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Immunology and Infection

Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Cette technique décrit un processeur d’image batch automatisé conçu pour mesurer les rayons de corps et de la capsule polysaccharidique. Initialement conçu pour les mesures capsules Cryptococcus neoformans , que le processeur d’image automatisé peut également s’appliquer aux autre détection de contraste basé des objets circulaires.

Abstract

Le but de cette technique est de fournir un processus cohérent, précis et facile à gérer pour un grand nombre de mesures capsule polysaccharidique.

Tout d’abord, une image de seuil est générée en fonction sur les valeurs d’intensité unique calculés pour chaque image. Puis, cercles sont détectés basée sur le contraste entre l’objet et l’arrière-plan à l’aide de l’algorithme de Transformation de Hough de cercle (CHT) bien établi. Enfin, les capsules de cellules détectées et les organes sont adaptées selon les coordonnées du centre et de la taille du rayon, et données sont exportées vers l’utilisateur dans un tableur facile à gérer.

Les avantages de cette technique sont simples mais importantes. Tout d’abord, parce que ces calculs sont effectués par un algorithme plutôt qu’un être humain l’exactitude et la fiabilité sont augmentés. Il n’y a pas de déclin dans l’exactitude ou la fiabilité peu importe combien d’échantillons est analysés. Deuxièmement, cette approche établit un mode opératoire normalisé potentiel pour le champ de Cryptococcus plutôt que de la situation actuelle où les capsule mesure varie selon le laboratoire. Troisièmement, étant donné que les mesures capsules manuelles sont lent et monotone, automation permet des mesures rapides sur un grand nombre de cellules de levure qui à son tour facilite l’analyse de données à haut débit et des statistiques de plus en plus puissants.

Les principales limites de cette technique viennent de comment les fonctions de l’algorithme. Tout d’abord, l’algorithme ne générera pas cercles. Alors que les cellules de Cryptococcus et leurs capsules prennent une morphologie circulaire, il serait difficile d’appliquer cette technique de détection d’objet non circulaire. Deuxièmement, en raison de comment sont détectées les cercles l’algorithme CHT peut détecter les énormes Pseudo-cercles basés sur les bords extérieurs de plusieurs cercles en cluster. Cependant, n’importe quel corps cellulaires dénaturés, pris dans le Pseudo-cercle de peut être facilement détectés et supprimés d’ensembles de données qui en résulte.

Cette technique est destinée à mesurer les capsules polysaccharidiques circulaire des espèces de Cryptococcus basés sur l’encre de Chine microscopie en champ clair ; Bien qu’elle pourrait s’appliquer aux autre contraste basé ses mesures objet circulaire.

Introduction

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Cryptococcus neoformans est une levure pathogène trouvée partout dans le monde entier qui est associé à des maladies humaines, principalement dans les populations immunodéprimées. C. neoformans représente surtout une cause importante de décès annuels totales en Afrique subsaharienne à cause de maladies infectieuses1. La principale manifestation clinique infection cryptococcique est une méningo-encéphalite, qui suit l’invasion du système nerveux central par les transports dans les macrophages infectés (manière de cheval de Troie) ou traversée directe de la barrière hémato - encéphalique. C. neoformans exprime plusieurs facteurs de virulence, y compris la possibilité de répliquer à la température du corps humain, l’activité uréasique, mélanisation et formation d’une capsule polysaccharidique2. La capsule de polysaccharide est composée de répéter des glucuronoxylomannan et des polymères glucoronoxylomannangalactan et des fonctions comme une barrière protectrice contre les facteurs tels que le stress environnemental et hôte des réponses immunitaires2.

Bien que la taille de la taille de capsule polysaccharidique cryptococcique n’a pas toujours été associée avec virulence, il y a des preuves que c’est un facteur dans la pathogenèse2,3,4,5, 6,7. Taille de la capsule est associé à la méningite pathologie6, peut affecter la capacité des macrophages pour contrôler l' infection de Cryptococcus 5et peut causer une perte de virulence si absent8. Donc, Mensurations taille capsule sont communes dans la recherche de cryptocoque, mais il n’y a aucun fieldwide standard pour une méthode de mesure de la capsule.

