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Bioengineering

बड़े क्षेत्र स्कैनिंग जांच Nanolithography स्वचालित संरेखण और सेल संस्कृति अध्ययन के लिए सब्सट्रेट निर्माण के लिए अपने आवेदन द्वारा सुविधा

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56967
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 4, 2, 3, 1
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry, University of Manchester, 2School of Engineering, University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering, University of Manchester, 4School of Science and Technology, Nottingham Trent University
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम व्यापक क्षेत्र स्कैनिंग जांच के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान nanolithography जांच arrays के चलने संरेखण द्वारा सक्षम है, साथ ही साथ सेल के लिए lithographic पैटर्न के उपयोग-सतह संपर्क अध्ययन ।

Abstract

स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी रचनात्मक के लिए तरीकों की एक किस्म के निर्माण को सक्षम किया गया है (' additive ') नैनोमीटर पैमाने पर सुविधाओं के ऊपर से नीचे निर्माण । ऐतिहासिक, स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी की एक बड़ी खामी एक जांच प्रणालियों के आंतरिक रूप से कम प्रवाह किया गया है । यह कई जांच की arrays के उपयोग से निपटने के लिए वृद्धि हुई nanolithography प्रवाह को सक्षम किया गया है । आदेश में इस तरह के समानांतर nanolithography को लागू करने के लिए, सब्सट्रेट सतह के साथ जांच arrays के सटीक संरेखण महत्वपूर्ण है, ताकि सभी जांच सतह के साथ संपर्क बनाने के एक साथ जब lithographic patterning शुरू होता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन बहुलक कलम लिथोग्राफी के उपयोग के लिए सेंटीमीटर से अधिक नैनोमीटर पैमाने पर सुविधाओं का उत्पादन, क्षेत्रों आकार, तेजी से, सटीक, और जांच arrays के स्वचालित संरेखण के लिए एक एल्गोरिथ्म के उपयोग से मदद की । यहां, सोने के सब्सट्रेट पर thiols के nanolithography उच्च एकरूपता के साथ सुविधाओं की पीढ़ी को दर्शाता है । इन नमूनों तो सतह के संदर्भ में उपयोग के लिए fibronectin के साथ कार्यात्मक सेल आकृति विज्ञान अध्ययन निर्देशित कर रहे हैं ।

Introduction

नैनो में प्रगति कुशलतापूर्वक और मज़बूती से सतहों पर नेनो सुविधाओं के निर्माण में सक्षम तकनीकों के विकास पर निर्भर है । 1 , 2 हालांकि, बड़े क्षेत्रों (एकाधिक सेमी2) मज़बूती से और अपेक्षाकृत कम लागत पर ऐसी सुविधाओं के सृजन एक गैर तुच्छ प्रयास है । सबसे मौजूदा तकनीक, अर्धचालक उद्योग से व्युत्पंन, पंचमी विभक्ति photolithography पर भरोसा करने के लिए ' मुश्किल ' सामग्री बनाना । हाल ही में, lithographic स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) से व्युत्पंन तकनीक नेनो डिजाइनों के तेजी से प्रोटोटाइप के लिए एक सुविधाजनक और बहुमुखी दृष्टिकोण के रूप में उभरा है । 3 एसपीएम आधारित तकनीक आसानी से और तेजी से ' लिखने ' किसी भी उपयोगकर्ता के पैटर्न परिभाषित करने में सक्षम हैं । इनमें से सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है डुबकी कलम nanolithography (DPN), Mirkin एट अलद्वारा बीड़ा उठाया है,4 जहां एक स्कैनिंग जांच एक ' कलम ' एक लेखन के अनुरूप फैशन में सुविधाओं का उत्पादन सतह के लिए एक आणविक ' स्याही ' हस्तांतरण करने के लिए के रूप में प्रयोग किया जाता है । परिवेश स्थितियों के तहत, एक जांच के रूप में एक सतह भर में स्कैन ' स्याही ' अणु एक पानी meniscus के माध्यम से सतह को हस्तांतरित कर रहे है कि जांच और सतह के बीच रूपों (चित्रा 1) । DPN इस प्रकार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के nanolithographic जमाव की अनुमति देता है, जैसे बहुलक और अणुओं के रूप में ' नरम सामग्री । 5 तरल पदार्थ वितरण के लिए चैनलों के साथ इंजीनियर जांच का उपयोग कर संबंधित तकनीक, विभिंन ' nanopipettes ' और ' नैनो फव्वारा ' कलम के रूप में संदर्भित, भी सूचित किया गया है । 6 , 7 , 8

एसपीएम-व्युत्पंन लिथोग्राफी के व्यापक आवेदन करने के लिए मुख्य बाधा प्रवाह है, के रूप में यह एक एक जांच के साथ एक जरूरत से ज्यादा लंबे समय के पैटर्न सेंटीमीटर पैमाने क्षेत्रों की आवश्यकता है । जल्दी से इस मुद्दे को संबोधित करने के प्रयास ब्रैकट के parallelization पर केंद्रित-आधारित DPN, दोनों ' एक आयामी ' और ' दो आयामी ' (2d) जांच arrays के लिथोग्राफी के लिए सूचित किया जा रहा है के साथ-क्षेत्रों आकार । 5 , 9 हालांकि, इन ब्रैकट arrays अपेक्षाकृत जटिल multistep निर्माण विधियों के माध्यम से उत्पादित कर रहे है और अपेक्षाकृत नाजुक हैं । बहुलक कलम लिथोग्राफी (पीपीएल) के आविष्कार नरम siloxane elastomer जांच के एक 2d सरणी के साथ मानक एसपीएम cantilevers की जगह एक गिलास स्लाइड के लिए बंधुआ द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया । 10 यह सरल जांच सेटअप काफी लागत और पैटर्न बड़े क्षेत्रों की जटिलता कम हो जाती है, आवेदनों की एक व्यापक रेंज के लिए खोलने nanolithography । इस ब्रैकट मुक्त वास्तुकला भी मुश्किल टिप नरम करने के लिए विस्तार किया गया है-वसंत लिथोग्राफी,11 जो कठिन सिलिकॉन का उपयोग कर उत्पादित पैटर्न की तुलना में बेहतर संकल्प देने के साथ नरम elastomeric समर्थन के एक संकर प्रदान करता है elastomer टिप्स.

इन 2 डी सरणी प्रौद्योगिकियों के निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि जांच सरणी बिल्कुल सतह सब्सट्रेट करने के लिए समानांतर इतना होना चाहिए कि जब लिथोग्राफी उपयोग किया जाता है, सभी जांच सतह के साथ संपर्क में एक साथ आते हैं । यहां तक कि एक छोटा सा संरेखण सरणी के दूसरे पक्ष से सुविधा के आकार में एक बड़ा अंतर पैदा कर सकता है, क्योंकि कुछ जांच सरणी के वंश के दौरान पहले सतह के साथ संपर्क में आ जाएगा, जबकि अंय संपर्क में बाद में आ जाएगा या बिल्कुल नहीं । 12 सटीक संरेखण नरम elastomer जांच की विकृति के कारण पीपीएल के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहां पहले सतह से संपर्क की जांच संकुचित हो जाएगा, सतह पर एक बड़ा निशान जा रहा है ।

पर जल्दी काम पीपीएल विशुद्ध रूप से दृश्य निरीक्षण के लिए संरेखण प्रक्रिया गाइड कार्यरत है, एक सरणी के ऊपर घुड़सवार कैमरा का उपयोग करने पिरामिड जांच के विकृति का निरीक्षण के रूप में वे सतह के साथ संपर्क में लाया गया । 10 संरेखण देख कर ंयाय किया गया था जो जांच के पक्ष पहले सतह के साथ संपर्क में आया, तो कोण समायोजन और एक चलने तरीके से प्रक्रिया दोहरा जब तक जांच के प्रत्येक पक्ष पर संपर्क में अंतर था आंख को भेद । के रूप में इस संरेखण प्रक्रिया ऑपरेटर द्वारा व्यक्तिपरक दृश्य निरीक्षण पर निर्भर करता है, reproducibility कम है ।

