Summary
Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.
Abstract
Bu teknik amacı polisakkarit kapsül ölçümleri çok sayıda için tutarlı, doğru ve yönetilebilir bir süreç sağlamaktır.
İlk olarak, bir eşik görüntü benzersiz olarak her görüntü için hesaplanan yoğunluk değerleri temel alınarak oluşturulur. Sonra daire nesne ve köklü daire Hough dönüştürme (CHT) algoritması ile arka plan arasındaki kontrast göre tespit edilir. Son olarak, tespit edilen hücre kapsül ve organları Merkezi koordinatları ve RADIUS boyutu göre eşleştirilir ve veri yönetilebilir elektronik tabloda kullanıcıya verilir.
Bu teknik avantajları basit ama önemli. İlk, çünkü bu hesaplamalar bir insan yerine bir algoritma tarafından gerçekleştirilir doğruluk ve güvenilirlik arttı. Doğruluğu veya güvenilirliği kaç örnekleri analiz edilir ne olursa olsun hiçbir düşüş vardır. İkinci olarak, bu yaklaşım potansiyel Standart prosedür Cryptococcus alanı yerine nerede kapsül ölçüm lab tarafından değişir mevcut durum için kurar. Üçüncü olarak, el ile kapsül ölçümler yavaş ve monoton göz önüne alındığında olduğuna göre otomasyon sırayla yüksek üretilen iş veri analizi ve giderek güçlü istatistik kolaylaştıran çok sayıda Maya hücreleri üzerinde hızlı ölçümler sağlar.
Bu tekniğin önemli sınırlamaları nasıl gelir algoritması işlevleri. İlk olarak, algoritma yalnızca daireler oluşturur. Cryptococcus hücreleri ve onların kapsül üzerinde dairesel bir Morfoloji alırken, Sigara-daire nesne algılama için bu tekniği uygulamak için zor olurdu. İkinci olarak, daire nasıl algılanır nedeniyle CHT algoritması büyük sözde çevrelerin birkaç kümelenmiş daire dış kenarlarına dayalı algılayabilir. Ancak, yanlış tanıtılmış hücre cesetler sahte daire içinde yakalanan kolayca algılanabilir ve elde edilen veri kümelerinden kaldırıldı.
Bu tekniği, çini mürekkebi parlak alan mikroskobu üzerinde dayalı Cryptococcus türlerin döngüsel polisakkarit kapsül ölçmek için içindir; için uygulanan olabilir rağmen diğer kontrast dairesel nesne ölçümleri dayalı.
Introduction
Cryptococcus neoformans ubiquitously insan hastalığında öncelikle baskılanmış nüfus ile ilişkili tüm dünyada bulunan patojen bir mayaymış. C. neoformans özellikle Sahra Güneyi Afrika bulaşıcı hastalık1nedeniyle toplam yıllık ölümlerin önemli bir çünkü hesapları. Önemli klinik cryptococcal enfeksiyon olarak enfekte makrofajlar (Truva atı şekilde) Ulaştırma merkezi sinir sistemi işgali aşağıdaki meningoensefalit tezahürüdür veya kan - beyin bariyerini doğrudan geçiş. C. neoformans insan vücudunun sıcaklığı, üreaz aktivitesi, melanization ve bir polisakkarit kapsül2oluşumu çoğaltmak için yeteneği dahil olmak üzere birkaç virülans faktörleri ifade eder. Polisakkarit kapsülü yinelenen glucuronoxylomannan ve glucoronoxylomannangalactan Polimerler ve işlevleri olarak çevresel stres ve ana makine bağışıklık yanıtı2gibi etkenlere karşı koruyucu bir bariyer oluşur.
Her ne kadar cryptococcal polisakkarit kapsül boyutunu sürekli virülans ile ilişkili olduğu değil, ortada bir kanıt Patogenez2,3,4,5bir faktör olduğunu, 6,7. Kapsül boyutu menenjit patoloji6ile ilişkilidir, makrofaj Cryptococcus enfeksiyon5kontrol yeteneğini etkileyebilir ve8Eğer yok virülans kaybına neden olabilir. Bu nedenle, kapsül boyutu ölçüm cryptococcal araştırmada yaygındır, ancak kapsül ölçüm yöntemi için standart yok fieldwide.