Actuellement, c. neoformans polysaccharide capsule mesure repose sur des mesures manuelles d’images de microscopie, et les méthodes exactes des acquisitions d’image et de mesure varient selon les laboratoires9,10, 11. Une préoccupation immédiate à cette méthode, c’est que certaines études nécessitent l’acquisition de milliers de mesures individuelles, ce qui rend difficile la maintien de précision et de fiabilité. En outre, même lorsque les résultats sont publiés, il y a souvent une description insuffisante de la méthode de mesure. Nombreuses publications n’expliquent pas comment leurs mesures ont été obtenues, quel plan focal a été utilisé, comment ils ont déterminé le seuil pour l’identification des capsule, si ils utilisaient rayon ou le diamètre, ils ont utilisé une mesure ou était en moyenne de plusieurs, ou d’autres Détails. Certaines publications seul État leur méthode dans le programme qui a été utilisée, par exemple, « Adobe Photoshop CS3 a été utilisé pour mesurer les cellules »11. Ce manque de normalisation et des rapports de détail peut rendre reproductibilité difficile voire impossible. Différences de vue humaine, la luminosité de l’ordinateur, paramètres de microscope, faire glisser l’éclairage et autres facteurs peuvent varier non seulement entre les individus, mais entre les échantillons, alors que les calculs basés sur les rapports des valeurs d’intensité pixel reste constantes et Il y a lieu entre les échantillons. Cette technique a été générée dans le contexte de la fourniture d’une technique normalisée, précise, rapide et simple pour mesurer des tailles de capsules pour un champ dans lequel il n’y avait aucun avant.

Tel que mentionné précédemment, l’algorithme CHT est établie de longue date, et scripts pour détecter automatiquement les cercles ont été écrit avant. Cette méthode améliore dans deux domaines où les autres scripts tomberait courts. Tout d’abord, simplement détecter les cercles ne suffit pas, car avec les cellules cryptococciques deux cercles distincts doivent être constatées par rapport à l’autre. Cette méthode détecte spécifiquement corps cellulaires dans les capsules, établit une distinction entre les deux et effectue des calculs que sur les paires de corps-capsule pertinentes. En second lieu, même lorsque suivant le même protocole, les différents chercheurs finiront avec différents acquis des images. En permettant le contrôle de l’enquêteur sur chaque paramètre d’algorithme, cet outil peut être réglé pour correspondre à un large éventail de méthodes d’acquisition. Il n’y a pas besoin d’un cadre normalisé, objectif, filtre et ainsi de suite.

Cette technique peut être appliquée facilement à toute situation dans laquelle l’enquêteur doit détecter les cercles dans une image qui contraste avec leur fond. Les deux cercles plus légers et plus sombres que leur origine puisse être détectée, compté, mesuré à l’aide de cette technique.

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Protocol

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1. préparation de l’encre de Chine diapositive

  1. Déposer 10µl de cryptococcose échantillon sur une diapositive. Toute souche de levure circulaire va fonctionner, mais pour cette expérience H99 était la seule souche utilisée.
    Remarque : Si l’échantillon est directement à partir de milieux de culture, dilution 1:2 avec PBS ou l’eau peut empêcher l’encre de Chine de s’agglutiner.
  2. Distribuer 2 µL de tache d’encre sur l’échantillon et mélanger en physiquement pousser l’embout de la pipette à l’échantillon et se déplaçant dans un mouvement circulaire jusqu'à ce que l’encre de Chine semble répartie de façon uniforme.
  3. Placez un lamelle couvre-objet sur l’échantillon en appuyant sur le bord gauche de la lamelle couvre-objet sur la surface de la diapositive, puis légèrement et uniformément abaissant l’autre côté de la lamelle couvre-objet sur l’échantillon.
  4. Permettre à la lame à l’air sec pendant 5 min.
  5. Exercez une légère couche de vernis à ongles à la frontière de la lamelle couvre-objet pour former un joint et préserver la tache d’encre de Chine.