बाद में, एक और अधिक उद्देश्य दृष्टिकोण विकसित किया गया है, एक शक्ति की सतह पर जांच के संपर्क पर लागू करने के लिए बल सब्सट्रेट नीचे घुड़सवार से मिलकर । 12 संरेखण इस प्रकार झुकाव कोण समायोजित करने के लिए लागू बल, जो संकेत दिया है कि सभी जांच एक साथ संपर्क में थे अधिकतम द्वारा प्राप्त किया गया था । इस विधि से पता चला कि संरेखण के भीतर ०.००४ ° सतह समानांतर संभव था । यह ' बल प्रतिक्रिया समतल ' अब दो स्वतंत्र रिपोर्टों में पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों में लागू किया गया है । 13 , 14 दोनों का उपयोग करें बल सेंसर की त्रय या तो सब्सट्रेट या ऊपर सरणी के नीचे घुड़सवार और जांच arrays और सतह के बीच संपर्क पर लागू बल की राशि को मापने । इन प्रणालियों उच्च परिशुद्धता दे, एक 1 सेमी लंबाई पैमाने पर,14 या ≤ 0.0003 ° १.४ सेमी से अधिक ≤ ०.००१ ° के ग़लतियों रिपोर्टिंग । इन स्वचालित संरेखण प्रणालियों भी ऑपरेटर समय और समग्र पूरा करने के लिए लिया समय में प्रमुख बचत प्रदान करते हैं लिथोग्राफी प्रक्रिया.

उच्च प्रवाह सतह निर्माण के एक प्रमुख आवेदन इस तकनीक द्वारा सक्षम सेल संस्कृति सब्सट्रेट की पीढ़ी है । अब यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सेल phenotype कोशिकाओं और सतह सुविधाओं के बीच प्रारंभिक संपर्क को नियंत्रित करने से चालाकी से किया जा सकता है, और है कि यह नेनो में बढ़ाया जा सकता है । 15 विशेष रूप से, स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी तरीकों को एक सतही विधि ऐसी कोशिका संस्कृति प्रयोगों के लिए nanofabricated सतहों की एक किस्म का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है । 16 उदाहरण के लिए, स्वयं के नेनो पैटर्न प्रस्तुत सतहों-इकट्ठे monolayers और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन पीपीएल और DPN द्वारा टेंपलेट को नैनो के क्षमता का अध्ययन किया गया है सामग्री प्रेरित भेदभाव में संशोधित सामग्री स्टेम सेल । 17

इस प्रोटोकॉल एक संशोधित परमाणु बल माइक्रोस्कोप (AFM) प्रणाली है कि बड़े क्षेत्र पीपीएल सक्षम बनाता है के उपयोग का वर्णन । हम विस्तार जांच-सतह से संपर्क का निर्धारण करने के साधन के रूप में बल का पता लगाने का उपयोग कर, एक एल्गोरिथ्म है कि चलने संरेखण प्रक्रिया को स्वचालित के साथ साथ । extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन fibronectin और मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSC) की संस्कृति के साथ इन नमूनों के बाद functionalization, पीपीएल के एक प्रदर्शन के रूप में वर्णित-निर्मित सतहों सेल संस्कृति के लिए लागू किया जाता है ।

Protocol

1. पीपीएल कलम सरणी के निर्माण

  1. polydimethylsiloxane (PDMS) copolymer मिश्रण तैयार करने के लिए:
    1. प्लेटिनम के 10 µ l को जोड़ें (0)-1, 3-divinyl-1, 1, 3, 3-tetramethyldisiloxane जटिल समाधान और १७२ µ l का 1, 3, 5, 7-tetramethyl-1, 3, 5, 7-tetravinylcyclotetrasiloxane से २५० g का (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane सह बहुलक । मिश्रण समरूप सुनिश्चित करने के लिए 7 दिनों के लिए एक रोटरी मिक्सर पर इन घटकों को अच्छी तरह से मिक्स ।
      चेतावनी: प्लैटिनम (0)-1, 3-divinyl-1, 1, 3, 3-tetramethyldisiloxane विषाक्त है । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
    2. जोड़ें ०.५ g (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane सह बहुलक एक वजन नाव में 1.1.1 कदम से मिश्रण का एक १.७ ग्राम भाग करने के लिए और एक रंग के साथ अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. यह एक निर्वात desiccator को स्थानांतरित करके इस मिश्रण Degas और कम दबाव को उजागर मिश्रण (२०० mTorr, ०.३ mBar) 20 मिनट के लिए जब तक सभी गैस बुलबुले का अपव्यय है ।
  2. एक प्लास्टिक पेंच में एक 13 x 13 मिमी ग्लास स्लाइड प्लेस-सबसे ऊपर 20 मिलीलीटर 2-propanol से भरा है, तो 10 मिनट के लिए किसी भी बड़े मलबे को हटाने के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में शीशी जगह है । स्लाइडें ताजा 2-propanol (१०० मिलीलीटर) में और नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत सूखी की मर्जी से धो लें ।
  3. एक 4 सेमी व्यास पेट्री डिश में एक सिलिकॉन मास्टर18 प्लेस और पर्याप्त degassed PDMS (कदम १.१ से) पॉलिमर मिश्रण पूरी तरह से कवर जब तक जोड़ें । आमतौर पर, १०० µ एल एक 20 x 20 मिमी मास्टर के लिए आवश्यक है । एक वैक्यूम dessicator में बहुलक मिश्रण के साथ गुरु प्लेस । मिश्रण के हस्तांतरण के दौरान गठित किसी भी गैस बुलबुले को दूर करने के लिए एक आगे 5 मिनट के लिए बहुलक Degas । ग्लास स्लाइड के ओ2 प्लाज्मा उपचार (नीचे १.४ कदम) degassing जगह ले जा रहा है, जबकि प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  4. किसी भी कार्बनिक संक्रमण को दूर करने के लिए और elastomer के आसंजन के लिए कांच पर एक समान ऑक्साइड परत उत्पन्न करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम आरएफ शक्ति पर ओ2 प्लाज्मा (६०० mTorr) के साथ कांच चौकों समझो । 19 प्लाज्मा इलाज स्लाइड तुरंत अगले चरण में उपयोग करें ।
  5. ध्यान से स्क्वायर ग्लास स्लाइड (१.४ कदम से) मास्टर पर पॉलिमर (१.३ कदम से) प्लाज्मा के साथ जगह साफ किया पक्ष नीचे का सामना करना पड़ । धीरे किसी भी फंस हवा को दूर करने के लिए और PDMS की एक समान फिल्म मास्टर और स्लाइड के बीच सैंडविच है सुनिश्चित करने के लिए सिलिकॉन मास्टर पर कांच स्लाइड नीचे दबाएँ ।
  6. नीचे से सिलिकॉन मास्टर के साथ एक पेट्री डिश में कदम ऊपर से सैंडविच PDMS सरणी प्लेस (यानी, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा कांच स्लाइड के पीछे के साथ) और एक ओवन में 70 − 80 ° c के लिए पकवान जगह 24 − 48 एच के लिए थर्मल के PDMS इलाज ।
  7. ओवन से ठीक सरणी निकालें और 15 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, तो एक उस्तरा ब्लेड के साथ ध्यान से कांच स्लाइड के पीछे और पक्षों से किसी भी अतिरिक्त PDMS हटाने और सूखी नाइट्रोजन की एक धारा का उपयोग करने के लिए दूर किसी भी ढीला PDMS मलबे झटका ।
    नोट: ध्यान रखना नहीं उस्तरा ब्लेड के साथ सिलिकॉन मास्टर खरोंच, के रूप में यह गैर छड़ी कोटिंग नुकसान हो सकता है ।
  8. 1 मिमी की गहराई पर सरणी के कोने में एक उस्तरा ब्लेड कील और ध्यान से गुरु से अलग सरणी खोदकर । इस क्रिया को एकल निरंतर उठाने वाली कार्रवाई में निष्पादित करें; arrays वापस मास्टर पर गिर करने की अनुमति नहीं है ।
  9. ध्यान से कटौती और दूर एक उस्तरा ब्लेड के साथ सरणी के किनारों पर PDMS के ०.५ mm परिमार्जन । सूखी नाइट्रोजन की एक धारा का उपयोग करने के लिए दूर किसी भी ढीला PDMS मलबे उड़ा ।
    नोट: यह stereoscope या एक आवर्धक कांच के तहत इस trimming कदम प्रदर्शन करने के लिए आसान हो सकता है । ध्यान रखना उस्तरा ब्लेड के साथ सिलिकॉन मास्टर खरोंच नहीं है, क्योंकि यह गैर छड़ी कोटिंग नुकसान हो सकता है ।

