Summary
Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.
Abstract
En un esfuerzo por aumentar la eficiencia en la creación de ratones modificados genéticamente a través de metodologías ES celular, presentamos una adaptación del protocolo actual de inyección de blastocisto. Aquí divulgamos que una simple rotación del embrión y de la inyección a través de la masa celular de Trans-interno (TICM) aumentó el porcentaje de ratones quiméricos del 31% al 50%, con ningún equipo adicional o formación más especializada. endogámicas de 26 diferentes clones y clones total 35 fueron inyectados en un período de 9 meses. No hubo diferencias significativas en la tasa de embarazo o índice de recuperación de embriones entre técnicas de inyección tradicional y TICM. Por lo tanto, sin ninguna alteración importante en el proceso de inyección y un simple posicionamiento del blastocisto e inyectar a través del ICM, liberación de las células madre embrionarias en la cavidad del blastocoel puede mejorar potencialmente la cantidad de producción quimérica y posterior transmisión de la línea germinal.
Introduction
Durante casi 25 años, la creación de ratones genéticamente apuntados ha sido un proceso lento, a menudo obstaculizado por un cuello de botella en la etapa de blastocistos ES células microinyección para la generación de germline transmisión de quimeras. Los avances recientes, incluyendo CRISPR/Cas91,2 en células madre embrionarias y de alto rendimiento ES célula consorcios de generación como KOMP, han mejorado la generación y disponibilidad de modificados genéticamente células madre embrionarias. Sin embargo, la generación de quimeras del germline sigue siendo un cuello de botella en la creación de ratones modificados genéticamente de estas células ES3,4. Proyectos de generación de alto rendimiento ES la célula han estado plagados de alta variabilidad en la calidad de células ES, que es crítica para la exitosa creación de quimeras del germline. Además, algunas de las líneas de células ES comúnmente utilizadas son conocidos por aneuploidia alta y la difícil producción de germline quimeras competentes5.
Muchos métodos se han desarrollado para la creación de ratones con una quimera o superior, o totalmente celular ES derivado ratones6,7,8,9,10. Mientras que cada uno de estos sistemas tiene sus propios méritos, también tienen sus defectos. La generación de quimeras tetraploides, mientras que la generación de celulares ES de 100% derivados de ratones, es ineficiente y generalmente limitado a líneas exogámica 5,6. Más nuevos métodos de inyección de mórula pueden producir alto porcentaje quimeras, cercana al 100%, pero generalmente requieren equipo adicional significativa (láser o piezoeléctricos) y capacitación10,11. En laboratorios donde estas técnicas ya están en marcha, esta nueva metodología puede no ser necesaria.
Objetivo de este estudio fue encontrar un método que utiliza técnicas comunes y equipos disponibles para aumentar la velocidad de generación de quimera, aumentando la posibilidad de transmisión del germline del alelo del mutante para establecer la colonia de ratón posterior.
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Protocol
Todas las operaciones se realizaron como parte del funcionamiento normal de la instalación de NIEHS Knock Out Mouse base. Todos los ratones fueron mantenidos en un 12:12 ciclo de h luz: oscuridad y se alimentan una dieta de agua y NIH-31 ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados según el cuidado Animal y Comité de uso del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental.
1. animal preparación
- Raza de ratones donantes, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos/j 8-10 semanas de edad naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratones machos entre 8 y 26 semanas de edad. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).
- Se crían ratones receptores, Swiss Webster ratones hembra entre 6 y 9 semanas de edad se crían naturalmente a vasectomía ratones machos Swiss Webster. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).
2. ES la célula preparación
- Para derieved 129 AB2.2 ES cells, cultura células en DMEM suplementado con 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/strep y 0.1% β-mercaptoetanol. Cultura todas las células de otras ES siguiendo las instrucciones del proveedor de celular ES, utilizando los protocolos recomendados.
3. embrión colección
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Disección de animales
- Preparar varios platos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratones más suplemento 3, con 10 mL ráfaga colección los medios de comunicación (BCM) (10% FBS en DMEM), y un 4 plato bien con 0.5 mL de BCM por pozo. Equilibrar a 37 ° C, 5% CO2.