Şu anda, C. neoformans polisakkarit kapsül ölçüm mikroskobu görüntüleri manuel ölçüm üzerinde temel alır ve görüntü ve ölçüm satın alma tam yöntemleri laboratuar9,10değişir, 11. Bir anında bu yöntemin bazı çalışmalar Bakımı doğruluk ve güvenilirlik zorlaştırır binlerce bireysel ölçümlerin edinimi gerektiren konusudur. Ayrıca, hatta sonuçları yayımlandığında, orada kez yetersiz ölçüm yönteminin açıklaması olduğunu. Birçok yayın nasıl onların ölçümler elde edilmiştir, açıklamak değil ne odak düzlemi kullanıldı, nasıl onlar belirlediğini eşik kapsül kimlik için bir ölçüm kullanılan veya birkaç veya diğer ortalama RADIUS veya çapı, kullanılan Ayrıntılar. Onların yöntemi hangi programı olarak kullanıldı, bazı yayınlar tek devlet Örneğin, "Adobe Photoshop CS3 hücreleri ölçmek için kullanılan"11. Standardizasyon ve ayrıntılı raporlama bu eksikliği tekrarlanabilirlik imkansız olmasa zorlaştırabilir. İnsan görme, bilgisayar parlaklık, mikroskop ayarları, farklılıkları slayt aydınlatma ve pixel yoğunluk değerleri oranları üzerinde dayanan hesaplamalar sabit kalır, ancak diğer faktörler sadece bireyler arasında ama örnek arasında değişebilir ve örnek arasında uygulanabilir. Bu teknik içinde yoktu önce bir alan için kapsül boyutları ölçmek için bir standart, doğru hızlı ve basit teknik sağlama bağlamında oluşturuldu.
Daha önce belirtildiği gibi CHT algoritmasıdır köklü ve daireler otomatik olarak algılamak üzere komut dosyaları önce yazdım. Bu yöntem diğer komut dosyaları nerede kısa düşeceği iki alanda geliştirir. Cryptococcal hücreleri ile iki ayrı daire birbirimizi ile ilgili olarak algılanması gerekir çünkü ilk, sadece daireler algılama, yetmez. Bu yöntem özellikle hücre organları kapsül içinde algılar, ikisi arasında ayrımcılık ve yalnızca ilgili vücut-kapsül çiftleri üzerinde hesaplamalar gerçekleştirir. İkinci olarak, hatta ne zaman takip aynı iletişim kuralını, farklı araştırmacılar farklı sona erecek görüntüleri elde. Her algoritma parametresini araştırmacı denetime olanak sağlayarak, bu araç edinme yöntemleri çok çeşitli eşleşecek şekilde ayarlanabilir. Standart kapsamı, amaç, filtre ve benzeri için gerek yoktur.
Bu teknik, araştırmacı daireler bir görüntü içinde onların arka plan ile bu kontrast tespit gereken herhangi bir durum için kolayca uygulanabilir. Her iki daire açık ve koyu arka plan tespit edilebilir daha sayılır ve bu teknik kullanılarak ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çini mürekkebi slayt hazırlanması
- Cryptococcal örnek bir slayda 10 µL pipet. Bu deneme için kullanılan tek zorlanma H99 oldu ama herhangi bir dairesel Maya zorlanma çalışacaktır.
Not: doğrudan kültür ortamından örneğiyse, 1:2 PBS veya su ile sulandrarak çini mürekkebi topaklanma üzerinden önlemeye yardımcı olabilir. - Hindistan mürekkep lekesi örnek üzerine 2 µL pipet ve fiziksel olarak pipet ucu örnek için bastırıyor ve çini mürekkebi düzgün dağıtılmış görünene kadar dairesel hareketlerle hareket ettirerek karıştırın.