2. imagerie Slide

  1. Placer les lames dans un microscope à champ lumineux avec une fixation de la caméra et connue pixel-à-micron conversion. Ajuster les filtres, objectifs et le contraste afin que les capsules de cellule sont claires et les corps cellulaires sont des bandes focalisées et sombres.
    NOTE : Les différents filtres, objectifs et paramètres de contraste vont travailler mais un 20 x objectif, filtre Ph1 et binning 2 x 2 est recommandé.
  2. Assurez-vous que le champ de vision est dense mais pas surpeuplée avec cellules cryptococciques, avec un contraste clair entre la capsule de la cellule et l’arrière-plan et correctement ciblée avec le corps de la cellule visualisé comme une bande sombre.
    Remarque : Le nombre exact de cellules pour une image optimale variera selon l’échantillon et l’objectif utilisé. Les aspects importants sont pour cellules ne soient pas en clusters ou qui se chevauchent, que les plans focaux de cellule ne varient pas significativement, et qu’il n’y a encre importante tachent bien visible à l’arrière-plan (au moins 25 % du champ).
  3. Enregistrer des images dans un répertoire unique avec des titres clairs, comme l’algorithme de mesure sera exécutée sur des images dans un répertoire unique et les données de sortie seront organisées selon les noms des fichiers image.

3. algorithme Setup

  1. Installez Python version 2.7 de
  2. Installer les bibliothèques supplémentaires python en exécutant les commandes « pip installer oreiller » et « pip install openpyxl ».
  3. Installer MATLAB en suivant les instructions à
  4. Construire la bibliothèque python MATLAB en suivant les instructions fournies à https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Télécharger les trois fichiers requis inclus dans documents de ce manuscrit complémentaires (« QCA.py », « Analysis2.m » et « TestRun.m »).
    Remarque : Ces fichiers peuvent être extraits à n’importe quel endroit, mais tous les trois doivent être dans le même répertoire.

4. utilisation de l’algorithme

  1. Exécutez l’application en double-cliquant sur QCA.py.
    Remarque : L’application peut prendre plusieurs minutes pour démarrer. Le fichier « QCA.py » contient la structure du programme qui appelle les « fichiers ".m" » pour exécuter l’algorithme réel.
  2. Suivez les étapes décrites dans le programme.
    1. Entrée précédée d’une période, le type d’extension des fichiers image et séparées par des points-virgules (ex. ». TIF ;. JPEG ») puis cliquez sur le bouton entrer .
    2. Choisissez le répertoire dans lequel se trouvent les fichiers d’image en cliquant sur le bouton Sélectionner le répertoire et sélectionner le dossier qui contient les images.
    3. Générer la liste des fichiers d’image dans le répertoire en cliquant sur le bouton Générer liste d’images . Les images apparaîtront dans la zone de texte vers la droite. Examiner et s’assurer de que la liste est exacts et complets.
    4. Sélectionnez une image au hasard dans la liste à utiliser comme un aperçu en cliquant sur le bouton Sélectionner une Image aléatoire .
      Remarque : Si l’image ne peut pas ouvrir en raison d’une « erreur de mode image incorrecte », l’algorithme encore fonctionnera correctement malgré ne pas afficher l’image. Après l’étape 4.2.7, affichera toujours l’image de test.
    5. Objectif de microscope et sélection des paramètres d’entrée. Si les paramètres par défaut ne correspondent pas au microscope utilisé, sélectionnez « Custom Pixel Conversion » et introduisez la conversion pixel-à-um pour les fichiers image. Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton de Conversion de calculer et d’assurer que la conversion est correcte selon la zone de texte sur la droite.
      NOTE : Les images représentatives illustrés à la Figure 1 ont été calculés avec 40 x grossissement et 2 x 2 binning sélectionné.
    6. Entrée des paramètres de l’algorithme de détection de cercle.
      1. Le rayon minimal et maximal détectable pour la détection de capsule externe comme les entrées Min et Max Capsule rayon d’entrée. Une plage plus petite permet des résultats plus précis.
      2. Le rayon minimal et maximal détectable pour détection corps cellulaire comme les entrées Min et Max corps cellulaire rayon d’entrée.
        Remarque : Tous les quatre de ces entrées doivent être nombres représentant leurs valeurs respectives en pixels, selon les images de la source.
      3. Déplacez les curseurs de Capsule et de la sensibilité du corps cellulaire d’ajuster le seuil de sensibilité de l’algorithme. Une faible sensibilité sera stricte et réduire la détection de faux positifs cercle, mais peut aussi détecter des cercles réels moins. À l’inverse, une sensibilité élevée augmentera le taux de détection, mais peut aussi entraîner des milieux positifs fausses.
        NOTE : Résultats représentatifs ont été obtenus avec un rayon minimal de capsule de 7, rayon capsule maximum de 45, rayon de corps minimale de 4, rayon de corps maximale de 30, capsule sensibilité de 87 et sensibilité de l’organisme de 87.
    7. Tester les paramètres de l’image sélectionnée au hasard en cliquant sur le bouton Exécuter le Test . Les résultats seront affichés au centre supérieur de la programme pour remplacer l’image d’origine. Si les résultats semblent exacts, il est recommandé de sélectionner une image aléatoire supplémentaire pour faire ainsi en sorte que les paramètres sélectionnés seront adaptera à toutes les images sélectionnées.
      1. Maximiser le nombre de corps et capsules détectés et inspectent visuellement si les cercles apparaissent pour monter correctement. Le nombre de corps dans les capsules détectés s’affiche dans la zone de texte vers la droite. Jusqu'à ce que les résultats sont exacts, manipuler les paramètres d’algorithme.
        NOTE : Les cercles colorés épais sont uniquement pour aider à la visualisation. Les cercles réelles générées pour la mesure est une courbe mathématique calculée par l’algorithme HCT.
    8. Exécuter l’algorithme de détection sur tout le répertoire des fichiers d’image en cliquant sur le bouton Commencer l’analyse . Chaque image sera analysé et le programme affiche « fini » dans la zone de texte vers la droite lorsque toutes les images ont été analysées.
    9. Cliquez sur le bouton de nettoyage et Match . Cela correspond à des corps cellulaires détectés aux capsules détectés qu’ils résident dans et calculer le rayon vrai capsule en soustrayant le corps de la capsule.
      Remarque : Si l’algorithme est utilisé pour détecter la fluorescence ou une autre situation dans laquelle un seul cercle est détecté cette étape est inutile. Au lieu de cela cliquez sur les Seules les instances de tirer ou Seulement tirer les Capsules pour recueillir les données pour seulement le bleu ou seulement les cercles verts, respectivement. Il est important de noter que si seulement les données de la capsules sont récupérées le rayon réfèrera au rayon total de la cellule comme le rayon du corps cellulaire ne pourrait pas être soustraite.
    10. Localiser les données dûment remplies dans le fichier « CleanedOuput.csv » dans le répertoire de l’image. Si seulement un élément de données a été activée, le fichier sera intitulé « CleanedBodies.csv » ou « CleanedCapsules.csv ».

