Summary
טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.
Abstract
מטרת טכניקה זו היא לספק תהליך עקבי, מדויק, הניתנים לניהול והגמישים עבור מספרים גדולים של מדידות קפסולה רב-סוכר.
ראשית, תמונת הסף נוצר בהתבסס על ערכי העוצמה מחושב באופן ייחודי עבור כל תמונה. לאחר מכן, עיגולים מזוהים בהתבסס על הניגוד בין אובייקט לבין רקע בעזרת האלגוריתם מעגל האף טרנספורמציה (CHT) ומבוססת. לבסוף, תא שזוהו קפסולות של גופים מתאימים על פי קואורדינטות מרכז ואת גודל הרדיוס, הנתונים מיוצאים אל המשתמש בגיליון לניהול.
היתרונות של שיטה זו הם פשוטים אך משמעותי. הראשון, כי חישובים אלה מבוצעים על ידי אלגוריתם מאשר אדם דיוק ואמינות הוגדלה. אין שום ירידה הדיוק או המהימנות בין כמה דוגמאות מנותחות. שנית, גישה זו מבססת על סטנדרטי פוטנציאליים עבור השדה קריפטוקוקוס במקום המצב הנוכחי שבו מדידה קפסולה משתנה על ידי המעבדה. שלישית, מכיוון שטווח המידות קפסולה ידני הם איטי ומונוטוני, אוטומציה מאפשר מדידות מהירה על מספר גדול של תאי שמרים בתורו המקל על תפוקה גבוהה ניתוח נתונים וסטטיסטיקות חזק יותר ויותר.
המגבלות הגדולות של טכניקה זו בא איך הפונקציות אלגוריתם. ראשית, האלגוריתם יפיק רק מעגלים. בעוד קריפטוקוקוס תאים וכמוסות שלהם לקחת על מורפולוגיה מעגלית של, זה יהיה קשה ליישם טכניקה זו לאיתור אובייקט שאינו עגול. שנית, בשל כמה עיגולים מזוהים האלגוריתם CHT יכול לזהות עצום עיגולים המדומה המבוססת על הקצוות החיצוניים של מעגלים באשכולות. עם זאת, גופות תא מטעים המוצגים נתפס בתוך המעגל מדומה בקלות ועוזרת להסיר ערכות הנתונים הנוצרת.
טכניקה זו מיועד למדידת הקפסולות רב-סוכר מעגלית של מינים קריפטוקוקוס בהתבסס על מיקרוסקופיית שדה בהיר דיו הודו; אבל זה יכול להיות מיושם על חדות אחרות מבוסס אובייקט עגול מדידות.
Introduction
קריפטוקוקוס neoformans היא פטרייה פתוגניים נמצאו ubiquitously ברחבי העולם המשויך מחלות אנושיות בעיקר באוכלוסיות immunosuppressed. Neoformans ג שהבולט מהווה גורם משמעותי סך מקרי המוות השנתי ב אפריקה שמדרום לסהרה עקב מחלה זיהומית1. הביטוי הקליני העיקריים של זיהום cryptococcal הוא meningoencephalitis, אשר עוקב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תחבורה נגוע מקרופאגים (הסוס הטרויאני באופן) או מעבר ישיר של מחסום הדם - מוח. Neoformans ג מבטא מספר גורמים התקפה אלימה, כולל היכולת לשכפל את טמפרטורת גוף נורמלית, פעילות אוראז, melanization, ואת היווצרות קפסולה רב-סוכר2. הקפסולה רב-סוכר מורכב חוזרות glucuronoxylomannan glucoronoxylomannangalactan פולימרים והפונקציות כמחסום מגן נגד גורמי עקה ו מארח תגובות חיסוניות2.
למרות הגודל לגודל הקפסולה cryptococcal רב-סוכר לא עקבי שויכה התקפה אלימה, יש ראיות כי זה גורם פתוגנזה2,3,4,5, 6,7. גודל קפסולה מזוהה עם דלקת קרום המוח פתולוגיה6, יכול להשפיע על מקרופאג היכולת לשלוט קריפטוקוקוס זיהום5, יכול לגרום לאובדן של התקפה אלימה אם נעדר8. לפיכך, מדידות גודל קפסולה נפוצים במחקר cryptococcal, אבל יש fieldwide אין תקן שיטת מדידה קפסולה.
