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Immunology and Infection

Cryptococcal प्रजातियों Polysaccharide कैप्सूल और कोशिका शरीर के स्वचालित माप

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

इस तकनीक का वर्णन एक स्वचालित बैच छवि प्रोसेसर polysaccharide कैप्सूल और शरीर radii को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया । शुरू में Cryptococcus neoformans कैप्सूल माप के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि स्वचालित छवि प्रोसेसर भी परिपत्र वस्तुओं का पता लगाने के आधार पर अन्य विपरीत करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

इस तकनीक का उद्देश्य polysaccharide कैप्सूल माप की बड़ी संख्या के लिए एक सुसंगत, सटीक और प्रबंधनीय प्रक्रिया प्रदान करना है ।

सबसे पहले, एक थ्रेशोल्ड छवि प्रत्येक छवि के लिए अनन्य रूप से परिकलित तीव्रता मानों पर आधारित उत्पन्न होती है. फिर, वृत्त के आधार पर अच्छी तरह से स्थापित सर्कल फिरभी परिवर्तन (सीएचटी) एल्गोरिथ्म का उपयोग कर ऑब्जेक्ट और पृष्ठभूमि के बीच का पता लगाया है । अंत में, पता लगाया सेल कैप्सूल और निकायों केंद्र निर्देशांक और त्रिज्या आकार के अनुसार मिलान कर रहे हैं, और डेटा एक प्रबंधनीय स्प्रेडशीट में उपयोगकर्ता के लिए निर्यात किया जाता है.

इस तकनीक के फायदे सरल लेकिन महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, क्योंकि इन गणना एक एल्गोरिथ्म के बजाय एक मानव दोनों सटीकता और विश्वसनीयता से प्रदर्शन कर रहे है बढ़ रहे हैं । सटीकता या विश्वसनीयता की परवाह किए बिना कितने नमूनों का विश्लेषण कर रहे है में कोई गिरावट नहीं है । दूसरा, यह approach वर्तमान स्थिति के बजाय Cryptococcus फ़ील्ड के लिए संभावित मानक ऑपरेटिंग कार्यविधि स्थापित करता है जहां प्रयोगशाला द्वारा कैप्सूल माप भिंन होता है । तीसरा, यह देखते हुए कि मैनुअल कैप्सूल माप धीमी और नीरस हैं, स्वचालन खमीर कोशिकाओं की बड़ी संख्या पर तेजी से माप की अनुमति देता है कि बारी में उच्च प्रवाह डेटा विश्लेषण और तेजी से शक्तिशाली आंकड़े की सुविधा ।

इस तकनीक की प्रमुख सीमाएं कैसे एल्गोरिथ्म कार्यों से आते हैं । सबसे पहले, एल्गोरिथ्म केवल हलकों पैदा करेगा । जबकि Cryptococcus कोशिकाओं और उनके कैप्सूल एक परिपत्र आकृति विज्ञान पर ले, यह गैर परिपत्र वस्तु का पता लगाने के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए मुश्किल होगा । दूसरा, कैसे हलकों सीएचटी एल्गोरिथ्म का पता लगाया जाता है के कारण भारी छद्म कई संकुल हलकों के बाहरी किनारों के आधार पर हलकों का पता लगा सकते हैं । हालांकि, छद्म चक्र के भीतर पकड़े गए किसी भी प्रतिनिधित्व सेल निकायों आसानी से पता लगाया जा सकता है और परिणामी डेटा सेट से हटा दिया ।

यह तकनीक भारत केे चमकीले मैदान माइक्रोस्कोपी पर आधारित Cryptococcus प्रजातियों के परिपत्र polysaccharide कैप्सूल को मापने के लिए होती है; हालांकि यह अंय विपरीत परिपत्र वस्तु माप आधारित करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

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Cryptococcus neoformans एक रोगजनक खमीर दुनिया है कि immunosuppressed आबादी में मुख्य रूप से मानव रोग के साथ जुड़ा हुआ है चारों ओर बैरे पाया है । C. neoformans सबसे विशेष रूप से उप सहारा अफ्रीका में कुल वार्षिक मौतों का एक महत्वपूर्ण कारण के लिए खातों संक्रामक रोग1के कारण । cryptococcal संक्रमण के प्रमुख नैदानिक अभिव्यक्ति meningoencephalitis है, जो संक्रमित मैक्रोफेज में परिवहन द्वारा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के आक्रमण का अनुसरण करता है (ट्रोजन हॉर्स तरीके) या रक्त मस्तिष्क बाधा के प्रत्यक्ष पार । C. neoformans मानव शरीर के तापमान पर दोहराने की क्षमता सहित कई डाह कारकों को व्यक्त करता है, यूरीस गतिविधि, melanization, और एक polysaccharide कैप्सूल2के गठन. polysaccharide कैप्सूल दोहराया glucuronoxylomannan और glucoronoxylomannangalactan पॉलिमर और पर्यावरणीय तनाव और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं2के रूप में कारकों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में कार्य के रूप में काम करता है से बना है ।

हालांकि cryptococcal polysaccharide कैप्सूल आकार का आकार लगातार डाह के साथ संबद्ध नहीं किया गया है, वहाँ सबूत है कि यह रोगजनन में एक कारक है2,3,4,5, 6,7. कैप्सूल का आकार दिमागी विकृति6के साथ जुड़ा हुआ है, Cryptococcus संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए macrophage क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं5, और अगर अनुपस्थित8डाह के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं. इसलिए, कैप्सूल आकार माप cryptococcal अनुसंधान में आम हैं, लेकिन कैप्सूल माप की एक विधि के लिए कोई fieldwide मानक है.