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Representative Results

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Tout d’abord, les images sont obtenues en microscopie de diapositives d’encre utilisant un microscope à champ lumineux couplé avec un appareil photo (Figure 1A). Il est important d’avoir des cellules séparées et sa densité suffisamment faible ne pas de submerger le champ de vision, ainsi qu’à utiliser assez tache pour créer un contraste entre les cellules et l’arrière-plan. Comme indiqué dans le protocole, le nombre exact de cellules pour une image optimale dépendra de l’échantillon, le microscope et objectif utilisé. Les aspects importants sont pour cellules ne soient pas en clusters ou qui se chevauchent, que les plans focaux de cellule ne varient pas significativement, et qu’il n’y a encre importante tachent bien visible à l’arrière-plan (au moins 25 % du champ). Ces indications permettent l’algorithme permettant de déterminer un seuil unique à chaque image en prenant la valeur d’intensité moyenne pixel et en ajoutant l’écart-type. Un pixel avec une valeur d’intensité supérieur dudit seuil est considéré comme blanc et pas avec une valeur d’intensité plus faible est considéré comme noir. L’image qui en résulte permet une distinction claire et nette de lorsque la capsule termine (Figure 1B). L’algorithme a ensuite un cercle robuste blanc sur noir contraste basée à détecter de la capsule et l’image d’origine prévoit un cercle noir sur blanc robuste de corps cellulaires. Une visualisation représentante des cercles détectés est générée dans le cadre du programme (Figure 1C). Cela permet à l’utilisateur rapidement analyser à travers des images traitées et s’assurer que les résultats apparaissent exactes.

