Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatisert måling av Cryptococcal arter polysakkarid kapsel og celle kroppen

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Denne teknikken beskriver en automatisert bakst image prosessor designet for å måle polysakkarid kapsel og kroppen radier. Mens opprinnelig utformet for Cryptococcus neoformans kapsel målinger automatisert bildeprosessoren kan også brukes til andre kontrast basert påvisning av sirkulære objekter.

Abstract

Formålet med denne teknikken er å gi en konsekvent, nøyaktig og håndterlig prosess for store tall av polysakkarid kapsel målinger.

Først er en terskel bildet generert basert på intensitetsverdiene unikt beregnes for hvert bilde. Deretter oppdages sirkler basert på kontrast mellom objekt og bakgrunnen med veletablerte sirkel Hough transformasjon (CHT) algoritmen. Endelig oppdaget celle kapsler og organer matches center koordinater og radius størrelse, og dataene eksporteres til brukeren i et håndterlig regneark.

Fordelene med denne teknikken er enkelt men betydelig. Først, fordi disse beregningene utføres av en algoritme i stedet for et menneske både nøyaktighet og pålitelighet er økt. Det er ingen nedgang i nøyaktighet eller pålitelighet uansett hvor mange eksempler er analysert. Andre etablerer denne tilnærmingen en potensiell standard prosedyre for feltet Cryptococcus i stedet for dagens situasjon der kapsel måling varierer av lab. Tredje, gitt at manuelle kapsel målinger er langsom og ensformig, automatisering kan rask målene på store mengder gjærceller som igjen muliggjør høy gjennomstrømning dataanalyse og stadig kraftigere statistikk.

De store begrensningene av denne teknikken kommer fra hvordan funksjonene algoritme. Først genererer algoritmen bare sirkler. Mens Cryptococcus celler og deres kapsler tar på en sirkulær morfologi, ville det være vanskelig å bruke denne teknikken til ikke-sirkulært objekt gjenkjenning. Andre, på grunn av hvordan sirkler oppdages CHT algoritmen kan oppdage enorme pseudo sirkler basert på ytre kant av flere gruppert sirkler. Men kan noen uriktig fremstilling cellen legemer fanget i pseudo sirkelen lett oppdaget og fjernet fra de resulterende datasettene.

Denne teknikken er ment for å måle sirkulær polysakkarid kapsler Cryptococcus arter basert på tusj lyse feltet mikroskopi; men det kan brukes til basert andre kontrast sirkulær objektet målinger.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cryptococcus neoformans er en sykdomsfremkallende gjær funnet overalt rundt om i verden som er tilknyttet for menneskelig sykdom i svekket immunapparat populasjoner. C. neoformans særlig utgjør en vesentlig årsak til totale årlige dødsfall i Sahara på grunn av infeksjonssykdommer1. Store klinisk manifestasjonen av cryptococcal infeksjon er meningoencefalitt, som følger invasjonen av sentralnervesystemet av transport i infiserte makrofager (trojansk hest måte) eller direkte krysset av blod - hjerne barrieren. C. neoformans uttrykker virulens-faktorer som inkluderer evnen å replikere på menneskekroppen temperatur, urease aktivitet, melanization og dannelsen av en polysakkarid kapsel2. Polysakkarid kapsel består av gjentatte glucuronoxylomannan og glucoronoxylomannangalactan polymerer og funksjoner som en beskyttende barriere mot kjønnsbasert miljøbelastning og vert immunreaksjoner2.

Selv om størrelsen på cryptococcal polysakkarid kapsel størrelsen ikke konsekvent er knyttet til virulens, er det bevis for at det er en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Kapsel størrelse er forbundet med meningitt patologi6, kan påvirke macrophage muligheten til å kontrollere Cryptococcus infeksjon5og kan resultere i tap av virulens hvis fraværende8. Derfor kapsel størrelse mål er vanlig i cryptococcal forskning, men det er ingen fieldwide standard for en metode for kapsel måling.