वर्तमान में, C. neoformans polysaccharide कैप्सूल माप माइक्रोस्कोपी छवियों के मैनुअल माप पर आधारित है, और छवि और माप अधिग्रहण दोनों की सटीक तरीके प्रयोगशालाओं में बदलती हैं9,10, 11. इस विधि के लिए एक तत्काल चिंता का विषय है कि कुछ अध्ययनों से व्यक्तिगत माप है, जो सटीकता और विश्वसनीयता को बनाए रखने मुश्किल बनाता है हजारों के अधिग्रहण की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब भी परिणाम प्रकाशित कर रहे हैं, वहां अक्सर माप विधि का अपर्याप्त वर्णन है । कई प्रकाशनों नहीं समझा कैसे उनके माप प्राप्त किए गए, क्या फोकल विमान का इस्तेमाल किया गया था, वे कैप्सूल पहचान के लिए सीमा निर्धारित कैसे, चाहे वे त्रिज्या या व्यास का इस्तेमाल किया, चाहे वे एक माप या औसत कई, या अन्य इस्तेमाल किया विवरण. कुछ प्रकाशनों केवल राज्य उनके विधि के रूप में जो प्रोग्राम इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, "एडोब फोटोशॉप CS3 कोशिकाओं"11मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मानकीकरण और रिपोर्टिंग विस्तार की यह कमी असंभव नहीं तो reproducibility मुश्किल बना सकते हैं । मानव दृष्टि, कंप्यूटर चमक, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, स्लाइड प्रकाश, और अन्य कारकों में अंतर न केवल व्यक्तियों के बीच, लेकिन नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं, जबकि पिक्सेल तीव्रता मूल्यों के अनुपात के आधार पर गणना लगातार रहेगा और नमूनों के बीच लागू । इस तकनीक को एक मानकीकृत, सटीक, तेजी से प्रदान करने के संदर्भ में उत्पंन किया गया था, और सरल तकनीक के लिए एक क्षेत्र है जिसमें वहां पहले कोई नहीं था के लिए कैप्सूल आकार को मापने ।

के रूप में पहले उल्लेख किया है, सीएचटी एल्गोरिथ्म लंबे समय से स्थापित है, और लिपियों स्वचालित रूप से पता लगाने हलकों से पहले लिखा गया है । इस विधि के दो क्षेत्रों में सुधार जहां अंय लिपियों कम गिर जाएगी । सबसे पहले, बस का पता लगाने हलकों पर्याप्त नहीं है, क्योंकि cryptococcal कोशिकाओं के साथ दो अलग हलकों एक दूसरे के संबंध में पता लगाया जाना चाहिए । इस विधि विशेष रूप से कैप्सूल के भीतर सेल निकायों का पता लगाता है, दोनों के बीच भेदभाव, और केवल प्रासंगिक शरीर कैप्सूल जोड़े पर गणना करता है. दूसरा, यहां तक कि जब एक ही प्रोटोकॉल का पालन, विभिंन जांचकर्ताओं विभिंन अधिग्रहीत छवियों के साथ खत्म हो जाएगा । प्रत्येक एल्गोरिथ्म पैरामीटर पर जांचकर्ता नियंत्रण की अनुमति देकर, इस उपकरण के अधिग्रहण विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला से मेल करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । एक मानकीकृत गुंजाइश, उद्देश्य, फिल्टर, और इतने पर के लिए कोई ज़रूरत नहीं है ।

इस तकनीक को आसानी से किसी भी स्थिति में अंवेषक के लिए एक छवि के भीतर हलकों का पता लगाने की जरूरत है कि उनकी पृष्ठभूमि के साथ इसके विपरीत लागू किया जा सकता है । दोनों हलकों हल्का और उनकी पृष्ठभूमि से गहरा पता लगाया जा सकता है, गिना, और इस तकनीक का उपयोग कर मापा ।

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Protocol

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1. भारत केे स्लाइड तैयार करना

  1. पिपेट एक स्लाइड पर cryptococcal नमूना के 10 µ एल । किसी भी परिपत्र खमीर तनाव काम करेंगे, लेकिन इस प्रयोग H99 के लिए ही इस्तेमाल किया तनाव था ।
    नोट: यदि नमूना कल्चर मीडिया से सीधे है, तो पंजाबियों या पानी के साथ कमजोर 1:2 भारत की स्याही को झुरमुट से रोकने में मदद कर सकता है ।
  2. पिपेट 2 µ एल के भारत स्याही दाग नमूना और शारीरिक रूप से नमूना करने के लिए पिपेट टिप धक्का द्वारा और मिश्रण पर भारत स्याही समान रूप से वितरित प्रकट होता है जब तक एक परिपत्र गति में बढ़ रहा है ।
  3. स्लाइड की सतह के खिलाफ coverslip के बाएँ किनारे को दबाए रखकर नमूने पर एक coverslip रखें, फिर धीरे से और समान रूप से नमूना पर coverslip के विपरीत पक्ष को कम.
  4. स्लाइड 5 मिनट के लिए शुष्क हवा की अनुमति दें ।
  5. धीरे coverslip सीमा को नेल पॉलिश के एक प्रकाश परत लागू करने के लिए एक मुहर फार्म और भारत स्याही दाग के संरक्षण ।