- Bir coverslip örnek üzerinde coverslip sonra yavaşça ve eşit olarak örnek üzerinde coverslip karşı tarafına düşürücü slayt, yüzeye karşı sol kenarına basılı tutarak yerleştirin.
- Slayt hava kuru 5 min için izin.
- Yavaşça oje ışık tabakası bir mühür formu ve çini mürekkebi leke korumak için coverslip kenarlık uygulayın.
2. görüntüleme slayt
- Slaytlar bir fotoğraf makinesi eki ve bilinen piksel mikron dönüşüm parlak alan mikroskopla yerleştirin. Filtreler, amaçları ve kontrast hücre kapsül ve hücre organlarıdır odaklanmış, karanlık bantları net şekilde ayarlayın.
Not: Çeşitli filtreler, amaçları ve kontrast ayarlarıyla çalışacaktır ancak bir 20 x amaç, Ph1 filtre ve 2 x 2 binning önerilir. - Görüş alanı yoğun ama değil hücre kapsül arka plan arasında açık kontrastlı cryptococcal hücrelerle nüfuslu ve karanlık bir grup görüntülenmiştir hücre gövdeli düzgün odaklanmış olduğundan emin olun.
Not: En iyi görüntü için tam sayısı örnek ve kullanılan objektif bağlı olarak değişir. Kümelenmiş veya örtüşen hücrelerdir değil emin olmak için önemli yönleridir, hücre odak uçaklar önemli ölçüde değişir değil ve önemli çini mürekkebi olduğunu açıkça (en az % 25 alanın) arka planda görünür leke. - Ölçüm algoritması görüntüleri tek bir dizin içinde çalışır ve çıkış veri görüntü dosyalarının adlarını göre düzenlenecek açık başlıklar içeren tek bir dizin için görüntüleri kaydetmek.
3. algoritması kurulumu
- Python sürüm 2,7 üzerinden yüklemek
- Ek python kütüphaneleri "pip yüklemek yastık" komutlarını çalıştırarak ve "pip yükleyin openpyxl".
- MATLAB şu sayfadaki talimatları izleyerek yükleyin
- Yapı https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html sağlanan yönergeleri izleyerek MATLAB python Kütüphane.
- Bu el yazması'nın takıma giren malzemeler ("QCA.py", "Analysis2.m" ve "TestRun.m") üç gerekli dosyaları indirmek.
Not: Bu dosyaları herhangi bir yere elde edilebilir, ama her üç aynı dizinde olması gerekir.
4. algoritma kullanımı
- Uygulamayı QCA.py üzerinde çift tıklayarak çalıştırın.
Not: Uygulama başlatmak için birkaç dakika sürebilir. "QCA.py" dosyası gerçek algoritma çalıştırmak için "anladım" dosyaları çağıran program yapısı içerir. - Programda anlatılan adımları izleyin.
- Görüntü dosyalarının uzantısı türü başına bir nokta koyarak ve noktalı virgüllerle ayrılmış Giriş (örn. ". TIF;. JPEG") sonra Enter düğmesini tıklatın.
- İçinde görüntü dosyaları Dizin Seç düğmesini tıklatarak ve görüntüleri içeren klasörü seçerek bulunduğu dizini seçin.
- Görüntü dosyaları listesini dizinde Resim listesi oluştur düğmesini tıklatarak oluşturun. Görüntüleri sağa metin kutusunda listelenir. Gözden geçirin ve listeden doğru ve eksiksiz olduğundan emin olun.
- Rasgele görüntü Seç düğmesini tıklatarak bir önizleme olarak kullanmak için listeden rastgele bir görüntü seçin.
Not: bir "yanlış görüntü modu hata nedeniyle" açamıyor görüntüyse, algoritma hala görüntü görüntülenmiyor rağmen düzgün. 4.2.7 adımdan sonra sınama yansıması görüntülenmeye devam eder. - Giriş mikroskop objektif ve ayarları binning. Varsayılan ayarları kullanılan mikroskop eşleşmiyorsa, "Özel piksel dönüşüm" seçin ve görüntü dosyaları için piksel-için-um dönüşüm giriş. Bir kez seçme, Dönüşüm hesapla düğmesini tıklatın ve dönüştürme metin kutusunun sağ göre doğru olduğundan emin olun.
