Summary
Nous présentons ici un protocole visant à augmenter la production de chimère sans l’utilisation de nouveaux équipements. Un changement d’orientation simple de l’embryon pour injection peut augmenter le nombre d’embryons obtenus et potentiellement réduire la chronologie à la transmission de la lignée germinale.
Abstract
Dans le but d’accroître l’efficacité dans la création de souris génétiquement modifiées par l’intermédiaire de méthodes ES cellules, nous présentons une adaptation à l’actuel protocole d’injection de blastocyste. Nous rapportons ici qu’une simple rotation de l’embryon et l’injection à travers une masse cellulaire interne-Trans (TICM) a augmenté le pourcentage de souris chimériques de 31 % à 50 %, sans équipement supplémentaire ou une formation plus spécialisée. 26 différentes lignées autofécondées clones et 35 totales clones ont été injectés sur une période de 9 mois. Il n’y avait aucune différence significative dans les taux de grossesse ou les taux de récupération d’embryons entre des techniques d’injection traditionnelles et TICM. Par conséquent, sans aucune modification majeure dans le processus d’injection et un positionnement simple du blastocyste et injecter par l’intermédiaire de l’ICM, libérant les cellules ES dans la cavité du blastocèle peut potentiellement améliorer la quantité de production chimérique et ultérieures transmission de la lignée germinale.
Introduction
Depuis près de 25 ans, la création de souris génétiquement ciblées est un processus lent, souvent entravé par un goulot d’étranglement au stade de blastocystes ES cellules microinjection pour la génération de la lignée germinale transmettant des chimères. Des avancées récentes, y compris CRISPR/Cas91,2 , le ciblage des cellules ES et ES haut débit cell consortiums de génération comme KOMP, ont amélioré la génération/disponibilité des cellules génétiquement modifiées. Cependant, la génération de la lignée germinale chimères reste un goulot d’étranglement dans la création de souris génétiquement modifiées de ces ES cellules3,4. Projets de production de haut débit ES cellules ont été en proie à la grande variabilité dans la qualité de cellules ES, ce qui est essentielle pour le succès de la création de chimères de la lignée germinale. En outre, certains des lignées de cellules ES couramment utilisées sont connus pour aneuploïdie élevée et la production difficile de germline chimères compétentes5.
Plusieurs méthodes ont été développées pour la création de souris avec une chimère soit supérieure ou complètement ES cellule dérivée souris6,7,8,9,10. Alors que chacun de ces systèmes a ses propres mérites, ils ont aussi leurs défauts. La génération de chimères tétraploïdes, tout en générant des cellules ES 100 % provenant de souris, est inefficace et généralement limité à des lignes non consanguins 5,6. Des méthodes plus récentes de l’injection de morula peuvent céder le pourcentage élevé de chimères, approchant les 100 %, mais généralement nécessitent un équipement supplémentaire significatif (lasers ou piezos) et la formation10,11. Dans les laboratoires où ces techniques sont déjà en place, cette nouvelle méthode ne peut pas être nécessaire.
Cette étude avait pour but de trouver une méthode qui utilise les techniques courantes et des équipements disponibles pour augmenter le taux de génération de chimère, augmentant les chances de transmission de la lignée germinale de l’allèle mutant pour établir la colonie de souris ultérieures.
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Protocol
Toutes les opérations ont été effectuées dans le cadre du fonctionnement normal de l’installation du NIEHS Knock Out souris Core. Toutes les souris ont été maintenus sur un 12:12 cycle h lumière : obscurité et ont été donner une nourriture de NIH-31 et de l’eau ad libitum. Toutes les expériences ont été effectuées conformément à la protection des animaux et le Comité d’urbanisme de l’Institut National de Environmental Health Sciences.
1. la préparation animaux
- Race de souris de donateurs, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à 8-10 semaines d’âge naturellement à B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris mâles entre 8 et 26 semaines d’âge. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).
- Nichent souris destinataires, Swiss Webster souris femelles entre 6 et 9 semaines d’âge sont naturellement élevés à des souris mâles Swiss Webster vasectomisés. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).
2. préparation de cellules ES
- 129-derieved AB2.2 CSEh, culture des cellules en DMEM supplémenté avec 15 % FBS, 1 % de Glutamine, 1 % Penn/strep et 0,1 % β-mercaptoéthanol. Culture de toutes les autres cellules ES selon les instructions du fournisseur de cellules ES, à l’aide de leurs protocoles recommandés.
