Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56967
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 4, 2, 3, 1
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry, University of Manchester, 2School of Engineering, University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering, University of Manchester, 4School of Science and Technology, Nottingham Trent University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour étendus balayage sonde nanolithographie activé par l’alignement itératif de sonde tableaux, ainsi que l’utilisation de modèles lithographiques pour études sur les interactions de surface cellulaire.

Abstract

Microscopie à sonde a permis la création d’une variété de méthodes pour la fabrication de haut en bas (« additive ») constructive des caractéristiques de l’échelle nanométrique. Historiquement, un inconvénient majeur de lithographie de sonde à balayage a été l’intrinsèquement faible débit des systèmes de sonde unique. Cela a été abordé par l’utilisation de tableaux de plusieurs sondes pour permettre un débit accru nanolithographie. Afin de mettre en œuvre ce nanolithographie parallélisée, l’alignement précis des tableaux de sonde avec la surface du substrat est essentiel, afin que toutes les sondes de prendre contact avec la surface simultanément lorsque lithographique répétition commence. Ce protocole décrit l’utilisation de la lithographie de stylo de polymère pour produire des dispositifs nanométriques sur les zones taille centimètre, facilitées par l’utilisation d’un algorithme pour l’alignement rapide, précise et automatisée des baies de la sonde. Ici, nanolithographie de thiols sur substrats or illustre la génération de fonctions avec grande uniformité. Ces modèles sont ensuite fonctionnalisés avec la fibronectine pour utilisation dans le cadre des études de morphologie axés sur la surface cellulaire.

Introduction

Progrès en nanotechnologie sont tributaire de l’évolution des techniques capables de fabriquer des dispositifs nanométriques sur surfaces efficace et fiable. 1 , 2 Toutefois, générant ces dispose de manière fiable sur de grandes surfaces (plusieurs cm2) et à un coût relativement faible est un effort non négligeable. La plupart des techniques existantes, dérivés de l’industrie des semi-conducteurs, dépendent de la photolithographie ablative pour fabriquer des matières « dures ». Plus récemment, des techniques lithographiques, dérivés de la microscopie de sonde (SPM) sont apparus comme une approche pratique et polyvalente pour le prototypage rapide des conceptions de l’échelle nanométrique. 3 techniques axées sur le SPM peuvent facilement et rapidement « écrire » n’importe quel modèle défini par l’utilisateur. Le plus connu d'entre eux est dip-pen nanolithographie (DPN), mis au point par Mirkin et al.,4 où une sonde de balayage est utilisée comme une « plume » de transférer un « ink » moléculaire à la surface, produisant des caractéristiques d’une manière analogue à l’écriture. Dans des conditions ambiantes, comme une sonde est analysée à travers une surface, les molécules « ink » sont transférés à la surface via un ménisque de l’eau qui se forme entre la sonde et la surface (Figure 1). DPN permet donc la déposition de nanolithographic d’un large éventail de matériaux, y compris ceux « en douceur » tels que les polymères et les biomolécules. 5 techniques connexes à l’aide de sondes conçues avec des chaînes pour livraison fluide, diversement appelé « nanopipettes » et « nano-stylos », ont également été signalés. 6 , 7 , 8

Le principal obstacle à une application plus large de la lithographie de SPM-dérivé est le débit, car elle exige un temps excessivement long aux zones de modèle à l’échelle du centimètre avec une seule sonde. Premiers efforts visant à résoudre ce problème, axé sur la parallélisation des DPN axée sur le cantilever, avec « one-dimensional » et « bidimensionnelle » tableaux de sonde (2D) signalés pour la lithographie de zones taille centimètre. 5 , 9 Toutefois, ces baies en porte-à-faux sont produites par des méthodes de fabrication de plusieurs étapes relativement complexes et sont relativement fragiles. L’invention de la lithographie de stylo de polymère (PPL) a abordé cette question en remplaçant les encorbellements SPM standards avec un tableau 2D de doux siloxane élastomère sondes collé sur une lame de verre. 10 cette configuration simple sonde diminue considérablement le coût et la complexité de la structuration des grandes surfaces, ouvrant la nanolithographie à un large éventail d’applications. Cette architecture en porte-à-faux-libre a également été élargie à la pointe en dur tendre-printemps de lithographie,11 , qui prévoit un hybride de soutien élastomère souple avec embouts silicone dur donnant une résolution améliorée par rapport aux modèles fabriqués à l’aide de doux conseils d’élastomère.

