injektionsnadel Embryonaler Stammzellen zu zeichnen, anwenden. Achten Sie darauf, um so wenig Raum wie möglich zwischen den Zellen zu halten. Die ES-Zellen zu zählen, hier oder bei der Injektion Schritt.
- Wählen Sie Embryonische Stammzellen, die Mittel bis klein im Vergleich zur allgemeinen Bevölkerung der Zellen, mit glatter Oberfläche und ohne offensichtliche Mängel wie Vakuolen sind.
Hinweis: ES-Zell-Populationen variieren stark in morphologischen Qualität und Standards verwendet musst mit ihnen anpassen.
- Injizieren Sie Embryonen mit ca. 15 ES-Zellen (Abbildung 1).
- Anhängen einer haltepipette Tipp: um eine zweite Luft-Microinjector und einen Embryo in der Nähe der Öffnung des Inhabers zu positionieren. Gelten Sie Vakuum um den Embryo an den Inhaber zu sichern.
- Für die Z-Achse von der haltepipette oben oder unten zu verschieben, so dass der Embryo nur die Folie, gefolgt von Feinfokussierung auf die Zona berührt einstellen. Als nächstes einstellen Sie die Z-Achse von der Injektionsnadel so, dass ES-Zellen in der Nähe der Spitze im Mittelpunkt stehen.
- Passen Sie den Embryo nun durch leichten Druck aus der Injektionsnadel an der Ober- oder Unterseite, drehen es um ICM in die gewünschte Position setzen.
- Legen Sie die Injektionsnadel durch die Zona und ICM oder Trophoblast, einen festen, aber kontrollierten Push verwenden. Leichten Druck auf die Microinjector der Injektionsnadel zu helfen, das blastocöl vor dem Kollaps.
- Sobald die Nadel das blastocöl eingedrungen ist, üben Sie Druck aus der Microinjector, ES-Zellen auf das blastocöl des Embryos zu übertragen. Pause kurz als die schräge der Nadel beginnt, verlassen Sie den Embryo um den Druck des Embryos zurück zu normal, Beibehaltung der Zellen zu ermöglichen.
Hinweis: Referenz-Gruppe-ES-Zellen wurden normalerweise injiziert, Anschluss an eine traditionelle ES Handy Injektion Protokoll9, kümmert sich nicht um das ICM zu berühren. ES-Zellen wurden auch durch das ICM, schieben die Nadel direkt durch das ICM (TICM) (Abbildung 2ergänzende Film) injiziert.
5. Übertragung von eEmbryos
- Transferieren Sie die Embryonen an Schweizer Webster Mäuse am E2.5, mit einem nicht-chirurgische Embryo Transfer Gerät pro Verfahren der Herstellung. Dieses nicht-chirurgische Verfahren erfordert keine Anästhesie oder spezielle postoperative Pflege. Hausmäuse individuell nach dem Transfer der Embryonen und durch Lieferung und anschließende absetzen.
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Representative Results
Zell-Linie als des random-Effekts zu behandeln, wurde ein lineares Modell gemischte Effekte verwendet, zum Analysieren der Daten in der Software (z.B. SAS (Version 9.2)). Jede Analyse für die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zell-Linie gesteuert. Die zweite Analyse auch für die Anzahl der Welpen, die überlebt gesteuert.
Für diese Studie jedes ES Zelllinie und Klon wurde sowohl mit traditionellen injiziert und TICM Techniken, abwechselnd zwischen den beiden Methoden nach jedem Embryo. Nach der Injektion waren Embryonen getrennt auf dem Teller und gruppiert nach Übertragung in der Regel zwischen 12 und 15 Embryonen pro Empfänger Weibchen. Embryonen, die nicht über eine deutlich sichtbare blastocöl fehlte eine Zona Pellucida, oder wo die microinjected ES-Zellen konnte nicht in das blastocöl eintreten schieden aus diesem Experiment.
Die ersten Daten geprüft wurde Schwangerschaftsrate. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden Schwangerschaftsraten in die TICM-Gruppe aus der Kontrollgruppe unverändert. Darüber hinaus ein gleicher Anteil der Welpen überlebt, Entwöhnung (P = 0,50, Abbildung 4). Am wichtigsten ist, während die Zahl der Mäuse bei der Entwöhnung bleibt unverändert, die Anzahl der Welpen anzeigen Mantel Farbe Chimärismus stieg von 31 % auf 50 % für die TICM-Gruppe (p = 0,005, Abbildung 5). Der Grad der Mantel Farbe Chimerism galt als zu subjektiv in dieser Studie ausgewertet werden, und nicht wirklich relevant für Keimbahn Chimärismus.