Il est essentiel de suivre le protocole exact pour acquérir des images optimales. Images sous-optimal résultent habituellement d’un manque de contraste entre la capsule et de l’encre (Figure 2A). Paramètres de contraste et acquisition optimales variera selon échantillon, modèles experiment, caméra et microscope, etc.. Une image optimale est un où les cellules de levure sont séparés si possible, où le bord extérieur de la capsule a claire contrairement à la tache d’encre de Chine, et où le corps cellulaire se concentre d’apparaître comme une bande sombre qui contraste fortement avec son arrière-plan. Si trop de cellules sont dans le champ de vision, ou si la tache est trop léger, les valeurs d’intensité de pixel seront en cluster et le programme ne sera pas en mesure d’établir un seuil capable d’élucider la capsule taille (Figure 2B). Lorsqu’on utilise des images moins qu’optimales le programme peut détecter des cercles de taille incorrecte, pas être capable de détecter des cercles ou détecter plusieurs Pseudo-cercles de issus des artefacts dans l’image de seuil (Figure 2C).

Détection des corps cellulaires pose un problème similaire en ce que le corps de la cellule doit être visualisé comme un cercle noir robuste sur le fond blanc de la capsule. Ce problème est abordé dans le protocole en décrivant le plan focal désiré pour l’acquisition d’images. Le meilleur plan focal à utiliser est un dans lequel le corps cellulaire apparaît comme une bande sombre, concentrée (Figure 3A). Ce plan focal est acceptable en tant que norme parce qu’il porte bien la cellule. Cela a été confirmé par la visualisation de la paroi cellulaire avec Uvitex, une tache de chitine (Figure 3B). La Uvitex tache montre clairement un croustillant, axé pariétaux avec signal faible dans le Centre (où le haut et le bas du corps cellulaire pourraient être tachés, floue).

Dans le développement de cette méthode, il est également important de confirmer que cet algorithme pourrait déterminer avec précision les mesures de capsule et corps cellulaire. Tandis que les cercles représentant les figures précédentes sont prometteurs, les mesures réelles ont été comparés entre ordinateur et Mensurations humaines. Lorsque le protocole est suivi fidèlement et images optimales sont obtenues, l’algorithme est précise et fiable (Figure 4A). Toutefois, si le protocole est suivi de manière incorrecte et sous-optimale images sont obtenues en raison de la mauvaise coloration, surpeuplement ou d’autres paramètres mentionnés précédemment, l’algorithme perd exactitude et ne peut pas récapituler les mensurations humaines (Figure 4B ). Étant donné que cette technique a été initialement développée pour une personne en particulier (premier auteur), une personne différente a été invitée à utiliser pour déterminer si les différences entre les styles de la souillure et la mesure affecterait précision malgré le protocole suivant. Les résultats ont montré que cette technique a été largement applicable tant que le protocole a été respecté comme ayant reçu des directives (Figure 4C). De même, cette technique peut servir à n’importe quel microscope capable d’acquérir des images de contraste de phase des lames préparées de l’encre de Chine. Afin d’assurer l’algorithme précis avec d’autres configurations de microscope, que cette expérience a été répétée par un tiers investigateur à l’aide d’un microscope à champ lumineux différent couplé à une caméra et comparé détectés diamètres capsules avec capsule manuellement mesurée diamètres. Aucune différence significative n’a été observée entre l’ordinateur et Mensurations humaines (Figure 4D).

Enfin, les futures applications de cet algorithme ont été explorées dans le contexte de la coloration de la fluorescence. Étant donné que l’imagerie de fluorescence est toujours issu des rapports signal sur bruit de valeurs d’intensités de pixels l’algorithme devrait être facilement applicable aux images de fluorescence tant que la tache est circulaire dans la nature. Cette demande a été confirmée lorsque l’algorithme a été capable de détecter avec succès Qu'uvitex teinté corps cellulaires à partir des images décrites précédemment (Figure 5A, 5 b). Les utilisateurs doivent être prudents afin d’optimiser les paramètres d’algorithme pour leur expérience, et des protocoles standardisés devraient être élaborées à l’avenir pour toute nouvelle demande.