Un facteur crucial dans l’exécution de ces technologies de tableau 2D, c’est que le tableau de la sonde doit être exactement parallèle à la surface substrat afin que lorsque lithographie est utilisée, toutes les sondes en contact avec la surface simultanément. Même un petit décalage peut provoquer une grande différence dans la taille d’un côté du tableau à l’autre, puisque certaines sondes entrera en contact avec la surface plus tôt au cours de la descente du tableau, tandis que d’autres viendront en contact plus tard ou pas du tout. 12 alignement exact est particulièrement important avec le PPL en raison de la déformabilité des sondes élastomère souple, où les sondes de contact avec la surface plus tôt seront compressés, laissant une plus grande empreinte sur la surface.

Les premiers travaux sur PPL employé contrôle purement visuel pour guider le processus d’alignement, en utilisant une caméra montée au-dessus du tableau d’observer la déformation des sondes pyramidales, comme ils ont été mis en contact avec la surface. 10 l’alignement a été jugé en observant quel côté des sondes est entré en contact avec la surface de tout d’abord, puis en réglage de l’angle et en répétant la procédure de manière itérative jusqu'à ce que la différence de contact de chaque côté de la sonde a été Impossible de distinguer à le œil. Comme cette procédure d’alignement s’appuie sur une inspection visuelle subjective par l’opérateur, la reproductibilité est faible.

Par la suite, une approche plus objective a été développée, composé d’un capteur de force monté sous le substrat pour mesurer la force appliquée au contact de la sonde sur la surface. 12 alignement a été ainsi obtenu en ajustant les angles d’inclinaison afin de maximiser la force exercée, qui a indiqué que toutes les sondes étaient simultanément en contact. Cette méthode a montré que l’alignement à 0,004 ° de la surface parallèle était possible. Cette « force feedback nivellement » a maintenant été implémentée dans des systèmes entièrement automatisés dans deux rapports indépendants. 13 , 14 fois utiliser une triade de capteurs de force montés sous le substrat ou au-dessus du tableau et mesurer la quantité de force exercée lors du contact entre les baies de la sonde et la surface. Ces systèmes donnent de haute précision, rapports des désalignements de 0,001 ° sur une échelle de longueur de 1 cm, le14 ou le ≤ 0,0003 ° sur 1,4 cm.13 ces systèmes d’alignement automatisé prévoient aussi grandes économies en temps opérateur et temps global pris pour compléter le procédé de lithographie.

Une application majeure de fabrication surface haut débit a permis par cette technologie est la génération de substrats de culture cellulaire. Il est maintenant bien établi que phénotype cellulaire peut être manipulé en contrôlant l’interaction initiale entre les cellules et les caractéristiques de la surface, et que cela peut être amélioré à l’échelle nanométrique. 15 précisément, balayage méthodes lithographie de sonde ont démontré qu’une méthode facile pour produire une variété de surfaces nanofabriquées pour de telles expériences de culture cellulaire. 16 par exemple, les surfaces présentant des motifs nanométriques de monocouches auto-assemblées et matrice extracellulaire protéines basé sur un modèle par PPL et DPN ont été utilisés pour étudier le potentiel des matériaux nano-modifiée en matière induit la différenciation des cellules souches. 17

Ce protocole décrit l’utilisation d’une force atomique mis à jour le microscope (AFM) système qui permet de grande surface PPL. Nous détaillons la détection de la force à l’aide de plusieurs capteurs de force comme le moyen de déterminer la sonde-surface de contact, avec un algorithme qui automatise le processus itératif d’alignement. Fonctionnalisation subséquente de ces modèles avec la fibronectine de protéine de matrice extracellulaire et la culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSAH) sont décrits, comme une démonstration de surfaces fabriqués en PPL, appliqué pour la culture cellulaire.