- Eutanasia a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos /J en E3.5 CO2 asfixia, con un caudal de 10%.
- Después euthanizing, coloque el ratón en la posición supina y mojado el abdomen con etanol al 70%.
- Hacer la primera incisión a través de la piel, en el punto medio del abdomen, haciendo la apertura tan amplia como sea posible. A continuación abra a través de la pared abdominal, otra vez hacer la incisión lo más amplia posible.
Nota: Hacerlo en dos pasos ayuda a reducir o eliminar la contaminación de la piel. - A partir de un ovario y sostiene la almohadilla grasa del ovario con fórceps romos, retire con cuidado el ovario, oviducto y útero, teniendo mucho cuidado para mantener el tejido adiposo a un mínimo. Extirpar el útero como una sola unidad, o como los cuernos, sin cambio en el procedimiento siguiente.
- Después del retiro, colocar el útero en un plato de 60 mm que contiene medios de colección ráfaga.
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Eliminación de embriones
- Preparar una jeringa de 10 mL llenada de BCM y montar con una aguja de 25 G.
- Un útero a la vez, les quite el plato de sujeción de BCM, seque en un paño para quitar el exceso de sangre y coloque en un plato de 60 mm con un aumento bajo microscopio de disección.
- Sujetando con cuidado y suavemente del útero justo por debajo del extremo distal (cerca del oviducto) con pinzas de disección, inserte la aguja en el centro del útero en como paralelo un plano como sea posible. Insertar la aguja más allá de las puntas de las pinzas.
- Aplicar presión a las pinzas para sujetar el útero a la aguja y expulsar aproximadamente 1 mL de BCM a través del cuerno del útero.
Nota: Debe tenerse cuidado en este paso, ya que demasiada presión sobre la jeringa causará un flujo incontrolable de los medios de comunicación, a menudo dejando el plato. - Después del lavado del útero, útero entero hasta 5 por plato 60 mm, vuelva a colocar el plato en la incubadora hasta la colección.
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Colección de embriones
- Utilizando una pipeta de cristal dibujado de la mano y un aparato de pipetas de boca, recoger blastocistos en un ámbito de disección, entre 25 X y 35 X. (Figura 1).
Nota: Aparato de pipetas de boca consta de 30-40 cm de tubería flexible, menores de 5 mm de diámetro interior Inserte un 1 000 μl Punta de pipeta, punto primero en un extremo y colocar la pipeta de vidrio en él. Agregar un filtro de jeringa en el otro extremo, con un atado 1 cc jeringa barril, sin émbolo, a actuar como una pieza de la boca. - Eliminar platos de la incubadora y usando un patrón cuadriculado, examinaron cada parte del plato para embriones. Embriones se recogen hasta individualmente y coloque sobre la gota de BCM en un plato secundario.
- Después de recoger de todos los platos, lavar los embriones una vez más en una gota de dulce BCM y luego colocar en el plato bien 4 a la espera de la inyección.
- Utilizando una pipeta de cristal dibujado de la mano y un aparato de pipetas de boca, recoger blastocistos en un ámbito de disección, entre 25 X y 35 X. (Figura 1).
4. embrión inyección
- Recoger células madre embrionarias individualmente con la aguja de inyección basada en la confirmación.
- Preparar un plato de inyección mediante la adición de 5-7 mL de medio de inyección (DMEM, 10% FBS y 20 mM HEPES) a un plato de inyección de fondo de cristal. Las inyecciones se realizan a temperatura ambiente.
- Uso microinyector aire o aceite, aplique vacío a la aguja para extraer células madre embrionarias. Tenga cuidado de mantener como poco espacio como sea posible entre las células. Cuentan las células ES aquí o en la etapa de inyección.
- Seleccione las celdas ES que son de mediano a pequeño tamaño en comparación con la población en general de las células, con una superficie lisa y sin defectos obvios como las vacuolas.
