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Immunology and Infection

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

Abstract

Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.

Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.

Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.

Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.

Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.

Introduction

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Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschiedene Virulenzfaktoren, einschließlich der Fähigkeit, an der Temperatur des menschlichen Körpers, Urease-Aktivität, Melanization und Bildung eines Polysaccharid Kapsel2zu replizieren. Die Polysaccharid-Kapsel besteht aus Glucuronoxylomannan und Glucoronoxylomannangalactan Polymeren und Funktionen als Schutzbarriere gegen Faktoren wie Umweltbelastung und Host Immunantworten2zu wiederholen.

Obwohl die Größe der Cryptococcus Polysaccharid Kapsel nicht konsequent Virulenz zugeordnet wurde, gibt es Hinweise darauf, dass es ein Faktor bei der Pathogenese2,3,4,5, 6,7. Kapsel Größe Meningitis Pathologie6zugeordnet ist, kann Makrophagen Möglichkeit Cryptococcus -Infektion5Steuern beeinflussen und wenn abwesend8Verlust der Virulenz führen kann. Folglich, Kapsel Größenmessungen sind häufig in der Cryptococcus Forschung jedoch gibt es keine Fieldwide für eine Kapsel Messmethode.

Derzeit, C. Neoformans Polysaccharid Kapsel Messung basiert auf manuelle Messungen von Mikroskopie-Bildern, und die genauen Methoden der Übernahmen von Bild und Messung unterschiedlich Labors9,10, 11. Ein unmittelbares Anliegen dieser Methode ist, dass einige Studien den Erwerb von Tausenden von Einzelmessungen, der was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit erschwert. Außerdem, auch wenn die Ergebnisse veröffentlicht werden, gibt es oft unzureichende Beschreibung des Messverfahrens. Viele Publikationen nicht erklären, wie ihre Messungen gewonnen wurden, welche Brennebene verwendet wurde, wie sie den Schwellenwert für die Kapsel Identifikation bestimmt, ob sie Radius oder Durchmesser, verwendet, ob sie eine Messung oder im Durchschnitt mehrere oder andere Details. Einige Publikationen einzige Staat ihre Methode als welches Programm verwendet wurde, z. B. "Adobe Photoshop CS3 diente, die Zellen zu messen"11. Dieser Mangel an Standardisierung und reporting-Detail kann Reproduzierbarkeit schwierig wenn nicht gar unmöglich machen. Unterschiede in der menschlichen Sehvermögen, Computer Helligkeit, Mikroskop-Einstellungen, schieben Sie Beleuchtung und andere Faktoren können variieren zwischen Einzelpersonen, aber auch zwischen Proben, während Berechnungen anhand der Kennzahlen der Pixelwerte Intensität konstant bleibt und zwischen Proben anwendbar. Diese Technik wurde im Zusammenhang mit der Bereitstellung einer standardisierten, genauen, schnelle und einfachen Technik um Kapseln Größen für ein Feld zu messen, in denen gab es vorher keine, generiert.

Wie bereits erwähnt der CHT-Algorithmus ist seit langem etablierte und Skripts zur automatischen Erkennung Kreise vor geschrieben worden. Diese Methode verbessert in zwei Bereichen, wo andere Skripte kurz fallen würde. Erstens ist einfach Kreise erkennen nicht genug, da zwei verschiedene Kreise mit Cryptococcus Zellen zueinander erkannt werden müssen. Diese Methode speziell erkennt Zellkörper in Kapseln, unterscheidet zwischen den beiden und Berechnungen nur auf die entsprechenden Körper-Kapsel-Paare. Zweitens erworben auch als Anschluss an das gleiche Protokoll, verschiedenen Forschern mit verschiedenen landet Bilder. Dadurch, dass die Ermittler Kontrolle über jeden Algorithmus-Parameter, kann dieses Tool auf verschiedenste Akquisemethoden angepasst werden. Es gibt keine Notwendigkeit für eine standardisierte Umfang, Zielsetzung, Filter und So weiter.