Not: şekil 1 ' de gösterilen temsili resim 40 x büyütme ve 2 x 2 seçili binning ile hesaplanır. - Giriş daire algılama için algoritma parametreleri.
- Minimum ve maksimum yarıçapı tespit Min ve Max kapsül RADIUS giriş dış kapsül algılama için giriş. Küçük bir aralığı daha doğru sonuçlar sağlayacaktır.
- Minimum ve maksimum yarıçapı tespit hücre vücut algılama Min ve Max hücre vücut RADIUS giriş için giriş.
Not: Bu girdilerin dört göre kaynak görüntüler ilgili değerlerini piksel cinsinden temsil eden sayılar olmalıdır. - Duyarlılık eşik algoritma ayarlamak için kapsül ve hücre cisim hassasiyeti kaydırıcılarını hareket ettirin. Düşük duyarlılık sıkı olacak ve yanlış pozitif daire algılama azaltmaz, ama daha az gerçek daireler Ayrıca algılayabilir. Tersine, yüksek bir hassasiyet tespit oranı artacak ama yanlış pozitif çevrelerde de neden olabilir.
Not: Temsilcisi sonuçları bir kapsül yarıçapında en az 7, 45 kapsül maksimum yarıçapı, en az vücut RADIUS 4, en fazla vücut RADIUS 30, 87 kapsül duyarlılık ve cisim hassasiyeti 87 ile elde edilmiştir.
- Parametreleri rasgele seçilen görüntü üzerinde Test çalışması düğmesini tıklatarak sınayın. Programın orijinal görüntü yerine, üst ortasında görüntülenir. Sonuçları doğru bakarsanız, bu da tüm seçilen görüntüler seçilen parametrelere uygun emin olmak denemek için ek rasgele görüntü seçmek için önerilir.
- Ceset sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kapsül algılanır ve daireler doğru sığdırmak için görünür olup olmadığını kontrol edin. Tespit kapsül içinde ceset sayısı sağa metin kutusunda görüntülenir. Aksi takdirde, sonuçları doğru olana algoritma parametreleri değiştirmek.
Not: Yalnızca görselleştirme ile yardımcı olmak için kalın renkli daireler vardır. Ölçüm için üretilen gerçek daireler HCT algoritması tarafından hesaplanan bir matematiksel eğrisi var.
- Ceset sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kapsül algılanır ve daireler doğru sığdırmak için görünür olup olmadığını kontrol edin. Tespit kapsül içinde ceset sayısı sağa metin kutusunda görüntülenir. Aksi takdirde, sonuçları doğru olana algoritma parametreleri değiştirmek.
- Algılama algoritması Başlar Analysis düğmesini tıklatarak görüntü dosyaları tüm dizin üzerinde çalıştırın. Her görüntü analiz edilecek ve tüm görüntüleri analiz programı "bitmiş" sağındaki metin kutusuna görüntülenir.
- Maç ve Temizleme düğmesini tıklatın. Bu tespit edilen hücre organları içinde bulundukları tespit edilen kapsül için maç ve gerçek kapsül RADIUS kapsül vücudundan çıkararak hesaplar.