2. सरणी तैयारी और सब्सट्रेट बढ़ते

  1. O2 प्लाज्मा उपचार द्वारा जांच सरणी पर एक हाइड्रोफिलिक सतह उत्पंन:
    1. एक पेट्री डिश में पीपीएल पेन सरणी प्लाज्मा चैंबर में प्लेस तो ६०० mTorr के लिए निर्वात लागू होते हैं । 30 एस के लिए प्लाज्मा जनरेटर (अधिकतम सेटिंग) पर स्विच करें ।
    2. वैक्यूम छोड़ें, सरणी को निकालें और इस सरणी पर पानी के 20 µ l को छोड़ने के द्वारा इसके hydrophilicity की जांच करें और देख लें कि क्या यहां तक कि सतह के आरपार जल का प्रसार हो रहा है । यदि यह उत्पंन नहीं होता है, प्लाज्मा उपचार के एक दूसरे दौर के लिए सरणी विषय । बाद में, सूखी नाइट्रोजन गैस की एक धारा के साथ अच्छी तरह से सरणी सूखी ।
  2. डबल पक्षीय कार्बन टेप का उपयोग कर, जांच धारक के बीच पर सरणी देते हैं । AFM गाढ़ापन धारक (चित्रा 2) पर जांच धारक माउंट ।
  3. 16-mercaptohexadecanoic एसिड (एमएचए) (' भनक ') के साथ पीपीएल सरणी लोड करने के लिए:
    1. एक ट्यूब में ८.६ मिलीग्राम 30 मिलीलीटर इथेनॉल में भंग करके 1 मिमी 16-mercaptohexadecanoic एसिड (एमएचए) समाधान तैयार है और यह एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 10 मिनट के लिए पूरी तरह से यौगिक भंग करने के लिए रख ।
      सावधानी: 16-mercaptohexadecanoic एसिड विषाक्त है । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
    2. एक micropipette का उपयोग करना, एमएचए समाधान के 20 µ एल ड्रॉप सरणी पर जमा । arrays के साथ पिपेट युक्तियों के संपर्क से बचें । यह सरणी भर में प्रसार करने के लिए अनुमति दें, तो इथेनॉल परिवेश की स्थिति के तहत लुप्त हो जाना अनुमति देते हैं ।
      नोट: पीपीएल सरणी वैकल्पिक रूप से संरेखण के बाद जगह ले ली है करार किया जा सकता है । 10
  4. एक बार एमएचए समाधान सूख गया है, AFM पर पीपीएल सरणी के साथ जांच धारक माउंट ।

3. पीपीएल के लिए सोने के सब्सट्रेट की तैयारी ।

  1. सोने के सब्सट्रेट या तो खरीदा जा सकता है, या थर्मल या इलेक्ट्रॉन बीम जमाव से घर में बनाया है, और एक गिलास या सिलिकॉन वेफर पर सोने के 20 एनएम के बाद एक 2 एनएम टाइटेनियम आसंजन परत का निर्माण कर रहे हैं । 18
  2. जहां आवश्यक हो, ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा सब्सट्रेट साफ १.४ कदम में वर्णित मापदंडों का उपयोग कर ।
  3. AFM नमूना चरण के बीच में सोने सब्सट्रेट प्लेस और सब्सट्रेट (चित्रा 2) की सीमाओं के आसपास चिपकने वाला टेप के साथ सुरक्षित । z-अक्ष नियंत्रक का उपयोग करते हुए निर्माता के ऑपरेटिंग निर्देशों में दर्शाए अनुसार चरण को सही ऊंचाई पर समायोजित करें ।

