Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att öka chimera produktionen utan användning av ny utrustning. En enkel orientering förändring av embryot injektionsvätska kan öka antalet embryon produceras, och eventuellt minska tidslinjen till könsceller överföring.
Abstract
I ett försök att öka effektiviteten i skapandet av genetiskt modifierade möss via ES Cell metoder, presenterar vi en anpassning till aktuella blastocysten injektion protokollet. Här rapportera vi att en enkel rotation av embryot, och injektion genom Trans-inre cellmassan (TICM) ökade andelen chimära möss från 31% till 50%, utan extra utrustning eller ytterligare specialiserad utbildning. 26 olika inavlade kloner och 35 totala kloner injicerades under 9 månader. Det var ingen signifikant skillnad i antingen dräktighetsfrekvens eller återvinningsgrad av embryon mellan traditionella injektionsteknik och TICM. Därför, utan någon större förändring i injektionsprocessen och en enkel positionering av blastocysten och injicera genom ICM, släppa de ES-cellerna i hålighet blastocoel kan potentiellt förbättra mängden chimära produktion och efterföljande könsceller överföring.
Introduction
För nästan 25 år varit skapandet av genetiskt målinriktat möss en långsam process, ofta hämmas av en flaskhals i blastocyster ES cellstadie Mikroskop för generering av könsceller överföra chimärer. Senaste framsteg, inklusive CRISPR/Cas91,2 inriktning i ES-celler och hög genomströmning ES cellen generation konsortier som KOMP, har förbättrat generation/tillgängligheten av genetiskt modifierade ES-celler. Generering av könsceller chimärer är dock fortfarande en flaskhals att skapa genmodifierade möss från dessa ES celler3,4. Hög genomströmning ES cell generation projekt har plågats av hög variation i ES cell kvalitet, vilket är avgörande för framgångsrik skapandet av könsceller chimärer. Dessutom är några av de vanligaste utnyttjad ES cell linjerna kända för hög aneuploidi och svåra produktion av könsceller behöriga chimärer5.
Många metoder har utvecklats för att skapa möss med antingen en högre chimär eller helt ES cellen härlett möss6,7,8,9,10. Medan varje system har sina egna meriter, har de också sina brister. Generering av gräsart chimärer, medan generera 100% ES cellen härlett möss, är ineffektiva och i allmänhet begränsade till utkonkurrerat dö ut linjerna 5,6. Nyare metoder för injicering morula kan ge en hög andel chimärer, närmar sig 100%, men kräver i allmänhet betydande extra utrustning (lasrar eller piezos) och utbildning10,11. I laboratorier där dessa tekniker är redan på plats, kan denna nya metod inte vara nödvändigt.
Detta studiens syfte var att hitta en metod som använder vanliga tekniker och lättillgänglig utrustning för att öka graden av chimera generation, ökar risken för könsceller överföring av den muterade allelen att upprätta efterföljande mus kolonin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla operationer utfördes som en del av den normala driften av anläggningen NIEHS slå ut musen Core. Alla möss hölls på en 12:12 h ljus: mörk cykel, och var foder en diet av NIH-31 och vatten ad lib. Alla experimenten utfördes enligt djur vård och användning kommittén av det nationella institutet för Environmental Health Sciences.
1. animaliskt förberedelse
- Föder upp givaren möss, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J honmöss vid 8-10 veckors ålder naturligt till B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J hanmöss mellan 8 och 26 veckors ålder. Kontrollera pluggar visuellt följande morgon (E0.5).
- Föder upp mottagarens möss, schweiziska Webster honmöss mellan 6 och 9 veckors ålder föds naturligt till vasektomerade schweiziska Webster hanmöss. Kontrollera pluggar visuellt följande morgon (E0.5).
2. ES Cell förberedelse
- För 129-derieved AB2.2 ES-celler, kultur celler DMEM kompletteras med 15% FBS, 1% glutamin, 1% Penn/strep och 0,1% β-merkaptoetanol. Kultur alla andra ES-celler per ES cell leverantörens instruktioner, med deras rekommenderade protokoll.