Diese Technik kann leicht auf jede Situation angewendet werden, in denen der Prüfer Kreise innerhalb eines Bildes, dass Kontrast mit ihrer Herkunft zu erkennen muss. Beide Kreise heller und dunkler als ihre Hintergrund erkannt werden kann, gezählt und gemessen, mit dieser Technik.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Tusche Folie

  1. Pipette 10 µL Cryptococcus Probe auf eine Folie. Jede Runde Hefestamm funktioniert aber für dieses Experiment H99 war die einzige Sorte verwendet.
    Hinweis: Wenn die Probe direkt aus Kultur, Medien, Verdünnung 1:2 mit PBS oder Wasser helfen Verklumpung der Tusche zu verhindern.
  2. Pipette 2 µL Indien Tintenfleck auf die Probe und mischen, indem Sie körperlich schieben die Pipettenspitze auf die Probe und in einer kreisförmigen Bewegung verschieben, bis die Tusche gleichmäßig verteilte erscheint.
  3. Platzieren Sie ein Deckglas über der Probe durch Gedrückthalten der linken Kante des Deckglases gegen die Oberfläche der Folie, dann sanft und gleichmäßig Absenken der Gegenseite das Deckglas über die Probe.
  4. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 5 min.
  5. Wenden Sie eine dünne Schicht des Nagellacks sanft auf Deckgläschen Grenze bilden eine Dichtung und bewahren die Tuschefleck an

(2) Imaging-Folie

  1. Platzieren Sie Folien in einem Hellfeld-Mikroskop mit einer Kamera Aufsatz und bekannten Pixel-µm-Konvertierung. Einstellen Sie Filter, Ziele und Kontrast so, dass Zelle Kapseln klar sind und Zellkörper konzentriert, dunkle Bänder sind.
    Hinweis: Verschiedene Filter, Ziele und Kontrasteinstellungen funktioniert, aber ein 20 x Ziel, Ph1 Filter und 2 x 2 binning wird empfohlen.
  2. Sicherstellen Sie, dass das Sichtfeld ist dicht aber nicht überbevölkerten mit Cryptococcus Zellen mit deutlichen Kontrast zwischen Zelle Kapsel und Hintergrund, und richtig fokussiert mit den Zellkörper als ein dunkles Band visualisiert.
    Hinweis: Die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild variiert je nach Probe und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes).
  3. Speichern Sie Bilder in einem einzelnen Verzeichnis mit klaren Titel, wie die Messung-Algorithmus auf Bilder in einem einzigen Verzeichnis ausgeführt werden wird und die Ausgabe von Daten nach dem Namen der Image-Dateien organisiert werden.

(3) Algorithmus Setup

  1. Installieren Sie Python Version 2.7 von
  2. Weitere Python-Bibliotheken durch Ausführen der Befehle "Pip installieren Kissen" und "Pip installieren Openpyxl".
  3. MATLAB zu installieren, indem Sie die Anweisungen auf
  4. Build die MATLAB-Python-Bibliothek anhand der Anweisungen auf https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html zur Verfügung gestellt.
  5. Laden Sie die drei benötigten Dateien in dieser Handschrift Zusatzmaterialien ("QCA.py", "Analysis2.m" und "TestRun.m") enthalten.
    Hinweis: Diese Dateien können an einem beliebigen Speicherort extrahiert werden, aber alle drei müssen im selben Verzeichnis sein.