2. इमेजिंग स्लाइड

  1. एक चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप में एक कैमरा लगाव और ज्ञात पिक्सेल-माइक्रोन रूपांतरण के साथ स्लाइड रखें । फिल्टर, उद्देश्यों, और इसके विपरीत समायोजित करें ताकि सेल कैप्सूल स्पष्ट कर रहे हैं और कोशिका निकायों, अंधेरे बैंड ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.
    नोट: विभिन्न फिल्टर, उद्देश्यों, और कंट्रास्ट सेटिंग्स काम करेंगे, लेकिन एक 20x उद्देश्य, Ph1 फिल्टर, और 2x2 बिन्नी की सिफारिश की है ।
  2. देखने के क्षेत्र को सुनिश्चित करने के घने है, लेकिन cryptococcal कोशिकाओं के साथ नहीं आबाद, सेल कैप्सूल और पृष्ठभूमि के बीच स्पष्ट इसके विपरीत के साथ, और ठीक से एक अंधेरे बैंड के रूप में visualized कोशिका शरीर के साथ ध्यान केंद्रित.
    नोट: एक इष्टतम छवि के लिए कोशिकाओं की सही संख्या नमूना और उद्देश्य के आधार पर इस्तेमाल किया जा महत्वपूर्ण पहलुओं को सुनिश्चित करने के लिए कर रहे है कोशिकाओं संकुल या अतिव्यापी नहीं हैं, कि सेल फोकल विमानों में काफी भिंनता नहीं है, और है कि वहां महत्वपूर्ण भारत स्याही दाग स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि में दिखाई दे रहे है (क्षेत्र के कम से 25%) ।
  3. स्पष्ट शीर्षकों के साथ एक एकल निर्देशिका में छवियाँ सहेजें, माप एल्गोरिथ्म छवियों पर एक एकल निर्देशिका में चलाया जाएगा और आउटपुट डेटा छवि फ़ाइलों के नाम के अनुसार व्यवस्थित किया जाएगा ।

3. एल्गोरिथ्म सेटअप

  1. अजगर संस्करण स्थापित करें २.७ से
  2. कमांड "रंज स्थापित तकिया" और "रंज स्थापित openpyxl" चलाकर अतिरिक्त अजगर पुस्तकालयों स्थापित करें ।
  3. पर निर्देशों का पालन करके MATLAB स्थापित
  4. https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html पर दिए गए निर्देशों का पालन करके MATLAB अजगर पुस्तकालय का निर्माण ।
  5. इस पांडुलिपि की अनुपूरक सामग्रियों ("QCA.py", "Analysis2. m", और "TestRun. m") में शामिल तीन आवश्यक फ़ाइलें डाउनलोड करें ।
    नोट: इन फ़ाइलों को किसी भी स्थान पर निकाला जा सकता है, लेकिन सभी तीन एक ही निर्देशिका में होना चाहिए ।

