Summary
Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.
Abstract
Nel tentativo di aumentare l'efficienza nella creazione di topi geneticamente modificati tramite metodologie delle cellule di ES, presentiamo un adattamento per l'attuale protocollo di iniezione di blastocisti. Qui segnaliamo che una semplice rotazione dell'embrione e iniezione attraverso massa cellulare Trans-interno (TICM) ha aumentato la percentuale dei topi chimerici dal 31% al 50%, con nessun equipaggiamento supplementare o ulteriore formazione specialistica. inbred 26 differenti cloni, e cloni totali 35 sono stati iniettati in un periodo di 9 mesi. Non c'era differenza significativa nel tasso di recupero di embrioni o di tasso di gravidanza tra tecniche di iniezione tradizionale e TICM. Pertanto, senza alcuna alterazione principali nel processo di iniezione e un semplice posizionamento della blastocisti e iniettare attraverso l'ICM, rilasciando le cellule ES nella cavità Blastocele possa potenzialmente migliorare la quantità di produzione chimerici e successive trasmissione nella linea germinale.
Introduction
Per quasi 25 anni, la creazione di topi geneticamente mirati è stato un processo lento, spesso ostacolato da un collo di bottiglia nella fase blastocisti ES cella microiniezione per la generazione di germline trasmissione chimere. Gli avanzamenti recenti, tra cui CRISPR/Cas91,2 di targeting in cellule ES ed ES di alto-rendimento cella consorzi di generazione come KOMP, hanno migliorato la disponibilità/generazione di cellule geneticamente modificate ES. Tuttavia, la generazione di germline chimere rimane un collo di bottiglia nella creazione di topi geneticamente modificati da queste cellule ES3,4. Progetti di generazione di alto-rendimento ES cella sono stati afflitti da alta variabilità nella qualità delle cellule di ES, che è fondamentale per la riuscita creazione di chimere di germline. Inoltre, alcune delle varietà di cellula ES comunemente utilizzati sono noti per aneuploidia alta e difficile produzione di germline chimere competente5.
Sono stati sviluppati molti metodi per la creazione di topi con una chimera o superiore, o completamente delle cellule di ES derivato topi6,7,8,9,10. Mentre ciascuno di questi sistemi ha i suoi meriti, hanno anche le loro carenze. La generazione delle chimere tetraploide, mentre la generazione delle cellule di ES 100% derivato topi, è inefficiente e generalmente limitata a linee nazionali 5,6. Recensioni più recenti metodi di iniezione morula possono produrre alta percentuale chimere, prossima al 100%, ma in genere richiedono significative ulteriori apparecchiature (laser o piezo) e formazione10,11. Nei laboratori dove queste tecniche sono già in atto, questa nuova metodologia potrebbe non essere necessaria.
Obiettivo di questo studio era di trovare un metodo che utilizza tecniche comuni e prontamente disponibili attrezzature per aumentare il tasso di generazione di chimera, aumentando la probabilità di trasmissione nella linea germinale dell'allele del mutante per fondare la Colonia del mouse successiva.
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Protocol
Tutte le operazioni sono state eseguite come parte del normale funzionamento dell'impianto NIEHS Knock Out Mouse Core. Tutti i topi sono stati tenuti su un 12:12 ciclo di luce: scuro h e sono stati di alimentazione una dieta di NIH-31 e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato di uso del National Institute of Environmental Health Sciences e cura degli animali.
1. animale preparazione
- Razza di topi di donatore, B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j topi femmina a 8-10 settimane di età naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > il topo maschio/j tra 8 e 26 settimane di età. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).
- Razza destinatari topi, topi femminili tra 6 e 9 settimane di età naturalmente sono allevati per vasectomia topi maschi Swiss Webster svizzero di Webster. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).
2. preparazione delle cellule ES
- Per 129-derieved AB2.2 ES cells, cultura cellule in DMEM completate con 15% FBS, 1% glutammina, 1% Penn/strep e 0,1% β-mercaptoetanolo. Tutte le altre celle di ES secondo le istruzioni del fornitore di cellule ES, utilizzando i protocolli consigliati della coltura.
3. gruppi di raccolta
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Dissezione animale
- Preparare diversi piatti di 60 mm, circa 1 / 5 topi più 3 extra, con 10 mL collezione di granigliatura (BCM) (10% FBS IN DMEM), e un 4 piatto bene con 0,5 mL BCM per pozzetto. Equilibrare a 37 ° C, 5% CO2.