Protocol

1. fabrication du tableau stylo PPL

  1. Pour préparer le mélange de copolymère polydiméthylsiloxane (PDMS) :
    1. Ajouter 10 µL de la platine (0) - 1, 3 - divinyl-1,1,3,3-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane solution complexe et 172 µL de 1,3,5,7-tétraméthyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane à 250 g de (7-8 % w/w vinylmethylsiloxane)-diméthylsiloxane co-polymère. Mélanger ces composants soigneusement sur un mélangeur rotatif pendant 7 jours afin d’assurer un mélange homogène.
      ATTENTION : platine (0) - 1, 3 - divinyl-1,1,3,3-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
    2. Ajouter 0,5 g de (25-35 % w/w methylhydrosiloxane)-diméthylsiloxane co-polymère à une portion de 1,7 g de mélange de l’étape 1.1.1 pour une pesée en bateau et bien mélanger avec une spatule.
    3. Une solution contenant ce mélange en transférant à un dessiccateur à vide et en exposant le mélange à basse pression (200 mTorr, 0,3 mBar) pendant 20 min jusqu'à ce que toutes les bulles de gaz sont soient dissipées.
  2. Place une lame de verre de 13 x 13 mm dans un flacon Garni vis en plastique remplie de 20 mL 2-propanol, puis placez le flacon dans un bain ultrasonique pendant 10 min enlever tout débris. Laver les diapositives en immergeant les diapositives de la fresh 2-propanol (100 mL) et sécher sous un courant d’azote gazeux.
  3. Place un silicium maîtriser18 dans un plat de Pétri de 4 cm de diamètre et ajouter suffisamment dégazé mélange prépolymère PDMS (à l’étape 1.1) jusqu'à entièrement couvert. En règle générale, il faut 100 µL pour un master de 20 x 20 mm. Placez le master avec le mélange prépolymère dans un dessiccateur sous vide. Dégazer le polymère pour un autre 5 min pour enlever les bulles de gaz formés lors du transfert du mélange. Le traitement au plasma2 O des lames de verre (étape 1.4 ci-dessous) doit être effectué alors que le dégazage se déroule.
  4. Traiter les carrés de verre avec du plasma de2 O (600 mTorr) à la puissance maximale RF pendant 1 min pour éliminer toute contamination organique et générer une couche uniforme d’oxyde sur le verre pour l’adhérence de l’élastomère. 19 utilisation du plasma traité diapositives immédiatement à l’étape suivante.
  5. Placer soigneusement la lame de verre carrés (de l’étape 1.4) sur le prépolymère sur le maître (de l’étape 1.3) avec le côté décapés plasma vers le bas. Appuyer doucement la lame de verre dans le masque de silicium pour enlever tout l’air emprisonné tout en assurant qu'une couche uniforme de PDMS est pris en sandwich entre le capitaine et la diapositive.
  6. Place le tableau PDMS sandwich par dessus pas dans une boîte de Pétri avec du silicium maîtriser au fond (c'est-à-dire, avec le dos de la lame vers le haut) et placer le plat dans un four à 70−80 ° C 24−48 h traiter thermiquement le PDMS.
  7. Retirer le tableau guéri du four et laisser refroidir pendant 15 min, puis avec une lame de rasoir avec précaution Retirez tout excès PDMS à l’arrière et les côtés du verre glissent et utilisent un courant d’azote sec pour souffler les débris PDMS.
    Remarque : attention de ne pas rayer le maître de silicium avec la lame de rasoir, car cela pourrait endommager le revêtement antiadhésif.
  8. Caler une lame de rasoir dans le coin de la baie sur une profondeur de 1 mm et dégager délicatement le tableau mis à part le maître. Effectuer cette opération en une seule action de levage continue ; ne laissez pas les baies à se replier sur le maître.
  9. Soigneusement coupée et grattez 0,5 mm du PDMS sur les bords du tableau avec une lame de rasoir. Utilisez un courant d’azote sec pour souffler les débris PDMS.
    Remarque : Il peut être plus facile d’exécuter cette étape de la coupe sous le stéréoscope ou une loupe. Attention de ne pas rayer le maître de silicium avec la lame de rasoir, car cela pourrait endommager le revêtement antiadhésif.

2. préparation et montage de substrat de tableau

  1. Générer une surface hydrophile sur le tableau de la sonde par traitement au plasma O2 :
    1. Place le tableau de stylo PPL dans une boîte de Pétri en chambre plasma puis appliquer le vide à 600 mTorr. Mettre en marche le générateur de plasma (réglage maximum) pendant 30 s.
    2. Libérer le vide, retirez le tableau et vérifiez son hydrophilicité en supprimant 20 µL d’eau déionisée dans le tableau et observer s’il y a même de répandre de l’eau sur toute la surface. Si cela ne fonctionne pas, sous réserve du tableau à un deuxième tour de traitement au plasma. Ensuite, séchez le tableau soigneusement avec un courant de gaz d’azote sec.
  2. À l’aide de ruban adhésif double-face carbone, fixer le tableau au milieu de la titulaire de la sonde. Fixer le support de sonde sur le support cinématique de l’AFM (Figure 2).
  3. Pour alimenter le tableau PPL avec 16-mercaptohexadecanoic acide (MHA) (« encrage ») :
    1. Préparer 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) solution en dissolvant 8,6 mg dans 30 mL d’éthanol dans un tube et placer dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes dissoudre complètement le composé.
      ATTENTION : 16-mercaptohexadecanoic acide est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
    2. À l’aide d’une micropipette, déposer 20 goutte µL de la solution MHA sur le tableau. Eviter tout contact des pointes de pipette avec les baies. Laisser se propager tout au long de la baie, et ensuite laisser l’éthanol s’évapore dans des conditions ambiantes.
      Remarque : Le tableau PPL peut alternativement être signé après que l’alignement a eu lieu. 10
  4. Une fois la solution MHA a séché, montez le support de sonde avec le tableau PPL sur l’AFM.