4. एल्गोरिथ्म का उपयोग

  1. QCA.py पर डबल क्लिक करके आवेदन चलाते हैं ।
    नोट: अनुप्रयोग प्रारंभ करने के लिए कई मिनट लग सकते हैं । "QCA.py" फ़ाइल में प्रोग्राम संरचना है जो वास्तविक एल्गोरिथ्म को चलाने के लिए ". m" फ़ाइलों को कॉल करता है ।
  2. प्रोग्राम में उल्लिखित चरणों का पालन करें ।
    1. किसी अवधि से पहले छवि फ़ाइलों के एक्सटेंशन प्रकार को इनपुट करें और अर्धविरामों (उदा. "से अलग कर दें. TIF; । jpeg ") फिर Enter बटन क्लिक करें ।
    2. वह निर्देशिका चुनें जिसमें निर्देशिका का चयन करें बटन क्लिक करके और छवियां शामिल करने वाले फ़ोल्डर का चयन करके छवि फ़ाइलें स्थित हैं ।
    3. छवि सूची जनरेट करें बटन क्लिक करके निर्देशिका में छवि फ़ाइलों की सूची बनाएं । छवियों को सही करने के लिए पाठ बॉक्स में सूचीबद्ध किया जाएगा । समीक्षा करें और सुनिश्चित करें कि सूची सटीक और पूर्ण है ।
    4. यादृच्छिक छवि का चयन करें बटन क्लिक करके पूर्वावलोकन के रूप में उपयोग करने के लिए सूची से एक यादृच्छिक छवि चुनें ।
      नोट: छवि एक "ग़लत छवि मोड त्रुटि के कारण खोलने में असमर्थ है, तो" एल्गोरिथ्म अभी भी ठीक से छवि प्रदर्शित नहीं करने के बावजूद कार्य करेगा । चरण 4.2.7 के बाद, परीक्षण छवि अभी भी प्रदर्शित करेगा ।
    5. इनपुट माइक्रोस्कोप उद्देश्य और बिन्नी सेटिंग्स । यदि डिफ़ॉल्ट सेटिंग उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप से मेल नहीं खाती है, तो "कस्टम पिक्सेल रूपांतरण" चुनें और छवि फ़ाइलों के लिए पिक्सेल-से-um रूपांतरण इनपुट करें. एक बार चयनित होने पर, रूपांतरण परिकलित करें बटन को क्लिक करके सुनिश्चित कर लेना सही पर पाठ बॉक्स के अनुसार रूपांतरण सही है ।
      नोट: चित्रा 1 में दिखाए गए प्रतिनिधि छवियों की गणना 40x आवर्धन और 2x2 बिन्नी के साथ की गई थी ।
    6. सर्कल डिटेक्शन के लिए इनपुट एल्गोरिथ्म पैरामीटर्स ।
      1. न्यूनतम और अधिकतम कैप्सूल त्रिज्या प्रविष्टियों के रूप में बाहरी कैप्सूल का पता लगाने के लिए पहचाने जाने वाले इनपुट । एक छोटी रेंज अधिक सटीक परिणाम की अनुमति देगा ।
      2. इनपुट न्यूनतम और अधिकतम सेल शरीर का पता लगाने के लिए मिन और अधिकतम कोशिका शरीर त्रिज्या प्रविष्टियों के रूप में detectable त्रिज्या ।
        नोट: इन प्रविष्टियों के सभी चार पिक्सल में उनके संबंधित मूल्यों का प्रतिनिधित्व संख्या होना चाहिए, स्रोत छवियों के अनुसार ।
      3. एल्गोरिथ्म की संवेदनशीलता थ्रेशोल्ड को समायोजित करने के लिए कैप्सूल और सेल शरीर संवेदनशीलता स्लाइडर्स ले जाएँ. एक कम संवेदनशीलता सख्त हो जाएगा और झूठी सकारात्मक सर्कल का पता लगाने को कम, लेकिन यह भी कम असली हलकों का पता लगा सकता है । इसके विपरीत, एक उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने की दर में वृद्धि होगी, लेकिन यह भी झूठी सकारात्मक हलकों में परिणाम हो सकता है ।
        नोट: प्रतिनिधि परिणाम 7 के एक न्यूनतम कैप्सूल त्रिज्या, ४५ के अधिकतम कैप्सूल त्रिज्या, न्यूनतम शरीर त्रिज्या के साथ प्राप्त किए गए 4, अधिकतम शरीर त्रिज्या की 30, कैप्सूल संवेदनशीलता की ८७, और शरीर की संवेदनशीलता ८७.
    7. परीक्षण चलाएं बटन क्लिक करके अनियमित रूप से चयनित छवि पर पैरामीटर्स का परीक्षण करें । परिणाम कार्यक्रम के ऊपरी केंद्र में प्रदर्शित किया जाएगा, मूल छवि की जगह । परिणाम सही लग रही है, यह चयनित मापदंडों सभी चयनित छवियों फिट होगा सुनिश्चित करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से प्रयास करने के लिए एक अतिरिक्त यादृच्छिक छवि का चयन करने के लिए सिफारिश की है.
      1. निकायों और कैप्सूल का पता चला और नेत्रहीनों की संख्या को अधिकतम करने के लिए हलकों सही ढंग से फिट दिखाई कि क्या निरीक्षण । कैप्सूल के भीतर शवों की संख्या का पता सही करने के लिए पाठ बॉक्स में प्रदर्शित किया जाएगा. अंयथा, एल्गोरिथ्म पैरामीटर में हेरफेर जब तक परिणाम सही हैं ।
        नोट: मोटे रंग के हलकों केवल दृश्य के साथ मदद करने के लिए कर रहे हैं । माप के लिए जनरेट किया गया वास्तविक वृत HCT एल्गोरिथ्म द्वारा परिकलित एक गणितीय वक्र है ।
    8. विश्लेषण प्रारंभ करें बटन क्लिक करके छवि फ़ाइलों की संपूर्ण निर्देशिका पर खोज एल्गोरिथ्म चलाएं । प्रत्येक छवि का विश्लेषण किया जाएगा और कार्यक्रम "समाप्त" पाठ बॉक्स में सही करने के लिए जब सभी छवियों का विश्लेषण किया गया है करने के लिए प्रदर्शित करेगा ।
    9. मेल और सफ़ाई बटन क्लिक करें । यह पता लगाया कैप्सूल वे में रहते हैं, और कैप्सूल से शरीर को घटाया द्वारा सच कैप्सूल त्रिज्या की गणना करने के लिए सेल निकायों का पता लगाया मैच होगा ।
      नोट: यदि एल्गोरिथ्म का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा रहा है प्रतिदीप्ति या किसी अंय स्थिति में केवल एक वृत्त का पता लगाया है, तो यह चरण अनावश्यक है । इसके बजाय केवल केवल नीले या केवल हरी हलकों, क्रमशः के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए केवल पुल निकायों या केवल पुल कैप्सूल बटन क्लिक करें । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि यदि केवल कैप्सूल डेटा प्राप्त त्रिज्या सेल शरीर की त्रिज्या के रूप में सेल के कुल त्रिज्या का उल्लेख होगा नहीं घटाया जा सकता है ।
    10. छवि निर्देशिका में "CleanedOuput. csv" फ़ाइल में पूर्ण डेटा की स्थिति जानें । यदि डेटा का केवल एक ही भाग चयनित किया गया था, तो फ़ाइल को "CleanedBodies. csv" या "CleanedCapsules. csv" लेबल किया जाएगा.