Foreløpig C. neoformans polysakkarid kapsel måling er basert på manuelle målinger av mikroskopi bilder og eksakt metodene av både bilde og mål oppkjøp variere laboratorier9,10, 11. En umiddelbar bekymring til denne metoden er at noen studier krever oppkjøpet av enkeltmål, som gjør opprettholde nøyaktigheten og påliteligheten vanskelig. Videre selv når resultatene er publisert, er det ofte utilstrekkelig beskrivelse av metoden måling. Mange publikasjoner ikke forklare hvordan deres mål ble oppnådd, hva fokalplanet ble brukt, hvordan de bestemmes terskelen for kapsel identifikasjon, om de brukte radius eller diameter, enten de brukes ett mål eller gjennomsnitt flere eller andre detaljer. Noen publikasjoner eneste staten sin metode som hvilket program som ble brukt, f.eks "Adobe Photoshop CS3 ble brukt til å måle cellene"11. Denne mangelen på standardisering og rapportering detaljer kan gjøre reproduserbarhet vanskelig om ikke umulig. Forskjeller i menneskelige syn, datamaskin lysstyrke, mikroskop innstillinger, skyv belysning og andre faktorer kan variere ikke bare mellom individer, men mellom prøvene, mens beregninger basert på prosenter av bildepunktverdier intensitet forblir konstant og gjeldende mellom eksempler. Denne teknikken ble generert i sammenheng med gir en standardisert, nøyaktig, rask og enkel metode for å måle kapsler størrelser for et felt der var det ingen før.

Som tidligere nevnt, CHT algoritmen er veletablert og skript automatisk merker sirkler har blitt skrevet før. Denne metoden øker i to områder der andre skript ville bommer. Først bare oppdage sirkler er ikke nok, fordi to forskjellige sirkler må registreres med cryptococcal celler, i forhold til hverandre. Denne metoden spesielt oppdager cellen legemer i kapsler, diskriminerer mellom to, og utfører beregninger på relevante kroppen-kapsel parene. Andre, selv når etter den samme protokoll, ulike etterforskere vil ende opp med forskjellige kjøpt bilder. Ved at etterforsker kontroll over enhver algoritmen parameter, kan dette verktøyet justeres for å matche en rekke anskaffelsesmetoder. Det er ikke behov for en standardisert omfang, mål, filtrere og så videre.

Denne teknikken kan lett brukes på enhver situasjon som etterforskeren må merker sirkler i et bilde som kontrast med sin bakgrunn. Begge sirkler lysere og mørkere enn deres bakgrunn kan registreres, telles og målt ved hjelp av denne teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse tusj lysbilde

  1. Pipetter 10 µL av cryptococcal prøve på et lysbilde. Sirkulær gjær belastning fungerer, men for dette eksperimentet H99 var bare påkjenningen brukes.
    Merk: Hvis prøven direkte fra kultur medier, fortynne 1:2 med PBS eller vann kan forhindre India blekk klumper.
  2. Pipetter 2 µL av blekk flekken på prøven og bland ved fysisk presser pipette spissen til prøven og flytte i en sirkulær bevegelse til India blekk vises jevnt fordelt.
  3. Plass en dekkglassvæske over prøven ved å holde nede den venstre kanten av dekkglassvæske mot overflaten av lysbildet, deretter forsiktig og jevnt senke motsatt side av dekkglassvæske over utvalget.
  4. Tillate lysbildet til luft tørr i 5 min.
  5. Forsiktig gjelde et lett lag av neglelakk dekkglassvæske grensen for å danne en sel og bevare blekk flekken.