כיום, neoformans ג רב-סוכר קפסולה המדידה מבוססת על מדידות ידניות של תמונות מיקרוסקופ, השיטות המדויק של רכישות התמונה והן מידה משתנים על פני מעבדות9,10, 11. הדאגה המיידית לשיטה זו היא כי מספר מחקרים דורשים הרכישה של אלפי מדידות, מה שהופך ולשמירה על רמת דיוק ואמינות קשה. יתר על כן, גם כאשר מתפרסמות התוצאות, יש לעיתים קרובות תיאור לקוי של שיטת מדידה. פרסומים רבים לא מסבירים איך המדידות שלהם התקבלו, איזה מטוס מוקד שימש, איך הם קבעו את הסף עבור זיהוי קפסולה, בין אם הם השתמשו רדיוס או קוטר, בין אם הם השתמשו מדידה אחת או בממוצע מספר, או אחרים פרטים. כמה פרסומים היחידה המדינה שלהם לשיטה כמו איזו תוכנית ששימשה, למשל, "Adobe Photoshop CS3 שימש כדי למדוד את התאים"11. חוסר פירוט תקנון ודיווח באפשרותך להפוך הפארמצבטית קשה אם לא בלתי אפשרי. הבדלים הראייה האנושי, בהירות המחשב, ההגדרות מיקרוסקופ, שקופיות תאורה, גורמים אחרים יכולים להשתנות לא רק בין יחידים אלא בין דגימות, ואילו חישובים בהתבסס על יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה יישאר קבוע, החלים בין הדגימות. טכניקה זו נוצר בהקשר של מתן טכניקה סטנדרטית, מדויק, מהיר ופשוט למדוד גדלים קפסולות של שדה שבו היה קודם.
כאמור, האלגוריתם CHT ותיקה, קבצי script כדי לזהות באופן אוטומטי את העיגולים נכתבו לפני. שיטה זו משפרת בשני תחומים איפה סקריפטים אחרים יפול קצר. ראשית, גילוי פשוט עיגולים אינה מספיקה, כי עם תאים cryptococcal שני מעגלים נפרדים חייב להתגלות אחד ביחס לשני. שיטה זו במיוחד מזהה תא גופות בתוך קפסולות מפלה בין השניים, מבצעת את החישובים רק על זוגות הגוף-קפסולת הרלוונטיים. שנית, אפילו כאשר בעקבות באותו פרוטוקול, חוקרים שונים יגיעו עם שונה רכשה תמונות. בכך שהוא מאפשר את השליטה חוקר כל פרמטר אלגוריתם, כלי זה יכול להיות מותאם כדי להתאים למגוון רחב של שיטות רכישה. יש צורך היקף מתוקננת, המטרה, סינון וכן הלאה.
טכניקה זו ניתן בקלות ליישם בכל מצב שבו החוקר צריך לזהות החוגים בתוך תמונה בניגוד עם הרקע שלהם. שניהם עיגולים בהיר יותר וכהה יותר הרקע שלהם יכול להתגלות, ספרתי, נמדד בעזרת טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת שקופית אינדיה אינק
- פיפטה 10 µL מדגם cryptococcal לשקופית. כל זן שמרים מעגלית תפעל אך עבור ניסוי זה H99 היה המתח היחידים בשימוש.
הערה: אם המדגם הוא ישירות מתוך תרבות המדיה, דילול 1:2 עם PBS או מים יכול לסייע למנוע את הדיו הודו הצליעה. - פיפטה 2 µL של כתם דיו הודו על המדגם ומערבבים על ידי דוחף את הטיפ פיפטה לדגימת ופיזית נע בתנועה סיבובית להופעת הדיו הודו המתפלג.