4. Verwendung des Algorithmus

  1. Führen Sie die Anwendung durch einen Doppelklick auf QCA.py.
    Hinweis: Die Anwendung kann mehrere Minuten zum starten dauern. Die "QCA.py"-Datei enthält die Programmstruktur, die die "m-" Dateien zum Ausführen des eigentlichen Algorithmus aufruft.
  2. Führen Sie die Schritte im Programm.
    1. Eingabe der Erweiterungstyp Bilddateien zeitlich vorangestellt und durch Semikolons getrennt (ex. ". TIF;. JPEG") dann klicken Sie auf die Enter -Taste.
    2. Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Bilddateien befinden, durch Klicken der Schaltfläche " Verzeichnis auswählen " und wählen Sie den Ordner, der die Bilder enthält.
    3. Erstellen Sie die Liste der Image-Dateien im Verzeichnis durch Anklicken des Buttons Generieren Bildliste . Die Bilder werden in das Textfeld auf der rechten Seite aufgelistet. Zu überprüfen Sie und sicherzustellen Sie, dass die Liste korrekt und vollständig sind.
    4. Wählen Sie ein zufälliges Bild aus der Liste als Vorschau klickst du Zufällige Bild auswählen .
      Achtung: Wenn das Bild nicht in der Lage, durch ein "falsches Bild Modus Fehler" zu öffnen, wird der Algorithmus noch richtig funktionieren trotz das Bild nicht angezeigt. Nach Schritt 4.2.7 zeigt noch das Testbild.
    5. Geben Sie Mikroskopobjektiv und binning Einstellungen ein. Wenn die Standardeinstellungen nicht übereinstimmen das Mikroskop verwendet, wählen Sie "Custom Pixel Konvertierung" und geben Sie die Pixel-auf-um Konvertierung für die Image-Dateien. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf Berechnen, Konvertierung und sicherzustellen Sie, dass die Konvertierung richtig laut das Textfeld auf der rechten Seite ist.
      Hinweis: Repräsentative in Abbildung 1 gezeigten Bilder wurden mit 40 x Vergrößerung und 2 x 2 binning ausgewählt berechnet.
    6. Eingabeparameter für die Kreis-Erkennung Algorithmus.
      1. Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die äußeren Kapsel Erkennung als Min und Max Kapsel Radius Einträge. Eine geringere Reichweite ermöglicht genauere Ergebnisse.
      2. Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die Zellkörper Erkennung als Min und Max Zellkörper Radius Einträge.
        Hinweis: Alle vier dieser Einträge sollte zahlen für ihre jeweiligen Werte in Pixel, nach der Quellbilder.
      3. Bewegen Sie die Kapsel und Zellkörper Empfindlichkeit Schieberegler die Sensibilitätsschwelle des Algorithmus anpassen. Eine geringe Empfindlichkeit wird streng sein und falsche positive Kreis Erkennung reduzieren, sondern auch weniger echte Kreise erkennen kann. Im Gegensatz dazu eine hohe Empfindlichkeit erhöht die Erkennungsrate aber auch unter Umständen falsche positive Kreise.
        Hinweis: Repräsentative Ergebnisse wurden mit einer Kapsel Mindestradius von 7, Kapsel Maximalradius von 45, minimale Körper Radius von 4, maximale Körper Radius von 30, Kapsel Empfindlichkeit von 87 und Körper Empfindlichkeit von 87.
    7. Prüfparameter auf zufällig ausgewählten Bild durch Anklicken der Schaltfläche Testen . Das Ergebnis erscheint oben in der Mitte des Programms, das ursprüngliche Bild zu ersetzen. Wenn die Ergebnisse genauer betrachten, empfiehlt es sich, wählen ein zusätzliche zufällige Bild, als auch zu versuchen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter werden alle ausgewählten Bilder passen.
      1. Maximieren Sie die Anzahl der Körper und Kapseln erkannt und visuell zu kontrollieren, ob die Kreise scheinen richtig passen. Die Anzahl der Körper in Kapseln erkannt wird in das Textfeld auf der rechten Seite angezeigt. Anderweitig, die Algorithmus-Parameter zu bearbeiten, bis die Ergebnisse genau sind.
        Hinweis: Die dicken farbigen Kreise sollen nur mit Visualisierung helfen. Die tatsächliche Kreise erzeugt für die Messung ist eine mathematische Kurve, die durch die HCT-Algorithmus berechnet.
    8. Führen Sie des Erkennungsalgorithmus auf das gesamte Verzeichnis von Image-Dateien durch Klicken auf die Schaltfläche Beginnen Analyse . Jedes Bild analysiert werden und das Programm zeigt "fertig" in das Textfeld auf der rechten Seite wenn alle Bilder analysiert wurden.
    9. Klicken Sie auf Spiel und Bereinigung . Dies wird entsprechen erkannten Zellkörper, die erkannten Kapseln, die, denen Sie Ihren Wohnsitz, und den wahre Kapsel Radius durch Subtraktion Körper von Kapsel zu berechnen.
      Hinweis: Wenn der Algorithmus verwendet wird, um Fluoreszenz erkennen oder eine andere Situation, in denen nur ein Kreis ist, dieser Schritt erkannt ist unnötig. Stattdessen klicken Sie Nur ziehen Körper oder die Schaltfläche " Nur ziehen Kapseln " zum Sammeln der Daten für nur blau oder nur die grüne Kreise, beziehungsweise. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn nur die Kapsel Daten abgerufen werden der Radius der Gesamtradius des der Zelle wird als Referenz der Radius der Zellkörper nicht abgezogen werden könnte.
    10. Suchen Sie die fertigen Daten in der Datei "CleanedOuput.csv" im Bildverzeichnis. Wenn nur ein Datenelement ausgewählt wurde, wird die Datei "CleanedBodies.csv" oder "CleanedCapsules.csv" beschriftet.