4. पेन सरणी का स्वचालित संरेखण

  1. खोलें और चलाएँ (' शून्य ') रीसेट करने के लिए कंप्यूटर पर स्टेज नियंत्रक सेटअप प्रोग्राम (SetupNSF. exe) सभी अक्षों और एक पूर्व-नपेed शून्य बिंदु करने के लिए कोण, फिर चरण x/y-अक्ष नियंत्रक कंसोल का उपयोग करने के लिए इच्छित संरेखण सब्सट्रेट ले जाएँ/ मुद्रण स्थान । इष्टतम परिणाम के लिए, सब्सट्रेट मंच के बल सेंसर के बीच, मंच के केंद्र के पास रखा जाना चाहिए.
    नोट: कंप्यूटर के कुछ मॉडलों में, x/y-अक्ष नियंत्रक USB संकेत है कि z-अक्ष नियंत्रक से हस्तक्षेप कर सकते हैं । यदि ऐसा होता है, तो इस चरण के बाद x/y-अक्ष नियंत्रक USB केबल डिस्कनेक्ट करें । इसके बाद संरेखण प्रक्रिया (चरण ४.७) के बाद फिर से कनेक्ट होना चाहिए ।
  2. नमूना चरण जारी करने के लिए स्टेज रिलीज लीवर स्विच और AFM निर्माता के निर्देशों के अनुसार संकेत के रूप में बल सेंसर के त्रय को सक्रिय करें. बल सेंसरों के लिए अनुमति देने के लिए कम से equilibrate 15 मिनट. इष्टतम परिणामों के लिए, 30-50 मिनट की अनुमति दें ।
  3. वृद्धि z-अक्ष ऊंचाई नेत्रहीन जांच सरणी और सतह देख द्वारा सब्सट्रेट के साथ करीब निकटता में सरणी लाने के लिए ।
    नोट: करीब सरणी सतह के लिए है, कम पुनरावृत्तियां संरेखण प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं, इस प्रकार समय की बचत ।
  4. स्वत: संरेखण प्रोग्राम (स्वत: संरेखण v16. exe) को खोलें और प्रोग्राम में प्रासंगिक संरेखण पैरामीटर्स दर्ज करें ।
    1. , आमतौर पर ०.१५ ° वांछित ' कोण कदम ' पैरामीटर मान दर्ज करें । इस पैरामीटर ऑफसेट कोण से प्रत्येक अक्ष के लिए ' इष्टतम ' कोण है कि कार्यक्रम द्वारा निर्धारित किया जाता है । इस पैरामीटर को ०.१ और ०.२ ° के बीच सेट करें, इस श्रेणी से कम कोण के रूप में सतह पर जांच के दृष्टिकोण पर एक स्पष्ट रूप से जासूसी बल अंतर में परिणाम नहीं है ।
      नोट: सॉफ्टवेयर millidegrees में मूल्यों को स्वीकार करता है (यानी, 1 x 10-3 °) । उदाहरण के लिए, ०.१५ ° के लिए, उपयोगकर्ताओं को ' १५० इनपुट चाहिए. '
    2. वांछित मोटे कदम ' पैरामीटर मान में प्रवेश, आमतौर पर ०.६ µm. इस पैरामीटर z-अक्ष कदम चरण के रूप में यह प्रारंभिक किसी न किसी संरेखण में जांच दृष्टिकोण के द्वारा इस्तेमाल किया आकार है । इस पैरामीटर को ०.२ और 1 µm के बीच सेट करें । बड़ा चरण आकार संरेखण प्रक्रिया के लिए लिया गया समय घटाएं लेकिन संरेखण की सटीकता को कम करें, और जांच पर पहनने को बढ़ाएं ।
      नोट: सॉफ्टवेयर micrometers में मोटे कदमों के मूल्यों को स्वीकार करता है । उदाहरण के लिए, ०.६ µm उपयोगकर्ताओं के लिए इनपुट ' ०.६ ' होना चाहिए ।
    3. इच्छित ' ठीक ' चरण पैरामीटर मान दर्ज करें, सामान्यतया ०.२ µm. यह पैरामीटर z-अक्ष चरण इष्टतम संरेखण के ठीक समायोजन के लिए उपयोग किया गया आकार है । अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, यह पैरामीटर ०.१ और ०.४ µm के बीच सेट करें । बड़ा मान चरण आकार संरेखण प्रक्रिया के लिए लिया गया समय की मात्रा कम हो जाएगा, लेकिन संरेखण की गुणवत्ता में कमी ।
      नोट: सॉफ्टवेयर micrometers में ठीक कदम के मूल्यों को स्वीकार करता है । उदाहरण के लिए, ०.२ µm के लिए, उपयोगकर्ताओं को ' ०.२ इनपुट चाहिए. '
    4. ' Excel फ़ाइल पथ ' को कॉंफ़िगर करें और ' फ़ोल्डर ' चिह्न का उपयोग कर, फ़ाइल स्थान पर नेविगेट करते हुए, और ' ठीक ' दबाकर प्रदान की गई स्प्रेडशीट टेंपलेट फ़ाइल की एक अनसंशोधित प्रति देते हैं । इस फ़ाइल में कच्चे और परिकलित डेटा है जो चरण के इष्टतम चरण झुकाव कोण निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  5. AFM नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें/चलाएं । इस कार्यक्रम के स्पेक्ट्रोस्कोपी घटक के लिए नेविगेट करें ' स्पेक्ट्रोस्कोपी ' बटन पर क्लिक करके (निर्माता के निर्देशों के अनुसार), और सेट AFM स्कैन सिर z-अक्ष पर 10 µm से दोलन करने के लिए १०० ms, २५० की एक ठहराव समय के साथ ms, तो 10 µm से अधिक वापस लेने के लिए १०० ms २५० ms (चित्रा 3) का ठहराव समय के साथ.
  6. AFM सिर दोलन कर रहा है के रूप में, स्वचालित संरेखण प्रक्रिया शुरू करने के लिए संरेखण सॉफ्टवेयर के ' प्रारंभ ' बटन पर क्लिक करें । जब प्रोग्राम चल रहा है, तो सॉफ़्टवेयर लेखन और चरण 4.4.4 में वर्णित फ़ाइल में डेटा पढ़ रहा है ।
    नोट: संरेखण के बीच 30 मिनट और 3 h चरण ४.३ और सॉफ़्टवेयर कॉन्फ़िगरेशन चरण ४.४ में दर्ज किए गए थे जो में सेट प्रारंभिक चरण स्थिति के आधार पर लेता है ।
    चेतावनी: चरण नियंत्रक कंसोल संरेखण प्रक्रिया के दौरान अभी भी सक्रिय है-संरेखण प्रक्रिया के दौरान उंहें उपयोग नहीं के रूप में इसे पंक्तिबद्धता के साथ हस्तक्षेप करेगा ।
  7. संरेखण समाप्त होने पर, संरेखण सॉफ़्टवेयर (चरण ४.४ से) पर ग्रीन लाइट बॉक्स ' संरेखण पूर्ण ' जलाया जाएगा । जब ऐसा होता है, तो संरेखण प्रक्रिया समाप्त करने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर ' STOP ' बटन क्लिक करें ।
  8. रिकॉर्ड किए गए डेटा बिंदुओं के बीच एक सहसंबंध के लिए स्प्रेडशीट टेम्पलेट फ़ाइल में रेखांकन का निरीक्षण करें और लाइन फिट है कि सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न होता है । एक अच्छा संबंध के उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें, ठेठ आर > ०.९९ के मूल्यों के साथ । यदि संरेखण असफल होता है, तो जांच सरणी को नए तैयार सरणी (चरण 2) से प्रतिस्थापित करें और संरेखण (चरण ४.४) को दोहराएँ ।
  9. उस अक्ष के लिए चरण नियंत्रक कंसोल का उपयोग करके चरण को z-अक्ष में ऊपर की ओर ले जाएं । मंच ५०० एनएम वेतन वृद्धि में ले जाया जाना चाहिए जब तक संपर्क AFM के शीर्ष दृश्य कैमरे से मनाया जा सकता है । सरणी और सब्सट्रेट के बीच संपर्क व्यक्तिगत जांच पिरामिड के शीर्ष पर उच्च कंट्रास्ट के एक ' सफेद डॉट ' के रूप में मनाया जा सकता है ।
  10. इस बिंदु पर, ' stop ' बटन पर क्लिक करें AFM नियंत्रण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोग्राम से ४.५ कदम रोकने के लिए सॉफ्टवेयर । यह सरणी 10 µm द्वारा वापस लेना होगा, इसलिए संभव z-अक्ष एक्सटेंशन के 10 µm छोड़ रहा है । AFM के शीर्ष दृश्य कैमरे से छवि की जांच करें सुनिश्चित करें कि जांच सब्सट्रेट के साथ संपर्क में नहीं हैं ।

5. बहुलक कलम लिथोग्राफी (पीपीएल)