2. imaging lysbildet

  1. Plasser lysbilder i en lysende felt mikroskop med kameraet vedlegg og kjente piksel til mikron-konvertering. Juster filtre, mål og kontrast slik at celle kapsler er klare og cellen legemer er fokusert, mørk band.
    Merk: Ulike filtre, mål og kontrastinnstillinger fungerer, men en 20 x mål, Ph1 filter og 2 x 2 binning anbefales.
  2. Kontroller synsfelt er tett, men ikke overbefolket med cryptococcal celler, med klare kontrast mellom cellen capsule og bakgrunn, og riktig fokusert med celle kroppen visualisert som en mørk band.
    Merk: Antallet celler for et optimalt bilde varierer avhengig samplingsfrekvens og målet som brukes. De viktige aspektene er å sikre celler ikke er gruppert eller overlappende, at cellen fokal flyene ikke varierer betydelig, og at det er betydelig tusj flekken synlig i bakgrunnen (minst 25% av feltet).
  3. Lagre bilder i en enkelt katalog med tydelige titler, måling algoritmen kjøres på bilder i en enkelt katalog og output data organiseres etter navnene på bildefilene.

3. algoritmen oppsett

  1. Installere Python versjon 2.7 fra
  2. Installere flere python biblioteker ved å kjøre kommandoene "pip installere pute" og "pip installere openpyxl".
  3. Installere MATLAB ved å følge instruksjonene på
  4. Bygge MATLAB python biblioteket ved å følge instruksjonene på https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Last ned tre nødvendige filene i dette manuskriptet utfyllende materialer ("QCA.py", "Analysis2.m" og "TestRun.m").
    Merk: Disse filene kan pakkes ut hvor som helst, men alle tre må være i samme mappe.