Figure 1
Figure 1 : Des résultats représentatifs de l’image obtenue de façon optimale. A. l’image initiale acquise par microscopie en champ clair d’une diapositive à l’encre de Chine. B. l’image binaire créé en utilisant un seuil calculé à partir de la valeur d’intensité moyenne pixel ajoutée à l’écart. Toutes les valeurs supérieures à ce seuil sont considérés comme blanc et tous ci-dessous sont considérés comme noir. C. une visualisation des capsules (vert) et les corps cellulaires (bleu) détectés par l’algorithme. Toutes les images ont été obtenues à un grossissement de x 40 avec binning 2 x 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs d’une image obtenue sous-optimales. A. la diapositive encre initiale acquise par microscopie en champ clair. Coloration inégale et insuffisante entraîne un fond particulièrement brillant avec des gradients d’intensité. B. l’image binaire résultante, dans laquelle capsules ne peuvent être clairement distingués en raison du signal de fond élevé. C. plusieurs capsules sont indétectables. Toutes les images ont été obtenues à un grossissement de x 40 avec binning 2 x 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: corps de cellule de détection. A. image de champ lumineux de capsule centrée dans le plan focal préféré. B. Uvitex image de fluorescence du corps cellulaire dans le plan focal préféré. Des images ont été obtenues à un grossissement de x 100 avec binning 2 x 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: analyses des comparaisons de résultats algorithm (noir) et homme (gris). A. lorsque les lames sont préparées selon le protocole et les images optimales sont obtenues il n’y a aucune différence appréciable entre les différentes mesures. B. si le protocole n’est pas respecté l’algorithme ne peut pas correctement identifier et mesurer capsules. Ici, plus précisément l’arrière-plan n’était pas conforme et il n’y avait ne pas clair contraste entre capsules et arrière-plan. Des variations importantes, calculées par le test t est remarqué que * pour des valeurs de P < 0,05. C. un enquêteur indépendant a été invité à se conformer au protocole et à comparer leurs analyses avec l’algorithme. Fiabilité est conservée dans les observateurs tant que les images sont bien acquises. D. Un deuxième chercheur indépendant avec un deuxième microscope a été utilisé pour confirmer que l’algorithme conserve précision autre personnes et matériel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Une application alternative potentielle de l’algorithme : identification et la mesure de la microscopie de fluorescence. Corps cellulaires ont été colorés et imagés avec Uvitex, puis identifiés par l’algorithme. Le cercle détecté s’étend au-delà de ce qui pourrait être étiqueté comme la paroi cellulaire parce que la détection est basée sur le signal de fluorescence. L’algorithme de détection peut être adaptée pour identifier précisément l’accumulation plus brillants du signal (la paroi cellulaire) en modifiant le seuil utilisé pour générer l’image binaire initiale représentée dans les Figures 1 b et 2 b. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 1
Supplémentaire Figure 1 : une capture d’écran représentative de l’application qui s’exécute dans un environnement Windows. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 2
Supplémentaire Figure 2 : représentations de bourgeonnement détecté les cellules de levure. Barre d’échelle représente 10 µm. A. Une cellule-mère et le bourgeon compté comme des cellules séparées dans leur capsule. B. une cellule de parent et le bourgeon comptent deux fois, une fois pour leur propre capsule et une fois pour l’autre capsule de cellule, ce qui a entraîné quatre cellules totales détecté d’un parent et un bourgeon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 3
Supplémentaire Figure 3 : une représentation des données finales fournies après la cellule de détection et de mesure. Fichier image renvoie au nom de l’image originale. Rayon total désigne le rayon des cercles verts représentant, capsule et corps cellulaire combiné. Capsule x et y de la Capsule se référer aux coordonnées de la capsule pour lesquels ces données s’applique à. Rayon de corps désigne le rayon des cercles bleus représentant. Rayon de la capsule se réfère au rayon total moins le rayon du corps, résultant dans un rayon de seulement la capsule. Ces valeurs seront en microns tant que l’utilisateur a inclus un taux de conversion pixel-à-micron dans étape 3.2.5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Les étapes critiques de cette technique sont préparer la diapositive de l’encre de Chine et acquérir les images de microscope. Alors que l’algorithme a été testé avec succès avec une variété de techniques de diapositive et image le protocole recommandé est décrite dans ce manuscrit. La capsule de polysaccharide est détectée basée sur l’exclusion des particules d’encre du domaine de la capsule, puisque ces particules sont trop grosses pour pénétrer dans le réseau de fibrilles de polysaccharide. Exclusion de l’encre de Chine se traduit par un cercle lumineux sur un fond sombre. L’algorithme détecte les cercles basés sur la façon dont ils contrastent avec leurs origines. Ainsi, une tache d’encre de Chine lourde se traduira par un contraste plus élevé entre la capsule polyosidique et fond, augmenter le rapport signal sur bruit et amélioration de la qualité du résultat. À l’inverse, le corps cellulaire est détecté comme un cercle foncé sur un fond clair. Le corps cellulaire va changer d’apparence basé sur quel plan focal est sur le microscope, apparaissant comme un diffus gris cercle en haut ou en bas de la cellule et comme une condensé bande sombre au centre. Pour les mêmes raisons déjà discutés, le plan focal, où le corps de la cellule apparaît comme une bande condensée, sombre doit servir pour l’acquisition d’images comme cela se traduira par la détection de cercle plus précise.