  1. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के ' लिथोग्राफी ' बटन पर क्लिक करके नियंत्रण के लिथोग्राफी घटक के लिए नेविगेट करें । z-मॉडुलन ऑपरेटिंग मोड चुनें और एक रैस्टर (बिटमैप) या वेक्टर छवि है कि लिथोग्राफी पैटर्न के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा आयात करते हैं । आदेश में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, एक बिटमैप 20 x 20 काले पिक्सल (पूरक सामग्री देखें), इसी के लिथोग्राफी के लिए इसी का उपयोग करने के लिए उत्पंन करने के लिए 20 x 20 पीपीएल सरणी पर जांच के प्रति डॉट्स के एक ग्रिड ।
  2. AFM नियंत्रक सॉफ्टवेयर की ' पिक्सेल ग्राफिक आयात ' विंडो में लिथोग्राफी पैरामीटर दर्ज करें ।
    1. कॉन्फ़िगर करें ' आकार ' पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, जैसे, लंबाई और चौड़ाई में ४० µm. ये पैरामीटर उस चौड़ाई और लंबाई को इंगित करते है जिस पर बिटमैप में छवि को स्केल किया जाएगा । प्रतिनिधि परिणामों में दिखाई गई सुविधाओं को जेनरेट करने के लिए, दोनों आयामों में ४० µm की चौड़ाई और लंबाई का उपयोग करें.
    2. दोनों x और y अक्ष पर 25 µm पर जनरेट करने के लिए प्रतिमान की ' Origin' सेट करें । ये पैरामीटर AFM x/y-अक्षों के केंद्र के सापेक्ष छवि के केंद्र का निर्धारण करते हैं । इन पैरामीटर्स को सतह के उस क्षेत्र से बचने के लिए सेट करें जहां जांच संरेखण प्रक्रिया के दौरान संपर्क में थीं ।
    3. मुद्रण ' पैरामीटर्स ' सेट करें । इन मूल्यों का निर्धारण कैसे जांच को बढ़ाया जा रहे है (यानी सतह के साथ संपर्क में लाया) बिटमैप छवि में प्रत्येक पिक्सेल के जवाब में ।
      1. ड्रॉप-डाउन मेनू ' मॉडुलन Abs जेड Pos ' और ' दो परतों को सरल ' से चुनें । यह मोड AFM केवल दो परिणामों द्वारा निर्धारित एक निरपेक्ष दूरी द्वारा जांच का विस्तार करने के लिए निर्देश देता है, या तो ' काला (0) ' या ' सफेद (1) ' फ़ील्ड ।
      2. क्रमश: 5 और-5 µm के लिए ' ब्लैक (0) ' और ' व्हाइट (1) ' फ़ील्ड में मान सेट करें । ये मान निर्धारित दूरी जांच बिटमैप छवि पर एक काले या सफेद पिक्सेल के जवाब में ले जाया जाना चाहिए और आम तौर पर के लिए 3 और 5 µm के बीच सेट कर रहे हैं ' ब्लैक ' (यानी, उस दूरी से नीचे की ओर जांच का विस्तार उस धुरी के शूंय बिंदु के सापेक्ष) और-3 से-5 µm ' सफेद ' के लिए (यानी, शूंय बिंदु के सापेक्ष 3 से 5 µm द्वारा ऊपर की जांच वापस ले) ।
        नोट: इन प्रतिनिधि दूरी मान लें कि एक 5 µm विस्तार की जांच में परिणाम सतह के साथ संपर्क में आ रहा है और इसलिए एक सुविधा की पीढ़ी है, जबकि एक 5 µm वापसी कोई संपर्क में जिसके परिणामस्वरूप सतह से दूर जांच लिफ्टों । Z-विस्तार सतह के साथ जांच संपर्क की सीमा का निर्धारण करके सुविधा का आकार को प्रभावित करता है, अधिक विस्तार की जांच में परिणाम की सतह में आगे दबाया जा रहा है, बड़ी सुविधाओं में जिसके परिणामस्वरूप । 10
      3. इन सेटिंग्स को कार्यान्वित करने और विंडो को बंद करने के लिए ' ठीक ' बटन पर क्लिक करें ।
  3. AFM नियंत्रण सॉफ्टवेयर, आम तौर पर 1 एस की लिथोग्राफी विंडो में ' ठहराव समय ' दर्ज करें । यह सेटिंग समय की जांच विस्तारित ' ब्लैक ' स्थिति है, जो आम तौर पर ०.१ और 10 एस के बीच सेट है में रहने की लंबाई निर्धारित करता है ।
    नोट: एमएचए सोने की सतह के लिए परिवहन की बड़ी राशि के कारण बड़ा सुविधा आकार में अब ठहराव बार परिणाम. उत्पंन सुविधाओं के आकार को नियंत्रित करने के बारे में अधिक जानकारी अंय रिपोर्टों में पाया जा सकता है । 20
  4. वायुमंडलीय नियंत्रण बाड़ा तैयार करें ।
    1. AFM पर वायुमंडलीय अलगाव चैंबर कम और खुले/भागो निर्माता-आपूर्ति वायुमंडलीय नियंत्रण सॉफ्टवेयर (MHG_control. exe) ।
    2. वायुमंडलीय नियंत्रण सॉफ्टवेयर सेट करने के लिए एक रिश्तेदार आर्द्रता बनाए रखने के लिए ४५%, तापमान के 25 ° c, और एक वातावरण विनिमय ' प्रवाह दर ' ५०० एमएल के सॉफ्टवेयर में इन मूल्यों में प्रवेश करके. सेटिंग्स को कार्यान्वित करने के लिए ' उपयोग ' पर क्लिक करें. वायुमंडलीय नियंत्रण मॉड्यूल तो चैंबर में humidified हवा पंप शुरू हो जाएगा ।
      नोट: उच्च आर्द्रता स्तर पेन सरणियों और सतह के बीच जनरेट किया गया एक बड़ा पानी meniscus के गठन के कारण बड़ी सुविधा आकार में परिणाम । 21 यह मान सामांयतया ४० और ६०% के बीच सेट है । प्रवाह दर आम तौर पर ३०० और ५०० मिलीलीटर के बीच सेट है । बड़ा प्रवाह वांछित आर्द्रता स्तर अधिक तेजी से पहुंचा जा करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन कम सटीक है । प्रतिनिधि परिणाम आर्द्रता के प्रारंभिक उत्पादन के लिए ५०० मिलीलीटर की एक प्रवाह दर का उपयोग करें और लिथोग्राफी के दौरान एक सटीक और स्थिर स्तर को बनाए रखने के लिए, वांछित नमी तक पहुँचने पर ३०० मिलीलीटर में कमी आई है ।
  5. एक बार वांछित आर्द्रता प्राप्त की है, सॉफ्टवेयर अंतरफलक पर ' प्रारंभ ' बटन दबाकर lithographic अनुक्रम शुरू करते हैं ।
  6. लिथोग्राफी के पूरा होने पर z-अक्ष चरण नियंत्रक कंसोल को सरणी से ५०० µm द्वारा चरण वापस ले जाने के लिए दूर सब्सट्रेट स्थानांतरित करने के लिए का उपयोग करें । उसके बाद अपने माउंट से वायुमंडलीय अलगाव चैंबर निकालें ।
  7. चरण रिलीज लीवर स्विच करने के लिए नमूना चरण ताला और बल सेंसर को निष्क्रिय, के रूप में AFM निर्माता के निर्देशों के द्वारा संकेत दिया है, तो मंच से सब्सट्रेट हटा दें ।

6. पैटर्न दृश्य

  1. पैटर्न निंनलिखित तरीकों में से एक का उपयोग कर visualized किया जा सकता है, पार्श्व बल स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी या रासायनिक नक़्क़ाशी ।
  2. सुविधाओं की जांच करने के लिए संपर्क मोड ब्रैकट का उपयोग करते हुए पार्श्व बल मोड के साथ AFM पर नमूनों की सतह को विनाशकारी रूप से स्कैन करें ।
    नोट: पार्श्व बल माइक्रोस्कोपी बहुलक कलम लिथोग्राफी द्वारा उत्पादित सुविधाओं को देखने का एक विनाशकारी विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इस विधि का उपयोग करते हुए, केवल एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र visualized किया जा सकता (सामांयतया १०० x १०० µm) ।
  3. के बाद से जमा एमएचए एक खोदना विरोध के रूप में कार्य कर सकते हैं, रासायनिक नक़्क़ाशी गैर नमूनों क्षेत्रों से सोने को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परिणामस्वरूप unधंसा क्षेत्रों तो ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप द्वारा visualized किया जा सकता है, एक व्यापक क्षेत्र अर्थ एक बार में देखा जा सकता है । 18
    नोट: इस तरह से धंसा हुआ सब्सट्रेट नीचे वर्णित बाद के सेल कल्चर प्रयोगों के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता ।
    1. अलग से, ४० मिमी thiourea, 27 मिमी आयरन (III) नाइट्रेट और १०० mm हाइड्रोक्लोरिक एसिड के जलीय समाधान तैयार करते हैं । इन तीन समाधानों में से प्रत्येक के 5 मिलीलीटर मिश्रण से खोदना तैयार करें । ताजा मिश्रण से पहले प्रत्येक का उपयोग करने के लिए । 22
      सावधानी: thiourea, आयरन (III) नाइट्रेट और हाइड्रोक्लोरिक एसिड विषैले होते हैं । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
    2. एक पेट्री पकवान में नमूनों सब्सट्रेट स्थानांतरण और पकवान में पर्याप्त पिपेट समाधान सब्सट्रेट (आमतौर पर 10 मिलीलीटर) की सतह को कवर करने के लिए । 4-5 मिनट के लिए जलमग्न सब्सट्रेट रखें सोने की 15 एनएम खोदना करने के लिए (3 एनएम/मिनट की अनुमानित दर पर) ।
    3. जब नक़्क़ाशी पूरा हो गया है, सब्सट्रेट निकालें और अच्छी तरह से पानी के साथ कुल्ला और नाइट्रोजन की एक धारा के साथ सूखी ।
      नोट: नक़्क़ाशी प्रक्रिया के पूरा होने के सोने की सतह की मोटाई से निर्धारित किया जाता है (चरण ३.१) निर्दिष्ट नक़्क़ाशी दर (step 6.2.2) के साथ जुड़े ।
    4. चमकदार क्षेत्र ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के तहत धंसा सोने सुविधाओं का निरीक्षण किया । शेष सोने की सुविधाओं है कि (५.२ कदम से) मुद्रित किया गया था पैटर्न के अनुरूप दिखाई देनी चाहिए । यदि पूरी सतह सजातीय प्रकट होता है, यह इंगित करता है कि सोने की एक महत्वपूर्ण राशि रहता है और नक़्क़ाशी कदम (चरण 6.2.2 निंनलिखित) 1-2 मिनट के लिए दोहराया जाना चाहिए ।