Not: algoritma Floresans algılamak için kullanılan veya bu adımı başka bir durum sadece bir daire olduğu tespit gereksizdir. Bunun yerine sırasıyla sadece mavi ya da sadece yeşil daireler için veri toplamak için Sadece çek organları veya Yalnızca çek kapsül düğmesini tıklatın. Kapsül veri alınır eğer sadece hücre vücut RADIUS değil düşülen gibi RADIUS hücre toplam RADIUS ile sevk edecektir olduğunu unutmamak gerekir. - Tamamlanan Veri görüntü dizinindeki "CleanedOuput.csv" dosyasını bulun. Eğer sadece bir parça veri seçildi, dosyayı "CleanedBodies.csv" veya "CleanedCapsules.csv" etiketi olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görüntüleri ilk mikroskobu çini mürekkebi slayt bir kamera (şekil 1A) ile birleştiğinde bir parlak alan mikroskop kullanarak elde edilir. Hücreler ayrılmış ve görünümü, alan de hücreleri ve arka plan arasındaki kontrast oluşturmak için yeterli leke kullanın olarak bastırmak değil için yeterince düşük yoğunluklu olması önemlidir. İletişim kuralında belirtildiği gibi en iyi görüntü için tam sayısı örnek, mikroskop ve kullanılan amaç bağlı olarak değişiklik gösterir. Kümelenmiş veya örtüşen hücrelerdir değil emin olmak için önemli yönleridir, hücre odak uçaklar önemli ölçüde değişir değil ve önemli çini mürekkebi olduğunu açıkça (en az % 25 alanın) arka planda görünür leke. Bu yönde bir eşik her resme benzersiz ortalama piksel yoğunluk değeri alma ve standart sapma ekleyerek belirlemek için kullanılan algoritma sağlar. Her pikselin dedi eşik değerinden daha yüksek bir yoğunluk değeri ile beyaz olarak kabul edilir ve herhangi bir yoğunluk değeri daha düşük ile siyah kabul edilir. Ortaya çıkan görüntü kapsül (şekil 1B) bittiği yerde, açık ve net bir ayrım sağlar. Algoritma sonra kapsül için algılamak için bir temel sağlam beyaz siyah kontrast daire ve orijinal görüntü hücre cisimler için sağlam bir siyah beyaz daire bulunmaktadır. Tespit edilen dairelerin temsilcisi bir görselleştirme programı (Resim 1C) bir parçası olarak oluşturulur. Bu hızlı bir şekilde işlenmiş resimlerle çözümleme ve sonuçları doğru görünmesini sağlamak kullanıcı sağlar.
En iyi görüntüleri elde etmek için tam protokolü takip etmek önemlidir. Alt-optimal görüntüleri genellikle kapsül ve mürekkep (Şekil 2A) arasındaki kontrast eksikliği sonucu. En iyi kontrast ve satın alma parametrelerini örnek, deney, kamera ve mikroskop modeller, vb göre değişir. En iyi görüntüyü biri nereye maya hücreleri mümkünse, kapsül dış kenarını net kontrast Hindistan mürekkep lekesi vardır ve hücre vücut keskin olan arka plan ile tezat karanlık bir grup olarak görünmesini odaklanmıştır ayrılır. Çok fazla hücreleri görüş alanı varsa ya da leke çok hafiftir, pixel yoğunluk değerleri küme ve program kapsül boyutu (Resim 2B) elucidating yetenekli bir eşiği belirlemek mümkün olmayacaktır. Alt-optimal görüntüleri kullanıldığında program yanlış boyutlarda daireler algılayan, değil herhangi bir daire algılayamaz veya eserler eşik görüntüdeki (Şekil 2C) temel alan birden çok sözde daireler algılamak.
Hücre vücut kapsül beyaz zemin üzerinde sağlam olan siyah bir daire olarak görüntülenmeyecektir gerekir o hücre ceset tespit benzer bir sorun teşkil etmektedir. Bu sorun iletişim kuralında zaman resim alma için istenen odak düzlemi açıklayan yöneliktir. Kullanmak için en iyi odak düzlemi hücre vücut karanlık, konsantre bant (şekil 3A) görünen biri. Düzgün hücre odaklanır çünkü bu odak düzlemi bir standart olarak kabul edilebilir. Bu hücre duvarı Uvitex, kitin leke (şekil 3B) ile görselleştirme tarafından doğrulandı. Uvitex leke açıkça bir net gösterir hücre duvarı (nerede hücre vücudun alt ve üst, odak dışında lekeli) Merkezi zayıf sinyal ile duruldu.
