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Immunology and Infection

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

Abstract

O objetivo desta técnica é fornecer um processo consistente, preciso e gerenciável para grande número de medições da cápsula de polissacarídeo.

Primeiro, uma imagem de limiar é gerada com base nos valores de intensidade calculados exclusivamente para cada imagem. Em seguida, círculos são detectados com base no contraste entre o objeto e o plano de fundo usando o algoritmo de transformação de Hough de círculo (CHT) bem estabelecida. Finalmente, a célula detectado cápsulas e corpos são comparados de acordo com o tamanho do raio e as coordenadas do centro, e dados são exportados para o usuário em uma planilha gerenciável.

As vantagens desta técnica são simples, mas significativo. Primeiro, porque esses cálculos são executados por um algoritmo, ao invés de um ser humano tanto a precisão e a confiabilidade são aumentadas. Não há nenhuma diminuição na precisão ou confiabilidade independentemente de quantas amostras são analisadas. Em segundo lugar, esta abordagem estabelece um potencial o procedimento padrão para o campo de Cryptococcus em vez da situação atual onde cápsula medição varia de acordo com o laboratório. Em terceiro lugar, dado que a medição manual da cápsula é lentas e monótonas, automação permite medições rápidas em um grande número de células de levedura que por sua vez facilita a análise de dados de alta taxa de transferência e estatísticas cada vez mais poderosas.

As principais limitações desta técnica vem como as funções do algoritmo. Em primeiro lugar, o algoritmo só irá gerar círculos. Enquanto as células Cryptococcus e suas cápsulas assumem uma morfologia circular, seria difícil aplicar esta técnica para detecção de objeto não-circular. Em segundo lugar, devido a como os círculos são detectados o algoritmo CHT pode detectar enormes círculos pseudo baseados-se nas bordas exteriores de vários círculos em cluster. No entanto, qualquer deturpados corpos celulares, pego dentro do círculo de pseudo podem ser facilmente detectados e removidos os conjuntos de dados resultantes.

Esta técnica é destinada a medir as cápsulas circulares polissacarídeo de espécies de Cryptococcus baseado em microscopia de campo claro tinta nanquim; Embora poderia ser aplicada para outro contraste com base em medições objeto circular.

Introduction

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Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica ubiquitously encontrada ao redor do globo que está associado com doença humana principalmente em populações de imunossuprimidos. C. neoformans mais notavelmente representa uma importante causa de mortes anuais totais na África subsahariana devido a doenças infecciosas1. A principal manifestação clínica de infecção criptocócica é meningoencefalite, que segue a invasão do sistema nervoso central de transportes em macrófagos infectados (forma de cavalo de Troia) ou cruzamento direto da barreira sangue - cérebro. C. neoformans manifesta vários fatores de virulência, incluindo a capacidade de replicar na temperatura do corpo humano, a atividade da urease, melanização e formação de uma cápsula de polissacarídeo2. A cápsula de polissacarídeo é composta de repetição glucuronoxylomannan e glucoronoxylomannangalactan de polímeros e funções como uma barreira protetora contra fatores como estresse ambiental e de respostas imunes do hospedeiro2.

Embora o tamanho do tamanho da cápsula de polissacarídeo criptocócica não foi consistentemente associado com virulência, há provas de que é um fator na patogênese2,3,4,5, 6,7. Cápsula tamanho está associado a meningite patologia6, pode afetar a capacidade de macrófago para controlar a infecção de Cryptococcus 5e pode resultar em perda de virulência se ausente8. Daí, medições do tamanho da cápsula são comuns em pesquisa criptocócica, mas não há nenhum fieldwide padrão para um método de medição da cápsula.