Nota: Poblaciones celulares ES varían mucho en calidad morfológica, y las normas utilizadas tendrán que ajustar con ellos.
- Inyectar los embriones con aproximadamente 15 células madre embrionarias (figura 1).
- Colocar una pipeta de sujeción punta un microinyector segundo de aire y coloque un embrión cerca de la abertura del titular. Se aplica vacío para sujetar el embrión al titular.
- Ajuste para el eje z moviendo la pipeta holding hacia arriba o hacia abajo para que el embrión apenas toca la diapositiva, seguida de concentración de la multa en la zona. A continuación, ajuste el eje Z de la aguja de inyección para que células madre embrionarias cerca de la punta están en foco.
- Ajuste el embrión ahora empujando suavemente de la aguja de inyección en la parte superior o inferior, girando para poner el ICM en la posición deseada.
- Inserte la aguja a través de la zona y el ICM o trofoblasto, usando una presión firme pero controlada. Aplicar una ligera presión a la microinyectora de la aguja de inyección para ayudar a mantener el blastocoel de derrumbarse.
- Una vez que la aguja ha penetrado el blastocoel, aplicar presión de la microinyectora para transferir células madre embrionarias para el blastocoel del embrión. PAUSE brevemente como el bisel de la aguja empieza a salir el embrión para permitir la presión en el embrión para volver a la normalidad, al tiempo que conserva las células.
Nota: Referencia grupo células madre embrionarias fueron inyectados normalmente, siguiendo un tradicional ES la célula de inyección protocolo9, teniendo cuidado de no para tocar el ICM. También se inyectaron células madre embrionarias a través del ICM, empuja la aguja directamente a través de la ICM (TICM) (figura 2película suplementario).
5. transferencia de eEmbryos
- Transferencia de embriones de ratones Swiss Webster en E2.5, utilizando un dispositivo de transferencia embrionaria no quirúrgica, por procedimientos de fabricación. Este procedimiento no quirúrgico no requiere anestesia ni cuidados especiales después de la operación. Ratones de la casa individualmente después de la transferencia de embriones y a través de la entrega y posterior al destete.
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Representative Results
Tratamiento de la línea celular como el efecto aleatorio, un modelo lineal de efectos mixtos se utilizó para analizar los datos en el software (e.g. SAS (versión 9.2)). Cada análisis para el número de embriones transferidos y la línea celular. El segundo análisis también controlado por el número de cachorros que sobrevivieron.
Para este estudio, cada línea ES celular y el clon fue inyectado con tradicionales y técnicas TICM, alternando entre los dos métodos después de cada embrión. Después de la inyección, los embriones fueron separados en el plato y agrupados por transferencia, generalmente entre 12 y 15 embriones por hembra receptora. Embriones que no tenía una visible blastocoel, carecía de una Zona pelúcida, o donde las células ES microinyectadas ha podido entrar el blastocoel, se eliminaron de este experimento.
Los primeros datos examinados fueron la tasa de embarazo. Como se muestra en la figura 3, las tasas de embarazo fueron inalteradas en el grupo TICM desde el grupo de control. Además, sobrevivió a una proporción de crías al destete (P = 0.50, figura 4). Lo más importante, mientras que el número de ratones al destete permanece sin cambios, el número de crías mostrando capa color chimerism aumentó de 31% a 50% para el grupo TICM (p = 0.005, figura 5). El grado de quimerismo de color de capa era considerado demasiado subjetiva para ser evaluados en este estudio y no verdaderamente relevante a quimerismo de línea germinal.