3. embryosamlingsgrupper
-
Djur dissektion
- Förbereda flera 60 mm rätter, ca 1 per 5 möss plus 3 extra, med 10 mL blast samling media (BCM) (10% FBS i DMEM), och en 4 väl skålen med 0,5 mL BCM per brunn. Jämvikta vid 37 ° C, 5% CO2.
- Euthanize B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J honmöss vid E3.5 med CO2 kvävning, med en flödeshastighet av 10%.
- Efter euthanizing, placera möss i ryggläge och blöt buk noggrant med 70% etanol.
- Gör det första snittet genom huden endast vid mittpunkten av buken, att göra öppningen så bred som möjligt. Nästa öppna genom bukväggen, återigen gör snittet så bred som möjligt.
Obs: Gör detta i två steg hjälper till att minska eller eliminera päls kontaminering. - Börjar på en äggstock, och hålla fettet pad av äggstocken med trubbig pincett, ta försiktigt bort den äggstockarna och äggledaren livmodern, tar extra omsorg för att hålla fettvävnaden till ett minimum. Ta bort livmodern som en enda enhet eller som enskilda horn, med ingen förändring i följande procedur.
- Efter avlägsnande, placera livmodern i en 60 mm maträtt som innehåller blast samling media.
-
Embryo borttagning
- Förbered en 10 mL spruta fylld med BCM och passar med en 25 G nål.
- En livmoder i taget, ta bort dem från jordbruksföretaget skålen av BCM, torka dem på en vävnad att ta bort överflödigt blod, och placera i en 60 mm maträtt i en låg förstoring dissekera mikroskopet.
- Håll noga och försiktigt livmodern precis under den distala änden (nära i äggledaren) med dissekera tången och för in nålen i till mitten av livmodern i som parallell ett plan som möjligt. Stick in nålen strax bortom tips av tången.
- Använda vissa påtryckningar på tången att hålla livmodern på nålen, och utvisa ungefär 1 mL av BCM genom livmodern horn.
Obs: Måste vara försiktig i detta steg, eftersom för mycket tryck på sprutan kommer att orsaka en okontrollerbar ström av media, ofta lämnar skålen. - Efter spolning livmodern, upp till 5 hela livmödrar per 60 mm maträtt, placera skålen tillbaka i inkubatorn tills samlingen.
-
Embryosamlingsgruppen
- Använda handen ritade glas pipett och en mun pipett apparatur, samla blastocyster under en dissekera omfattning, mellan 25 X och 35 X. (Figur 1).
Obs: Mun pipett apparater består av 30-40 cm på flexibel slang, under 5 mm I.D. Infoga en 1, 000 µL pipettspetsen, peka först i ena änden och anbringa glas pipetten i den. Lägga till ett filter i sprutan till den andra änden, med en bifogad 1 cc spruta fat, ingen kolven, att agera som ett munstycke. - Ta bort rätter ur ruvmaskinen, och använder ett rutmönster, undersöka varje del av skålen för embryon. Embryon plockas upp individuellt och placera på släpp av BCM i en sekundär maträtt.
- Efter insamling från alla rätter, tvätta embryona gång i en droppe av färska BCM och placera i 4 väl skålen att invänta injektion.
- Använda handen ritade glas pipett och en mun pipett apparatur, samla blastocyster under en dissekera omfattning, mellan 25 X och 35 X. (Figur 1).
4. embryot injektion
- Plocka upp ES-celler individuellt med injektionsnålen baserat på bekräftelse.
- Förbereda en injektion maträtt genom att tillsätta 5-7 mL injektion media (DMEM, 10% FBS och 20 mM HEPES) till ett glas botten injektion maträtt. Injektioner görs vid rumstemperatur.
- Använd antingen luft eller olja microinjector applicera vakuum injektionsnålen Rita ES-celler. Var noga med för att hålla så lite plats som möjligt mellan celler. Räkna de ES-cellerna här eller vid injektion steg.