Abbildung 1: spezialisierte Ausrüstung. (Links) Injektion Mikroskop Einrichtung, einschließlich Micro-Manipulatoren (A) und (B) Zelle Straßenbahn Luft. (Rechts) Mund-Pipette-Apparat mit gezeichneten Glaspipette (C) , (D) 1000µL PIPETTENSPITZE (E) Schläuche, Filter (F) und (G) Spritze Fass. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiel für Blastozysten-Embryo-Injektion. (A, B) Traditionelle Injektionsverfahren, wo die Injektionsnadel tritt gegenüber des ICM, jede Interaktion mit dem ICM zu vermeiden. (C, D) TICM Methode, wo die Injektionsnadel direkt über das ICM in der blastocöl tritt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schwangerschaftsrate. Die Schwangerschaftsrate zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen traditionellen (39/50) und TICM (64/76). Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Überlebensrate. Die Überlebensrate beträgt die Anzahl der Welpen, die überlebten, Entwöhnung, wo es ein Wurf zu entwöhnen. Welpen, die nicht überlebten, Entwöhnung und Würfe, wo keine Welpen überlebt, Entwöhnung, waren nicht in diesen Daten enthalten. Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Chimärismus Preis. Diese Daten stellt nur die Anzahl, wenn Chimären produziert und nicht die Qualität der Chimärismus adressiert. Im Bereich "traditionelle" zeigte 31 % (34/110) der Nachkommen Chimärismus, wo die TICM-Gruppe durchschnittlich 50 % (79/158). Durchschnitt plus Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.
Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und der begleitenden Hypoblast die Inzidenz von ES Zelle Integration in die neu gebildete ICM nach Mikroinjektion erhöhen. Neuere Arbeiten auf dem Gebiet der iPSCs hat gezeigt, dass mechanische Stimulation hilft bei der Reprogrammierung von menschlichen iPSC14. Wenn mechanische Manipulation eine ähnliche Wirkung im ICM des Mausembryos hat, hätte es die Wirkung der Rückgabe Zellen des ICM potenziell begonnen hatte, zu unterscheiden, wieder in einen pluripotenten Zustand entfernen ein Potenzial "Vorsprung" der Blastozyste Spender abgeleitete Zellen bei der Bildung des embryonalen Gewebes. Zu guter Letzt ist es möglich, dass die Injektion durch die ICM-Ergebnisse in den Tod einer unbekannten Anzahl von Zellen im ICM, das Absenken des Wettbewerbs für die mikroinjiziert genetisch ES-Zellen verändert.
Die Hauptvorteile dieser Modifikation der Methode sind, dass es kein neues lernen, Fehlerbehebung oder Ausrüstung erfordert. Alle Techniken Übertrag von standard-Blastozyste Injektion. Unverändert bleiben auch die kritischsten Schritte; richtige und rechtzeitige Sammlung von Embryonen und richtige Kulturbedingungen für die Embryonen vor, während und nach der Injektion. Wenn die nichtoperative Embryo Transfer-Technik verwenden, es für den richtigen Empfänger Mäuse wählen wichtiger geworden. Mit chirurgischen Transfers der Chirurg hatte die Gelegenheit zu prüfen, die Maus, um die ordnungsgemäße reproduktiven Status zu überprüfen wo mit nicht-chirurgischen Transfers, dies ist nicht möglich. Mäuse sollte der besten reproduktiven Alter (6-9 Wochen) und sollte nur Mäuse mit sichtbaren Stecker verwendet werden. Der wichtigste Aspekt dieser Technik und alle ES Zelle Injektionen, ist die Qualität von ES-Zellen.
Beim Umgang mit hochwertigen, robusten Zelllinien, diese Technik kann nur minimale Unterschiede ergeben, aber mit suboptimalen ES Zellinien oder schwierig, mit Linien zu arbeiten, gegebenenfalls auch kleinere Verbesserungen, können erheblich sein und machen den Unterschied zwischen Projekterfolg und scheitern. Es ist auch der Hinweis, dass im Laufe dieser Studie mehrere handelsübliche ES-Zell-Linien Keimbahn Chimären generiert, und fast alle kommerziellen ES Linien, die Keimbahn Chimären erzeugt TICM Injektionen wurden. Hier haben wir gezeigt, dass eine einfache Änderung der Technik eine deutliche Verbesserung der Produktivität, ohne zusätzliche Kosten für neue Geräte, Training oder Steigerung des Einsatzes von Tieren führen kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [teilweise] unterstützt. Besonderen Dank an Shyamal Peddada für statistische Analysen. Wir wünschen auch Humphrey Yao, Gary Vogel und Yuki Arao zur Überprüfung dieser Handschrift, und Franco DeMayo für seine anhaltende Unterstützung und Beratung bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
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