4. Bruk av algoritmen

  1. Kjør programmet ved å dobbeltklikke på QCA.py.
    Merk: Programmet kan ta flere minutter å starte. "QCA.py" filen inneholder programmet strukturen som kaller ".m" filene for å kjøre den faktiske algoritmen.
  2. Følg fremgangsmåten i programmet.
    1. Forlengelsen type bildefilene innledes med en periode og atskilt med semikolon (ex. ". TIF;. JPEG") så klikk på Enter -knappen.
    2. Velg mappen der bildefilene ligger ved å klikke knappen Velg mappe og velge mappen som inneholder bildene.
    3. Generer listen over bildefiler i mappen ved å klikke Generer bildelisten . Bildene vises i boksen til høyre. Gå gjennom og Kontroller listen er nøyaktige og fullstendige.
    4. Velg et tilfeldig bilde fra listen for å bruke som en forhåndsvisning ved å klikke Velg tilfeldig bilde .
      Merk: Hvis bildet ikke kan åpne pga"feil image-modus", algoritmen vil fremdeles fungere ordentlig til tross for ikke viser bildet. Etter trinn 4.2.7 vises fortsatt testbildet.
    5. Input mikroskop mål og binning innstillinger. Hvis standardinnstillinger ikke samsvarer mikroskopet brukes, velger du "Egendefinert Pixel konvertering" og innspill pixel-to-um-konvertering for bildefilene. Når valgt, klikk Beregne konvertering og sikre konverteringen er riktig etter tekstboksen til høyre.
      Merk: Representant bilder vist i figur 1 ble beregnet med 40 x forstørrelse og 2 x 2 binning valgt.
    6. Angi algoritmen parametere for sirkel gjenkjenning.
      1. Angi minimum og maksimum radius synlig for ytre kapsel påvisning som Min og Max Capsule Radius oppføringer. Et mindre utvalg vil gi mer nøyaktige resultater.
      2. Angi minimum og maksimum radius synlig for celle kroppen gjenkjenning som Min og Max celle kroppen Radius oppføringer.
        Merk: Alle fire av disse oppføringene må være tall som representerer deres respektive verdier i piksler, ifølge kildebildene.
      3. Flytt glidebryterne Capsule og celle kroppen følsomheten å justere følsomheten terskelen algoritmen. En lav sensitivitet vil være strenge og redusere falske positive sirkel gjenkjenning, men kan også detektere færre virkelige sirkler. Omvendt, en høy følsomhet vil øke oppdagelsen rate, men kan også resultere i falske positive sirkler.
        Merk: Representant resultater ble oppnådd med minimum kapsel radius av 7, maksimal kapsel radius på 45, minimum kroppen radius på 4, maksimal kroppen radius av 30, kapsel følsomhet av 87, og kroppen følsomhet av 87.
    7. Teste parameterne på tilfeldig valgt bilde ved å klikke Kjør Test . Resultatene vises i øvre midten av programmet, erstatte det opprinnelige bildet. Hvis resultatene ser nøyaktig, anbefales det å velge et mer tilfeldig bilde å prøve også å sikre de valgte parameterne passer alle merkede bilder.
      1. Maksimere antall organer og kapsler oppdaget og visuelt inspisere om sirkler å passe riktig. Antall organer innen kapsler oppdaget vises i boksen til høyre. Ellers manipulere parameterne algoritmen til resultatet er nøyaktig.
        Merk: De tykke sirklene er bare å hjelpe til med visualisering. Den faktiske sirkler generert for måling er en matematisk kurve beregnet av HCT algoritmen.
    8. Kjøre algoritmen på hele katalogen av bildefiler ved å klikke Begynne analyse . Hvert bilde vil bli analysert og vises "ferdig" i tekstboksen til høyre når alle bilder er analysert.
    9. Klikk kamp og opprydding -knappen. Dette tilsvarer oppdaget celle kroppen til oppdaget kapsler de bor i, og beregne sanne kapsel radius ved å trekke kroppen fra kapsel.
      Merk: Hvis algoritmen brukes til å oppdage fluorescens eller en annen situasjon der bare én sirkelen er oppdaget dette trinnet er unødvendig. I stedet Velg Bare trekke organer eller Bare trekke kapsler for å samle inn data for bare blå eller bare de grønne sirklene, henholdsvis. Det er viktig å merke seg at hvis bare kapsel dataene hentes radius vil referere til cellen totalt radius som radius av celle kroppen ikke kan trekkes.
    10. Finne fullført dataene i filen "CleanedOuput.csv" i bilde-katalogen. Hvis bare én datadel ble valgt, vil filen bli merket "CleanedBodies.csv" eller "CleanedCapsules.csv".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bilder er første oppnås ved mikroskopi tusj lysbilder med lyse feltet mikroskop kombinert med et kamera (figur 1A). Det er viktig å ha celler atskilt og tilstrekkelig lav tetthet ikke å overvelde synsfelt, samt å bruke nok flekken for å skape kontrast mellom bakgrunnen og celler. Som nevnt i protokollen, vil antallet celler for et optimalt bilde variere avhengig av prøven, mikroskop og målet som brukes. De viktige aspektene er å sikre celler ikke er gruppert eller overlappende, at cellen fokal flyene ikke varierer betydelig, og at det er betydelig tusj flekken synlig i bakgrunnen (minst 25% av feltet). Disse retningene tillate algoritme for å avgjøre en terskel unike bildet ved å ta gjennomsnittet intensitet bildepunktverdien og legge standardavviket. Hvilket som helst bildepunkt med intensitetsverdi høyere enn sa terskelen anses hvite og noen med en lavere intensitetsverdi er svart. Det resulterende bildet gir en klar og skarp forskjellsbehandling av hvor kapselen ender (figur 1B). Algoritmen har en robust hvitt på svart kontrast basert sirkel etter kapselen og originalbildet gir en robust svart på hvitt sirkel for cellen legemer. En representant visualisering av oppdaget sirkler genereres som en del av programmet (figur 1C). Dette lar brukeren raskt analysere gjennom behandlede bildene og sikre at resultatene vises korrekt.

Det er viktig å følger nøyaktig protokoll for å få optimale bilder. Sub-optimale bilder skyldes vanligvis mangel på kontrast mellom capsule og blekk (figur 2A). Optimal kontrast og oppkjøp parametere vil variere på prøve, eksperiment, kamera og mikroskopet modeller, etc. Et optimalt bilde er en der gjærceller er atskilt hvis mulig, hvor den ytre kanten av kapselen har klart kontrast til tusj flekken og hvor celle kroppen er fokusert vises som en mørk band som står i skarp kontrast med bakgrunnen. Hvis for mange celler i synsfelt, eller hvis flekken er for lyse, intensitet bildepunktverdiene vil klynge og programmet vil ikke kunne etablere en terskel kan Klargjørende kapsel størrelse (figur 2B). Når sub-optimale bilder brukes kan programmet merker sirkler av feil størrelser, ikke kunne oppdage noen sirkler eller oppdage flere pseudo sirkler basert på gjenstander i terskelen bildet (figur 2C).