7. fibronectin के साथ पैटर्न functionalization

  1. 1 घंटे के लिए इथेनॉल में 1 मिमी (11-mercaptoundecyl) हेक्सा (ईथीलीन ग्लाइकोल) समाधान में नमूनों सब्सट्रेट विसर्जित कर दिया सब्सट्रेट तीन बार इथेनॉल के साथ धोने और अच्छी तरह से नाइट्रोजन की एक धारा के तहत सूखी. यह कदम passivates के साथ ही अनपैटर्न्ड गोल्ड एरियाज को लेकर है ।
    सावधानी: (11-mercaptoundecyl) हेक्सा (ईथीलीन ग्लाइकोल) विषाक्त है । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
  2. एक 10 मिमी सह में सब्सट्रेट जलमग्न (कोई3)2 जलीय समाधान 5 मिनट के लिए. अगले, समाधान से सब्सट्रेट निकालें, ultrapure पानी के साथ तीन बार धोने, और सूखी नाइट्रोजन की एक धारा के तहत सूखी ।
    सावधानी: कं (कोई3)2 विषाक्त है । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
  3. फॉस्फेट में fibronectin के एक ५० µ g/mL समाधान में सब्सट्रेट विसर्जित (पंजाब) और 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए 15 ज. धो सब्सट्रेट तीन बार पंजाबियों के साथ, तो सूखी नाइट्रोजन की एक धारा के तहत सब्सट्रेट सूखी ।
    नोट: Fibronectin एमएचए पर टर्मिनल carboxylic एसिड समूहों द्वारा सह के केलेशनथेरेपी (द्वितीय) के माध्यम से एमएचए-कार्यात्मक क्षेत्रों के लिए बाध्य है । Fibronectin तो अपने कोलेजन-बंधन डोमेन के माध्यम से सह (II) बांधता है । 23
  4. यदि वांछित, यह फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग द्वारा सतह बाध्य fibronectin कल्पना:
    1. 1:100 unconjugated खरगोश विरोधी fibronectin प्राथमिक एंटीबॉडी में 5% (डब्ल्यू/वी) के 2 मिलीलीटर समाधान लागू करें पंजाब में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) की सतह के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए 16 ज. महाप्राण supernatant और पंजाबियों के साथ तीन बार धो लो ।
    2. फ्लोरोसेंट संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के 2 मिलीलीटर समाधान में सब्सट्रेट विलय (निर्माता निर्दिष्ट कमजोर पड़ने पर, पंजाब में BSA के 5% (डब्ल्यू/वी) में 2 बूंदें/, टिन पन्नी में कवर, और 1 एच महाप्राण के लिए कमरे के तापमान पर मशीन supernatant और पंजाबियों के साथ तीन बार धो लें ।
    3. ५९४ एनएम के लिए सेट एक उत्तेजना फिल्टर के साथ, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सुविधाओं के epifluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों को रिकॉर्ड.

8. nanofabricated सतहों पर सेल संस्कृति

  1. अच्छी तरह से विशेषता hMSCs है कि 4गु और 6वें बीतने के बीच कर रहे है की एक निलंबन तैयार करें । 24
    1. 10 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ एक बार धोने के द्वारा कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह कुप्पी निलंबित, अलग कर देना T75 ऊतक संस्कृति कुप्पी में trypsin/EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं का पालन किया, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में कुप्पी की मशीन 5% सह2 के लिए 5 मिनट तक के लिए पूरक ९०% हे f कोशिकाओं को सतह से अलग कर रहे हैं ।
    2. बाद में, नई संस्कृति मीडिया के 6 मिलीलीटर जोड़ें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) कुप्पी में और संक्षेप में मीडिया के साथ कुप्पी कुल्ला जोड़ा । स्थानांतरण सेल निलंबन में एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ४०० जी में केंद्रापसारक ।
    3. supernatant निकालें और ताजा संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
    4. एक hemocytometer25 का उपयोग कर सेल घनत्व गिनती और संस्कृति मीडिया का एक उचित मात्रा के अलावा द्वारा 2 एक्स 104 कोशिकाओं के लिए सेल निलंबन के घनत्व को समायोजित/
  2. बीज पर सब्सट्रेट्स कोशिकाओं के घनत्व पर 104 कोशिकाओं/
    1. 1 एक्स 1 सेमी2 हीरा मुंशी के साथ में सब्सट्रेट कट और यह एक अच्छी तरह से में जगह 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली.
    2. पिपेट संस्कृति मीडिया में सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर (चरण 8.1.4 से) में अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में मशीन के साथ 5% सह2 के लिए पूरक 24 एच ।
  3. पैटर्न पर सेल विकास के बाद, सेल लगाव की सीमा का विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा फैल:
    1. पंजाबियों के साथ एक बार मीडिया और धुलाई सब्सट्रेट निकालें । पंजाब में 4% paraformaldehyde के समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (३७ डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व में गर्म) धुएं हूड में 20 मिनट के लिए और पंजाबियों के साथ तीन बार धो लो ।
      सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है । कृपया इस समाधान के साथ काम करने से पहले MSDS पढ़ें । केमिकल से निपटने के दौरान सेफ्टी इक्विपमेंट जरूर पहने जाने चाहिए ।
    2. Permeabilize ०.५% डिटर्जेंट के समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए पंजाब में ( सामग्री की तालिकादेखें), तो तीन बार पंजाबियों के साथ धो लो ।
    3. unconjugated खरगोश विरोधी fibronectin प्राथमिक एंटीबॉडी के एक समाधान के 2 मिलीलीटर में सब्सट्रेट विलय 5% (डब्ल्यू/वी) के साथ 1:100 के कमजोर पड़ने पर पंजाब में BSA और 16 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, फिर तीन बार ०.१% (वी/वी) के बीच 20 में पंजाब (PBST) के बीच धो लो ।
    4. बाद में फ्लोरोसेंट संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के एक समाधान के 2 मिलीलीटर में सब्सट्रेट डूब (5% के साथ पतला (डब्ल्यू/वी.) निर्माता निर्दिष्ट कमजोर पड़ने पर पंजाब में BSA, 2 बूँदें/एमएल), टिन पन्नी में कवर और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, फिर ०.१% PBST के साथ तीन बार धो लें ।
    5. actin रेशा लेबल करने के लिए, पंजाब में 1:250 के एक कमजोर पड़ने पर फ्लोरोसेंट संयुग्मित phalloidin के 2 मिलीलीटर जलमग्न, टिन पन्नी में कवर और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी तो पंजाबियों के साथ तीन बार धो लो ।
    6. इसके साथ ही सेल नाभिक दाग और बढ़ते मध्यम DAPI युक्त की एक बूंद लगाने और एक coverslip के साथ कवर द्वारा सब्सट्रेट माउंट ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं कल्पना, नाभिक के लिए ३६५ एनएम के उत्तेजना फिल्टर के साथ (DAPI), एफ के लिए ४८८ एनएम-actin और ५९४ एनएम के लिए fibronectin ।