3. la collecte des embryons
-
Dissection animale
- Préparer plusieurs boîtes de 60 mm, environ 1 par 5 souris plus 3 extra, avec 10 mL blast collection médias (BCM) (10 % BF en DMEM), et un 4 bien plat avec 0,5 mL BCM / puits. Equilibrer à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Euthanasier B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à E3.5 à l’aide de CO2 asphyxie, avec un débit de 10 %.
- Après l’euthanasie, placez les souris en décubitus dorsal et mouiller l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
- Faire la première incision à travers la peau seulement, au milieu de l’abdomen, rendant l’ouverture aussi large que possible. Ensuite, ouvrez à travers la paroi abdominale, encore une fois faire l’incision aussi large que possible.
Remarque : Ce faisant en deux étapes permet de réduire ou éliminer la contamination de la fourrure. - À partir de l’ovaire et tenant de la garniture de l’ovaire avec une pince émoussée, retirer soigneusement l’ovaire, oviducte et utérus, prendre des précautions supplémentaires pour maintenir le tissu adipeux au minimum. Enlever l’utérus comme une seule unité ou cornes individuels, sans changement dans la procédure suivante.
- Après le retrait, placez l’utérus dans un plat de 60 mm contenant les médias collection blast.
-
Élimination de l’embryon
- Préparez une seringue de 10 mL remplie de BCM et dotée d’une aiguille 25 G.
- Un utérus à un moment, retirer le plat de la tenue du BCM, les éponger sur un mouchoir en papier pour enlever le sang excédentaire et placer dans un plat de 60 mm sous un grossissement faible binoculaire.
- Tenez soigneusement et délicatement l’utérus juste en dessous de l’extrémité distale (près de l’oviducte) avec pinces de dissection et insérez l’aiguille au centre de l’utérus en parallèle un avion que possible. Insérer l’aiguille juste au-delà de l’extrémité de la pince.
- Appliquer une pression à la pince pour maintenir l’utérus à l’aiguille et d’expulser environ 1 mL de BCM à travers la corne de l’utérus.
Remarque : Il faut à cette étape, trop de pression sur la seringue qui provoquerait un flux incontrôlable de médias, laissant souvent le plat. - Après le rinçage de l’utérus, l’utérus entiers jusqu'à 5 par plat de 60 mm, placer la capsule dans l’incubateur jusqu’en collection.
-
Collecte des embryons
- À l’aide d’une pipette de verre dessiné de main et un appareil de pipette de bouche, recueillir des blastocystes sous une dissection étendue, situé entre 25 X et 35 X. (Figure 1).
Remarque : Appareil de pipette de bouche se compose de 30-40 cm de tuyau flexible, moins de 5 mm ø int. Insérer un 1, 000 de pipette µL, pointez tout d’abord à une extrémité et d’apposer la pipette de verre dedans. Ajouter un filtre de seringue à l’autre extrémité, avec un joint 1 cc seringue, sans piston, d’agir comme un embout buccal. - Enlèvement des contenants de l’incubateur et à l’aide d’un quadrillage, examinent chaque partie du plat pour les embryons. Les embryons sont pris individuellement vers le haut et placez sur la goutte de BCM dans un plat secondaire.
- Après le rassemblement de tous les plats, laver les embryons une fois de plus une baisse des frais BCM et ensuite placer dans le plat bien 4 pour attendre l’injection.
- À l’aide d’une pipette de verre dessiné de main et un appareil de pipette de bouche, recueillir des blastocystes sous une dissection étendue, situé entre 25 X et 35 X. (Figure 1).
4. embryon Injection
- Ramasser les cellules ES individuellement avec l’aiguille d’injection basée sur la confirmation.
- Préparer un plat d’injection en ajoutant 5-7 mL des fluides d’injection (DMEM, 10 % FBS et 20 mM HEPES) à un plat en verre fond injection. Les injections sont effectuées à température ambiante.
- Microinjector un air ou huile, appliquez au vide à l’aiguille d’injection pour dessiner des cellules ES dans. Prenez soin de garder en tant que peu d’espace que possible entre les cellules. Compter les cellules ES ici, ou à l’étape de l’injection.