Figura 1: equipos especializados. (Izquierda) Configuración del microscopio de inyección, como manipuladores de Micro (A) y (B) célula tranvía aire. (Derecha) Aparato de pipetas de boca, con pipeta de vidrio estirado (C) , (D) 1000μl pipeta, tubo (E) , filtro (F) y (G) jeringa de barril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplo de inyección de embrión blastocisto. (A, B) Método de inyección tradicional, donde la aguja entra en frente del ICM, evitando cualquier interacción con el ICM. (C, D) Método del TICM, donde la aguja entra directamente a través del ICM al blastocoel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: tasa de embarazo. La tasa de embarazo no mostró diferencias significativas entre el tradicional (39/50) y TICM (64/76). Medias y error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: tasa de supervivencia. La tasa de supervivencia es el número de crías que sobrevivieron hasta el destete, donde había una camada de destetar. Que no sobreviven al destete los cachorros y camadas donde no sobrevivieron crías al destete, no se incluyeron en estos datos. Medias y error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: tasa de Chimerism. Estos datos sólo representan el número si quimeras producción y no responde a la calidad de quimerismo. En el grupo tradicional, 31% (34/110) de la descendencia demostraron chimerism, donde el grupo TICM tuvo un promedio de 50% (79/158). Promedio y error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante mucho tiempo se ha pensado que cualquier disturbio del ICM podría conducir a la mortalidad, de hecho, los protocolos actuales de microinyección blastocisto todavía advierten de esta12,13. Lo que hemos mostrado aquí es la microinyección a través de la RIC no es perjudicial para el embrión y aumenta la producción de quimeras.
El mecanismo exacto de este efecto no ha sido identificado. Sin embargo, la interrupción mecánica del ICM y el hipoblasto que lo acompaña, debe aumentar la incidencia de la integración de células ES en el ICM recién formado tras microinyección. Trabajos recientes en el campo de iPSCs ha demostrado que estímulo mecánico ayuda a la reprogramación de iPSC humana14. Si la manipulación mecánica tiene un efecto similar en el ICM del embrión de ratón, podría tener el efecto de volver las células de la ICM que potencialmente se empezó a diferenciar, a un estado pluripotente, eliminando un potencial 'head start' del donante blastocisto células derivadas en la formación del tejido embrionario. Por último, es posible que la inyección a través de los resultados ICM en la muerte de un número desconocido de células en el ICM, bajar el nivel de competencia para el microinyectados genéticamente modificado células madre embrionarias.
Los principales beneficios de la modificación de este método son que no requiere de nuevos aprendizajes, resolución de problemas o equipo. Todas las técnicas se transportan de inyección estándar de blastocistos. Los pasos más críticos también permanecen inalterados; adecuada y oportuna colección de embriones y las condiciones de cultivo adecuado para los embriones, antes, durante y después de la inyección. Cuando se utiliza la técnica de transferencia embrionaria no quirúrgica, es más crítico para seleccionar los ratones receptores adecuados. Con las transferencias de quirúrgicas, el cirujano tuvo la oportunidad de examinar el ratón para comprobar el correcto estado reproductivo, donde con las transferencias no-quirúrgico, esto no es posible. Ratones deben ser privilegiada edad de procrear (6-9 semanas) y deben utilizarse solamente ratones con enchufes visibles. El aspecto más importante de esta técnica e inyecciones de células ES todos, es la calidad de las células madre embrionarias.
Cuando tratando con alta calidad, líneas celulares sólidas, esta técnica puede rendir sólo mínimas diferencias, pero con ES subóptima de células o difícil de trabajar con líneas, cualquiera, incluso menores de mejoras, puede ser significativa y hacer la diferencia entre el éxito del proyecto y el fracaso. También es de nota, que en el transcurso de este estudio, varias líneas de celulares disponibles en el mercado ES generan del germline quimeras, y casi todas las líneas ES comerciales que genera quimeras del germline las inyecciones TICM. Aquí hemos demostrado que un simple cambio en la técnica puede resultar en una mejora significativa en la productividad, sin incurrir en costes adicionales para el equipo nuevo, entrenamiento o aumentar el uso de animales.
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Disclosures
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada [en parte] por el programa de investigación intramuros del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental. Agradecimiento especial a Shyamal Peddada para el análisis estadístico. También queremos agradecer a Humphrey Yao, Gary Ave y Yuki Arao para la revisión de este manuscrito y Franco DeMayo por su continuo apoyo y asesoramiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
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