Onaylamak önemliydi bu yöntem geliştirme konusunda bu algoritma doğru kapsül ve hücre Vücut ölçüleri belirlemek. Önceki rakamlar temsilcisi çevrelerde umut verici olmakla birlikte, gerçek ölçümleri arasında bilgisayarınızı ve insan ölçümleri karşılaştırıldı. Ne zaman protokol doğru bir şekilde takip ve en iyi görüntüleri elde edilir, doğru ve güvenilir algoritma (şekil 4A). Ancak, protokol yanlış takip ve suboptimal görüntüleri zavallı boyama, aşırı kalabalık veya daha önce bahsedilen diğer parametreler nedeniyle elde edilen, algoritma doğruluk kaybeder ve insan ölçümleri (şekil 4B özetlemek olamaz ). Beri bu tekniği aslında belirli bir birey için geliştirildi (ilk yazar), boyama ve ölçüm stilleri arasında farklar aşağıdaki protokol rağmen doğruluk etkileyeceğini belirlemek için kullanmak üzere farklı bir birey istendi. Protokol talimat (şekil 4C) izledi olduğu sürece bu teknik yaygın olarak uygulanabilir sonuçlar gösterdi. Benzer şekilde, bu teknik herhangi bir mikroskopla faz kontrast görüntüleri hazır çini mürekkebi slayt alma yeteneğine sahip kullanılabilir. Algoritma ile bu deney üçte bir oranında tekrar edilmiş diğer mikroskop kurulumları doğru kalır emin olmak için bir başka parlak alan mikroskop kullanarak araştırmacı bir kamera ile birleştiğinde ve algılanan kapsül çapı el ile ölçülen kapsül ile karşılaştırıldığında çapları. Bilgisayar ve insan ölçümleri (şekil 4D) arasında anlamlı bir fark gözlendi.
Son olarak, bu algoritmanın gelecekteki uygulamalar Floresans boyama bağlamında keşfedilmeyi. Floresans görüntüleme hala sinyal noise oranları piksel yoğunluğu değerleri için temel bu yana leke doğada dairesel olduğu sürece algoritma Floresans resimlere kolayca uygulanabilir olmalıdır. Algoritma başarıyla Uvitex hücre gövdeleri (şekil 5A, 5B) yukarıda açıklanan görüntülerden lekeli tespit etmek mümkün iken bu uygulama teyit edildi. Kullanıcıların onların deneme için algoritma parametreleri en iyi duruma getirmek için dikkatli olmalısınız ve standart protokolleri herhangi bir yeni uygulamalar için gelecekte geliştirilmelidir.
Resim 1 : En iyi şekilde elde edilen görüntünün bir temsilcisi sonuçları. A. bir çini mürekkebi slayt parlak alan mikroskobu tarafından edinilen ilk görüntü. B. hesaplanan Standart sapma eklendi ortalama piksel yoğunluk değeri bir eşik kullanılarak oluşturulan ikili resim. Bu eşiğin tüm değerleri beyaz olarak kabul edilir ve tüm aşağıda siyah kabul edilir. C. kapsül (yeşil) ve hücre organları (mavi) algoritması tarafından algılanan bir görselleştirme. Tüm görüntüleri ile 2 x 2 binning 40 x büyütme, elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bir alt en iyi şekilde elde görüntüsü temsilcisi sonuçları. A. parlak alan mikroskobu edinilen ilk çini mürekkebi slayt. Düzensiz ve yetersiz boyama özellikle parlak bir arka plan yoğunluk gradyanlar ile sonuçlanır. B. içinde kapsül açıkça yüksek arka plan sinyal nedeniyle ayırt edemez ortaya çıkan ikili görüntü. C. birkaç kapsül vardır. Tüm görüntüleri ile 2 x 2 binning 40 x büyütme, elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: algılama hücre organları. A. parlak alan görüntü tercih edilen odak düzlemi merkezli kapsül. B. Uvitex floresan görüntü tercih edilen odak düzlemi, hücre vücudun. Görüntüleri, 2 x 2 binning ile 100 x büyütme elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: karşılaştırma algoritma (siyah) ve insan (gri) sonuçlarının analizleri. A. zaman slaytlar protokole göre hazırlanmış ve en iyi