- הצב של coverslip על המדגם על-ידי החזקת הקצה השמאלי של coverslip מפני השטח של השקופית, ואז בעדינות ובצורה שווה להורדת הנגדי של coverslip על המדגם.
- לאפשר את השקופית מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות.
- בעדינות להחיל שכבה של לק coverslip הגבול טופס גושפנקה ולשמר את הכתם אינדיה אינק.
2. הדמיה שקופיות
- מקום שקופיות מיקרוסקופ שדה בהיר עם המצלמה המצורף, המרת פיקסלים-כדי-מיקרו-ידוע. התאם מסננים, מטרות וחדות כך תא קפסולות ברורים ולא תא הגופות להקות ממוקד, כהה.
הערה: שונים מסננים, מטרות והגדרות ניגודיות יעבוד אבל 20 x אובייקטיבי, Ph1 מסנן ו- 2 x 2 binning מומלץ. - ודא שדה הראיה צפוף אבל לא כבדה ומזיהום עם התאים cryptococcal, עם ניגודיות ברורה בין כמוסה תא ורקע, וממוקד כראוי עם גוף התא דמיינו כלהקה כהה.
הערה: המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישתנו באופן משמעותי, וזה משמעותי דיו הודו כתם בבירור ברקע (לפחות 25% של השדה). - לשמור תמונות ספריה בודדת עם כותרות ברורות, האלגוריתם מדידה יופעלו על תמונות ספריה בודדת, נתוני הפלט ימוינו לפי השמות של קבצי התמונות.
3. אלגוריתם ההתקנה
- התקנת פייתון גירסה 2.7 מ
- התקן ספריות פיתון נוספים על ידי הפעלת הפקודות "פיפ להתקין את הכרית", "פיפ להתקין את openpyxl".
- התקנת MATLAB בהתאם להוראות המפורטות ב
- מבנה הספרייה פיתון MATLAB על-ידי ביצוע ההוראות המפורטות ב- https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
- להוריד את הקבצים הדרושים שלוש הכלולות בחומרים של כתב יד זה משלים ("QCA.py", "Analysis2.m" ו- "TestRun.m").
הערה: קבצים אלה ניתן לחילוץ לכל מקום, אבל שלושתן חייב להיות באותה ספריה.
4. שימוש באלגוריתם
- הפעל את היישום על-ידי לחיצה כפולה על QCA.py.
הערה: היישום עשוי להימשך מספר דקות כדי להתחיל. קובץ ה-"QCA.py" מכיל את מבנה תוכנית שקוראת את הקבצים "דדי כהן" כדי להפעיל את האלגוריתם בפועל. - בצע את השלבים המפורטים בתכנית.
- הקלט סוג הסיומת של קבצי התמונות ולפניהם תקופה, כשהם מופרדים באמצעות תווי נקודה-פסיק (ex. ". TIF;. jpeg") ואז לחץ לחצן Enter .
- בחר את הספריה שבה ממוקמים את קובצי התמונה על-ידי לחיצה על לחצן בחר מדריך ובחירת התיקיה המכילה את התמונות.
- צור הרשימה של קבצי תמונה בספריה על-ידי לחיצה על לחצן צור רשימת התמונה . התמונות יפורטו בתיבת הטקסט לימין. לסקור, ודא שהרשימה מדויקים ומלאים.
- בחר תמונה אקראית מתוך הרשימה שתשמש תצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על לחצן בחר תמונה אקראית .
הערה: אם התמונה היא אפשרות לפתוח עקב "שגוי תמונת מצב שגיאה", האלגוריתם ימשיכו לפעול כראוי למרות לא מציג את התמונה. לאחר שלב 4.2.7, עדיין להציג תמונת הבדיקה. - קלט מיקרוסקופ אובייקטיבית, binning הגדרות. אם הגדרות ברירת המחדל אינם תואמים המיקרוסקופ משמש, בחר מותאמת אישית פיקסל המרה"ולהזין פיקסל-כדי-אום ההמרה עבור קבצי תמונה. לאחר הבחירה, לחץ על כפתור חישוב המרה ולהבטיח שההמרה היא הנכונה לפי תיבת הטקסט בצד הימין.