La méthode mentionnée ici a progressé au travers de plusieurs modifications et plusieurs obus de dépannage. L’algorithme a été initialement codé attend que les cellules ne serait pas plus petits que 4 ou supérieur à 60 pixels basés sur le microscope qui a été utilisé. D’étendre l’application de cet algorithme à différents grossissements et taille des cellules que ces limites étaient plutôt remplacés par les champs d’entrée utilisateur décrits dans le protocole. Les utilisateurs peuvent maintenant entrer paramètres spécifiques à chaque expérience pour une précision maximale. Si cet algorithme est appliqué à une situation à l’extérieur de Cryptococcus mesure capsule il est recommandé pour ce premier ensemble une série de préliminaire des conditions pour déterminer comment les échantillons devraient être générés et imagés.

La plus importante limitation de cette technique est qu’il a été conçu avec une application spécifique à l’esprit, à savoir la mesure de la capsule cryptococcique. Alors qu’il peut être facilement modifié pour s’adapter à des applications supplémentaires, ce script n’est directement utilisable pour le protocole de mesure capsule décrit ci-dessus. Toutefois, cette limitation décrit également l’importance de cette méthode en ce qui concerne son domaine et aux méthodes actuelles. En outre, le bourgeonnement des cellules de levure peuvent présenter un problème pour les chercheurs qui souhaitent seulement mesurer les tailles de cellule de parent. Cet algorithme est capable de détecter les bourgeons sous forme de cellules uniques (Figure S2A). Tout d’abord, cela peut être un problème si l’enquêteur auquel cas ils souhaiteraient la supprimer les mesures de bourgeon ou de supprimer les deux cellules si elle ne peut pas être déterminé qui a détecté le cercle est le bourgeon et qui est le parent. Deuxièmement, cela peut entraîner un autre problème si le bourgeon est détecté comme un corps cellulaire toujours dans les limites de la capsule parentale (Figure S2B), dans lequel cas l’algorithme mesurera le bourgeon en référence à la capsule parental. Dans cet exemple chaque cellule est comptée deux fois, car chaque corps cellulaire se trouve dans deux capsules. Ou l’autre de ces problèmes peuvent être résolus facilement une fois que le protocole est terminé. La dernière série de données s’affiche comme une feuille de calcul où chaque individu détecté cellulaire est étiqueté selon le fichier image, il est venu et le x et y coordonnées du corps cellulaire (Figure S3). Les enquêteurs peuvent simplement trouver et exclure les données qui correspond à le œuf. Malgré la taille de la capsule étant un élément important et largement étudié facteur de virulence que le champ Cryptococcus n’a pas encore d’établir des protocoles standard pour l’acquisition de mesure ou image capsule. Cette technique a été conçue pour remplir ces rôles de manière précise et pratique disponible gratuitement aux laboratoires avec la configuration minimale requise.

Les applications futures de cette technique sont en grande partie pour l’appliquer à d’autres expériences. N’importe quelle image base de détection ou mesure d’objets circulaires doit être analysable par le biais de cet algorithme. Images de microscopie fluorescente peuvent être analysés en appliquant l’algorithme de canaux individuels laser. Comptage de colonies bactériennes est possible et avec la modification supplémentaire pourrait distinguer les reporters de galactose. Tests de croissance levure colonie pourraient aussi être évalués à l’aide de cet algorithme pour estimer la taille de la colonie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Anthony Bowen dont diapositives ont été utilisés comme une deuxième comparaison côte-à-côte humaine mais aussi Sabrina Nolan dont diapositives ont été utilisés comme un troisième homme side-by-side et la deuxième comparaison de microscope.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
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Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide <em>cryptococcique</em> espèces et corps cellulaire
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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