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Representative Results

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Bilder werden zuerst durch Mikroskopie von Tusche Dias mit einem Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera (Abb. 1A) gewonnen. Es ist wichtig, Zellen getrennt und in ausreichend niedrigen Dichte nicht um das Blickfeld, als auch zu überwältigen, genügend Fleck zu verwenden, um Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund zu schaffen haben. Wie im Protokoll erwähnt, variiert die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild je nach der Probe, Mikroskop und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes). Diese Richtungen erlauben den Algorithmus, um einzigartig zu jedem Bild einen Schwellenwert zu bestimmen, indem man die durchschnittliche Intensität Pixelwert und die Standardabweichung hinzufügen. Alle Pixel mit einem Intensitätswert höher als dieser Grenzwert gilt weiß und mit einer geringeren Intensitätswert gilt als schwarz. Das resultierende Bild ermöglicht eine klare und scharfe Unterscheidung der wo die Kapsel (Abbildung 1B) endet. Der Algorithmus hat dann einen robusten weiß-auf-schwarz-Kontrast basierend Kreis für die Kapsel zu erkennen und das Originalbild bietet einen robuste schwarz-auf-weiß-Kreis für Zellkörper. Eine repräsentative Visualisierung der erkannten Kreise entsteht im Rahmen des Programms (Abbildung 1C). Dies ermöglicht dem Benutzer, schnell durch die verarbeiteten Bilder analysieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse korrekt angezeigt werden.

Es ist wichtig, die genaue Protokoll um optimale Bilder zu erwerben. Suboptimale Bildern führen in der Regel aus einem Mangel an Kontrast zwischen Kapsel und Tinte (Abb. 2A). Optimalen Kontrast und Erwerb Parameter variiert je nach Probe, Experiment, Kamera und Mikroskop-Modelle, etc.. Ein optimales Bild gehört zu dem Hefezellen wenn möglich getrennt in den äußeren Rand der Kapsel deutlichen Kontrast zu der Tuschefleck hat und wo Zellkörper ausgerichtet ist, als ein dunkles Band erscheinen die scharf mit dem Hintergrund kontrastiert. Wenn zu viele Zellen in das Blickfeld sind oder wenn der Fleck zu hell ist, werden die Pixelwerte Intensität cluster und das Programm wird möglicherweise nicht in der Lage, verdeutlichend Kapsel Größe (Abbildung 2B) einen Grenzwert festzulegen. Wenn Sub-optimale Bilder verwendet werden kann das Programm Kreise falsche Größen zu erkennen, keine Kreise erkennen oder erkennen mehrere Pseudo-Kreise basierend auf Artefakte im Bild Schwelle (Abbildung 2C).