הערה: להחליפן בתמונות המוצגות באיור 1 חושבו עם 40 x הגדלה ו 2 x 2 binning שנבחר. - קלט פרמטרי האלגוריתם לזיהוי עיגול.
- קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי איתור קפסולה החיצוני כערכים Min ו- Max כמוסה רדיוס. מגוון קטן יותר יאפשר תוצאות מדויקות יותר.
- קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי לגילוי גוף התא כערכים Min ו- Max גוף התא Radius.
הערה: כל ארבעת ערכים אלה צריכים להיות מספרים המייצגים את הערכים המתאימים שלהם בפיקסלים, על פי תמונות המקור. - הזז את המחוונים כמוסה ורגישות לגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה יהיה נוקשה, להפחית את זיהוי מעגל חיובי כוזב, אך עלולה גם לאתר פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה יגדל שיעור גילוי, אך עלולה גם במעגלים חיובי כוזב.
הערה: נציג התוצאות התקבלו עם מינימום רדיוס קפסולה של 7, רדיוס קפסולה מקסימלית של 45, הגוף מינימום רדיוס של 4, הגוף המרבי ברדיוס של 30, רגישות קפסולה של 87, ורגישות הגוף של 87.
- בדוק את הפרמטרים בתמונה שנבחרו באקראי על ידי לחיצה על לחצן הפעל בדיקת . התוצאות יוצגו במרכז העליון של התוכנית, החלפת התמונה המקורית. אם התוצאות נראות מדויק, מומלץ לבחור תמונה אקראית נוספים כדי לנסות כמו גם להבטיח שערכי הפרמטרים יתאימו לכל התמונות שנבחרו.
- להגדיל את מספר הגופות, קפסולות זוהה באופן חזותי לבחון החוגים יופיעו כדי להתאים כראוי. מספר הגופות בתוך קפסולות זוהה יוצג בתיבת הטקסט לימין. אחרת, לשנות את הפרמטרים אלגוריתם עד התוצאות מדויקות.
הערה: עיגולים צבעוניים עבים הם רק. כדי לעזור עם פריט חזותי. החוגים בפועל שנוצר למדידה הוא עקומה מתמטית מחושב על ידי האלגוריתם של HCT.
- להגדיל את מספר הגופות, קפסולות זוהה באופן חזותי לבחון החוגים יופיעו כדי להתאים כראוי. מספר הגופות בתוך קפסולות זוהה יוצג בתיבת הטקסט לימין. אחרת, לשנות את הפרמטרים אלגוריתם עד התוצאות מדויקות.
- להפעיל את אלגוריתם זיהוי על הספריה כולה של קבצי תמונה על-ידי לחיצה על לחצן להתחיל בניתוח . כל תמונה ינותחו ויציג התוכנית "סיים" בתיבת הטקסט ימינה כאשר יש כבר ניתחו את כל התמונות.
- לחץ על הלחצן התאמה וניקוי . זה תואם הגופות שזוהו תא הקפסולות שזוהו שהם מתגוררים, לחשב את רדיוס קפסולה נכון על-ידי חיסור מהגוף כמוסה.