Atualmente, c. neoformans polissacarídeo cápsula medida baseia-se na medição manual de imagens de microscopia, e os métodos exatos de aquisições tanto imagem e medição variam entre laboratórios9,10, 11. Uma preocupação imediata para este método é que alguns estudos exigem a aquisição de milhares de medições individuais, o que torna difícil a manutenção de precisão e confiabilidade. Além disso, mesmo quando os resultados são publicados, lá é muitas vezes insuficiente descrição do método de medição. Muitas publicações não explicam como foram obtidas as medidas, utilizou-se o que plano focal, como determinado o limiar para identificação da cápsula, se eles usaram o raio ou o diâmetro, eles utilizado uma medição ou a média de vários, ou outros detalhes. Algumas publicações único Estado seu método como qual programa foi usado, por exemplo, "Adobe Photoshop CS3 foi usado para medir as células"11. Esta falta de padronização e relatando detalhes pode dificultar a reprodutibilidade se não impossível. Diferenças na visão humana, brilho do computador, configurações do microscópio, deslize a iluminação, e outros fatores podem variar não só entre indivíduos, mas entre as amostras, Considerando que cálculos baseados em proporções de valores de intensidade do pixel permanecerá constantes e aplicáveis entre as amostras. Esta técnica foi gerada no contexto de fornecer uma técnica padronizada, precisa, rápida e simples para medir tamanhos de cápsulas para um campo em que não havia nenhum antes.

Como mencionado anteriormente, o algoritmo CHT é bem estabelecida, e scripts para detectar automaticamente os círculos foram escritos antes. Esse método melhora em duas áreas onde outros scripts que ficam aquém. Em primeiro lugar, simplesmente detectar círculos não é suficiente, porque com células criptocócica devem ser detectados dois círculos distintos em relação à outra. Esse método especificamente detecta corpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre os dois e realiza cálculos apenas sobre os pares de corpo-cápsula relevantes. Em segundo lugar, mesmo quando seguir o mesmo protocolo, diferentes investigadores vai acabar com diferentes adquiridas imagens. Permitindo o controle do investigador sobre cada parâmetro de algoritmo, esta ferramenta pode ser ajustada para coincidir com uma ampla gama de métodos de aquisição. Não há nenhuma necessidade para um escopo padronizado, objetivo, filtro e assim por diante.

Esta técnica pode ser aplicada facilmente a qualquer situação em que o investigador precisa detectar círculos dentro de uma imagem que contrastam com o fundo. Ambos os círculos mais leves e mais escuros do seu plano de fundo pode ser detectado, contados e medidos usando esta técnica.

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Protocol

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1. preparação de tinta nanquim Slide

  1. Pipete 10 µ l de amostra criptocócica numa lâmina. Qualquer levedura circular irá funcionar, mas para este experimento H99 foi a única estirpe utilizada.
    Nota: Se a amostra for directamente a partir de meios de cultura, diluição 1:2 com PBS ou água pode ajudar a prevenir a tinta da Índia de aglutinação.
  2. Pipetar 2 µ l de mancha de tinta da Índia para a amostra e misture fisicamente empurrando a ponta da pipeta para a amostra e movendo-se em movimentos circulares até que a tinta da Índia aparece uniformemente distribuída.
  3. Coloque uma lamela sobre a amostra, pressionando a borda esquerda da lamela contra a superfície da lâmina, então delicadamente e uniformente abaixando o lado oposto da lamela da amostra.
  4. O slide para o ar deixe secar por 5 min.
  5. Aplica suavemente uma leve camada de verniz para fronteira lamela para formar um selo e preservar a mancha de tinta nanquim.

2. Slide de imagem

  1. Coloque slides em um microscópio de campo claro com um acessório de câmera e conversão de pixel-a-micron conhecido. Ajuste contraste, objectivos e filtros para que cápsulas de célula são claras e corpos celulares são bandas focadas, escuras.
    Nota: Vários filtros, objectivos e configurações de contraste vão trabalhar, mas recomenda-se um 20 x objetivo, Ph1 filtro e binning 2x2.
  2. Certifique-se que o campo de visão é denso mas não superpovoado com células criptocócica, com claro contraste entre a cápsula de célula e plano de fundo e devidamente concentrado com o corpo de célula visualizado como uma banda escura.
    Nota: O número exato de células para uma imagem ideal pode variar dependendo da amostra e o objetivo sendo usado. Os aspectos importantes são para células não sejam agrupados ou sobrepostos, que os aviões focal de célula não variam significativamente, e que há significativa Nanquim mancham claramente visível no plano de fundo (pelo menos 25% do campo).
  3. Salve imagens em um único diretório com títulos claros, como o algoritmo de medição será executado em imagens em um único diretório e os dados de saída serão organizados de acordo com os nomes dos arquivos de imagem.

3. algoritmo Setup

  1. Instalar a versão do Python 2.7 de
  2. Instalar bibliotecas python adicionais executando os comandos "pip install travesseiro" e "pip install openpyxl".
  3. Instalar o MATLAB, seguindo as instruções no
  4. Compilar a biblioteca python MATLAB, seguindo as instruções fornecidas no https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Baixe os três arquivos necessários incluídos em materiais suplementares a este manuscrito ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m").
    Nota: Esses arquivos podem ser extraídos para qualquer local, mas todos os três devem estar no mesmo diretório.

4. utilização do algoritmo

  1. Execute o aplicativo clicando duas vezes em QCA.py.
    Nota: A aplicação pode levar alguns minutos para começar. O arquivo "QCA.py" contém a estrutura de programa que chama os arquivos ". m" para executar o algoritmo real.
  2. Siga as etapas descritas no programa.
    1. Entrada, o tipo de extensão de arquivos de imagem, precedido por um ponto e separados por ponto e vírgula (ex. ". TIF;. JPEG") em seguida clique no botão Enter .
    2. Escolha o diretório no qual os arquivos de imagem estão localizados clicando no botão Selecionar diretório e selecionando a pasta que contém as imagens.
    3. Gera a lista de arquivos de imagem no diretório clicando no botão Gerar lista de imagem . As imagens serão listadas na caixa de texto à direita. Revisar e assegurar que a lista é exacto e completo.
    4. Selecione uma imagem aleatória da lista para usar como uma visualização clicando no botão Selecionar imagem aleatória .
      Nota: Se a imagem for não é possível abrir devido a um erro de modo"imagem incorreta", o algoritmo ainda funcionará correctamente apesar de não exibir a imagem. Após a etapa 4.2.7, ainda exibirá a imagem de teste.
    5. Objetivo do microscópio e binning configurações de entrada. Se as configurações padrão não coincidem com o microscópio usado, selecione "Custom Pixel conversão" e a conversão de pixel-para-um para os arquivos de imagem de entrada. Uma vez selecionado, clique no botão Calcular conversão e assegurar que a conversão está correta de acordo com a caixa de texto à direita.
      Nota: Imagens representativas, mostradas na Figura 1 foram calculadas com 40 x ampliação e 2x2 binning selecionado.
    6. Parâmetros de algoritmo para a deteção do círculo de entrada.
      1. Entrada do raio máximo e mínimo detectável para a deteção da cápsula externa como as entradas de Min e Max cápsula Radius. Um intervalo menor permitirá obter resultados mais precisos.
      2. Entrada do raio mínimo e máximo detectável para detecção do corpo celular como as entradas de Min e Max corpo celular Radius.
        Nota: Todos os quatro dessas entradas devem ser números representando seus respectivos valores em pixels, de acordo com as imagens de origem.
      3. Mova os controles deslizantes de cápsula e sensibilidade do corpo celular para ajustar o limiar de sensibilidade do algoritmo. Uma baixa sensibilidade será rigorosa e reduzir a deteção do círculo positivo falso, mas também pode detectar círculos reais menos. Por outro lado, uma alta sensibilidade aumentará a taxa de detecção, mas também pode resultar em falsos positivos círculos.
        Nota: Resultados representativos foram obtidos com um raio mínimo de cápsula de 7 raio máximo de cápsulas de 45, raio de corpo mínimo de 4, raio máximo de corpo de 30, cápsula sensibilidade de 87 e a sensibilidade do corpo de 87.
    7. Teste os parâmetros na imagem aleatoriamente selecionado clicando no botão Executar teste . O resultado será exibido no centro superior do programa, substituindo a imagem original. Se os resultados precisos, é recomendável para selecionar uma imagem aleatória adicional para tentar garantir que os parâmetros selecionados vão caber todas as imagens selecionadas também.
      1. Maximizar o número de corpos e cápsulas detectado e inspecionam visualmente se os círculos parecem caber corretamente. O número de corpos dentro de cápsulas detectados será exibido na caixa de texto à direita. Caso contrário, manipule os parâmetros de algoritmo até que os resultados são precisos.
        Nota: Os espesso círculos coloridos são apenas para ajudar com a visualização. Os círculos reais gerados para medição é uma curva matemática calculada pelo algoritmo HCT.
    8. Execute o algoritmo de detecção em todo o diretório de arquivos de imagem clicando no botão Iniciar análise . Cada imagem será analisada e o programa irá exibir "terminado" na caixa de texto para a direita quando todas as imagens foram analisadas.
    9. Clique no botão de partida e limpeza . Isto corresponder detectados corpos celulares para as cápsulas detectados que residem no e calcular o raio da cápsula verdadeiro subtraindo o corpo da cápsula.
      Nota: Se o algoritmo está sendo usado para detectar fluorescência ou outra situação em que apenas um círculo é detectado este passo é desnecessário. Em vez disso, clique os Corpos apenas puxar ou o botão de Cápsulas só puxar para coletar os dados para somente o azul ou só os círculos verdes, respectivamente. É importante notar que se apenas os dados da cápsula são recuperados o raio irá se referir o raio total da célula como o raio do corpo celular não poderia ser subtraído.
    10. Localize os dados concluídos no arquivo "CleanedOuput.csv" no diretório de imagens. Se apenas uma parte dos dados foi seleccionada, o arquivo será rotulado "CleanedBodies.csv" ou "CleanedCapsules.csv".

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Representative Results

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Imagens primeiro são obtidas pela microscopia de Nanquim slides usando um microscópio de campo claro, juntamente com uma câmera (Figura 1A). É importante que as células separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão, bem como como usar bastante mancha para criar contraste entre células e plano de fundo. Conforme o protocolo, o número exato de células para uma óptima imagem irá variar dependendo da amostra, microscópio e objetivo sendo usado. Os aspectos importantes são para células não sejam agrupados ou sobrepostos, que os aviões focal de célula não variam significativamente, e que há significativa Nanquim mancham claramente visível no plano de fundo (pelo menos 25% do campo). Estas instruções permitem o algoritmo para determinar um limite exclusivo para cada imagem, obtendo o valor de intensidade média de pixel e adicionando o desvio-padrão. Qualquer pixel com um valor de intensidade superior ao limiar referido é considerado branco e qualquer um com um valor de intensidade menor é considerado negro. A imagem resultante permite uma distinção clara e nítida de onde a cápsula termina (Figura 1B). O algoritmo, em seguida, tem um círculo de contraste de branco sobre preto robusto baseado para detectar a cápsula e a imagem original fornece um círculo preto no branco robusto para corpos celulares. Uma visualização representativa dos círculos detectados é gerada como parte do programa (Figura 1C). Isto permite que o usuário rapidamente analisar através de imagens processadas e garantir que os resultados aparecem precisos.

É essencial seguir o protocolo exato para adquirir imagens ideais. Imagens sub-ótimas geralmente resultam de uma falta de contraste entre a cápsula e a tinta(Figura 2). Parâmetros ideais de contraste e aquisição irão variar com base na amostra, modelos de experimento, câmera e microscópio, etc. Uma imagem ideal é um onde as células de levedura são separadas, se possível, onde o canto exterior da cápsula tem claro contraste para a mancha de tinta da Índia, e onde o corpo da célula é focado para aparecer como uma faixa escura que contrasta fortemente com seu plano de fundo. Se muitas células estão no campo de visão, ou se a mancha é muito leve, os valores de intensidade do pixel serão de cluster e o programa não será capaz de estabelecer um limite capaz de elucidar o tamanho da cápsula (Figura 2B). Quando são usadas imagens sub-ótimas o programa pode detectar círculos de tamanhos incorretos, não ser capaz de detectar qualquer círculos ou detectar vários círculos pseudo baseados em artefatos na imagem do limiar (Figura 2C).

Detecção de corpos celulares coloca um problema semelhante, em que o corpo da célula deve ser visualizado como um círculo preto robusto sobre o fundo branco da cápsula. Este problema é abordado no protocolo ao descrever o plano focal desejado para aquisição de imagens. O melhor plano focal usar é um em que o corpo de célula aparece como uma banda escura, concentrada(Figura 3). Este plano focal é aceitável como um padrão porque corretamente centra-se na célula. Isto foi confirmado através da visualização da parede celular com Uvitex, uma mancha de quitina (Figura 3B). O Uvitex mancha mostra claramente uma batata frita, focada a parede celular com sinal fraco no centro (onde a parte superior e inferior do corpo celular estavam manchados, fora de foco).

Em desenvolver este método também foi importante confirmar que este algoritmo poderia determinar com precisão as medições de cápsula e corpo celular. Enquanto os círculos representativos nas figuras anteriores são promissores, as medições reais foram comparadas entre computador e medidas humanas. Quando o protocolo é seguido com precisão e óptimas imagens são obtidas, o algoritmo é precisa e confiável(Figura 4). No entanto, se o protocolo é seguido incorretamente e imagens de qualidade inferior são obtidas devido à coloração pobre, superlotação ou outros parâmetros mencionados anteriormente, o algoritmo perde precisão e não pode repetir medições humanas (Figura 4B ). Uma vez que esta técnica foi originalmente desenvolvida para um indivíduo específico (primeiro autor), um indivíduo diferente foi convidado para usá-lo para determinar se as diferenças entre os estilos de coloração e medição afetaria precisão apesar de seguir protocolo. Os resultados mostraram que esta técnica foi amplamente aplicável, desde que o protocolo foi seguido como instruído (Figura 4C). Da mesma forma, esta técnica pode ser usada com qualquer microscópio capaz de adquirir imagens de contraste de fase dos slides preparados tinta nanquim. Para garantir que o algoritmo exato com outras configurações de microscópio que este experimento foi repetido por um terceiro investigador usando um microscópio de campo brilhante diferente juntamente com uma câmera e comparado detectados diâmetros cápsula com cápsula medido manualmente diâmetros. Nenhuma diferença significativa foi observada entre o computador e medições humanas (Figura 4-D).

Finalmente, as aplicações futuras deste algoritmo foram exploradas no contexto da fluorescência de coloração. Desde imagens de fluorescência baseia-se ainda a sinal de rácios de ruído dos valores de intensidade do pixel o algoritmo deve ser prontamente aplicável a imagens de fluorescência, enquanto a mancha é circular na natureza. Esta aplicação foi confirmada quando o algoritmo foi capaz de detectar com sucesso que uvitex manchado de corpos celulares de imagens descritas anteriormente (Figura 5A, 5B). Os usuários devem ter cuidadosos para otimizar os parâmetros de algoritmo para o experimento, e protocolos padronizados devem ser desenvolvidos no futuro para quaisquer novas aplicações.

Figure 1
Figura 1 : Resultados representativos de uma imagem ideal obtido. R. a imagem inicial, adquirida pela microscopia de campo claro de um slide de Nanquim. B. A imagem binária criada usando um limiar calculado a partir de pixel média intensidade valor acrescentado para o desvio-padrão. Todos os valores acima desse limite são considerados brancas e todos abaixo são considerados preto. C. uma visualização das cápsulas (verde) e corpos celulares (azul) detectados pelo algoritmo. Todas as imagens foram obtidas na ampliação de x 40 com binning 2x2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Resultados representativos de uma imagem sub-optimizada obtido. R. o slide de Nanquim inicial adquirido através de microscopia de campo claro. Irregular e inadequada resulta em um fundo particularmente brilhante com gradientes de intensidade de coloração. B. A binária imagem resultante, em que claramente não podem ser distinguidas cápsulas devido ao sinal de fundo elevado. C. várias cápsulas são indetectáveis. Todas as imagens foram obtidas na ampliação de x 40 com binning 2x2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: detecção de corpos de células. R. campo brilhante imagem da cápsula centralizada no plano focal preferencial. B. Uvitex imagem de fluorescência do corpo celular no plano focal preferencial. Imagens foram obtidas na ampliação de 100 x com binning 2x2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: análises de as comparações dos resultados para o algoritmo (preto) e humanos (cinza). R. quando slides são preparados de acordo com o protocolo e obtêm-se imagens ideais não há nenhuma diferença significativa entre as medições. B. se o protocolo não é seguido o algoritmo não pode com precisão identificar e medir as cápsulas. Aqui especificamente o fundo não foi consistente e havia não limpar o contraste entre o fundo e cápsulas. Variações significativas, calculadas através do teste t é anotado como * para valores de P < 0,05. C. um investigador independente foi convidado a seguir o protocolo e comparar suas análises com o algoritmo. Confiabilidade é mantida através de observadores, enquanto as imagens são adquiridas corretamente. M. Um segundo investigador independente com um microscópio segundo foi usado para confirmar que o algoritmo mantém precisão através de indivíduos e de hardware. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Uma potencial aplicação alternativa do algoritmo: identificação e medição de microscopia de fluorescência. Corpos celulares foram manchados e fotografados com Uvitex e depois identificados pelo algoritmo. O círculo detectado ultrapassa o que seria rotulado como parede celular porque a deteção baseia-se o sinal de fluorescência. O algoritmo de detecção pode ser adaptado para identificar especificamente a acumulação mais brilhante de sinal (parede celular), modificando o limite usado para gerar a imagem binária inicial representada em Figuras 1B e 2B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementar Figura 1: uma imagem representativa do aplicativo em execução em um ambiente Windows. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 2
Suplementar Figura 2: células de levedura representações de brotamento detectado. Barra de escala representa 10 µm. r. Uma célula-mãe e bud cada contado como celas separadas dentro de sua própria cápsula. Cada célula B. pai e bud contados duas vezes, uma vez que para sua própria cápsula e uma vez para a cápsula de outras células, resultando em quatro células totais detectado de um pai e amigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 3
Suplementar Figura 3: uma representação dos dados fornecidos após a deteção de célula e medição finais. Arquivo de imagem se refere ao nome da imagem original. Raio total refere-se ao raio dos círculos verdes representativos, cápsula e corpo celular combinada. Cápsula x e y de cápsula referem-se as coordenadas da cápsula para que esses dados se aplica a. Raio do corpo refere-se ao raio dos círculos azuis representativos. Raio de cápsula refere-se ao raio total menos o raio do corpo, resultando em um raio de apenas a cápsula. Esses valores serão em mícrons, contanto que o usuário incluído uma relação de conversão de pixel-a-micron no passo 3.2.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Os passos críticos desta técnica estão preparando o slide de tinta nanquim e aquisição de imagens do microscópio. Enquanto o algoritmo foi testado com êxito com uma variedade de técnicas de slide e imagem o protocolo recomendado é descrito neste manuscrito. A cápsula de polissacarídeo é detectada com base na exclusão de partículas de tinta da Índia do domínio da cápsula como estas partículas são muito grandes para penetrar a rede de fibrila de polissacarídeo. Exclusão de Nanquim resulta em um círculo brilhante em cima de um fundo escuro. O algoritmo detecta círculos com base em quão bem eles contrastam com seus antecedentes. Assim, uma mancha de tinta nanquim pesada irá resultar em maior contraste entre a cápsula de polissacarídeo e fundo, aumentando o sinal à relação de ruído e melhorar a qualidade do resultado. Por outro lado, o corpo celular é detectado como um círculo escuro em cima de um fundo brilhante. O corpo celular irá mudar a aparência com base em qual plano focal, o microscópio é conjunto, aparecendo como uma difusa cinzento círculo na parte superior ou inferior da célula e como uma banda escura condensada no centro. Pelas mesmas razões que já discutida, plano focal onde o corpo de célula aparece como uma banda de condensado, escura deve ser usado para aquisição de imagens, pois isso resultará na detecção de círculo mais precisa.

O método aqui relatado evoluiu através de várias modificações e rodadas de solução de problemas. O algoritmo foi inicialmente codificado, esperando que as células não seria menores do que 4 ou maior que 60 pixels com base no microscópio que foi usado. Para expandir a aplicação deste algoritmo para ampliações diferentes e tamanhos de células, que estes limites em vez disso foram substituídos pelos campos de entrada de usuário descritos no protocolo. Os usuários podem agora entrada parâmetros específicos para cada experimento para precisão máxima. Se esse algoritmo está sendo aplicado a uma situação fora da cápsula medição Cryptococcus é recomendável primeiro configurar uma série de gama encontrar condições para determinar como as amostras devem ser geradas e fotografadas.

A mais significativa limitação dessa técnica é que ele foi projetado com uma aplicação específica em mente, ou seja, a medição da cápsula criptocócica. Enquanto ele pode ser facilmente modificado para caber aplicações adicionais, este script só é directamente aplicável para o protocolo de medição cápsula descrito acima. No entanto, esta limitação também descreve a importância desse método em relação ao seu campo e para os métodos existentes. Além disso, brotamento células de levedura podem representar um problema para os investigadores que desejam apenas medir os tamanhos de pilha do pai. Este algoritmo é capaz de detectar os botões como células únicas (Figura S2A). Primeiro, isso pode ser um problema se o investigador no caso eles gostaria de remover as medições de broto, ou ambas as células se não puder ser determinado qual detectado círculo é o bud e que é o pai. Em segundo lugar, isso pode causar outro problema se o broto é detectado como um corpo celular ainda dentro dos limites da cápsula parental (Figura S2B) em que caso o algoritmo irá medir o broto em referência a cápsula parental. Neste exemplo cada célula será contada duas vezes, porque cada corpo celular reside em duas cápsulas. Qualquer um destes problemas pode ser resolvido facilmente, uma vez terminado o protocolo. O conjunto final de dados aparecerá como uma planilha onde cada indivíduo detectado célula é rotulada de acordo com o arquivo de imagem veio e o x e y coordenadas do corpo celular (Figura S3). Os investigadores podem basta localizar e excluir os dados que corresponde à nascença. Apesar do tamanho da cápsula, sendo um importante e fortemente estudou o factor de virulência que Cryptococcus campo ainda tem de estabelecer protocolos padrão para aquisição de medição ou imagem da cápsula. Esta técnica foi projetada para preencher essas funções de modo exato e conveniente livremente disponível aos laboratórios com pré-requisitos mínimos.

Futuras aplicações desta técnica são, principalmente, para aplicá-la a outras experiências. Qualquer imagem base deteção ou medição de objetos circulares deve ser analisáveis através desse algoritmo. Imagens de microscopia fluorescente podem ser analisadas, aplicando o algoritmo para canais individuais do laser. Contagem de colônia bacteriana pode ser alcançado e com modificação adicional poderia distinguir entre repórteres de galactose. Ensaios de crescimento de colônia de levedura também podem ser avaliados usando esse algoritmo para estimar o tamanho da área de colônia.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Nós gostaríamos de reconhecer Anthony Bowen cujos slides foram usados como uma segunda comparação lado-a-lado humana, bem como Sabrina Nolan cujos slides foram usados como um terceiro lado-por-lado humano e segundo microscópio de comparação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Automáticos de medição de <em>criptocócica</em> espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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