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Representative Results

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छवियां पहले भारत इंक की माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त कर रहे है एक चमकदार क्षेत्र एक कैमरा (चित्रा 1) के साथ मिलकर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड । यह अलग कोशिकाओं और पर्याप्त कम घनत्व में देखने के क्षेत्र डूब नहीं है महत्वपूर्ण है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पर्याप्त के लिए कोशिकाओं और पृष्ठभूमि के बीच विपरीत बनाने के दाग का उपयोग करें । प्रोटोकॉल में कहा गया है, एक इष्टतम छवि के लिए कोशिकाओं की सही संख्या नमूना, माइक्रोस्कोप के आधार पर भिन्न हो जाएगा, और उद्देश्य इस्तेमाल किया जा रहा. महत्वपूर्ण पहलुओं को सुनिश्चित करने के लिए कर रहे है कोशिकाओं संकुल या अतिव्यापी नहीं हैं, कि सेल फोकल विमानों में काफी भिंनता नहीं है, और है कि वहां महत्वपूर्ण भारत स्याही दाग स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि में दिखाई दे रहे है (क्षेत्र के कम से 25%) । इन दिशाओं एल्गोरिथ्म औसत पिक्सेल तीव्रता मान लेने और मानक विचलन जोड़ कर प्रत्येक छवि के लिए अनन्य थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए अनुमति दें । एक तीव्रता मान के साथ किसी भी पिक्सेल से अधिक कहा थ्रेसहोल्ड सफेद माना जाता है और एक तीव्रता के साथ किसी भी मूल्य कम काला माना जाता है. परिणामस्वरूप छवि जहां कैप्सूल समाप्त होता है (चित्रा 1बी) के एक स्पष्ट और कुरकुरा भेद की अनुमति देता है । एल्गोरिथ्म तो कैप्सूल के लिए का पता लगाने के लिए एक मजबूत सफेद पर काला कंट्रास्ट आधारित सर्कल है और मूल छवि सेल निकायों के लिए एक मजबूत काले पर सफेद सर्कल प्रदान करता है । पता लगाया हलकों के एक प्रतिनिधि विज़ुअलाइज़ेशन प्रोग्राम (चित्र 1C) के भाग के रूप में उत्पन्न होता है । यह उपयोगकर्ता जल्दी से संसाधित छवियों के माध्यम से पार्स और परिणाम सटीक दिखाई सुनिश्चित करने के लिए अनुमति देता है ।

यह इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए सटीक प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आवश्यक है । उप इष्टतम छवियों को आम तौर पर कैप्सूल और स्याही के बीच विपरीत की कमी से परिणाम (चित्रा 2). इष्टतम इसके विपरीत और अधिग्रहण मापदंडों नमूना, प्रयोग, कैमरा और माइक्रोस्कोप मॉडल, आदि के आधार पर भिन्न हो जाएगा एक इष्टतम छवि एक जहां खमीर कोशिकाओं यदि संभव हो अलग कर रहे हैं, जहां कैप्सूल के बाहरी किनारे भारत स्याही दाग को स्पष्ट इसके विपरीत है, और जहां कोशिका शरीर को एक अंधेरे बैंड जो अपनी पृष्ठभूमि के साथ तेजी से विरोधाभासों के रूप में प्रदर्शित करने के लिए ध्यान केंद्रित है । यदि बहुत अधिक कक्ष दृश्य के क्षेत्र में हैं या यदि दाग बहुत हल्का है, तो पिक्सेल तीव्रता मान क्लस्टर होगा और प्रोग्राम elucidating कैप्सूल आकार (चित्र 2B) में सक्षम थ्रेशोल्ड स्थापित करने में सक्षम नहीं होगा । जब उप-इष्टतम छवियों का उपयोग किया जाता है कार्यक्रम गलत आकार के हलकों का पता लगाने के लिए, किसी भी हलकों का पता लगाने में सक्षम नहीं हो सकता है, या कई छद्म हलकों में कलाकृतियों के आधार पर सर्किलों का पता लगाने (चित्रा 2सी) ।

सेल निकायों का पता लगाने के एक समान समस्या है कि सेल शरीर कैप्सूल की सफेद पृष्ठभूमि पर एक मजबूत काले सर्कल के रूप में visualized किया जाना चाहिए बन गया । इस समस्या को जब छवि अधिग्रहण के लिए वांछित फोकल विमान का वर्णन प्रोटोकॉल में संबोधित किया है । सबसे अच्छा फोकल विमान का उपयोग करने के लिए एक है जिसमें कोशिका शरीर एक अंधेरे, केंद्रित बैंड (चित्रा 3) के रूप में प्रकट होता है । यह फोकल विमान एक मानक के रूप में स्वीकार्य है क्योंकि यह ठीक से सेल केंद्रित है । इस Uvitex, एक काइटिन दाग (चित्रा 3बी) के साथ सेल दीवार visualizing द्वारा पुष्टि की थी । Uvitex दाग स्पष्ट रूप से एक कुरकुरा, केंद्र में कमजोर संकेत के साथ केंद्रित सेल दीवार से पता चलता है (जहां ऊपर और कोशिका शरीर के नीचे दाग होगा, ध्यान से बाहर) ।