görüntüleri elde edilir ölçümleri arasında kayda değer hiçbir fark yoktur. B. protokol değil izlediyseniz algoritma doğru tanımlamak ve kapsül ölçmek. Burada özellikle arka plan tutarlı değildi ve orada kapsül ve arka plan arasındaki kontrast açık değildir. T-testi ile hesaplanan önemli varyasyonları olarak kaydetti * P < 0,05 değerleri için. C. bağımsız bir araştırmacı protokolü takip etmek ve onların analizleri algoritması ile karşılaştırmak istendi. Görüntüleri düzgün elde sürece güvenilirlik gözlemciler korunur. Ö. İkinci mikroskop ile ikinci bir bağımsız araştırmacı bireyler ve donanım üzerinde doğruluk algoritma korur onaylamak için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Algoritma olası bir alternatif uygulama: kimlik ve floresan mikroskopi ölçümü. Hücre organları lekeli ve Uvitex ile yansıma sonra algoritması tarafından tanımlanan. Algılanan daire algılama Floresans İşaretimle dayalı olduğu için ne hücre duvarı olarak etiketlenmiş olacak bir geçmiş genişletir. Algılama algoritması rakamlar 1B ve 2Btemsil ilk ikili görüntü oluşturmak için kullanılan eşik değiştirerek sinyal (hücre duvarı) özellikle parlak birikimi tanımlamak için uygun olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 1: uygulama bir Windows ortamında çalışan bir temsilcisi ekran. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: algılanan tomurcuklanma temsilleri Maya hücreleri. Ölçek çubuğu 10 µm. A. temsil eder Bir üst hücre ve bud kendi kapsül içinde ayrı hücreler olarak sayılır. Kendi kapsül ve diğer hücre kapsül için bir kez için dört toplam hücrelerinde kaynaklanan bir üst ve bir bud kez algılandı B. A üst hücre ve bud her iki kere saydım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 3: hücre algılama ve ölçüm sonra sağlanan son verilerin bir sunumunu. Görüntü dosyası orijinal görüntü adını gösterir. Toplam RADIUS temsilcisi yeşil daireler, kapsül ve hücre kombine vücut RADIUS ile ifade eder. Kapsül x ve kapsül y bu veriler için geçerli olduğu kapsül koordinatlarını bakın. Vücut RADIUS temsilcisi mavi daireler RADIUS ile ifade eder. Kapsül RADIUS sadece kapsül yarıçapı içinde ortaya çıkan vücut RADIUS eksi toplam RADIUS anlamına gelir. Kullanıcı adım 3.2.5 bir piksel mikron dönüşüm oranı dahil sürece bu değerleri mikron olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tekniğin önemli adımlar çini mürekkebi slayt hazırlama ve mikroskop görüntüleri elde etme. Algoritma başarıyla çeşitli slayt ve görüntü teknikleri ile test ederken önerilen bir protokoldür bu el yazması açıklanmıştır. Polisakkarit kapsülü bu parçacıklar polisakkarit Fibriller ağ nüfuz için çok büyük olduğundan mürekkep parçacıklar dışlama kapsül etki alanından göre tespit edilmiştir. Çini Mürekkebi dışlama koyu arka plan üzerine bir daire sonuçlanır. Algoritma daireler üzerinde ne kadar iyi kendi arka plan ile kontrast göre algılar. Böylece, bir ağır çini mürekkebi leke polisakkarit kapsülü sinyal gürültü oranı artan ve sonuç kalitesini artırma arka plan arasında daha yüksek kontrast neden olur. Buna karşılık, hücre vücut parlak bir arka plan üzerinde koyu bir daire olarak algılanır. Hücre vücut mikroskop ayarlamak hangi odak düzlemi diffüz görünen daire üstündeki gri veya alt hücre ve yoğun karanlık grup merkezi olarak temel görünümünü değiştirmek. Bu en doğru daire algılama yol açar gibi zaten tartışılan aynı nedenlerle hücre vücut yoğun, koyu bir grup olarak görüntülendiği odak düzlemi resim alma için kullanılmalıdır.