Erkennung von Zellkörpern stellt ein ähnliches Problem, dass die Zellkörper als einem robusten schwarzen Kreis auf dem weißen Hintergrund der Kapsel visualisiert werden müssen. Dieses Problem wird im Protokoll angesprochen, wenn die gewünschte Brennebene für die Bildaufnahme beschreiben. Die besten Brennebene zu verwenden ist eine in der Zellkörper als dunkle, konzentrierte Band(Abbildung 3)angezeigt wird. Dieses Brennebene ist akzeptabel als Standard, da er die Zelle richtig konzentriert. Dies wurde bestätigt durch die Visualisierung der Zellwand mit Uvitex, einen Chitin-Fleck (Abbildung 3B). Die Uvitex Fleck zeigt deutlich eine gestochen scharfe, konzentriert Zellwand mit schwachem Signal in der Mitte (wo die oberen und unteren Rand der Zellkörper, unscharf befleckt werden würde).

Bei der Entwicklung dieser Methode war es auch wichtig, sicherzustellen, dass kann dieser Algorithmus genau bestimmen, Kapsel und Zellkörper Messungen. Während die repräsentative Kreise in den obigen Abbildungen vielversprechend sind, wurden die tatsächliche Messungen zwischen Computer und menschlichen Messungen verglichen. Wenn das Protokoll genau befolgt und optimale Bilder stammen, der Algorithmus ist genau und zuverlässig (Abb. 4A). Jedoch wenn das Protokoll nicht korrekt befolgt ist und suboptimale Bildern sich aufgrund von schlechten Färbung, Überfüllung oder anderen zuvor genannten Parameter ergeben, der Algorithmus verliert Genauigkeit und kann nicht rekapitulieren menschliche Messungen (Abbildung 4B ). Da diese Technik ursprünglich für eine bestimmte Person entwickelt wurde (Erstautor), eine andere Person wurde gebeten, es zu benutzen, um festzustellen, ob Unterschiede zwischen Färbung und Messung Stile Genauigkeit trotz folgendes Protokoll auswirken würde. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Technik überall anwendbar, solange das Protokoll als Beauftragte (Abb. 4C) folgte. Ebenso kann diese Technik mit jedes Mikroskop erwerben Phase kontrastreiche Bilder der unterschiedliche Musterpräparate Tusche verwendet werden. Um sicherzustellen, dass der Algorithmus korrekt mit anderen Mikroskop-Setups bleibt, die um ein Drittel dieses Experiment wiederholt wurde Ermittler mit einem unterschiedlichen Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera und erkannten Kapsel Durchmesser mit manuell gemessene Kapsel im Vergleich Durchmesser. Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen Computer und menschlichen Messungen (Abbildung 4D) beobachtet.

Zu guter Letzt wurden zukünftige Anwendungen dieses Algorithmus im Zusammenhang mit der Fluoreszenz Färbung erkundet. Da Fluoreszenz-Bildgebung noch auf Signal-Rausch-Verhältnis der Pixelwerte Intensität basiert sollte der Algorithmus leicht auf Fluoreszenzbilder anwendbar, solange der Fleck kreisförmig in der Natur ist. Diese Anwendung wurde bestätigt, als der Algorithmus konnte erfolgreich nachweisen, dass Uvitex Zellkörpern aus den zuvor beschriebenen Bildern (Abbildung 5A, 5 b) gebeizt. Benutzer sollten darauf achten, den Algorithmus-Parameter für ihr Experiment zu optimieren, und standardisierte Protokolle sollten in Zukunft für neuen Anwendungen entwickelt werden.