इस विधि को विकसित करने में यह भी पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण था कि इस एल्गोरिथ्म सही कैप्सूल और कोशिका शरीर माप निर्धारित कर सकता है. जबकि पिछले आंकड़ों में प्रतिनिधि हलकों का वादा कर रहे हैं, वास्तविक माप कंप्यूटर और मानव माप के बीच की तुलना में थे । जब प्रोटोकॉल सही और इष्टतम छवियों को प्राप्त कर रहे है का पालन किया है, एल्गोरिथ्म सटीक और विश्वसनीय है (चित्रा 4) । हालांकि, अगर प्रोटोकॉल गलत तरीके से पीछा किया जाता है और खराब धुंधला, भीड़, या अन्य पहले उल्लेखित मापदंडों के कारण इष्टतम छवियों प्राप्त कर रहे हैं, एल्गोरिथ्म सटीकता खो देता है और मानव मापन दोहराऊंगा नहीं कर सकता (चित्रा 4बी ). चूंकि इस तकनीक को मूल रूप से एक विशिष्ट व्यक्ति (प्रथम लेखक) के लिए विकसित किया गया था, एक अलग व्यक्ति का उपयोग करने के लिए कहा गया था यह निर्धारित करने के लिए अगर दाग और माप शैलियों के बीच अंतर प्रोटोकॉल निंनलिखित के बावजूद सटीकता को प्रभावित करेगा । परिणामों से पता चला कि इस तकनीक को व्यापक रूप से लागू किया गया था जब तक प्रोटोकॉल के रूप में निर्देश (चित्रा 4सी) का पालन किया गया । इसी तरह, इस तकनीक को तैयार भारत स्याही स्लाइड के चरण कंट्रास्ट छवियों को प्राप्त करने में सक्षम किसी भी माइक्रोस्कोप के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए एल्गोरिथ्म अन्य माइक्रोस्कोप setups के साथ सटीक रहता है इस प्रयोग एक तीसरी अंवेषक एक अलग उज्ज्वल क्षेत्र एक कैमरा के साथ मिलकर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दोहराया गया था और तुलना में पाया कैप्सूल व्यास मैन्युअल रूप से मापा कैप्सूल के साथ व्यास. कंप्यूटर और मानव मापन (चित्रा 4डी) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया ।