- Eutanasia B6 (Cg)-Tyr < c-2J > topi femmina/j a E3.5 usando CO2 asfissia, con una portata di 10%.
- Dopo l'eutanasia, posizionare i mouse nella posizione supina e bagnato l'addome accuratamente con etanolo al 70%.
- Fare la prima incisione attraverso la pelle solo, al punto centrale dell'addome, rendendo l'apertura più ampio possibile. Quindi aprire attraverso la parete addominale, rendendo nuovamente l'incisione più ampio possibile.
Nota: Questa operazione in due passaggi aiuta a ridurre o eliminare la contaminazione di pelliccia. - A partire da un'ovaia e che tiene il cuscinetto adiposo dell'ovaia con il forcipe smussato, rimuovere con cautela l'ovaia, ovidotto e dell'utero, prendendo cura in più per mantenere il tessuto adiposo al minimo. Rimuovere l'utero come una singola unità, o come corna individuali, con nessun cambiamento nella procedura seguente.
- Dopo la rimozione, è necessario mettere l'utero in un piatto di 60 mm contenente materiale di granigliatura collezione.
-
Rimozione di embrione
- Preparare una siringa da 10 mL riempita con BCM e misura con un ago da 25 G.
- Uno utero alla volta, rimuoverli dal piatto della holding del BCM, li asciugare su un panno per rimuovere il sangue in eccesso e mettere in un piatto di 60 mm con un basso ingrandimento microscopio per dissezione.
- Tenendo accuratamente e delicatamente l'utero appena sotto l'estremità distale (vicino l'ovidotto) con forcipe di dissezione, inserire l'ago al centro dell'utero in parallelo un aereo come possibile. Inserire l'ago appena oltre le punte della pinza.
- Applicare un po' di pressione per il forcipe per tenere l'utero per l'ago e di espellere circa 1 mL di BCM attraverso il corno dell'utero.
Nota: Deve prestare attenzione a questo punto, come troppa pressione sulla siringa causerà un flusso incontrollabile dei media, spesso lasciando il piatto. - Dopo aver sciacquato l'utero, uteri interi fino a 5 per ogni piatto di 60 mm, posizionare il piatto indietro nell'incubatore fino alla raccolta.
-
Raccolta degli embrioni
- Utilizzando una pipetta di vetro tirato a mano e un apparato di pipetta di bocca, raccogliere blastocisti in un ambito di dissezione, impostare tra 25 X e 35 X. (Figura 1).
Nota: Bocca pipetta apparato è costituito da 30-40 cm di tubo flessibile, inferiore a 5 mm I.D. Inserire un 1, punta della pipetta 000 µ l, scegliere innanzitutto a un'estremità e apporre la pipetta di vetro in esso. Aggiungere un filtro per siringa a altra estremità, con un annesso 1 cc siringa, non lo stantuffo, per agire come un pezzo di bocca. - Rimozione di piatti dall'incubatrice e utilizzando un modello di griglia, esaminare ogni parte del piatto per gli embrioni. Gli embrioni vengono raccolte fino individualmente e posizionarvi la goccia di BCM in un piatto secondario.
- Dopo aver raccolto da tutti i piatti, lavare gli embrioni ancora una volta in una goccia di BCM fresco e quindi posizionare nel piatto ben 4 in attesa di iniezione.
- Utilizzando una pipetta di vetro tirato a mano e un apparato di pipetta di bocca, raccogliere blastocisti in un ambito di dissezione, impostare tra 25 X e 35 X. (Figura 1).
4. embrione iniezione
- Pick up cellule ES individualmente con l'ago per iniezione basata sulla conferma.
- Preparare un piatto di iniezione con l'aggiunta di 5-7 mL di media di iniezione (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) per un piatto di vetro inferiore ad iniezione. Le iniezioni sono fatte a temperatura ambiente.
- Utilizzando un olio o aria microinjector, applicare il vuoto per l'inserimento dell'ago per disegnare le cellule ES in. Fare attenzione a tenere il piccolo spazio possibile tra le celle. Contare le celle ES qui, o nella fase di iniezione.