Oppdage cellen legemer utgjør et lignende problem i at celle kroppen må visualiseres som en robust svart sirkel på hvit bakgrunn av kapselen. Dette problemet er rettet i protokollen når de beskriver ønsket fokalplanet for bildeopptak. Den beste fokalplanet bruke er en der celle kroppen vises som en mørk, konsentrert band (Figur 3A). Denne fokalplanet er akseptabelt som standard fordi det riktig fokuserer cellen. Dette ble bekreftet ved å visualisere cellen vegg med Uvitex, en chitin flekk (Figur 3B). Uvitex flekk tydelig viser en skarp, fokusert cellevegg med svakt signal i center (hvor toppen og bunnen av cellen kroppen ville bli farget, ute av fokus).

Utvikle denne metoden det er også viktig å bekrefte at kan denne algoritmen nøyaktig fastslå capsule og celle kroppen målinger. Mens representant sirkler i forrige tallene er lovende, var faktiske mål forhold mellom datamaskinen og menneskelig mål. Når protokollen etterfølges nøyaktig og optimal bilder, algoritmen er nøyaktig og pålitelig (Figur 4A). Men hvis protokollen etterfølges feil og suboptimal bilder hentes på grunn av dårlig flekker, overbefolkning eller andre nevnte parametere, algoritmen mister nøyaktighet og recapitulate ikke menneskelige målinger (Figur 4B ). Siden denne teknikken ble opprinnelig utviklet for en bestemt person (første forfatter), en annen person ble bedt om å bruk den for å avgjøre hvis forskjellene mellom flekker og målingen vil påvirke nøyaktigheten til tross for følgende protokollen. Resultatene viste at denne teknikken var allment gjeldende som protokollen ble etterfulgt som instruert (Figur 4C). Tilsvarende kan denne teknikken brukes med et mikroskop kan anskaffe fase kontrast bilder forberedt tusj lysbildene. For å sikre algoritmen forblir nøyaktig med andre mikroskop oppsett dette forsøket ble gjentatt av en tredjeparts etterforsker bruker et annet lyse felt mikroskop kombinert med et kamera og sammenlignet oppdaget kapsel diameter med manuelt målt capsule diameter. Ingen signifikant forskjell ble observert mellom datamaskinen og menneskelige målinger (Figur 4D).

Til slutt, fremtidige anvendelser av denne algoritmen ble undersøkt i sammenheng med fluorescens flekker. Siden fluorescens imaging er fortsatt basert på signal til støy forhold av intensitet bildepunktverdier bør algoritmen være lett gjelder fluorescens bilder så lenge flekken er rund i naturen. Dette programmet ble bekreftet når algoritmen kunne oppdage Uvitex farget cellen legemer fra tidligere beskrevet bilder (figur 5A, 5B). Brukere bør være forsiktig å optimalisere algoritmen parametrene for eksperimentet deres, og standardiserte protokoller skal utvikles i fremtiden for nye programmer.