Representative Results

यह जांचने के लिए कि क्या स्वचालित संरेखण सफल हुआ था, संरेखण डेटा से प्लॉट किए गए ग्राफ़ (चरण ४.८ से स्प्रेडशीट में) की जांच की गई । जहां संरेखण प्रक्रिया दो भूखंडों सफल रहा था, जिस कोण से नमूना चरण θ और φ अक्षों के साथ झुका दिया गया है के लिए इसी, बढ़ती है और डेटा बिंदुओं उतरते की एक श्रृंखला दिखाई । भूखंडों में से प्रत्येक में, डेटा अंक के दो रैखिक फिट बैठता है एक अच्छी तरह से परिभाषित-काटना "चोटी" अधिकतम z-विस्तार और इसी कोण है जो संरेखण (चित्रा 4a और 4B) हासिल किया गया था का संकेत दिखाया । इस प्रक्रिया को चार बार दोहराया जाता है (यानी, दो बार प्रत्येक अक्ष के लिए) और चार निर्देशांक का एक सेट के रूप में रची गई. निर्देशांक के प्रत्येक जोड़ी के प्रतिच्छेदन इस प्रकार समग्र इष्टतम कोण (आंकड़ा 4c) से पता चलता है. 13 मामलों में जहां संरेखण सफल नहीं था, यह देखा जा सकता है कि उनके इसी θ और φ कोण भूखंड अच्छी गुणवत्ता रैखिक फिट नहीं देते हैं, या एक दूसरे को काटना नहीं है (चित्रा 5) । इस तरह के विफल संरेखण आमतौर पर arrays गलत तरीके से छंटनी की जा रही है या जांच धारक के लिए घुड़सवार का एक परिणाम के रूप में कर रहे है (चरण १.७, १.८, और २.२) । इन मामलों में, सरणियों को छोड़ दिया गया और एक नया तैयार और माउंट किया गया (चरण 1 और 2), और संरेखण प्रक्रिया दोहराया (चरण 4) ।

पर सफल संरेखण और पीपीएल द्वारा एमएचए के साथ लिथोग्राफी, नमूनों सोने सब्सट्रेट तो पार्श्व बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए कि क्या बयान जगह ले लिया था की जांच की छवि थे । मुद्रित सतहों का एक बड़ा क्षेत्र परीक्षा भी जमा thiol द्वारा संरक्षित नहीं सोने के नक़्क़ाशी के बाद सब्सट्रेट्स के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आयोजित किया गया था (चित्रा 6 और चित्रा 7) । हालांकि, नक़्क़ाशी पैटर्न आगे functionalization के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और केवल मुद्रित सतह सब्सट्रेट के एक बैच के प्रतिनिधि नमूनों पर पैटर्न की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यदि धंसा हुआ प्रतिमान व्यक्तिगत पेन (चित्र 8) से संबंधित रिक्त क्षेत्रों को दिखाते हैं, तो यह परिणाम इंगित करता है कि जांच सरणियों का उत्पादन सफलतापूर्वक नहीं किया गया है, और यह कि कुछ जांचें क्षतिग्रस्त या अनुपलब्ध हैं । जांच की इस सजातीयता एक पुराने मास्टर जहां perfluorinated कोटिंग दूर पहना है के उपयोग के कारण हो सकता है (१.३ कदम), कुछ जांच में जिसके परिणामस्वरूप दूर जब सरणी गुरु से अलग है फटे जा रहा है । इन मामलों में, एक नया मास्टर उपयोग किया जाना चाहिए । परिणाम भी हवा कांच समर्थन और गुरु के बीच फंस बुलबुले की उपस्थिति के कारण हो सकता है (चरण १.५), या यदि जांच सरणी साफ नहीं था (१.८ कदम) इलाज के बाद गुरु से अलग ।

फ्लोरोसेंट fibronectin कार्यात्मक सतहों के माइक्रोस्कोपी छवियों मशीन hMSCs भी एकत्र किए गए (9 अंक) । सामांय में, सभी सब्सट्रेट में इन विट्रो संस्कृति के वातावरण के भीतर स्थिर थे और कोशिकाओं का पालन किया और छोटे अलग 20 के मामले में मुद्रित पैटर्न के लिए अपनी आकृति विज्ञान अनुकूलित सुविधाओं के २० x 20 सरणी.