- Selezionare le celle di ES che sono medio-piccole dimensioni rispetto alla popolazione generale delle cellule, con una superficie liscia e senza difetti evidenti come vacuoli.
Nota: Le popolazioni delle cellule ES variano notevolmente nella qualità morfologiche, e gli standard utilizzati saranno necessario regolare con loro.
- Iniettare gli embrioni con circa 15 cellule ES (Figura 1).
- Allegare una pipetta di supporto punta a una seconda microinjector di aria e posizionare un embrione vicino all'apertura del titolare. Applicare il vuoto per proteggere l'embrione al titolare.
- Regolare per l'asse z spostando la pipetta di supporto verso l'alto o verso il basso così che l'embrione è solo toccare la diapositiva, seguita da una messa a fuoco fine sulla zona. Successivamente, regolare l'asse Z dell'ago per iniezione in modo che le cellule ES vicino alla punta sono a fuoco.
- Regolare l'embrione ora spingendo delicatamente dall'ago per iniezione nella parte superiore o inferiore, ruotandola per mettere l'ICM nella posizione desiderata.
- Inserire l'ago per iniezione attraverso la zona e l'ICM o il trofoblasto, utilizzando una spinta costante ma controllata. Esercitare una leggera pressione per la microinjector dell'ago per iniezione per aiutare a mantenere il Blastocele dal collasso.
- Una volta che l'ago ha penetrato il Blastocele, applicare una pressione da microinjector per trasferire le cellule ES al Blastocele dell'embrione. Pausa brevemente come la smussatura dell'ago inizia a uscire l'embrione per consentire la pressione nell'embrione di tornare alla normalità, pur mantenendo le cellule.
Nota: Le celle di riferimento gruppo ES sono state iniettate normalmente, seguendo una tradizionale ES cell iniezione protocollo9, avendo cura di non per toccare l'ICM. Le cellule ES sono state iniettate anche attraverso l'ICM, spingendo l'ago direttamente attraverso l'ICM (TICM) (Figura 2film supplementare).
5. trasferimento di eEmbryos
- Trasferire gli embrioni in topi Swiss Webster a E2.5, utilizzando un dispositivo di trasferimento di embrioni non chirurgico, per le procedure di fabbricazione. Questa procedura non chirurgica non richiede alcuna anestesia o la speciale cura post-op. Casa topi singolarmente dopo il trasferimento degli embrioni e attraverso la consegna e lo svezzamento successive.
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Representative Results
Trattamento linea cellulare come l'effetto casuale, un modello lineare di effetti misti è stato utilizzato per analizzare i dati nel software (ad es. SAS (versione 9.2)). Ogni analisi controllata per il numero di embrioni trasferiti e la linea cellulare. La seconda analisi anche controllata per il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti.
Per questo studio, ogni linea cellulare ES e clone è stato iniettato entrambi con tradizionali e tecniche TICM, alternando i due metodi dopo ogni embrione. Dopo l'iniezione, embrioni sono stati segregati sul piatto e raggruppati per trasferimento, generalmente fra 12 e 15 embrioni per donna destinatario. Gli embrioni che non hanno un Blastocele chiaramente visibile, mancava una Zona pellucida, o dove le cellule ES iniettate non riuscì ad entrare il Blastocele, sono stati eliminati da questo esperimento.
I primi dati esaminati erano il tasso di gravidanza. Come mostrato nella Figura 3, i tassi di gravidanza erano invariati nel gruppo TICM dal gruppo di controllo. Inoltre, un'uguale percentuale di cuccioli sono sopravvissuti allo svezzamento (P = 0,50, Figura 4). La cosa più importante, mentre il numero di topi allo svezzamento rimane invariato, il numero di cuccioli visualizzati da cappotto colore chimerismo aumentato dal 31% al 50% per il gruppo TICM (p = 0,005, Figura 5). Il grado di chimerismo di colore del cappotto è stato considerato troppo soggettivo per essere valutati in questo studio e non veramente rilevanti per chimerismo germinale.