Figure 1
Figur 1 : Representant resultatene av et optimalt innhentet bilde. A. første bildet av lysende felt mikroskopi en tusj lysbilde. B. det binære bildet ved hjelp av en terskel beregnet fra gjennomsnittlig intensitet bildepunktverdien lagt til standardavviket. Alle verdier over denne grenseverdien anses hvitt og alle under anses svart. C. en visualisering av kapsler (grønn) og cellen legemer (blå) oppdaget av algoritmen. Alle bildene ble innhentet på 40 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant resultatene av en dårlig fått bilde. A. første tusj lysbildet ervervet via lyse feltet mikroskopi. Ujevn og utilstrekkelig fargeresultatene i et spesielt lys bakgrunn med graderinger i intensitet. B. den resulterende binær image, som kapsler ikke kan klart skilles på grunn av høye signal. C. flere kapsler er umulig å oppdage. Alle bildene ble innhentet på 40 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: oppdager cellen legemer. A. lyse feltet bilde av kapselen sentrert på foretrukne fokalplanet. B. Uvitex fluorescens bilde av celle kroppen på foretrukne fokalplanet. Bildene ble oppnådd på 100 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: sammenligninger av resultater for algoritmen (svart) og human (grå) analyser. A. når lysbilder er utarbeidet etter protokollen og optimale bilder det er ingen merkbar forskjell mellom målinger. B. hvis protokollen ikke etterfølges algoritmen ikke nøyaktig identifisere og måle kapsler. Spesielt bakgrunnen var her ikke forenlig og det var ikke klart kontrasten mellom kapsler og bakgrunn. Betydelige variasjoner beregnet via t-test er kjent som * for P verdier < 0,05. C. en uavhengig etterforsker ble bedt om å følge protokollen og sammenligne sine analyser med algoritmen. Pålitelighet opprettholdes over observatører som bildene er riktig ervervet. D. En andre uavhengig etterforsker med andre mikroskop ble brukt til å bekrefte algoritmen beholder nøyaktighet over enkeltpersoner og maskinvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : En potensiell alternativ anvendelse av algoritmen: identifikasjon og måling av fluorescens mikroskopi. Cellen legemer var farget fotografert med Uvitex, og identifiseres av algoritmen. Oppdaget sirkelen utvides forbi hva ville være merket som cellen vegg påvisning er basert på fluorescens signalet. Algoritmen kan skreddersys for å identifisere spesielt smarteste akkumulering av signal (cellen vegg) ved å endre terskelen brukes til å generere de første binære bildet tall 1B og 2B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 1
Ekstra figur 1: et representativt skjermbilde av program som kjører på et Windows-miljø. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 2
Ekstra figur 2: representasjoner av oppdaget spirende gjær celler. Skala linjen representerer 10 µm. A. En overordnet celle og bud hver regnet som separate celler innenfor egne kapsel. B. A forelder-cellen og bud hver talt to ganger, når sin egen capsule og én gang for den andre celle kapselen, som resulterer i fire totale celler oppdaget fra en forelder, og én knopp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 3
Ekstra figur 3: en representasjon av de endelige dataene gitt etter celle gjenkjenning og måling. Bildefilen refererer til navnet på det opprinnelige bildet. Totalt radius refererer radius av representant grønne sirkler, kapsel og celle kroppen kombinert. Kapsel x og kapsel y se koordinatene til kapsel som dataene gjelder. Kroppen radius refererer til radius av representant blå sirkler. Kapsel radius refererer totale radius minus kroppen radius, som resulterer i radius av bare kapselen. Disse verdiene blir i mikron så lenge brukeren inkludert en piksel til mikron bytteforhold i trinn 3.2.5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De avgjørende skritt i denne teknikken er forbereder tusj lysbildet og anskaffe mikroskop-bildene. Mens algoritmen har blitt testet med en rekke lysbilde og bildet er det anbefalte protokollen beskrevet i dette manuskriptet. Polysakkarid kapsel oppdages basert på utelukkelse av blekk partikler fra domenet av kapselen som disse partiklene er for store til å trenge polysakkarid fibril nettverket. Tusj utelukkelse resulterer i en lyse sirkel på en mørk bakgrunn. Algoritmen merker sirkler basert på hvor godt de kontrast med sin bakgrunn. Således, en tung tusj flekk vil resultere i høyere kontrast mellom polysakkarid kapsel og bakgrunn, øke signal til støyforhold, og forbedre resultatet kvalitet. Derimot blir celle kroppen gjenkjent som en mørk sirkel på en lys bakgrunn. Celle kroppen endres utseendet basert på hvilke fokalplanet mikroskopet er satt til, vises som en diffus grå sirkel på toppen eller bunnen av cellen og som en kondensert mørk band på center. Av samme grunn allerede diskutert fokalplanet der celle kroppen vises som en kondensert, mørk band bør brukes for bildeopptak som dette vil resultere i den mest nøyaktige sirkel-gjenkjenningen.