Figure 1
चित्र 1. बहुलक कलम लिथोग्राफी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जांच टिप पर एक पानी meniscus के माध्यम से आणविक स्याही परिवहन दिखा । (क) ओर देखने और (ख) बहुलक कलम सरणी के शीर्ष दृश्य संकेत मिलता है कि जब जांच सरणी और सतह सब्सट्रेट पूरी तरह से गठबंधन कर रहे हैं, सभी जांच सतह के साथ संपर्क में एक साथ आते हैं, समानांतर लिथोग्राफी में जिसके परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. बहुलक कलम लिथोग्राफी की स्थापना की योजनाबद्ध आरेख । (क) प्रयोगात्मक सेट अप जहां तैयार जांच सरणी जांच धारक से जुड़ा हुआ है और AFM स्कैनर के लिए मुहिम शुरू की ओर देखने का विस्तार किया । सब्सट्रेट मंच पर रखा गया है, जो नीचे तीन बल सेंसर स्थित हैं. (ख) नमूना मंच के सापेक्ष AFM स्कैन सिर दिखा, इकट्ठे इंस्ट्रूमेंटेशन का एक प्रतिनिधित्व. (ग) नीचे देखने के बल संवेदक स्थान दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व संरेखण प्रक्रिया के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपी कार्यक्रम चित्रण । AFM स्कैनर १०० ms के भीतर 10 µm की दूरी से नमूना की ओर जांच स्थानांतरित करने के लिए सेट है, २५० ms के लिए स्थिति में आयोजित, १०० ms के भीतर 10 µm के एक पुनर्कर्षण के बाद, और फिर मुकर स्थिति में २५० ms के लिए आयोजित किया । गति तो संरेखण प्रक्रिया में दोहराया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. रेखांकन एक सफल संरेखण illustrating । झुकाव कोण के खिलाफ z स्थिति का रेखांकन (एक) θ और (ख) एक सफल संरेखण के लिए φ, जहां ● वास्तविक मूल्यों को इंगित करता है मापा जाता है और + न्यूनतम-वर्गों विधि के साथ सबसे अच्छा फिट इंगित करता है । (ग) चार अंक जहां अधिकतम z-स्थिति तक पहुंच गया था के साथ θ फिट कोणों के खिलाफ φ का ग्राफ । चौराहे चिह्नित बिंदु दोनों कुल्हाड़ियों भर में अंतिम इष्टतम झुकाव कोण है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. एक असफल संरेखण illustrating रेखांकन । झुकाव कोण के खिलाफ z स्थिति का रेखांकन (एक) θ और (ख) एक असफल संरेखण, जहां ● इंगित करता है वास्तविक मूल्यों मापा जाता है और + के लिए सबसे अच्छा फिट से संकेत मिलता है के लिए कम-वर्गों विधि । (ग) चार अंक जहां अधिकतम z-स्थिति तक पहुंच गया था के साथ θ फिट कोणों के खिलाफ φ का ग्राफ । कोई स्पष्ट ऑप्टिमा या चौराहे बिंदु मनाया जाता है और इसलिए इष्टतम संरेखण कोण हल नहीं कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. उदाहरण के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और परमाणु बल सोने के सब्सट्रेट कि गठबंधन पीपीएल arrays द्वारा एमएचए के साथ नमूनों थे और फिर धंसा के माइक्रोस्कोप छवियां । (क) और (ख) क्रमिक रूप से धंसा पैटर्न के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों बढ़ाया; (ग) पैटर्न के एक एकल ग्रिड की एक AFM स्थलाकृति छवि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. सोने के सब्सट्रेट कि गठबंधन पीपीएल arrays द्वारा एमएचए के साथ नमूनों थे और फिर धंसा के उदाहरण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों । (क) और (ख) क्रमिक रूप से धंसा पैटर्न के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों को बढ़ाया है और (ग) एक कम इज़ाफ़ा छवि है कि बड़े क्षेत्र सजातीय पैटर्न से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. एक सोने सब्सट्रेट कि असमान एमएचए के साथ patterned था और फिर धंसा के उदाहरण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवि । इरादा पैटर्न (इनसेट में दिखाया गया है) 20 लाइनों में व्यवस्थित लाइन डॉट के ग्रिड दोहरा रहे थे, हर दो के साथ 1 µm द्वारा z-अक्ष विस्तार बढ़ाने द्वारा उत्पादित लाइनों के साथ, (5 से लेकर-5 µm) । यह देखा जा सकता है कि कुछ क्षेत्रों में कोई पैटर्न उत्पंन कर रहे हैं, उन स्थानों में लापता जांच के कारण । उन क्षेत्रों में जहां डॉट्स की केवल दो लाइनें उत्पादित होती हैं, यह परिणाम इंगित करता है कि एक जांच मौजूद है, लेकिन यह पूरी तरह से कार्य जांच के रूप में एक ही ऊंचाई का नहीं है, इसलिए केवल सुविधाएं जमा करें जब सरणी पूर्ण z-अक्ष दूरी तक विस्तारित हो । इस छवि में, इसके विपरीत जानबूझकर आंशिक रूप से मुद्रित क्षेत्रों की निगरानी सक्षम करने के लिए बदल दिया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9. hMSCs के Epifluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों पीपीएल द्वारा टेंपलेट fibronectin arrays पर कल्चरित । (A) और (B) व्यक्तिगत कक्षों को दिखाते हुए उच्च आवर्धन छवियां हैं । (ग) एक अनुयाई सेल के बिना fibronectin सरणी के एक उदाहरण पैटर्न से पता चलता है और (घ) एक ग्रिड व्यवस्था में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के एक व्यापक क्षेत्र की छवि है (मुद्रित पैटर्न के एक योजनाबद्ध भी जड़ना में दिखाया गया है) । कोशिकाओं fibronectin (लाल), एफ actin (हरा) और सेल नाभिक (नीला) दिखाने के लिए दाग रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए एक सुविधाजनक पद्धति के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करने के लिए तेजी से बड़े (सेमी2) क्षेत्रों पर उच्च एकरूपता और नियंत्रणीय सुविधा के आकार के साथ nanolithographic पैटर्न बाहर ले कार्य करता है । इन बड़े क्षेत्र nanopatterns असर सब्सट्रेट तो आगे अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए सविस्तार कर सकते हैं । इस प्रौद्योगिकी के एक प्रमुख आवेदन सेल सतह संपर्क अध्ययन के लिए nanofabricated सतहों की पीढ़ी में है । इस रिपोर्ट में इन सामग्रियों पर सेल संस्कृति के कुछ उदाहरण दिखाता है, nanofabricated सब्सट्रेट द्वारा hMSC आकृति विज्ञान के नियंत्रण का प्रदर्शन ।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सक्षमीकरण संरेखण प्रक्रिया (चरण 4) है कि अत्यधिक समान और उच्च प्रवाह के उत्पादन की अनुमति देता है के स्वचालन है सतहों पर नेनो संकल्प है, जो सेल संस्कृति के प्रयोगों के तेजी से कारोबार में सक्षम बनाता है के लिए नीचे । बहुलक कलम इस संरेखण एल्गोरिथ्म का उपयोग किया लिथोग्राफी लगभग 30 मिनट के भीतर नेनो सुविधाओं को उत्पंन करने में सक्षम है । reproducibility और स्वचालित संरेखण की सटीकता, और इस प्रकार पैटर्न सुविधाओं की एकरूपता, लेकिन गंभीर रूप से जांच arrays कि उत्पादित कर रहे है की गुणवत्ता पर निर्भर है (चरण 1 और 2) । उनकी तैयारी में कोई खामियां है कि कुंद, टूट या लापता जांच में परिणाम; इस तरह के रूप में फंस हवाई बुलबुले (चरण १.५) या मास्टर से जांच की अनुचित जुदाई (चरण १.८) गलत संरेखण और गरीब गुणवत्ता लिथोग्राफी में परिणाम कर सकते हैं ।

इस विधि रिपोर्ट बल प्रतिक्रिया पर निर्भर करते हैं जो अन्य संरेखण विधियों के साथ सामान्य में एक सीमा साझा करता है । जब जांच सतह के साथ संपर्क में है का सही निर्धारण परिवेश वातावरण और नमूना चरण के आंदोलन की वजह से पृष्ठभूमि कंपन के लिए खाते की जरूरत से विवश है । । सामान्य में, सेंसर µN शासन में एक बल संवेदनशीलता है (इस मामले में 2 µN), लेकिन संरेखण एल्गोरिथ्म केवल जांच और सतह के बीच निश्चित संपर्क के रूप में कम से ४९० µN के एक बल रजिस्टर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, आदेश में किसी भी ' झूठी सकारात्मक ' से बचने के लिए रेसुल पृष्ठभूमि शोर से टिंग । 13 इस प्रकार, इस विधि के लिए बड़ी सुविधाओं का उत्पादन (1-2 µm) के बाद से जांच z-धुरी पर एक बड़ी दूरी (एक फलस्वरूप उच्च शक्ति के साथ) विस्तारित करने के लिए संपर्क रजिस्टर करना चाहिए जाता है । क्षतिपूर्ति के लिए, छोटे सुविधाओं z-अक्ष दूरी लिथोग्राफी चरण के दौरान यात्रा को कम करने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता (जैसे, चरण 5.2.3.2 में ' ब्लैक ' सेटिंग में प्रवेश 5 µm के बजाय 3 µm के रूप में).

फिर भी, यहां तक कि इस सीमा के साथ, स्वचालन एल्गोरिथ्म समानांतर स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी तरीकों के आवेदन में एक महत्वपूर्ण पहलू को संबोधित करने में सक्षम है, संरेखण पहले सबसे अधिक समय की मांग की थी और में गलत कदम इन तकनीकों का कार्यांवयन । इस स्वचालन अब दर-संरेखण से निर्माण की प्रक्रिया के कदम सीमित बदलाव lithographic को ही लेखन । हालांकि इस प्रोटोकॉल पीपीएल के लिए इस संरेखण प्रक्रिया के आवेदन को दर्शाता है, फ्रेमवर्क ऐसे लिपिड के रूप में SPL तकनीक की एक संख्या के लिए लागू किया जा सकता है-DPN26 और मैट्रिक्स-लिथोग्राफी27 सहायता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित भविष्य उत्प्रेरक जांच प्रणाली । 28

Disclosures

संरेखण एल्गोरिथ्म और सॉफ्टवेयर द्वारा विकसित किया गया है, और स्वामित्व के लिए कर रहे हैं, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय । यह http://www.click2go.umip.com/पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध है ।

Acknowledgments

लेखक ब्रिटेन के इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान refs सहित स्रोतों की एक किस्म से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । ep/K011685/1, ep/K024485/1) और झारखंड के लिए एक स्नातक की छात्राओं; Leverhulme ट्रस्ट (आरपीजी-2014-292); वेलकम ट्रस्ट संस्थागत रणनीतिक सहायता कोष (105610/जेड/14/ ब्रिटिश परिषद (२१६१९६८३४); और मैनचेस्टर के विश्वविद्यालय के एक विश्वविद्यालय के लिए अनुसंधान संस्थान (ऊमरी पंप भड़काना कोष) और एक राष्ट्रपति डॉक्टर के लिए छात्रवृत्ति SW । डॉ एंड्रियास Lieb (Nanosurf एजी) द्वारा तकनीकी सहायता भी आभार स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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References

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