अंत में, इस एल्गोरिथ्म के भविष्य अनुप्रयोगों प्रतिदीप्ति धुंधला के संदर्भ में पता लगाया गया । चूंकि प्रतिदीप्ति इमेजिंग अभी भी पिक्सेल तीव्रता मूल्यों के शोर अनुपात के लिए संकेत पर आधारित है एल्गोरिथ्म आसानी से प्रतिदीप्ति छवियों के लिए लागू किया जाना चाहिए इतनी देर के रूप में दाग प्रकृति में परिपत्र है । एल्गोरिथ्म सफलतापूर्वक पहले से वर्णित छवियों (चित्रा 5ए, 5B) से Uvitex सना हुआ सेल निकायों का पता लगाने में सक्षम था जब इस आवेदन की पुष्टि की थी । उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोग के लिए एल्गोरिथ्म मापदंडों का अनुकूलन सावधान रहना चाहिए, और मानकीकृत प्रोटोकॉल भविष्य में किसी भी नए अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1 : एक इष्टतम रूप से प्राप्त छवि के प्रतिनिधि परिणाम । A. एक भारत स्याही स्लाइड के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत प्रारंभिक छवि । B. मानक विचलन में जोड़ी गई औसत पिक्सेल तीव्रता मान से परिकलित थ्रेशोल्ड का उपयोग करके बनाई गई बाइनरी छवि । इस दहलीज के ऊपर सभी मूल्यों को सफेद माना जाता है और सभी नीचे काले माने जाते हैं । C. कैप्सूल (हरा) और कोशिका निकायों (नीला) का एक दृश्य एल्गोरिथ्म द्वारा पता चला. 2x2 बिन्नी के साथ 40x आवर्धन पर सभी छवियां प्राप्त की गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक उप-इष्टतम रूप से प्राप्त छवि के प्रतिनिधि परिणाम । A. प्रारंभिक भारत इंक स्लाइड उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के माध्यम से हासिल की । असमान और अपर्याप्त धुंधला परिणाम तीव्रता की ढाल के साथ एक विशेष रूप से उज्ज्वल पृष्ठभूमि में । B. जिसके परिणामस्वरूप बाइनरी छवि, जिसमें कैप्सूल स्पष्ट रूप से उच्च पृष्ठभूमि संकेत के कारण प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है । C. कई कैप्सूल undetectable हैं । 2x2 बिन्नी के साथ 40x आवर्धन पर सभी छवियां प्राप्त की गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कोशिका निकायों का पता लगाने। पसंदीदा फोकल विमान में केंद्रित कैप्सूल की ए. ब्राइट फील्ड छवि । पसंदीदा फोकल विमान में सेल शरीर के बी. Uvitex प्रतिदीप्ति छवि । 2x2 बिन्नी के साथ 100x आवर्धन पर छवियां प्राप्त की गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एल्गोरिथ्म (काला) और मानव (ग्रे) विश्लेषण के लिए परिणामों की तुलना. A. जब स्लाइड प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार की जाती है और इष्टतम छवियां प्राप्त की जाती है तो मापन के बीच कोई प्रशंसनीय अंतर नहीं होता है । B. यदि प्रोटोकॉल का पालन नहीं है एल्गोरिथ्म सही रूप से पहचान और कैप्सूल को मापने नहीं कर सकता । यहाँ विशेष रूप से पृष्ठभूमि अनुरूप नहीं था और कैप्सूल और पृष्ठभूमि के बीच स्पष्ट इसके विपरीत नहीं था. t-परीक्षण के माध्यम से परिकलित महत्वपूर्ण भिन्नता * P मान के लिए < ०.०५ के रूप में नोट किया गया है । C. एक स्वतंत्र अन्वेषक प्रोटोकॉल का पालन करें और एल्गोरिथ्म के साथ उनके विश्लेषण की तुलना करने के लिए कहा गया था. जब तक छवियों को ठीक से प्राप्त कर रहे है विश्वसनीयता पर्यवेक्षकों भर में बनाए रखा है । D. एक दूसरे माइक्रोस्कोप के साथ एक दूसरे स्वतंत्र अन्वेषक एल्गोरिथ्म व्यक्तियों और हार्डवेयर भर में सटीकता बरकरार रखती पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की पहचान और माप: एल्गोरिथ्म का एक संभावित वैकल्पिक अनुप्रयोग. सेल निकायों और दाग थे Uvitex के साथ छवि, तो एल्गोरिथ्म द्वारा की पहचान की । पता लगाया सर्कल पिछले क्या सेल दीवार के रूप में चिह्नित किया जाएगा क्योंकि पता लगाने प्रतिदीप्ति संकेत पर आधारित है फैली हुई है । पता लगाने एल्गोरिथ्म विशेष रूप से संकेत के प्रतिभाशाली संचय (सेल दीवार) के लिए प्रारंभिक बाइनरी छवि उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया आंकड़े 1b और बी bमें प्रतिनिधित्व की पहचान के अनुरूप किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: एक Windows वातावरण में चल रहे अनुप्रयोग का एक प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: का पता लगाया नवोदित खमीर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व. स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 10 µm. A. एक माता पिता के सेल और कली प्रत्येक अपने स्वयं के कैप्सूल के भीतर अलग कोशिकाओं के रूप में गिना । ख. एक माता पिता के सेल और कली प्रत्येक दो बार गिना, एक बार अपने कैप्सूल के लिए और एक बार दूसरे सेल कैप्सूल के लिए, चार कुल कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप एक माता पिता और एक कली से पता चला. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 3
पूरक चित्रा 3: सेल का पता लगाने और माप के बाद प्रदान किए गए अंतिम डेटा का एक प्रस्तुतिकरण. छवि फ़ाइल मूल छवि के नाम को संदर्भित करता है । कुल त्रिज्या प्रतिनिधि हरी हलकों, कैप्सूल और सेल शरीर संयुक्त की त्रिज्या को संदर्भित करता है । कैप् सूल x और कैप् सूल y कैप्सूल के निर्देशांक देखें जिनके लिए यह डेटा लागू होता है. शरीर त्रिज्या प्रतिनिधि नीले हलकों के दायरे को संदर्भित करता है । कैप्सूल त्रिज्या शरीर त्रिज्या शूंय से कुल त्रिज्या को संदर्भित करता है, बस कैप्सूल के दायरे में जिसके परिणामस्वरूप । जब तक यूजर को स्टेप 3.2.5 में पिक्सेल-माइक्रोन रूपांतरण अनुपात शामिल होता है तब तक ये मान माइक्रोन में होंगे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस तकनीक के अहम कदम भारत केे स्लाइड तैयार कर रहे हैं और माइक्रोस्कोपी इमेज हासिल कर रहे हैं । एल्गोरिथ्म सफलतापूर्वक स्लाइड और छवि तकनीक की एक किस्म के साथ परीक्षण किया गया है, जबकि अनुशंसित प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में वर्णित है । polysaccharide कैप्सूल के रूप में इन कणों polysaccharide फाइब्रिल नेटवर्क घुसना करने के लिए बहुत बड़ा कर रहे हैं के रूप में कैप्सूल के डोमेन से भारत स्याही कणों के अपवर्जन के आधार पर पता चला है । एक अंधेरे पृष्ठभूमि के शीर्ष पर एक चमकदार सर्कल में भारत स्याही अपवर्जन परिणाम । एल्गोरिथ्म कितनी अच्छी तरह वे अपनी पृष्ठभूमि के साथ इसके विपरीत के आधार पर हलकों का पता लगाता है । इस प्रकार, एक भारी भारत स्याही दाग polysaccharide कैप्सूल और पृष्ठभूमि के बीच उच्च विपरीत में परिणाम, शोर अनुपात के लिए संकेत बढ़ रही है, और परिणाम की गुणवत्ता में सुधार होगा । इसके विपरीत, कोशिका शरीर एक चमकदार पृष्ठभूमि के शीर्ष पर एक काले घेरे के रूप में पता चला है । सेल शरीर के आधार पर जो फोकल विमान माइक्रोस्कोप के लिए, ऊपर या कोशिका के नीचे और केंद्र में एक गाढ़ा अंधेरे बैंड के रूप में एक फैलाना ग्रे सर्कल के रूप में प्रदर्शित होने के लिए सेट किया गया है उपस्थिति बदल जाएगा । एक ही कारण के लिए पहले से ही चर्चा की, फोकल विमान जहां कोशिका शरीर एक गाढ़ा के रूप में प्रकट होता है, अंधेरे बैंड छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में यह सबसे सटीक चक्र का पता लगाने में परिणाम होगा ।

विधि यहां रिपोर्ट कई संशोधनों और समस्या निवारण के दौर के माध्यम से प्रगति की है । एल्गोरिथ्म शुरू में अपेक्षित कोडित था कि कोशिकाओं से 4 या बड़े ६० पिक्सेल से अधिक माइक्रोस्कोप है कि इस्तेमाल किया गया था पर आधारित नहीं होगा । विभिंन आवर्धन और कक्ष आकार के लिए इस एल्गोरिथ्म के अनुप्रयोग का विस्तार करने के लिए इन सीमाओं के बजाय प्रोटोकॉल में वर्णित उपयोगकर्ता इनपुट फ़ील्ड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया । उपयोगकर्ताओं को अब अधिकतम सटीकता के लिए प्रत्येक प्रयोग करने के लिए विशिष्ट पैरामीटर इनपुट हो सकता है । इस एल्गोरिथ्म Cryptococcus कैप्सूल माप के बाहर एक स्थिति के लिए लागू किया जा रहा है, तो यह पहले से निर्धारित कैसे नमूनों उत्पन्न किया जाना चाहिए और छवि निर्धारण करने के लिए शर्तों को खोजने रेंज की एक श्रृंखला सेट करने के लिए सिफारिश की है ।

इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह मन में एक विशिष्ट अनुप्रयोग, अर्थात् cryptococcal कैप्सूल की माप के साथ बनाया गया था । यह आसानी से अतिरिक्त अनुप्रयोगों फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, यह स्क्रिप्ट केवल सीधे ऊपर उल्लिखित कैप्सूल माप प्रोटोकॉल के लिए लागू है. हालांकि, इस सीमा भी अपने क्षेत्र के लिए और मौजूदा विधियों के संबंध में इस विधि के महत्व का वर्णन करता है । इसके अतिरिक्त, नवोदित खमीर कोशिकाओं जांचकर्ता जो केवल जनक कोशिका आकार मापने के लिए इच्छा के लिए एक समस्या पेश कर सकते हैं । इस एल्गोरिथ्म अद्वितीय कोशिकाओं (चित्रा S2A) के रूप में कलियों का पता लगाने में सक्षम है । सबसे पहले, यह एक समस्या हो सकती है अगर जांचकर्ता जिस मामले में वे कली माप, या दोनों कोशिकाओं को हटाने की इच्छा होगी अगर यह निर्धारित नहीं किया जा सकता है जो पता चला चक्र कली है और जो माता पिता है । दूसरा, यह एक और समस्या पैदा कर सकता है अगर कली माता पिता के कैप्सूल के दायरे में अभी भी एक कोशिका शरीर के रूप में पता चला है (चित्रा S2B) जो मामले में एल्गोरिथ्म पैतृक कैप्सूल के संदर्भ में कली उपाय करेंगे. प्रत्येक कोशिका शरीर दो कैप्सूल के भीतर रहता है क्योंकि इस उदाहरण में प्रत्येक कोशिका दो बार गिना जाएगा. या तो इन समस्याओं का आसानी से संबोधित किया जा सकता है एक बार प्रोटोकॉल समाप्त हो गया है । अंतिम डेटा सेट एक स्प्रेडशीट के रूप में दिखाई देगा, जहां प्रत्येक व्यक्ति का पता लगाया गया कक्ष उस छवि फ़ाइल के अनुसार लेबल किया गया है, जहां से यह आया था, और सेल बॉडी के x और y निर्देशांक (चित्र S3) । जांचकर्ताओं बस पा सकते है और डेटा जो कली मैच के बाहर । कैप्सूल आकार के बावजूद एक महत्वपूर्ण और भारी अध्ययन किया जा रहा डाह कारक Cryptococcus फ़ील्ड अभी तक कैप्सूल माप या छवि अधिग्रहण के लिए मानक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए है । इस तकनीक को एक सटीक और सुविधाजनक तरीके से इन भूमिकाओं को मुक्त रूप से ंयूनतम आवश्यकता के साथ प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध भरने के लिए डिज़ाइन किया गया था ।

इस तकनीक के भविष्य के आवेदनों को मोटे तौर पर इसे अंय प्रयोगों के लिए लागू होते हैं । किसी भी छवि आधारित पता लगाने या परिपत्र वस्तुओं की माप इस एल्गोरिथ्म के माध्यम से विश्लेषण किया जाना चाहिए । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों व्यक्तिगत लेजर चैनलों के लिए एल्गोरिथ्म लागू करने से विश्लेषण किया जा सकता है । बैक्टीरियल कॉलोनी गिनती प्राप्त किया जा सकता है, और अतिरिक्त संशोधन के साथ गैलेक्टोज पत्रकारों के बीच भेद सकता है । खमीर कॉलोनी विकास परख भी इस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए कॉलोनी क्षेत्र आकार अनुमान मूल्यांकन किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम एंथनी Bowen स्वीकार करते है जिसकी स्लाइड के रूप में एक दूसरे मानव के साथ-साथ तुलना के रूप में अच्छी तरह से सबरीना नोलन जिनकी स्लाइड एक तिहाई मानव पक्ष के रूप में इस्तेमाल किया गया था और दूसरा खुर्दबीन तुलना के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

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References

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<em>Cryptococcal</em> प्रजातियों Polysaccharide कैप्सूल और कोशिका शरीर के स्वचालित माप
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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