- Välj ES-celler som är medelstora till små i storlek jämfört med den allmänna befolkningen av celler, med en slät yta och utan uppenbara defekter såsom vakuoler.
Obs: ES cellpopulationer varierar kraftigt i morfologiska kvalitet, och de standarder som används kommer att behöva justera med dem.
- Injicera embryon med cirka 15 ES-celler (figur 1).
- Bifoga en anläggning pipett spets till en andra luft-microinjector, och placera ett embryo nära öppnandet av innehavaren. Tillämpa vakuum för att säkra embryot till innehavaren.
- Justera för z-axeln genom att flytta anläggningen pipetten upp eller ned så att embryot bara Vidrör bilden följt av fina inriktning på zona. Nästa, justera Z-axeln av injektionsnålen så att ES-celler nära spetsen är i fokus.
- Justera embryot nu genom att försiktigt trycka från injektionsnålen på toppen eller botten, vrida den för att sätta ICM i önskad position.
- In injektionsnålen genom zona, och antingen ICM eller trofoblaster, använder en fast men kontrollerade push. Applicera ett lätt tryck till microinjector av injektionsnålen för att hålla blastocoel från att kollapsa.
- När nålen har trängt in i blastocoel, utöva påtryckningar från microinjector att överföra ES-celler till blastocoel av embryot. Gör en kort paus som fasning av nålen börjar att avsluta embryot så att trycket i embryot att återgå till det normala, samtidigt behålla cellerna.
Obs: Referens grupp ES-celler injicerades normalt, efter en traditionell ES cell injektionen protokoll9, noga med att inte röra ICM. ES-celler injicerades också genom ICM, trycker in nålen direkt genom den ICM (TICM) (figur 2kompletterande film).
5. överföring av eEmbryos
- Överföra embryon till schweiziska Webster möss vid E2.5, med en icke-kirurgisk embryo transfer enhet, per tillverkarens förfaranden. Denna icke-kirurgiska ingrepp kräver ingen anestesi eller särskild post-op vård. Hus möss individuellt efter överföring av embryon, och genom leverans och efterföljande avvänjning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling av cell-linjen som den slumpmässiga effekten, användes blandade effekter linjär modell för att analysera data i programvaran (t.ex. SAS (version 9.2)). Varje analys som kontrolleras för antalet embryon överförts och cellinje. Den andra analysen också kontrolleras för antalet valpar som överlevde.
För denna studie, varje ES cellinje och klon injicerades både med traditionella och TICM tekniker, alternerande mellan de två metoderna efter varje embryo. Efter injektionen var embryon segregerade på skålen och grupperade efter överföring, vanligtvis mellan 12 och 15 embryon per mottagare hona. Embryon som inte har en klart synlig blastocoel, saknade en Zona pellucida eller där de microinjected ES-cellerna strandat till gå in blastocoel, avlägsnades från detta experiment.
De första uppgifterna som undersöktes var dräktighetsfrekvens. Som visas i figur 3, var graviditet oförändrat i gruppen TICM från kontrollgruppen. Dessutom en lika stor andel valpar överlevde till avvänjning (P = 0,50, figur 4). Viktigast av allt, medan antalet möss vid avvänjning förblir oförändrat, antalet valpar visar päls färg chimärism ökade från 31% till 50% för den TICM gruppen (p = 0,005, figur 5). Graden av päls färg chimärism ansågs alltför subjektiva utvärderas i denna studie, och inte riktigt relevant för könsceller chimärism.