הערה: אם האלגוריתם נמצא בשימוש כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית או מצב אחר שבו מעגל היחידה היא מזוהה שלב זה הוא מיותר. במקום לחץ על הגופים למשוך רק או לחצן קפסולות למשוך רק כדי לאסוף את הנתונים רק את הכחול או רק את עיגולים ירוקים, בהתאמה. חשוב לציין כי אם רק אחזור הנתונים קפסולה הרדיוס יפנה מהרדיוס הכולל של התא כפי הרדיוס של גוף התא לא יכול להיות מופחתים. - לאתר את הנתונים הושלמה בקובץ "CleanedOuput.csv" בספריית תמונות. אם רק חתיכה אחת של נתונים נבחרה, יסומנו כסעיפים את הקובץ "CleanedBodies.csv" או "CleanedCapsules.csv".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות מתקבלים לראשונה על ידי מיקרוסקופ של דיות שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בשילוב עם מצלמה (איור 1א'). חשוב לקבוע תאים נפרדו, בצפיפות נמוכה מספיק לא להכריע בתחום התצוגה, כמו גם באשר להשתמש הכתם מספיק כדי ליצור ניגודיות בין תאים לבין הרקע. כאמור בפרוטוקול, המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה, מיקרוסקופ, המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישתנו באופן משמעותי, וזה משמעותי דיו הודו כתם בבירור ברקע (לפחות 25% של השדה). כיוונים אלו מאפשרים את האלגוריתם לקבוע סף ייחודי לכל תמונה על-ידי לוקח בערך העוצמה הפיקסלים הממוצע והוספת סטיית התקן. פיקסל כלשהו עם ערך בעוצמה גבוהה יותר מסף אמר נחשב לבן, כל ערך בעוצמה נמוכה יותר נחשב שחור. התמונה שתיווצר מאפשר הבחנה חדה וברורה של הקפסולה מסתיים (איור 1B). האלגוריתם ואז יש עיגול חזקים ניגוד לבן על שחור מבוסס כדי לאתר הקפסולה ומספק התמונה המקורית עיגול שחור על לבן חזקים לגופים התא. ויזואליזציה נציג של החוגים שזוהו נוצר במסגרת התוכנית (איור 1C). זה מאפשר למשתמש לנתח באמצעות תמונות מעובד ובמהירות להבטיח שהתוצאות יופיעו מדויק.
זה חיוני כדי לעקוב אחר הפרוטוקול המדויק כדי לרכוש תמונות אופטימלית. תמונות תת אופטימלית בדרך כלל תוצאה של חוסר הניגוד בין כמוסה דיו (איור 2א). פרמטרים אופטימליים ניגודיות ורכישה משתנים בהתאם לדוגמה, מודלים ניסוי, מצלמה, מיקרוסקופ, וכו '. תמונה אופטימלית הוא אחד שבו תאי שמרים מופרדים זה מזה במידת האפשר, כאשר הקצה החיצוני של הקפסולה יש ניגוד ברור על הכתם אינדיה אינק וכל הגוף תא ממוקד להופיע כלהקה כהה, אשר בניגוד בחדות את הרקע שלו. אם תאים רבים נמצאים בתחום התצוגה, או אם הכתם קל מידי, ערכי העוצמה של הפיקסל אשכול, התוכנית לא תהיה אפשרות לקבוע סף מסוגל שחקרתי קפסולה בגודל (איור 2B). כאשר תמונות תת אופטימלית משמשים התוכנית ניתן לזהות עיגולים בגדלים שגוי, לא יוכל לזהות כל עיגולים או לזהות מספר עיגולים המדומה המבוססת על ממצאים בתמונת הסף (איור 2C).
זיהוי גופות התא מהווה בעיה דומה כי בגוף התא, כנראה ניתן לאבחן כמו עיגול שחור עמיד על הרקע הלבן של הקפסולה. בעיה זו נדונה הפרוטוקול כאשר תיאר את המטוס מוקד הרצוי עבור רכישת התמונה. המטוס מוקד בצורה הטובה ביותר לשימוש היא אחת שבה הגוף תא מופיע בתור להקה כהה, מרוכז (איור 3א). במישור המוקד הזה מקובל כסטנדרט כי היא מתמקדת כהלכה את התא. זה אושר ע י להמחיש את הקיר עם Uvitex, כתם כיטין (איור 3ב). Uvitex הכתם מראה בבירור חדה, ממוקדת דופן התא עם האות חלש במרכז (איפה העליון והתחתון של גוף התא להיות מוכתם, מחוץ לפוקוס).