Rapor burada yöntemi çeşitli değişiklikler ve sorun giderme tur ilerlemiştir. Algoritma ilk kodlanmış hücreleri 4'ten daha küçük olmaz bekliyor ya da kullanılan mikroskop esaslı 60 piksel daha büyük. Bu algoritma uygulaması farklı büyüklüklerde ve bu sınırlar yerine iletişim kuralında tanımlanan kullanıcı giriş alanları tarafından değiştirildi hücre boyutlarını genişletmek için. Kullanıcılar şimdi giriş parametreleri her deneme için maksimum doğruluk için belirli. Eğer bu algoritma Cryptococcus kapsül ölçüm dışında bir durum için uygulanan bu örnekleri nasıl oluşturulur ve yansıma belirlemek için mesafe koşulları bir dizi ilk ayarlamak için önerilir.
Bu tekniğin en önemli sınırlama bu akılda, yani cryptococcal kapsül ölçümü belirli bir uygulama ile dizayn edilmiştir var. Ek uygulamalar uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir iken, bu komut dosyası yalnızca yukarıda özetlenen kapsül ölçüm protokolü için doğrudan uygulanabilir olduğunu. Ancak, bu sınırlama da bu yöntemi kendi alanı ile ilgili olarak ve varolan yöntemleri için önemini açıklar. Ayrıca, tomurcuklanan Maya hücreleri bir sorun sadece üst hücre boyutları ölçmek isteyen araştırmacılar için sunabilirim. Bu algoritma tomurcukları benzersiz hücreler (Şekil S2A) olarak tespit yeteneğine sahiptir. Araştırmacı bud ölçümleri kaldırmak veya bu olamaz eğer her iki hücre kaldırma için istedikleri hangi durumda hangi daire tomurcuk algılandığında tespit ve üstüdür, ilk olarak, bu bir sorun olabilir. Tomurcuk hala durum algoritma bud ebeveyn kapsül referans olarak ölçmek ebeveyn kapsül (Şekil S2B) sınırları içinde bir hücre organ olarak tespit edilirse ikinci olarak, bu başka bir sorun neden olabilir. İki kez her hücre vücut iki kapsül içinde bulunduğundan bu örnekte her hücre sayılır. İletişim kuralı tamamlandıktan sonra da bu sorunların kolayca saptanabilir. Son veri kümesi nerede her birey hücre etiketli görüntü dosyası geldiğini ve x göre tespit bir elektronik tablo olarak görünür ve y koordinatları hücre vücut (Şekil S3). Müfettişler sadece bulmak ve tomurcuk eşleşen verileri dışlamak. Kapsül boyutlarına rağmen önemli bir varlık ve ağır Cryptococcus alan kapsül ölçüm veya görüntü edinme için standart iletişim kuralları kurmak henüz virülans faktörü okudu. Bu teknik ile en az Önkoşullar doğru ve uygun bir şekilde laboratuvarlar için serbestçe kullanılabilir bu rolleri doldurmak için tasarlanmıştır.
Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar büyük ölçüde diğer deneyler uygulamak üzeresiniz. Herhangi bir görüntü algılama dayalı veya ölçüm dairesel nesneler bu algoritma analyzable olmalıdır. Floresan mikroskopi görüntüleri bireysel lazer kanallara algoritma uygulayarak analiz edilebilir. Bakteriyel koloni sayımı elde edilebilir ve ek değişiklik ile galaktoz gazeteciler arasında ayırt edilebileceğini. Maya kolonisi büyüme deneyleri de koloni alan boyutunu tahmin etmek için bu algoritma kullanılarak hesaplandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Anthony olan slaytlar ikinci insan yan yana karşılaştırma olarak kullanılan Bowen hem de Sabrina olan slaytlar bir üçüncü insan-yan yana ve ikinci mikroskop karşılaştırma olarak kullanılan Nolan kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