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Ergebnisse Bildbereiche optimal erhalten. A. das ursprüngliche Bild von Hellfeld-Mikroskopie eine Tusche Folie erworben. B. die binäre Bild erstellt mit einer Schwelle aus der durchschnittliche Intensität Pixelwert hinzugefügt, um die Standardabweichung berechnet. Alle Werte oberhalb dieser Schwelle gelten weiß und alle folgenden gelten als schwarz. C. eine Visualisierung der Kapseln (grün) und Zellkörper (blau) vom Algorithmus erkannt. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse von einem Bild suboptimal erzielt. A. der ersten Tusche Folie über Hellfeld Mikroskopieren erworben. Uneben und unzureichende Färbung führt zu einem besonders hellen Hintergrund mit Steigungen von Intensität. B. die resultierende binäres Bild, in dem Kapseln aufgrund hoher Hintergrundsignal klar unterschieden werden können. C. mehrere Kapseln sind nicht nachweisbar. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Detecting Zellkörper. A. Hellfeld Bild der Kapsel an die bevorzugte Brennebene zentriert. B. Uvitex Fluoreszenzbild aus dem Zellkörper an der bevorzugten Brennebene. Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vergleiche der Ergebnisse für Algorithmus (schwarz) und Mensch (grau) Analysen. A. wenn Folien laut Protokoll vorbereitet sind und optimale Bilder stammen gibt es keinen nennenswerter Unterschied zwischen den Messungen. B. wenn das Protokoll nicht gefolgt ist der Algorithmus nicht genau identifizieren und Kapseln zu messen. Hier entsprach nicht speziell der Hintergrund und es gab Kontrast zwischen Kapseln und Hintergrund nicht klar. Erhebliche Abweichungen über t-Test berechnet wird als gemerkt * für P < 0,05 Werte. C. ein unabhängiger Ermittler wurde gebeten, das Protokoll zu folgen und ihre Analysen mit dem Algorithmus zu vergleichen. Zuverlässigkeit ist über Beobachter aufrechterhalten, solange die Bilder richtig erworben werden. D. Eine zweite unabhängige Ermittler mit einem zweiten Mikroskop wurde verwendet, um zu bestätigen, dass der Algorithmus Genauigkeit über Einzelpersonen und Hardware behält. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Eine mögliche alternative Anwendung des Algorithmus: Identifizierung und Messung der Fluoreszenz-Mikroskopie. Zellkörper wurden gebeizt und mit Uvitex abgebildet, dann durch Algorithmus identifiziert. Die erkannten Kreis erstreckt sich vorbei an was als die Zellwand bezeichnet werden würde, denn die Erkennung auf das Fluoreszenzsignal basiert. Der Erkennungsalgorithmus kann zugeschnitten werden speziell die hellsten Anhäufung des Signals (Zellwand) identifizieren durch Ändern der Schwellenwerts zur Erzeugung von der anfänglichen binären Bildes in Zahlen 1 b und 2 bdargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung1: ein repräsentativer Screenshot der Anwendung in einer Windows-Umgebung ausgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplemental Figure 2
Ergänzende Abbildung2: Darstellungen der erkannten angehende Hefezellen. Maßstabsleiste stellt 10 µm. A. Eine Mutterzelle und Knospe als getrennte Zellen innerhalb ihrer eigenen Kapsel gezählt. B. A Mutterzelle und Bud zählt zweimal, einmal für ihren eigenen Kapsel und einmal für die andere Zelle Kapsel, wodurch insgesamt vier Zellen aus einem Elternteil und eine Knospe erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplemental Figure 3
Ergänzende Abbildung 3: eine Darstellung der endgültigen Angaben nach Zelle Erkennung und Messung. Image-Datei verweist auf den Namen des ursprünglichen Bildes. Gesamtradius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen grüne Kreise, Kapsel und Zellkörper kombiniert. Kapsel x und y Kapsel beziehen sich auf die Koordinaten der Kapsel, wofür diese Daten zu gelten. Körper-Radius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen blaue Kreise. Kapsel Radius bezieht sich auf den Gesamtradius abzüglich der Körper Radius, was im Umkreis von nur die Kapsel. Diese Werte werden in Mikron, solange der Benutzer eine Pixel-µm-Umtauschverhältnis in Schritt 3.2.5 enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis auf einem dunklen Hintergrund. Der Algorithmus erkennt Kreise basierend auf wie gut sie mit ihren Hintergrund kontrastieren. So führt eine schwere Indien Tintenfleck höheren Kontrast zwischen Polysaccharid-Kapsel und Hintergrund, Erhöhung Signal-Rausch-Verhältnis und die Verbesserung der Ergebnisqualität. Im Gegensatz dazu ist der Zellkörper als einen dunklen Kreis auf einem hellen Hintergrund erkannt. Die Zellkörper wechselt aussehen basierend auf die Brennebene des Mikroskops eingestellt ist, erscheint als eine diffuse graue Kreis oben oder unten der Zelle und als eine verkürzte dunkles Band in der Mitte. Aus den gleichen Gründen bereits besprochen sollte die Brennebene, wo die Zellkörper als kondensierte, dunkle Band erscheint, für die Bildaufnahme verwendet werden, da dies in der genauesten Kreis Erkennung führt.

Die Methode hier berichtet ist durch mehrere Änderungen und Runden der Fehlersuche vorangekommen. Der Algorithmus wurde zunächst codierten erwartet, dass Zellen nicht kleiner als 4 oder größer als 60 Pixel basierend auf das Mikroskop, das verwendet wurde. Erweitern Sie die Anwendung dieses Algorithmus auf verschiedenen Vergrößerungen und Zellgrößen, die diese Grenzen durch die Benutzer Eingabefelder im Protokoll beschrieben stattdessen ersetzt wurden. Benutzer können jetzt Parameter spezifisch für jedes Experiment für maximale Genauigkeit geben. Wenn dieser Algorithmus auf eine Situation außerhalb Cryptococcus Kapsel Messung angewendet wird empfiehlt es zuerst Einrichten einer Reihe von Dosisfindung Bedingungen zu bestimmen, wie Muster erzeugt und abgebildet werden.

Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist, dass es mit einer bestimmten Anwendung im Auge, nämlich die Messung von Cryptococcus Kapsel entwickelt wurde. Während es leicht geändert werden kann, um zusätzliche Anwendungen zu passen, ist dieses Skript nur direkt auf die Kapsel Messprotokoll skizzierten anwendbar. Jedoch beschreibt diese Einschränkung auch die Bedeutung dieser Methode in Bezug auf seinem Gebiet und zu den bestehenden Methoden. Darüber hinaus angehende Hefezellen können ein Problem für die Ermittler, die wollen nur übergeordnete Zellgrößen Messen präsentieren. Dieser Algorithmus ist in der Lage erkennen Knospen als einzigartige Zellen (Abbildung S2A). Erstens kann dies ein Problem sein, wenn die Ermittler in welchem Fall sie Knospe Messungen zu entfernen, oder beide Zellen zu entfernen, wenn sie nicht möchten bestimmt die erkannten Kreis die Knospe ist und die das übergeordnete Element ist. Zweitens kann dadurch ein weiteres Problem Wenn die Knospe als Zelle Körper noch innerhalb der Grenzen der elterlichen Kapsel (Abbildung S2B) erkannt wird in dem Fall der Algorithmus die Knospe in Bezug auf die elterliche Kapsel messen wird. In diesem Beispiel wird jede Zelle gezählt werden, zweimal, weil jede Zelle Körper in zwei Kapseln wohnt. Eines dieser Probleme können leicht angegangen werden, sobald das Protokoll fertig ist. Der letzte Datensatz erscheint wie eine Tabellenkalkulation erkannt wo jeder einzelne Zelle ist mit der Bezeichnung nach der Image-Datei aus, und die x und y-Koordinaten der Zellkörper (Abbildung S3). Ermittler können einfach finden und die Daten, die die Knospe entspricht ausschließen. Trotz Kapsel Größe wird eine wichtige und stark studierte Virulenzfaktor Cryptococcus -Bereich bisher noch Standardprotokolle für Kapsel Messung oder Bild Erwerb zu etablieren. Diese Technik wurde entwickelt, um eine präzise und komfortable Art und Weise frei verfügbar für Labors mit minimalen Voraussetzungen diese Rollen ausfüllen.

Zukünftige Anwendungen dieser Technik sind weitgehend auf andere Experimente anwenden. Alle Image-basierte Erkennung oder Messung von kreisförmigen Objekten sollte durch diesen Algorithmus analysierbar. Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder können durch Anwendung des Algorithmus zu einzelnen Laserkanäle analysiert werden. Bakterielle Koloniezahlbestimmung erreicht werden kann, und mit zusätzlichen Modifikationen konnte unterscheiden zwischen Galaktose Reporter. Hefe-Kolonie-Wachstum-Assays konnte auch ausgewertet werden, mit diesem Algorithmus, um Kolonie Bereichsgröße zu schätzen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Automatisierte Messung von <em>Cryptococcus</em> Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper
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Cite this Article

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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