בפיתוח שיטה זו היה גם חשוב לוודא זאת אלגוריתם זה יכול לקבוע במדויק מדידות כמוסה וגוף התא. בעוד החוגים נציג של הדמויות הקודם הם מבטיחים, מדידות בפועל הושוו בין המחשב לבין מדידות אנושי. כאשר הפרוטוקול מלווה במדויק תמונות אופטימלית מתקבלים, האלגוריתם הוא מדויק ואמין (איור 4א). עם זאת, אם הפרוטוקול מלווה באופן שגוי, שיוצרת תמונות מתקבלים עקב מכתים המסכן, צפיפות יתר או פרמטרים אחרים כאמור, האלגוריתם מאבד דיוק, אי אפשר לסכם האנושי מדידות (איור 4B ). מאז טכניקה זו פותחה במקור עבור אדם ספציפי (המחבר הראשון), אדם שונה התבקש להשתמש בו כדי לקבוע אם ההבדלים בין סגנונות מכתים או מידה ישפיע דיוק למרות פרוטוקול הבאים. התוצאות הראו כי טכניקה זו היה החלים נרחב ככל הפרוטוקול עקבו אחרי כמו שאמרת לי (איור 4C). באופן דומה, ניתן להשתמש בטכניקה זו עם כל מיקרוסקופ המסוגל לשלב תמונות חדות של השקופיות אינדיה אינק מוכן. כדי להבטיח שהאלגוריתם יישאר מדויק עם אחרים setups מיקרוסקופ שהניסוי הזה חזר על עצמו על ידי שליש החוקר באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר שונים בשילוב עם מצלמה והשוו קטרים קפסולה שזוהו עם קפסולה נמדד באופן ידני קטרים. אין הבדל משמעותי נצפתה בין המחשב האנושי מדידות (איור 4D).
לבסוף, יישומים עתידיים של אלגוריתם זה היו חקר בהקשר של קרינה פלואורסצנטית מכתים. מאז פלורסצנטיות הדמיה עדיין מבוססת על אות רעש יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה האלגוריתם צריך להיות בקלות החלים על ידי קרינה פלואורסצנטית תמונות כל עוד הכתם עגול בטבע. יישום זה אושר כאשר האלגוריתם היה מסוגל לזהות בהצלחה ש-uvitex צבעונית תא הגופות מן התמונות שתואר לעיל (איור 5א, 5B). המשתמשים צריכים להיות זהירים כדי למטב את פרמטרי האלגוריתם לניסוי שלהם, יש לפתח פרוטוקולים סטנדרטיים בעתיד עבור כל היישומים החדשים.
איור 1 : תוצאות נציג של תמונה שהושג בצורה אופטימלית. א התמונה הראשונית שרכשה מיקרוסקופיית שדה בהיר של שקופית אינדיה אינק. B. התמונה הבינארית שנוצרו באמצעות סף שמחושבים בערך העוצמה הפיקסלים הממוצע הוסיף את סטיית התקן. כל הערכים מעל הסף הזה נחשב לבן, כל מתחת נחשבים שחור. ג. פריט חזותי של קפסולות (ירוק), גופי התא (כחול) זוהה על ידי האלגוריתם. כל התמונות התקבלו בהגדלה x 40 עם 2 x 2 binning. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוצאות נציג של תמונת שהושג תת אופטימלי. א השקופית אינדיה אינק ראשוניות נרכש מיקרוסקופיית שדה בהיר. לא אחידה ולא כשיר מכתים תוצאות רקע מבריק במיוחד עם מעברי צבע בעוצמה. B. הבינארית התמונה שתיווצר, שבו קפסולות לא ברור ניתן להבחין בין בשל רקע אות. ג. כמה קפסולות ניתנים לגילוי. כל התמונות התקבלו בהגדלה x 40 עם 2 x 2 binning. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: גופים תא Detecting. א שדה בהיר תמונה של כמוסה מרוכזת בשעה המטוס מוקד מועדף. B. Uvitex קרינה פלואורסצנטית תמונה של גוף התא על המטוס מוקד מועדף. תמונות התקבלו ב 100 x הגדלה עם 2 x 2 binning. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוחים השוואות של תוצאות עבור אלגוריתם (שחור), אדם (אפור). א כאשר שקופיות מוכנים לפי הנוהל, תמונות אופטימלית מתקבלים יש הבדל ניכר בין מדידות. B. אם הפרוטוקול אינו אחריו האלגוריתם לא במדויק לזהות ולמדוד את כמוסות. כאן במיוחד על הרקע לא הייתה עקבית ולא היה לא ברור הניגוד בין קפסולות ורקע. וריאציות משמעותיות מחושב באמצעות מבחן t הוא ציין כמו * עבור P ערכים < 0.05. ג. חוקר עצמאי התבקש לעקוב אחר הפרוטוקול ולהשוות את בדיקותיהם את האלגוריתם. אמינות נשמר מעבר משקיפים כל עוד התמונות נרכשים כראוי. ד חוקר עצמאי השני עם מיקרוסקופ השני שימש כדי לאשר האלגוריתם שומר על דיוק על פני יחידים, חומרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : יישום חלופה פוטנציאלית של האלגוריתם: זיהוי ומדידה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. תא גופות היו מוכתמים, עם תמונה עם Uvitex ולאחר מכן המזוהה על-ידי אלגוריתם. המעגל שזוהו מרחיב מעבר מה תווית של דופן התא מכיוון הזיהוי מבוסס על האות זריחה. האלגוריתם לזיהוי התפורות כדי לזהות באופן ספציפי הצטברות המבריקים של האות (קיר התא) על-ידי שינוי הסף המשמש ליצירת התמונה הבינארית הראשונית ייצג דמויות 1B , 2B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: נציג צילום מסך של היישום פועל בסביבת Windows. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 2: ייצוגים של ניצני שזוהו תאים שמרים- סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. א תא אב, באד לספור תאים נפרדים בתוך כמוסה משלהם. B. A אב התא, באד נספרים פעמיים, פעם אחת עבור קפסולת משלהם, פעם אחת הקפסולה תאים אחרים, והתוצאה היא ארבעה תאים הכולל זוהה הורה אחד, ניצן אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 3: ייצוג של הנתונים הסופי שנתקבלו לאחר תא זיהוי ומדידה. קובץ תמונה מתייחס השם של התמונה המקורית. רדיוס הכולל מתייחס הרדיוס של עיגולים ירוקים הנציגה, כמוסה והגוף תא משולב. כמוסה x ו- y כמוסה להפנות הקואורדינטות של הקפסולה אשר נתונים אלה חל. רדיוס הגוף מתייחס הרדיוס של העיגולים הכחולים מייצגים. רדיוס קפסולה מתייחס מהרדיוס הכולל מינוס רדיוס הגוף, וכתוצאה מכך הרדיוס של רק הקפסולה. ערכים אלה יהיו מיקרון כל עוד המשתמש כלל יחס ההמרה פיקסל-כדי-מיקרו בשלב 3.2.5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים של טכניקה זו מכין את השקופית אינדיה אינק, רכישת תמונות מיקרוסקופ. בעוד האלגוריתם נבדק בהצלחה עם מגוון רחב של טכניקות שקופיות ותמונה הפרוטוקול המומלץ מתואר בכתב היד. הקפסולה רב-סוכר מזוהה בהתבסס על הכללת חלקיקי דיו הודו מהתחום של הקפסולה, כמו חלקיקי האלה גדולות מדי לחדור לרשת fibril רב-סוכר. אינדיה אינק הדרה תוצאות במעגל בהיר על רקע כהה. האלגוריתם יזהה חוגים מבוסס על מה טוב הם חדות עם הרקע שלהם. לפיכך, כתם דיו הודו כבד יגרום חדות גבוהה יותר בין רב-סוכר כמוסה ורקע, הגדלת האות לרעש יחס ושיפור איכות התוצאה. לעומת זאת, בגוף התא מתגלה כמו עיגול כהה על רקע בהיר. גוף התא ישתנה המראה בהתבסס על איזה מטוס מוקד המיקרוסקופ מוגדר, מופיעה ' מאטום לשקוף ' גריי עיגול בחלק העליון או התחתון של התא, כלהקה כהה דחוס במרכז. מאותן סיבות כבר דנו, המטוס מוקד שבו הגוף תא מופיע בתור להקה דחוס ואפל צריך לשמש עבור רכישת התמונה התוצאה תהיה זיהוי מעגל מדויק ביותר.