Figura 1: apparecchiatura specializzata. (Sinistra) Installazione di microscopio di iniezione, tra cui manipolatori Micro (A) e (B) cella Tram aria. (A destra) Apparato di pipetta di bocca, con pipetta di vetro tirato (C) , (D) 1000 µ l punta della pipetta, tubo (E) , filtro (F) e (G) siringa in botte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempio di iniezione embrione blastocisti. (A, B) Metodo di iniezione tradizionale, dove l'ago per iniezione entra nel fronte del ICM, evitando qualsiasi interazione con l'ICM. (C, D) Metodo TICM, dove l'ago per iniezione entra direttamente attraverso l'ICM al Blastocele. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: tasso di gravidanza. Il tasso di gravidanza ha mostrato alcuna differenza significativa tra tradizionale (39/50) e TICM (64/76). Medie più errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: tasso di sopravvivenza. Il tasso di sopravvivenza è il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti allo svezzamento, dove c'era una cucciolata di svezzare. Cuccioli che non sopravvisse allo svezzamento e cucciolate dove nessun cuccioli sono sopravvissuti allo svezzamento, non sono stati inclusi in questi dati. Medie più errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: tasso di Chimerism. Questi dati rappresentano solo il numero se chimere prodotte e non riguarda la qualità del chimerism. Nel gruppo tradizionale, 31% (34/110) della prole ha mostrato chimerismo, dove il gruppo TICM ha avuto una media del 50% (79/158). Media plus errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Si è a lungo pensato che qualsiasi disturbo del ICM potrebbe portare alla mortalità, infatti, protocolli di microinjection di blastocisti correnti ancora avvertono di questo12,13. Quello che vi abbiamo mostrato qui è che microiniezione attraverso l'ICM non è dannosa per l'embrione e aumenta la resa delle chimere.
L'esatto meccanismo di questo effetto non è stato identificato. Tuttavia, la rottura meccanica del ICM e l'accompagnamento ipoblasto, dovrebbe aumentare l'incidenza di integrazione delle cellule ES la neonata ICM dopo microiniezione. Recenti lavori nel campo della iPSCs ha dimostrato che la stimolazione meccanica aiuta alla riprogrammazione di iPSC umano14. Se la manipolazione meccanica ha un effetto simile in ICM dell'embrione del mouse, potrebbe avere l'effetto di ritorno cellule del ICM che potenzialmente aveva iniziato a differenziare, torna a uno stato pluripotenti, eliminando un potenziale 'head start' del donatore blastocisti cellule derivate nella formazione di tessuto embrionale. Infine, è possibile che l'iniezione attraverso i risultati ICM nella morte di un numero imprecisato di cellule in ICM, abbassando il livello di concorrenza per l'iniettati geneticamente modificato cellule ES.
I principali vantaggi di questo metodo di modifica sono che non richiede nuovo apprendimento, risoluzione dei problemi o attrezzature. Tutte le tecniche di riporto da iniezione standard blastocisti. Le fasi più critiche rimangono invariati; corretta e tempestiva raccolta di embrioni e condizioni di coltura adeguato per gli embrioni prima, durante e dopo l'iniezione. Quando si utilizza la tecnica di trasferimento dell'embrione non-chirurgico, lo fa diventare più critico per selezionare il destinatari corretto topi. Con trasferimenti chirurgici, il chirurgo ha avuto l'opportunità di esaminare il mouse per verificare il corretto stato riproduttivo, dove con i trasferimenti non chirurgica, non è possibile. Topi dovrebbero essere privilegiata età riproduttiva (6-9 settimane) e devono essere utilizzati solo topi con spine visibili. L'aspetto più importante di questa tecnica e tutte le iniezioni di cellule ES, sono la qualità delle cellule ES.
Quando si occupano di alta qualità, robusto di cellula, questa tecnica può solo minime differenze di resa, ma con ES suboptimale linee cellulari o difficoltà a lavorare con linee, uno qualsiasi, anche minori miglioramenti, può essere significativo e fare la differenza tra il successo del progetto e il fallimento. È anche da notare, che nel corso di questo studio, diverse linee di cellule ES commercialmente disponibile generato germline chimere, e quasi tutte le linee di ES commerciale che ha generato le chimere di germline erano iniezioni TICM. Qui abbiamo indicato che un semplice cambiamento nella tecnica può comportare un miglioramento significativo della produttività, senza incorrere in alcun costo aggiuntivo per le nuove attrezzature, formazione o aumento dell'uso di animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta [in parte] dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Si ringrazia Shyamal Peddada per l'analisi statistica. Desideriamo anche ringraziare Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao per la revisione di questo manoscritto e Franco DeMayo per il suo continuo supporto e consulenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
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