Metoden rapporterte her har kommet gjennom flere endringer og runder feilsøking. Algoritmen var opprinnelig kodet forventer at celler ikke ville være mindre enn 4 eller større enn 60 piksler basert på mikroskopet som ble brukt. Å utvide anvendelsen av denne algoritmen til ulike forstørrelser og celle størrelser disse grensene ble i stedet erstattet av bruker input felt beskrevet i protokollen. Brukere kan nå inndataparameterne spesifikke for hvert eksperiment maksimal nøyaktighet. Hvis denne algoritmen brukes til en situasjon utenfor Cryptococcus kapsel måling anbefales første sette opp en serie av å finne betingelser til å bestemme hvordan prøver skal genereres og fotografert.

Viktigste begrensningen av denne teknikken er at den ble designet med et bestemt program i tankene, nemlig måling av cryptococcal kapsel. Mens det kan lett endres for å passe flere programmer, er dette skriptet bare direkte gjelder kapsel måling protokollen skissert ovenfor. Denne begrensningen beskriver imidlertid også betydningen av denne metoden med hensyn til sitt felt og de eksisterende metodene. I tillegg spirende gjærceller kan presentere et problem for etterforskerne som ønsker å bare måle overordnet celle størrelser. Denne algoritmen er dugelig av oppdager knopper som unik celler (Figur S2A). Først, kan dette være et problem hvis investigator da de skulle ønske å fjerne bud målinger eller fjerne begge celler hvis det ikke kan fastsettes som oppdaget sirkelen er bud, og som er overordnet. Andre, kan dette forårsake et annet problem hvis knopp som en celle kroppen fortsatt innenfor rammen av foreldrenes kapselen (Figur S2B) der tilfelle algoritmen måler knopp referanse til foreldrenes kapselen. I dette eksemplet vil hver celle telles to ganger fordi hver celle kroppen ligger innenfor to kapsler. Noen av disse problemene kan løses enkelt når protokollen er ferdig. Siste datasettet vises som et regneark der hver enkelt oppdaget celle er merket bildefilen den kom fra, og x og y koordinatene til celle kroppen (Figur S3). Etterforskerne kan bare finne og utelate dataene som samsvarer med bud. Til tross for kapsel størrelse er en viktig og tungt studerte virulens faktor feltet Cryptococcus har ennå å etablere standardprotokoller for kapsel måling eller bilde oppkjøpet. Denne teknikken ble utformet for å fylle disse rollene i en presis og enkel måte fritt tilgjengelig for laboratorier med minimal forutsetninger.

Fremtidige anvendelser av denne teknikken er i stor grad til å bruke den andre eksperimenter. Ethvert bilde basert oppdagelsen eller måling av sirkulære objekter skal analyzable gjennom denne algoritmen. Fluorescerende mikroskopi bilder kan analyseres ved å bruke algoritmen personlige laser kanaler. Bakterie kolonien teller kan oppnås, og med ytterligere modifisering kunne skille mellom galaktose journalister. Gjær kolonien vekst analyser kan også vurderes ved hjelp av denne algoritmen for å anslå kolonien størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å erkjenne Anthony Bowen lysbilder som ble brukt som en andre menneskelige side-ved-side-sammenligning samt Sabrina Nolan lysbilder som ble brukt som en tredje menneskelige side-ved-side og andre mikroskop sammenligning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (7), 019760 (2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76, (2), 508 (1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80, (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209, (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7, (1), 29561 (2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3, (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12, (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71, (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
Automatisert måling av <em>Cryptococcal</em> arter polysakkarid kapsel og celle kroppen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter