Store område Scanning Probe Nanolithography lettes ved automatisk justering og dens anvendelse til substrat Fabrication for celle kultur studier

Summary

Her præsenterer vi en protokol til wide area scanning probe nanolithography aktiveres med den iterative justering af sonden arrays, samt udnyttelse af Litografisk mønstre for celle-overflade interaktion undersøgelser.

Abstract

Scanning probe mikroskopi har muliggjort oprettelsen af en række metoder for den konstruktive (additiv) top-down fabrikation af nanometer skala funktioner. En væsentlig ulempe ved scanning probe litografi har historisk set været den uløseligt lav dataoverførselshastighed i enkeltsonde systemer. Dette har været behandlet ved brug af arrays af flere sonder at muliggøre øget nanolithography overførselshastighed. For at gennemføre sådanne paralleliseret nanolithography, præcis justering af sonden arrays med substrat overfladen er afgørende, således at alle sonder gøre kontakt med overfladen samtidig når Litografisk mønstret begynder. Denne protokol beskriver udnyttelse af polymer pen litografi at producere nanometer skala funktioner over centimeter-store områder, lettes ved anvendelse af en algoritme til den hurtige, præcise og automatiseret justering af sonden arrays. Her, viser nanolithography af dithioler på guld substrater generation af funktioner med høj ensartethed. Disse mønstre er derefter functionalized med fibronektin til brug i forbindelse med overflade-instrueret celle morfologi undersøgelser.

Introduction

Fremskridt i nanoteknologi er afhængig af udviklingen af teknikker i stand til at effektivt og pålideligt opdigte nanoskala funktioner på overflader. ^{1 , 2} dog generere sådanne funktioner over store områder (flere cm²) pålideligt og på relativt lave omkostninger er en ikke-triviel bestræbelse. De fleste eksisterende teknikker, afledt af halvlederindustrien, stole på ablativ fotolitografi at fabrikere ‘hårde’ materialer. Mere nylig, Litografisk teknikker stammer fra scanning probe mikroskopi (SPM) er dukket op som et praktisk og alsidigt tilgang til den rapid prototyping af nanoskala designs. ³ SPM-baserede teknikker er i stand til hurtigt og bekvemt ‘skrive’ enhver brugerdefineret mønster. Den mest kendte af disse er dip-pen nanolithography (DPN), pioner af Mirkin et al.,⁴ hvor en scanning probe bruges som en ‘pen’ til at overføre en molekylær ‘blæk’ overflade producerer funktioner på en måde svarende til skrivning. Omgivende betingelser, som en sonde er scannet på tværs af en overflade ‘blæk’ molekyler er overført til den overflade via en vand menisk, der danner mellem sonden og overflade (figur 1). DPN herigennem tillader nanolithographic aflejring af en lang række materialer, herunder ‘bløde’ materialer som polymerer og biomolekyler. ⁵ relaterede teknikker, der anvender sonder manipuleret med kanaler til væske levering, skiftevis refereret til som ‘nanopipettes’ og ‘nano-fyldepenne’, er også blevet rapporteret. ^{6 , 7 , 8}

Den største hindring for en bredere anvendelse af SPM-afledte litografi er overførselshastighed, da det kræver en alt for lang tid at mønster centimeter-skala områder med en enkelt sonde. Tidlig indsats for at løse dette problem fokuseret på parallelization af cantilever-baserede DPN, med både ‘én-dimensionelle’ og ‘to-dimensionelle’ (2D) sonde arrays rapporteres til litografi af centimeter-store områder. ^{5 , 9} men disse cantilever arrays er produceret gennem relativt komplekse omstændelig fabrikation metoder og er relativt skrøbeligt. Opfindelsen af polymer pen litografi (PPL) behandlet dette spørgsmål ved at erstatte de standard SPM udkragninger med en 2D vifte af bløde siloxan elastomer sonder bundet til et glas dias. ¹⁰ denne enkle sonde opsætning betydeligt reducerer omkostningerne og kompleksiteten af mønster store områder, åbning af nanolithography til en bredere vifte af applikationer. Denne cantilever-fri arkitektur er også blevet udvidet til hard-tip soft-foråret litografi,¹¹ , som giver en hybrid af blødt elastomer opbakning med hårde silicium tips giver forbedret opløsning i forhold til mønstre, fremstillet ved hjælp af bløde elastomer tips.

En afgørende faktor i forbindelse med udførelsen af disse 2D array teknologier er, at sonden array skal være nøjagtig parallel med den overflade substrat så når litografi er udnyttet, alle sonder kommer i kontakt med overfladen samtidig. Selv en lille forskydning kan forårsage en stor forskel i funktionen størrelse fra den ene side af matrixen til den anden, da nogle sonder vil komme i kontakt med overfladen tidligere under nedstigningen af matrixen, mens andre vil komme i kontakt, senere eller slet ikke. ¹² nøjagtig justering er især vigtigt med PPL på grund af deformability af blødt elastomer sonder, hvor sonder at kontakte overfladen tidligere vil blive komprimeret, forlader et større fodaftryk på overfladen.

Den tidlige arbejde på PPL ansat rent besigtigelse at guide justeringsprocessen, bruger et kamera monteret ovenstående array’et for at observere deformation af de pyramideformede sonder, som de blev bragt i kontakt med overfladen. ¹⁰ justering blev bedømt af iagttage, hvilken side af sonderne kom i kontakt med overfladen først, og derefter justere vinklen og gentage proceduren i en iterativ måde, indtil forskellen i kontakt på hver side af sonden var uhørlige for øjet. Som denne tilpasning procedure er baseret på subjektive besigtigelse af operatøren, er reproducerbarhed lav.

Efterfølgende er blevet udviklet en mere objektiv tilgang, bestående af en force sensor monteret under substrat til at måle den kraft, ved kontakt af sonder på overfladen. ¹² justering var dermed opnået ved at justere tilt vinkler for at maksimere den kraft, der virker, som antydede, at alle sonderne samtidig i kontakt. Denne metode viste, at tilpasning til 0.004 ° af den overflade parallel var muligt. Denne ‘force feedback levelling’ er nu blevet gennemført ind i fuldautomatisk systemer i to uafhængige rapporter. ^{13 , 14} både bruge en treklang af force sensorer monteret under underlaget eller ovenstående array’et og måle mængden af kraft, der virker ved kontakt mellem sonde arrays og overflade. Disse systemer giver høj præcision, rapportering forskydninger af ≤0.001 ° over en 1 cm længde skala,¹⁴ eller ≤ 0,0003 ° over 1,4 cm.¹³ disse automatiske justering systemer også give store besparelser i operatørtid og samlede tid, det tager at fuldføre den litografi proces.

En større anvendelse af høj overførselshastighed overflade fabrikation aktiveret ved denne teknologi er generation af celle kultur substrater. Det er nu veletableret at celle fænotype kan manipuleres ved at kontrollere den første interaktion mellem celler og overflade egenskaber, og at dette kan forbedres på nanoplan. ¹⁵ specifikt, scanning probe litografi metoder har vist sig at være en letkøbt metode til at producere en bred vifte af nanofabricated overflader for sådanne celle kultur eksperimenter. ¹⁶ f.eks overflader præsenterer nanoskala mønstre af selvsamlede monolag og ekstracellulære matrix proteiner skabelonbaserede af PPL og DPN er blevet brugt til at undersøge potentialet i nano-modificerede materialer i materiale induceret differentiering af stamceller. ¹⁷

Denne protokol beskriver udnyttelse af en modificeret atomic force mikroskop (AFM) system, der gør det store område PPL. Vi detalje påvisning af kraft ved hjælp af flere kraftmålerne som middel til bestemmelse af sonde-overflade kontakt, sammen med en algoritme, der automatiserer iterative justeringsprocessen. Efterfølgende functionalization af disse mønstre med ekstracellulære matrix protein fibronektin og kultur af humane mesenkymale stamceller (hMSC) er beskrevet som en demonstration af PPL-fabrikeret overflader anvendes til cellekultur.

Protocol

1. fabrikation af PPL pen array At forberede Polydimethylsiloxan (PDMS) copolymer blanding: Tilsæt 10 µL af platin (0) – 1,3 – divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane kompleks løsning og 172 µL af 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane til 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane Co-polymer. Bland disse komponenter grundigt på en roterende mixer i 7 dage for at sikre homogen blanding.Forsigtig: platinum (0) – 1,3 – divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane er giftigt. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Der tilsættes 0,5 g (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane Co-polymer til en 1,7 g del af blandingen fra trin 1.1.1 i en vejning båd og blandes grundigt med en spatel. Degas denne blanding ved at overføre det til et vakuum ekssikkator og udsætter blandingen til lavtryk (200 mTorr, 0.3 mBar) i 20 min., indtil alle gasbobler har spredes. Sted en 13 x 13 mm glas dias i en plastik skrue-topped hætteglas fyldt med 20 mL 2-propanol, derefter placere hætteglasset i et ultralydsbad i 10 min at fjerne store snavs. Vask dias ved nedsænkning dias i frisk 2-propanol (100 mL) og tør under en strøm af nitrogen gas. Sted en silicium master18 i en 4 cm diameter petriskål og tilføje tilstrækkelig afgasses PDMS prepolymer blanding (fra trin 1.1) indtil fuldt dækket. 100 µL er typisk kræves for en 20 x 20 mm master. Plads master med prepolymer blandingen i et vakuum ekssikkator. Degas polymer for en yderligere 5 min at fjerne eventuelle gasbobler, dannet under overførsel af blandingen. O2 plasma behandling af glas dias (trin 1.4 nedenfor) bør udføres, mens den afgasning sted. Behandle glas firkanter med O2 plasma (600 mTorr) ved maksimal RF power i 1 minut til at fjerne enhver organisk forurening og til at generere en ensartet oxidlaget på glas til vedhæftning af elastomer. 19 brug plasma behandlet dias straks i næste trin. Omhyggeligt placere det firkantede glas dias (fra trin 1.4) over prepolymer på master (fra trin 1.3) med plasma-rengjort side vender nedad. Tryk forsigtigt ned glas dias på silicium master, at fjerne enhver fanget luft og sikre en ensartet film af PDMS er klemt inde mellem master og diaset. Sted den klemt PDMS array fra oven trin i en petriskål med silicium mestre i bunden (dvs, med bagsiden af glas dias opad) og Placer fadet i ovnen ved 70−80 ° C for 24−48 h til termisk helbrede PDMS. Fjerne den hærdede array fra ovnen og lad afkøle i 15 min, så med et barberblad omhyggeligt fjerne eventuelle overskydende PDMS fra bagsiden og siderne af glasset slide og bruge en strøm af tør nitrogen til at blæse væk løs PDMS snavs.Bemærk: sørge for ikke at ridse silicium master med barberblad, da dette kan beskadige klæbefri belægning. Kile et barberblad ind i hjørnet af array ved en dybde på 1 mm og lirk forsigtigt indsatsen array bortset fra skibsføreren. Udføre denne handling i en enkelt kontinuerlig hejse handling; Tillad ikke arrays til at falde tilbage på master. Forsigtigt skære og skrabe væk 0,5 mm af PDMS på kanterne af array med et barberblad. Bruge en strøm af tør nitrogen til at blæse væk løs PDMS snavs.Bemærk: Det kan være nemmere at udføre trinnet trimning under Stereoskopet eller et forstørrelsesglas. Passe på ikke at ridse silicium master med barberblad, da dette kan beskadige klæbefri belægning. 2. array forberedelse og substrat montering Generere en hydrofil overflade på sonden array af O2 plasma behandling: Sted PPL pen array i en petriskål i plasma kammer derefter anvende vakuum til 600 mTorr. Tænd plasma generator (maksimale indstilling) for 30 s. Frigive vakuum, fjerne array og tjekke sin hydrofiliciteten ved at droppe 20 µL deioniseret vand over array og observere, om der er endda spredning af vandet hen over overfladen. Hvis dette ikke sker, er underlagt matrixen til en anden runde af plasma behandling. Bagefter, tørre array grundigt med en strøm af tør nitrogen gas. Med dobbelt-sidet carbon bånd, vedhæfte matrix på midten af indehaveren af sonden. Mount indehaveren af sonde på AFM kinematiske indehaveren (figur 2). Indlæse PPL array med 16-mercaptohexadecanoic syre (MHA) (‘farvende’): Forbered 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) løsning ved at opløse 8,6 mg i 30 mL ethanol i en tube og placere det i et ultralydsbad i 10 min at fuldt opløse sammensat.Forsigtig: 16-mercaptohexadecanoic syre er giftigt. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Med en mikropipette, deponere 20 µL dråbe MHA løsning på arrayet. Undgå kontakt med pipette tips med arrays. Lad det spredt over hele arrayet, så tillader ethanol til at fordampe omgivende betingelser.Bemærk: PPL array kan alternativt blive sværtet efter justeringen har fundet sted. 10 Når MHA løsning har tørret, mount indehaveren sonde med PPL matrix på AFM. 3. forberedelse af guld substrater for PPL. Guld substrater kan enten være købt eller lavet in-house af termisk eller electron stråle deposition, og er konstrueret af en 2 nm titanium vedhæftning layer efterfulgt af 20 nm af guld på et glas eller silicium wafer. 18 Om nødvendigt, ren substraterne ved ilt plasma behandling ved hjælp af de parametre, der er beskrevet i trin 1.4. Placer guld underlaget i midten af AFM prøve fase og fastgør med selvklæbende tape rundt grænser af substrat (figur 2). Justere scene til den korrekte højde, som angivet i fabrikantens instruktioner ved hjælp af z-akse controlleren. 4. automatiske tilpasning af pen array Åbne og køre fase controller-installationsprogrammet (SetupNSF.exe) på computeren til at nulstille (‘nul’) alle akser og vinkler til en forud kalibrerede nulpunktet, så brug fase x/y-akse controlleren konsol til at flytte substratet til den ønskede justering / udskrivning af placering. For optimale resultater, skal underlaget placeres i nærheden af centrum af Stadium, mellem den fase Kraftmålerne.Bemærk: I nogle modeller af computer, x/y-akse controlleren USB-signal kan forstyrre der fra z-akse controlleren. Hvis dette sker, skal du afbryde x/y-akse controlleren USB kabel efter dette trin. Det bør derefter være genetableret efter justering procedure (trin 4.7). Skifte fase frigørelseshåndtaget til at frigive den prøve fase og aktivere Triaden af kraftmålerne som angivet af AFM producentens anvisninger. Tillad Kraftmålerne til blandingen henstår i mindst 15 min. For optimale resultater, Tillad 30-50 min. Øge z-aksen højde for at bringe arrayet i tæt nærhed med underlaget ved visuelt observere sonde array og overflade.Bemærk: Jo tættere array er til overfladen, de færre gentagelser er nødvendige for justeringsprocessen, hvorved der spares tid. Åbne/køre programmet automatisk justering (Auto justering v16.exe) og skrive relevante justeringen parametre i programmet. Angiv den ønskede vinkel trin parameterværdi, typisk 0,15 °. Denne parameter er den offset vinkel fra den ‘optimale’ vinkel for hver akse, der bestemmes af programmet. Sæt denne parameter mellem 0,1 og 0,2 °, som vinkler lavere end dette interval ikke resulterer i en klart påviselig kraft forskel ved tilgang af sonderne til overfladen.Bemærk: Softwaren accepterer værdier i millidegrees (dvs., 1 x 10-3 °). For eksempel, for 0,15 °, skal brugere indtaste ‘150.’ At indtaste det ønskede grove skridt ‘-parameterværdi, typisk 0,6 µm. Denne parameter er z-aksen skridt nummer bruges af scenen som den nærmer sig sonder i den indledende ru justering. Sæt denne parameter mellem 0,2 og 1 µm. større trin størrelser fald den tid, det tager for justeringsprocessen men reducere nøjagtigheden af justeringen, og øge sliddet på sonderne.Bemærk: Softwaren accepterer værdier af grove trin i mikrometer. For eksempel, for 0,6 µm skal brugere indtaste ‘0,6’. Angiv den ønskede ‘Fine trin’ parameterværdi, typisk 0,2 µm. Denne parameter er z-aksen trin størrelse anvendes til finjustering af den optimale justering. For de fleste applikationer, skal denne parameter mellem 0,1 og 0,4 µm. større værdi trin størrelser vil reducere mængden af tid, det tager for justeringsprocessen men reducere kvaliteten af justeringen.Bemærk: Softwaren accepterer værdier af fine trin i mikrometer. For eksempel for 0,2 µm, skal brugere indtaste ‘0,2.’ Konfigurere ‘Excel filsti’ og vedhæfte en uændret kopi af medfølgende regneark skabelonfil ved hjælp af ikonet for ‘mappe’, navigere til filplaceringen, og trykke på ‘OK’. Denne fil indeholder den rå og beregnede data, der bruges til at bestemme optimal fase tilt vinkler af scenen. Åbne/køre AFM kontrol software. Naviger til komponenten spektroskopi af dette program ved at klikke på knappen ‘spektroskopi’ (ifølge producentens anvisninger), og indstille AFM scanningen hovedet z-aksen til at svinge ved 10 µm over 100 ms, med en pausetid med 250 ms, så du kan trække 10 µm over 100 ms med en pausetid med 250 ms (figur 3). Som AFM hoved oscillerende, klik på knappen ‘start’ justering software til at påbegynde den automatiske justering. Når programmet kører, er softwaren skrivning og læsning af data i filen beskrevet taktfast 4.4.4.Bemærk: Justeringen tager mellem 30 min. og 3 timer afhængig af den indledende fase holdning i skridt 4.3 og softwarekonfiguration der blev angivet i trin 4.4.Forsigtig: Fase controller konsoller er stadig aktive under justeringsprocessen – bruge ikke dem under justeringsprocessen, da det vil forstyrre justeringen. Når justeringen er færdig, lyser grønt lys boksen Justering afsluttet på justering software (fra trin 4.4). Når dette sker, skal du klikke på knappen “STOP” i brugergrænsefladen til slut justeringsprocessen. Inspicere grafer i filen regneark skabelon for en sammenhæng mellem registrerede datapunkter og linjen passer, der genereres af softwaren. Se repræsentative resultater for eksempler på en god korrelation med typiske Rasmussen2 værdier > 0,99. Hvis justeringen mislykkes, erstatte sonde array med en nypræparerede array (trin 2) og Gentag justering (trin 4.4). Bevæge bordet opad i z-akse ved hjælp af scenen controller konsol for denne akse. Scenen skal flyttes i 500 nm-trin indtil kontakt kan observeres fra den øverste kamera af AFM. Kontakt mellem array og substrat kan ses som en ‘hvid prik’ af høj kontrast i spidsen af de enkelte sonde pyramider. På dette tidspunkt, klik på ‘stop’ knappen på AFM control-software til at stoppe programmet spektroskopi fra trin 4.5. Dette vil trække vifte af 10 µm, derfor forlader 10 µm af mulige z-aksen forlængelse. Tjek billedet fra den øverste kamera af AFM til at sikre, at sonderne ikke er i kontakt med underlaget. 5. polymer pen litografi (PPL) Naviger til komponenten litografi af control-software ved at klikke på knappen ‘litografi’ på control-software. Vælge z-modulation drift tilstand og importere en raster (bitmap) eller vektor billede, der skal bruges som litografi mønster. Generere funktioner vist i de repræsentative resultater, skal du bruge bitmap bestående 20 x 20 sort pixel (Se supplerende materiale), der svarer til litografi af et gitter med 20 x 20 dots per sonden på matrixen PPL. Angiv parametrene litografi i vinduet ‘Pixel grafisk Import’ af AFM kontrolsoftwaren. Konfigurere ‘Størrelse’ mønster skal genereres, f.eks., 40 µm i længde og bredde. Disse parametre angiver bredde og længde som skaleres billedet i bitmappen. For at generere funktioner vist i de repræsentative resultater, skal du bruge en bredde og længde af 40 µm i begge dimensioner. Indstil “Oprindelse” mønsterets skal genereres på 25 µm på både x – og y -aksen. Disse parametre afgør i midten af billedet i forhold til centrum af AFM x/y-akser. Angiv disse parametre at undgå regionen i overfladen hvor sonderne var i kontakt under justeringsprocessen. Indstille udskrivning ‘Parametre’. Disse værdier bestemmer, hvordan sonderne er udvidet (dvs. bringes i kontakt med overfladen) som svar på hver pixel i bitmapbilledet. Vælg fra drop-down menuen ‘Modulation Abs Z Pos’ og ‘Forenkle til’ to lag. Denne funktion pålægger AFM at udvide sonder af en absolut afstand bestemmes af kun to resultater, enten ‘Sort (0)’ eller ‘Hvid (1)’ felter. Angiv værdierne i ‘Sort (0)’ og ‘White (1)’ felter til 5 og -5 µm, henholdsvis. Disse værdier bestemmer afstanden sonderne bør flyttes som svar på en sort eller hvid pixel på bitmapbilledet og er typisk sæt mellem 3 og 5 µm for ‘Sort’ (dvs., udvide sonder nedad ved denne afstand i forhold til nulpunktet i denne akse) og -3 til-5 µm til ‘Hvid’ (dvs.trække sonderne opad af 3-5 µm i forhold til nulpunktet).Bemærk: Disse repræsentative afstande antager at filtypenavnet 5 µm resulterer i sonder kommer i kontakt med overfladen og dermed generation af en funktion, mens en 5 µm tilbagetrækning elevatorer sonder fra overfladen resulterer i ingen kontakt. Z-udvidelse påvirker funktionen størrelse ved at bestemme omfanget af sonden kontakt med overfladen, større udvidelser resultatet i sonder at blive presset yderligere ind i overfladen, resulterer i større funktioner. 10 Klik på knappen ‘OK’ for at gennemføre disse indstillinger og lukke vinduet. Angiv pausetid i vinduet litografi af AFM kontrol software, typisk 1 s. Denne indstilling bestemmer, hvor lang tid sonderne forbliver i den udvidede ‘Sort’ holdning, som ligger typisk mellem 0,1 og 10 s.Bemærk: Længere pause gange resultere i større indslag størrelser på grund af den større mængde af MHA transporteret guld overflade. Yderligere oplysninger om kontrol med størrelsen af funktioner genereret kan findes i andre rapporter. 20 Forberede den atmosfæriske kontrol kabinet. Sænke den atmosfæriske isolation kammer på AFM og åbne/køre producentleveret atmosfæriske kontrol software (MHG_control.exe). Sæt den atmosfæriske kontrol software til at opretholde en relativ fugtighed på 45%, en temperatur på 25 ° C og en atmosfære udveksling ‘Flyde sats’ 500 ml ved at angive disse værdier ind i softwaren. Klik på “Brug” for at gennemføre indstillingerne. Det atmosfæriske kontrolmodulet vil derefter begynde at pumpe befugtet luft ind i kammeret.Bemærk: Højere luftfugtighed resultere i større indslag størrelser på grund af dannelsen af en større vand menisk genereret mellem pen arrays og overflade. 21 denne værdi angives typisk mellem 40 og 60%. Flowet ligger typisk mellem 300 og 500 mL. Større strømme tillade den ønskede luftfugtighed skal nås hurtigere men er mindre nøjagtig. De repræsentative resultater brug en gennemstrømningshastighed på 500 mL for første generation af fugtighed og er faldet til 300 mL ved ankomsten til den ønskede luftfugtighed, for at opretholde en nøjagtig og stabil under litografi. Når ønskede fugtighed er opnået, skal du starte den litografiske sekvens ved at trykke på ‘start’-knappen på software interfacet. Efter afslutningen af litografi, bruge z-aksen fase controller konsol til at flytte substrat fra array af tilbagetrækningskraften scenen af 500 µm. Fjern derefter den atmosfæriske isolation kammer fra sin mount. Skifte fase udløserhåndtag for at låse den prøve fase og deaktivere Kraftmålerne, som angivet af AFM producentens instruktioner, derefter fjerne substratet fra scenen. 6. mønster visualisering Mønstre kan visualiseres ved hjælp af en af følgende metoder, lateral kraft scanning probe mikroskopi eller kemisk ætsning. Skan mønstrede overfladen på AFM med lateral kraft tilstand ved hjælp af kontakt tilstand cantilever for at undersøge funktionerne uden at slette noget.Bemærk: Lateral kraft mikroskopi kan bruges som en ikke-destruktiv metode til visning af de funktioner, der er produceret af polymer pen litografi; men ved hjælp af denne metode, kan kun et relativt lille område være visualiseret (typisk 100 x 100 µm). Da den deponerede MHA kan fungere som en etch modstå, kan kemisk ætsning bruges til at fjerne guld fra de ikke-mønstrede områder. De resulterende unetched områder kan derefter visualiseres af Optisk mikroskopi, hvilket betyder et bredt område kan ses på én gang. 18Bemærk: Substrater, der er ætset på denne måde kan derefter bruges til efterfølgende celle kultur eksperimenter beskrevet nedenfor. Separat, forberede vandige opløsninger af 40 mM thiourinstof, 27 mM iron(III) nitrat og 100 mM saltsyre. Forberede TIPkan ved blanding af 5 mL af hver af disse tre løsninger. Frisk blandes inden hver anvendelse. 22Forsigtig: thiourinstof, iron(III) nitrat og saltsyre er giftige. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Overføre det mønstrede underlag i en petriskål og pipette tilstrækkelig TIPkan løsning i skålen til at dække overfladen af substrat (typisk 10 mL). Holde underlaget neddykket i 4-5 min til etch 15 nm af guld (med en omtrentlig hastighed på 3 nm/min). Når ætsning er afsluttet, fjerne substratet og grundigt skylles med vand og tør med en strøm af kvælstof.Bemærk: Afslutningen af ætsning proces afhænger af tykkelsen af guld overflade fremstillet (trin 3.1) tilknyttet den ætsning anførte sats (trin 6.2.2). Inspicere de ætsede guld funktioner under lysfelt Optisk mikroskopi. De resterende guld funktioner, der fortsat skal vises svarer til det mønster, der blev trykt (fra trin 5.2). Hvis hele overfladen vises homogene, indikerer dette at en betydelig mængde af guld forbliver og ætsning trin (følgende trin 6.2.2) bør gentages for 1-2 min. 7. mønster functionalization med fibronektin Fordybe de mønstrede underlag i en opløsning af 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) opløsning i ethanol for 1 h. vask substratet tre gange med ethanol og tør grundigt under en strøm af kvælstof. Dette trin passivates unpatterned guld områder.Forsigtig: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) er giftigt. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Dykke substrater i en 10 mM Co (3)2 vandig opløsning i 5 min. Næste, fjerne substraterne fra løsning, vaskes tre gange med ultrarent vand, og tør under en strøm af tør nitrogen.Forsigtig: Co (3)2 er giftigt. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Fordyb substrat i en 50 µg/mL opløsning af fibronektin i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og inkuberes ved 4 ° C for 16 h. vask substratet tre gange med PBS, så tør substrat under en strøm af tør nitrogen.Bemærk: Fibronektin er bundet til MHA-functionalized områder gennem kelation af Co(II) ved terminal carboxylsyre grupper på MHA. Fibronektin derefter binder sig til Co(II) via sit kollagen-bindende domæne. 23 Hvis det ønskes, visualisere overflade-bundet fibronektin ved mærkning det med fluorescerende antistoffer: Anvende en 2 mL opløsning af 1: 100 ukonjugeret kanin anti-fibronektin primære antistof i 5% (w/v) af bovint serumalbumin (BSA) i PBS til overfladen og der inkuberes ved 4 ° C for 16 h. aspirat supernatanten og vaskes tre gange med PBS. Dykke substrat i et 2 mL opløsning af fluorescently konjugerede anti-kanin sekundær antistof (på den af fabrikanten angivne fortynding, 2 dråber/mL) i 5% (w/v) af BSA i PBS, dække i sølvpapir og inkuberes ved stuetemperatur i 1 h. aspirat den supernatanten og vaskes tre gange med PBS. Optag epifluorescensmikroskop mikroskopi billeder af funktionerne ved hjælp af et fluorescens mikroskop ifølge fabrikantens anvisninger, med en excitation filter sat til 594 nm. 8. celle kultur på nanofabricated overflader Der forberedes en suspension af godt karakteriseret hMSCs, der er mellem de 4th og 6th passage. 24 Suspendere en sammenflydende kolbe af celler ved at skylle en gang med 10 mL PBS, tage afstand overholdt celler ved at tilføje 5 mL trypsin/EDTA i T75 vævskultur kolben, og der inkuberes kolben i et befugtet kammer ved 37 ° C suppleret med 5% CO2 i op til 5 min indtil 90% o f celler er løsrevet fra overfladen. Efterfølgende tilsættes 6 mL frisk kultur medier indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) i kolben og kortvarigt skyl kolben med medierne tilføjet. Overføre cellesuspension i en 15 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 400 g ved 25 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 3 mL frisk dyrkningsmedier. Tælle celle tæthed ved hjælp af en hemocytometer25 og justere tæthed af cellesuspension til 2 x 104 celler/mL ved tilsætning af en passende mængde af Kulturmedier. Frø celler på substrater med en tæthed på 104 celler/cm2. Skær underlaget i 1 x 1 cm2 med diamant scribe og placere det i en brønd i 12-godt vævskultur plade. Der afpipetteres 2 mL cellesuspension i kultur medier (fra trin 8.1.4) i godt og Inkuber i et befugtet kammer ved 37 ° C suppleret med 5% CO2 i 24 timer. Efter cellevækst på mønstrene, analysere omfanget af celle vedhæftet fil og breder sig ved immunfluorescens: Fjerne medier og vaske substrater engang med PBS. Fix celler med 2 mL af opløsning af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pre-hjertelig til 37 ° C) i 20 min. i stinkskab og vaskes tre gange med PBS.Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt. Læs venligst muskel-og Skeletbesvær før arbejdet med denne løsning. Sikkerhedsudstyr skal bæres under håndtering af kemikaliet. Permeabilize celler med 2 mL af opløsning 0,5% vaskemiddel (Se Tabel af materialer) i PBS i 15 min., derefter vaskes tre gange med PBS. Dykke substrat i 2 mL af opløsning af ukonjugeret kanin anti-fibronektin primære antistof ved fortynding på 1: 100 med 5% (w/v) BSA i PBS og inkuberes ved 4 ° C for 16 h, derefter vaskes tre gange med 0,1% (v/v) Tween 20 i PBS (PBST). Derefter nedsænkes substrat i 2 mL af en oploesning af fluorescently konjugerede anti-kanin sekundær antistof (fortyndet med 5% (w/v) BSA i PBS på den af fabrikanten angivne fortynding, 2 dråber/mL), dækker i sølvpapir og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time, derefter vaskes tre gange med 0,1% PBST. Hvis du vil navngive actin filamenter, dykke 2 mL af fluorescently konjugeret phalloidin på en fortynding af 1:250 i PBS, dække i sølvpapir og inkuberes ved 4 ° C i 30 min så vaskes tre gange med PBS. Samtidig pletten cellekerner og montere underlaget ved at anvende en dråbe montering medium indeholdende DAPI og dække med en coverslip. Visualisere celler ved hjælp af et fluorescens mikroskop ifølge fabrikantens anvisninger, med excitation filtre af 365 nm for kerner (DAPI), 488 nm til F-actin og 594 nm for fibronektin.

Representative Results

For at kontrollere, om den automatiske justering havde været vellykket, blev grafer afbildet fra justering data (i regneark fra trin 4.8) undersøgt. Hvis justeringsprocessen var lykkedes de to parceller, svarende til den vinkel, som prøven scenen har været vippes langs θ og φ akserne, viste en række af stigende og faldende datapunkter. I hver af parceller, to lineære passer datapunkter viste en veldefineret krydsfelt “peak” angiver den maksimale z-udvidelse og den tilsvarende vinkel, hvor justeringen var opnået (figur 4A og 4B). Denne proces er gentaget fire gange (dvs., to gange for hver akse) og afbildet som et sæt af fire koordinater. Skæringspunktet mellem hvert par af koordinater viser således de samlede optimal vinkler (figur 4 c). 13 i tilfælde, hvor justeringen ikke var vellykket, det kan konstateres at deres tilsvarende θ og φ vinkel grunde ikke give god kvalitet lineær passer, eller ikke skærer (figur 5). Sådanne mislykkede alignments er typisk som følge af arrays er forkert trimmet eller monteret på sonden indehaveren (trin 1.7, 1,8 og 2,2). I disse tilfælde arrays blev kasseret, og en ny rede og monteret (trin 1 og 2), og justeringsprocessen gentages (trin 4). Efter vellykket tilpasning og litografi med MHA af PPL, var mønstret guld substrater derefter afbildet ved hjælp af lateral kraft mikroskopi til at undersøge, om depositionen havde fundet sted. Et større område undersøgelse af de trykte overflader blev også gennemført af Optisk mikroskopi af substraterne efter ætsning af guldet ikke er beskyttet af den deponerede thiol (figur 6 og figur 7). Men de ætsede mønstre kan ikke bruges til yderligere functionalization og bør kun bruges til at bekræfte mønster på repræsentative prøver af et parti af trykte overflade substrater. Hvis de ætsede mønstre Vis tomme områder svarende til enkeltbokse (figur 8), angiver dette resultat produktion af sonden arrays ikke er gjort med succes, og at nogle sonder er beskadiget eller mangler. Denne uensartethed i sonderne kan skyldes brugen af en gammel master hvor perfluorinated belægning er slidt væk (trin 1.3), hvilket resulterer i nogle sonder at blive revet væk når arrayet er adskilt fra masteren. I disse tilfælde bør en ny master anvendes. Resultatet kan også skyldes tilstedeværelsen af luft bobler fanget mellem glasset opbakning og master (trin 1,5), eller hvis matrixen sonde ikke var rent adskilt fra master efter hærdning (trin 1.8). Fluorescerende mikroskopi billeder af fibronektin functionalized overflader rugede hMSCs blev også indsamlet (figur 9). Generelt er alle substrater var stabilt inden for in vitro- kultur miljø og cellerne overholdes og tilpasset deres morfologi til de trykte mønstre i tilfælde af mindre isolerede 20 x 20 array af funktioner. Figur 1. Skematisk fremstilling af polymer pen litografi viser molekylære blæk transport via en vand menisk på sonden spids. A sidekig og b ovenfra af polymer pen array angiver, at når sonden array og overflade substrat er fuldt justeret, alle sonder kommer i kontakt med overfladen samtidig, hvilket resulterer i paralleliseret litografi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Skematisk diagram af polymer pen litografi sat op. (A) udvidet sideudsigt over eksperimentelle sæt op hvor matrixen rede sonde er knyttet til at probe indehaveren og monteret til AFM scanner. Underlaget er placeret på scenen, nedenfor som ligger tre tvinge sensorer. (B) en repræsentation af de forsamlede instrumentation, viser AFM scanningen hovedet i forhold til den prøve fase. (C) bunden visning viser force sensor placering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. Skematisk repræsentation skildrer spektroskopi automatisk tilpasning procedure. AFM scanner er indstillet til at flytte sonder mod prøven ved en afstand på 10 µm indenfor 100 ms, afholdt på position for 250 ms, efterfulgt af en tilbagetrækning af 10 µm indenfor 100 ms, og derefter holdt for 250 ms på tilbagetrukken stilling. Forslaget er derefter gentaget hele justeringsprocessen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4. Grafer illustrerer en vellykket tilpasning. Grafer af z stilling mod tilt vinkler a θ og b φ for en vellykket tilpasning, hvor ● angiver de faktiske værdier målt og + angiver bedst pasform med den mindste kvadraters metode. C grafen for φ mod θ monteret vinkler med de fire punkter, hvor den maksimale z-position var nået. Skæringspunkt mærket er den endelige optimale tilt vinkel på tværs af begge akser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5. Grafer illustrerer en mislykket justering. Grafer af z stilling mod tilt vinkler a θ og b φ for en mislykket justering, hvor ● angiver de faktiske værdier målt og + angiver bedst pasform med den mindste kvadraters metode. C grafen for φ mod θ monteret vinkler med de fire punkter, hvor den maksimale z-position var nået. Ingen klare optima eller skæringspunkt er observeret og derfor optimal tilpasning vinkler ikke er løst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 6. Illustrative Optisk mikroskopi og atomic force mikroskopi billeder af guld substrater, der blev mønstret med MHA af justeret PPL arrays og derefter ætset. (A) og (B) er fortløbende forstørret Optisk mikroskopi billeder af de ætsede mønstre; (C) er et AFM topografi billede af et enkelt gitter af mønstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 7. Illustrative Optisk mikroskopi billeder af guld substrater, der blev mønstret med MHA af justeret PPL arrays og derefter ætset. (A) og (B) er fortløbende forstørret Optisk mikroskopi billeder af ætset mønstre og (C) er en lavere forstørrelse billede, der viser store område homogene mønstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 8. Illustrative Optisk mikroskopi billede af en guld substrat, der var ulige mønstrede med MHA og derefter ætset. De påtænkte mønstre (vist i indsatsen) var gentage gitre af 20 dot linjer arrangeret i 20 linjer med hver to linjer produceret ved at øge z-akse udvidelse af 1 µm (lige fra 5 til-5 µm). Det kan ses, at i nogle områder, er ingen mønstre genereret på grund af manglende sonder i disse områder. I de områder, hvor kun to linjer med prikker er produceret, dette resultat angiver, at en sonde er til stede, men det er ikke af samme hoejde som de fuldt fungerende sonder, så eneste indbetaling funktioner når array er udvidet til den fulde z-akse afstanden. I dette billede, er kontrasten bevidst blevet ændret for at aktivere observation af de delvist udskrevne områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 9. Epifluorescensmikroskop mikroskopi billeder af hMSCs kulturperler på fibronektin arrays skabelonbaserede af PPL. (A) og (B) er høj forstørrelse billeder viser individuelle celler. (C) viser et eksempel mønster af matrixen fibronektin uden en tilhænger celle og (D) er et bredt billede af celler dyrkes i et gitter arrangement (en skematisk af det udskrevne mønster er også vist i indlægget). Cellerne er farvet for at vise fibronektin (rød), F-actin (grøn) og celle kerner (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol tjener til at give brugerne en praktisk metode til hurtigt at udføre nanolithographic mønster med høj ensartethed og kontrollerbar funktion størrelse over store (cm²) områder. Substrater forsynet med disse store område nanopatterns kan derefter udbygges yderligere til en lang række applikationer. En større anvendelse af denne teknologi er i generation af nanofabricated overflader for celle-overflade interaktion undersøgelser. Rapporten viser nogle illustrative eksempler på cellekultur af disse materialer, demonstrerer kontrol af hMSC morfologi af nanofabricated substrater.

Nøglefaktor i denne protokol er automatisering af tilpasning procedure (trin 4), der giver mulighed for meget ensartet og høj overførselshastighed produktion af funktioner på overflader, ned til nanoskala opløsning, som muliggør en hurtig omsætning af celle kultur eksperimenter. Polymer pen litografi udføres ved hjælp af denne justering algoritme er i stand til at generere nanoskala funktioner inden for ca 30 min. Reproducerbarhed og nøjagtigheden af automatisk justering, og dermed ensartethed af de mønstrede funktioner, er dog kritisk afhængig af kvaliteten af sonden arrays, der er produceret (trin 1 og 2). Nogen fejl i deres forberedelse, der resulterer i stumpt, ødelagte eller manglende sonder; såsom fanget luft kan bobler (trin 1,5) eller forkert adskillelse af sonderne fra master (trin 1.8) resultere i ukorrekte justering og dårlig kvalitet litografi.

Dette rapporterede metode deler en begrænsning til fælles med andre justering metoder, der er afhængige af force feedback. Nøjagtig bestemmelse af når sonderne er i kontakt med overfladen er begrænset af nødvendigheden af at tage højde for baggrunden vibrationer forårsaget af det omgivende miljø og bevægelse af prøven fase. I almindelighed, sensorer har en kraft følsomhed i µN regime (2 µN i dette tilfælde), men justering algoritme er designet til kun registrere en kraft på mindst 490 µN som endelige kontakt mellem sonderne og overfladen, for at undgå enhver “falske positiver” resul ting fra baggrundsstøj. ¹³ saaledes denne metode tendens til at producere store funktioner (1-2 µm) da sonderne skal udvides en stor afstand på z-akse (med en deraf følgende højere kraft) for at registrere kontakt. For at kompensere, mindre funktioner kan blive genereret ved at reducere z-akse afstand tilbagelagt under litografi trin (f.eks.at angive indstillingen ‘Sort’ i trin 5.2.3.2 som 3 µm i stedet for 5 µm).

Dog selv med denne begrænsning, automation algoritme er stand til at løse et kritisk aspekt i anvendelsen af paralleliseret scanning probe litografi metoder, som justering var tidligere den mest tid krævende og upræcise skridt i den gennemførelsen af disse teknikker. Denne automatisering nu skifter det hastighedsbegrænsende trin i fabrikationsproces fra tilpasning til den litografiske skrive sig selv. Mens denne protokol viser anvendelsen af denne tilpasning procedure til PPL, kunne rammen anvendes på en række SPL teknikker som lipid-DPN²⁶ og matrix-assisteret litografi²⁷ samt potentielle fremtidige katalytisk sonden systemer. ²⁸

Materials

Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage	NanoSurf	P40008
AFM control software	NanoSurf	C3000
Engraving pen	Sigma-Aldrich	Z225568
Plasma Cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2
PlasmaFlo	Harrick plasma	PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump	Harrick plasma	PDC-OPE-2
Tube Rotator	Stuart	SB3
Vacuum Desiccator	Thermo Fisher Scientific	5311-0250
Milli-Q Water Purification System	Merck Millipore	ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator	proUmid	MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL	Sartorius	728070
Silicon masters	NIL Technology	custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope	Olympus	BX51
Microscope objectives	Olympus	10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope	Leica	DM 2500M
Ultrasonicator	Ultrawave Ltd.	U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results	Microsoft	Excel
Reagent
2-propanol	Sigma-Aldrich	34863	FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground	Thermo Fisher Scientific	451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated	Gelest	VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane	Gelest	SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution	Sigma-Aldrich	479527	HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated	Gelest	HMS-301
Weigh Boat 100 mL	Scientific Laboratory Supplies	BALI828
Pasteur pipette	Appleton Woods	KS230
Petri dish	SARSTEDT	82.1473
Razor blade	Thermo Fisher Scientific	ST10-031T
Adhesive Carbon Tape	Agar scientific	AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid	Sigma-Aldrich	448303-1G	HARMFUL, TOXIC
Ethanol	Sigma-Aldrich	34852	FLAMMABLE
Gold coated microscope slide	Sigma-Aldrich	643203	Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656	HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	529303	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	84415	HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	675105	HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate	Sigma-Aldrich	203106	HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium	Lonza UK	PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza UK	PT-2501
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes	Greiner Bio-One	188261
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	P/0840/53	HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	"Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody	Abcam	ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	R37117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
12-well plate	Thermo Fisher Scientific	10253041
T75 tissue culture flask	Thermo Fisher Scientific	10790113
cantilever	BudgetSensor	ContAl-G