Figur 1: specialiserad utrustning. (Vänster) Injektion Mikroskop installationen, inklusive (A) Micro manipulatorer och (B) Cell spårvagn luft. (Höger) Munnen pipett apparater, med (C) ritade glas pipett, (D) 1000µL pipettspetsen, (E) slangar, (F) Filter och (G) spruta fat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på blastocyst embryon injektion. (A, B) Traditionella injektion metod, där injektionsnålen in mittemot av ICM, undvika interaktion med ICM. (C, D) TICM metod, där injektionsnålen kommer in direkt genom ICM i att blastocoel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: dräktighetsfrekvens. Den dräktighetsfrekvens visade ingen signifikant skillnad mellan traditionella (39/50) och TICM (64/76). Medelvärden plus standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: överlevnaden. Överlevnaden är antalet valpar som överlevde till avvänjning, där det fanns en kull att avvänja. Ungar som inte överlevde till avvänjning, samt kullar där inga ungar överlevde till avvänjning, ingick inte i dessa uppgifter. Medelvärden plus standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: chimärism rate. Dessa data representerar endast numret chimärer som produceras, och behandlar inte kvaliteten på chimärism. I den traditionella gruppen visade 31% (34/110) av avkomman chimärism, där gruppen TICM hade ett genomsnitt på 50% (79/158). Genomsnitt plus standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har länge tänkt att störningar på ICM kan leda till dödlighet, i själva verket nuvarande blastocysten Mikroskop protokoll varnar fortfarande för denna12,13. Vad vi har här visas som Mikroskop genom ICM är inte skadligt för embryot, och ökar avkastningen av chimärer.
Den exakta mekanismen för denna effekt har inte identifierats. Mekaniska störningar av ICM, och den medföljande hypoblast, bör dock öka incidensen av ES cell integrering i den nybildade ICM efter Mikroskop. Senaste arbete inom iPSCs har visat att mekanisk stimulering hjälper omprogrammering av mänskliga iPSC14. Om mekanisk manipulation har en liknande effekt i ICM mus embryot, kunde det ha effekten av återvänder celler av ICM som potentiellt hade börjat skilja, tillbaka till pluripotenta tillstånd, att ta bort en potentiell 'head start' av den blastocyst givaren härledda celler bilda embryonala vävnaden. Slutligen är det möjligt att injektionen genom ICM resultaten i döden av ett okänt antal celler i ICM, sänka nivån av konkurrens för den microinjected genetiskt modifierade ES-celler.
Primära fördelarna med denna metod ändring är att den kräver inga nya lärande, felsökning eller utrustning. Alla tekniker föra över från standard blastocysten injektion. De mest kritiska steg också oförändrade; korrekt och snabb insamling av embryon och rätt odlingsbetingelser för embryon före, under och efter injektion. När du använder den icke-kirurgiska embryo transfer tekniken, blir det viktigare att välja rätt mottagare möss. Med kirurgiska överföringar, kirurgen hade tillfälle att undersöka musen för att kontrollera korrekt reproduktiv stat, där med icke-kirurgiska överföringar, är detta inte möjligt. Möss bör prime reproduktiv ålder (6-9 veckor) och endast möss med synliga pluggar ska användas. Den viktigaste aspekten av denna teknik, och alla ES cell injektioner, är kvaliteten på de ES-cellerna.
När du arbetar med hög kvalitet, robust cellinjer, denna teknik kan ge endast minimala skillnader, men med suboptimal ES cellinjer eller svårt att arbeta med linjer, någon, ännu mindre förbättringar, kan vara betydande och gör skillnaden mellan framgångsrika projekt och misslyckande. Det är också att notera, att under loppet av denna studie, flera kommersiellt tillgängliga ES cellinjer genereras könsceller chimärer, och nästan alla kommersiella ES linjer som genererade könsceller chimärer var TICM injektioner. Här har vi visat att en enkel förändring av tekniken kan resultera i en signifikant förbättring i produktivitet, utan att ådra sig några ytterligare kostnader för ny utrustning, utbildning och ökad användning av djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds [delvis] av intramurala forskningsprogrammet i NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Speciellt tack till Shyamal Peddada för statistisk analys. Vi vill också tacka Humphrey Yao, Gary fågelarter och Yuki Arao för granskning av detta manuskript och Franco DeMayo för hans fortsatta stöd och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