- Sélectionnez les cellules ES qui sont des moyennes et petites dimensions par rapport à l’ensemble de la population de cellules, avec une surface lisse et sans défauts apparents tels que les vacuoles.
Remarque : Les populations de cellules ES varient considérablement en qualité morphologique et les normes utilisées devront s’adapter avec eux.
- Injecter des embryons avec environ 15 cellules ES (Figure 1).
- Attacher une pipette holding astuce pour un deuxième microinjector d’air et un embryon près de l’ouverture du titulaire du poste. Appliquer le vide pour fixer l’embryon au titulaire.
- Réglage de l’axe z en déplaçant la pipette tenue vers le haut ou vers le bas afin que l’embryon est juste toucher la lame, suivie d’une mise au point fine sur le zona. Ensuite, ajustez l’axe Z de l’aiguille d’injection afin que les cellules ES près de la pointe sont en discussion.
- Réglez maintenant l’embryon en poussant doucement de l’aiguille d’injection en haut ou en bas, tournant pour mettre l’ICM dans la position désirée.
- Insérer l’aiguille d’injection par le zona et l’ICM ou par le trophoblaste, à l’aide d’une pression ferme mais contrôlée. Exercer une légère pression sur le microinjector de l’aiguille d’injection pour aider à empêcher le blastocèle de s’effondrer.
- Une fois l’aiguille a pénétré le blastocèle, appliquer une pression de la microinjector pour transférer les cellules ES vers le blastocèle de l’embryon. Pause brièvement comme le biseau de l’aiguille commence à sortir de l’embryon pour laisser descendre la pression dans l’embryon pour revenir à la normale, tout en conservant les cellules.
NOTE : Suite à un traditionnel ES cellules injection protocole9, prenant soin de ne pas pour toucher l’ICM, référence groupe ES des cellules ont été injectées normalement. Les cellules ES étaient aussi injectés par le biais de l’ICM, poussant l’aiguille directement grâce à l’ICM (TICM) (Figure 2film supplémentaire).
5. transfert d’eEmbryos
- Transfert des embryons de souris Swiss-Webster à E2.5, à l’aide d’un dispositif de transfert d’embryon non chirurgical, par des procédures de la manufacture. Cette procédure non-chirurgicale ne nécessite aucune anesthésie ou soins postopératoires spéciaux. Souris domestiques individuellement après le transfert d’embryons et par livraison et sevrage ultérieur.
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Representative Results
Traitement de lignée cellulaire comme l’effet aléatoire, un modèle linéaire à effets mixtes a été utilisé pour analyser les données dans le logiciel (p. ex. SAS (version 9.2)). Chaque analyse contrôlée pour le nombre d’embryons transférés et la lignée cellulaire. La deuxième analyse également contrôlée pour le nombre de chiots qui ont survécu.
Pour cette étude, chaque lignée cellulaire ES et clone a été injecté avec traditionnelles et techniques TICM, alternant entre les deux méthodes après chaque embryon. Après l’injection, embryons ont été séparés sur le plat et regroupés par transfert, généralement entre 12 et 15 embryons par destinataire femelle. Embryons qui n’ont pas un blastocèle clairement visible, manquaient une zone pellucide ou lorsque les cellules ES microinjectés n’a pas pu entrer dans le blastocoele, ont été éliminés de cette expérience.
Les premières données examinées étaient le taux de grossesse. Comme illustré à la Figure 3, les taux de grossesse étaient inchangées dans le groupe TICM appartenant au groupe témoin. En outre, une proportion égale de chiots ont survécu jusqu’au sevrage (P = 0,50, Figure 4). Plus important encore, tandis que le nombre de souris au moment du sevrage reste inchangé, le nombre de petits affichant manteau couleur chimérisme est passée de 31 % à 50 % pour le groupe TICM (p = 0,005, Figure 5). Le degré de chimérisme couleur manteau était considéré comme trop subjective pour être évalué dans cette étude et ne conviennent pas vraiment pour la lignée germinale chimérisme.