שיטת דיווח על התקדמות דרך מספר שינויים, סיבובים של פתרון בעיות. האלגוריתם היה מקודד מצפה כי תאים לא יהיה קטן מ- 4 או גדול יותר פיקסלים 60 המבוססת על המיקרוסקופ ששימש בתחילה. כדי להרחיב את היישום של אלגוריתם זה רמות הגדלה שונות וגדלים תא שמגבלות אלה הוחלפו במקום זאת שדות קלט המשתמש המתוארות בפרוטוקול. משתמשים עשויים כעת ספיציפית ניסוי עבור דיוק מירבי פרמטרים של קלט. אם אלגוריתם זה היא מיושמת למצב מחוץ מדידה קפסולה קריפטוקוקוס מומלץ הסט הראשון סדרה של טווח מציאת התנאים כדי לקבוע כיצד צריך להיות שנוצר ודוגמאות עם תמונה.
המגבלה המשמעותי ביותר של טכניקה זו היא כי הוא תוכנן עם יישום מסוים בראש, כלומר המדד של קפסולה cryptococcal. בזמן זה ניתן בקלות לשנות כדי להתאים יישומים נוספים, התסריט הזה חל רק ישירות בפרוטוקול מדידה קפסולה שפורטו לעיל. עם זאת, מגבלה זו מתאר גם את המשמעות של שיטה זו ביחס בתחומה ועל השיטות הקיימות. בנוסף, הנצה תאי שמרים ניתן להציג בעיה עבור חוקרים שרוצים רק למדוד הגדלים תא האב. אלגוריתם זה היא מסוגלת לאתר ניצנים כתאי ייחודי (איור S2A). קודם כל, זה יכול להיות בעיה אם החוקר שבמקרה הם ירצו להסיר באד מדידות, או להסיר את שני התאים, אם זה לא יכול להיות נחוש אשר זוהה העיגול הוא הניצן ואילו ההורה. שנית, זה יכול לגרום בעיה נוספת אם הניצן מזוהה כגוף תא עדיין בגבולות הקפסולה הורים (איור S2B) שבו התיק האלגוריתם ימדוד את הניצן ביחס הקפסולה הורים. בדוגמה זו כל תא ייספר פעמיים כי כל גוף התא שוכן בתוך שתי כמוסות. גם בעיות אלו ניתן לטפל בקלות לאחר סיום הפרוטוקול. ערכת הנתונים הסופי יופיע כגיליון אלקטרוני שבו כל אדם שאותרו תא תוצמד לפי קובץ התמונה זה הגיע, ולא x ו y קואורדינטות של גוף התא (איור S3). חוקרים יכולים פשוט למצוא, לא לכלול את הנתונים התואם את הניצן. למרות גודל קפסולה להיות חשובה ולמד בכבדות מקדם התקפה אלימה שהשדה קריפטוקוקוס טרם להקים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור רכישת קפסולה מדידה או תמונה. טכניקה זו נועדה למלא תפקידים אלה באופן מדויק ונוח זמינה בחופשיות למעבדות עם דרישות מינימליות.
יישומים עתידיים של טכניקה זו הם בעיקר כדי להחילו על ניסויים אחרים. כל תמונה מבוססת זיהוי או מדידה של אובייקטים מעגלית צריך להיות בקופסאת באמצעות אלגוריתם זה. ניתן לנתח אותם מיקרוסקופ פלואורסצנטי תמונות על-ידי החלת האלגוריתם לערוצים בודדות לייזר. מושבת חיידקים סופר יכולה להיות מושגת, בשינוי נוסף יכול היה להבחין בין הכתבים גלקטוז. שמרים המושבה צמיחה מבחני יוכל גם להעריך באמצעות אלגוריתם זה כדי לאמוד את גודל איזור המושבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להכיר בואן אנתוני שקופיות אשר שימשו השוואה side-by-side האדם השני, כמו גם סברינה נולאן שקופיות אשר שימשו כמו השלישי אנושי-לצד השני השוואה מיקרוסקופ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