Figure 1 : équipement spécialisé. (Gauche) Installation de microscope d’injection, y compris les manipulateurs de Micro (A) et (B) cellule Tram aérien. (Droit) Appareils de pipette de bouche, avec la pipette en verre dessiné (C) (D) 1000µL de pipette, tube (E) , filtre (F) et (G) seringue en barriques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemple d’injection de blastocyste embryon. (A, B) Méthode d’injection traditionnelle, où l’aiguille d’injection passe en face de la MCI, en évitant toute interaction avec l’ICM. (C, D) Méthode TICM, là où l’aiguille d’injection rentre directement par l’intermédiaire de l’ICM en pour le blastocèle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : taux de grossesse. Le taux de grossesse ont montré aucune différence significative entre les traditionnels (39/50) et TICM (64/76). Moyennes et écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : taux de survie à. Le taux de survie est le nombre de chiots qui ont survécu jusqu’au sevrage, où il y avait une portée de sevrer. Les petits qui n’ont pas survécu au sevrage et litières où aucun chiots a survécu jusqu’au sevrage, ne figuraient pas dans ces données. Moyennes et écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : taux de chimérisme. Ces données représentent seulement le nombre si chimères produites et n’aborde pas la qualité de chimérisme. Dans le groupe traditionnel, 31 % (34/110) de la progéniture a montré chimérisme, où le groupe TICM avait une moyenne de 50 % (79/158). Moyenne et écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
On a longtemps pensé que toute perturbation de l’ICM pourrait conduire à la mortalité, en effet, les protocoles actuels de microinjection de blastocyste toujours avertissent de cette12,13. Ce que nous avons montré ici est que la microinjection par le biais de l’ICM ne nuire pas à l’embryon et augmente le rendement de chimères.
Le mécanisme exact de cet effet n’a pas été identifié. Cependant, la rupture mécanique de l’ICM et le hypoblast qui l’accompagne, devrait augmenter la fréquence d’intégration de cellules ES à l’ICM nouvellement formé après microinjection. Des travaux récents dans le domaine de la CISP a montré qu’une stimulation mécanique aide à la reprogrammation de l’iPSC humain14. Si manipulation mécanique a un effet similaire à l’ICM de l’embryon de souris, cela pourrait avoir l’effet du retour des cellules de l’ICM qui potentiellement commençait à se différencier, à un État pluripotentes, enlevant un potentiel « head start » du donneur blastocyste cellules dérivées en formant le tissu embryonnaire. Enfin, il est possible que l’injection à travers les résultats de l’ICM dans la mort d’un nombre inconnu de cellules à l’ICM, abaisser le niveau de concurrence pour la micro-injection génétiquement modifié des cellules ES.
Les principaux avantages de cette modification de la méthode sont qu’il n’exige aucun nouvel apprentissage, de dépannage ou d’équipement. Toutes les techniques portent l’injection standard blastocyste. Aussi, les étapes plus critiques restent inchangés ; collection appropriée et opportune d’embryons et les conditions appropriées de culture pour les embryons avant, pendant et après l’injection. Lorsque vous utilisez la technique de transfert d’embryon non chirurgical, il devient plus critique pour sélectionner le bon destinataires souris. Avec transferts chirurgicales, le chirurgien a eu l’occasion d’examiner la souris pour vérifier le bon état de reproduction, où les transferts non chirurgicale, ce n’est pas possible. Souris doivent être de la force de l’âge reproductif (6-9 semaines) et seules les souris avec fiches visibles doivent être utilisés. L’aspect le plus important de cette technique et toutes les injections de cellules ES, sont la qualité des cellules ES.
Lorsque traitant de haute qualité, lignées cellulaires robuste, cette technique peut donner seulement des différences minimes, mais avec ES sous-optimal des lignées cellulaires ou difficile de travailler avec des lignes, toute, même mineure améliorations, peuvent être importantes et faire la différence entre la réussite du projet et l’échec. Il est également à noter, qu’au cours de cette étude, plusieurs lignées de cellules ES disponibles dans le commerce généré germline chimères, et la quasi-totalité des lignes commerciales ES qui a généré les chimères de la lignée germinale sont les injections TICM. Ici, nous avons montré qu’un simple changement dans la technique peut entraîner une amélioration significative de productivité, sans encourir de frais supplémentaires pour les nouveaux équipements, formation ou augmentation de l’utilisation des animaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée [en partie] par le programme de recherche intra-muros de la NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Merci à Shyamal Peddada pour l’analyse statistique. Nous tiens également à remercier Humphrey Yao, Gary Bird et Yuki Arao pour l’examen de ce manuscrit et Franco dereve pour ses conseils et son soutien continus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
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