3. préparation des substrats or pour le PPL.

  1. Substrats or peuvent être achetés ou faits maison par thermique ou électrons dépôts du faisceau et sont construits d’une couche d’adhérence titane nm 2 suivie de 20 nm d’or sur une plaquette de silicium ou de verre. 18
  2. Si nécessaire, nettoyer les substrats par traitement au plasma oxygène en utilisant les paramètres décrits à l’étape 1.4.
  3. Placez le substrat d’or au milieu de la scène d’échantillon AFM et fixez-la avec du ruban adhésif autour des frontières du substrat (Figure 2). Ajuster la scène à la bonne hauteur, comme indiqué dans la notice d’utilisation du fabricant, en utilisant le z-contrôleur d’axe.

4. automatique alignement du tableau de stylo

  1. Ouvrez et exécutez le contrôleur de stage programme d’installation (SetupNSF.exe) sur l’ordinateur de réinitialiser (« zéro ») tous les axes et angles à un précalibré point zéro, puis utiliser la scène x/y-axe manette console pour passer le substrat à l’alignement souhaité / position d’impression. Pour des résultats optimaux, le substrat doit être placé près du centre de la scène, entre les capteurs de force de la scène.
    Remarque : dans certains modèles d’ordinateur, le x/y-signal d’axe contrôleur USB peut interférer avec celui de la z-contrôleur d’axe. Si cela se produit, débrancher le x/y-contrôleur d’axes USB câble après cette étape. Il devrait ensuite être reconnectée après la procédure d’alignement (étape 4.7).
  2. Basculer le levier de dégagement du stade pour libérer la scène de l’échantillon et activer la triade des capteurs de force, comme indiqué par les instructions du fabricant de l’AFM. Laisser les capteurs de force s’équilibrer pendant au moins 15 min. Pour des résultats optimaux, permettent de 30 à 50 min.
  3. Augmentez la hauteur de l’axe z pour mettre le tableau en étroite proximité avec le substrat en observant visuellement le tableau de la sonde et la surface.
    Remarque : Plus le tableau est à la surface, les moins d’itérations sont nécessaires pour le processus d’alignement, économisant ainsi du temps.
  4. Ouvrir/exécuter le programme d’alignement automatique (Auto alignement v16.exe) et entrez les paramètres pertinents de l’alignement dans le programme.
    1. Entrez la valeur du paramètre désiré « Angle escalier », en général de 0,15 °. Ce paramètre est l’angle de décalage de l’angle « optimal » pour chaque axe est déterminée par le programme. Définissez ce paramètre entre 0,1 et 0,2 °, comme les angles inférieurs à cette plage n’aboutissent pas à une différence de force clairement décelables à l’approche des sondes à la surface.
      Remarque : Logiciel accepte des valeurs au millièmes (c'est-à-dire, 1 x 10-3 °). Par exemple, pour 0,15 °, les utilisateurs devraient entrer '150. »
    2. Entrer dans l’étape de grossiers souhaitée ' valeur du paramètre, en général 0,6 µm. Ce paramètre est la taille de palier d’axe z utilisée par la phase approche les sondes dans l’alignement initial rugueux. Définissez ce paramètre entre 0,2 et 1 µm. Larger étape diminution des tailles le temps pris par le processus d’alignement, mais réduire la précision de l’alignement et augmenter l’usure sur les sondes.
      Remarque : Logiciel accepte des valeurs d’étapes grossiers en micromètres. Par exemple, pour 0,6 µm les utilisateurs doivent entrer « 0,6'.
    3. Entrez la valeur du paramètre « Belle étape » désirée, généralement de 0,2 µm. Ce paramètre est la taille de palier d’axe z utilisée pour le réglage fin de l’alignement optimal. Pour la plupart des applications, affectez à ce paramètre entre 0,1 et 0,4 µm. valeur étape de taille va diminuer la quantité de temps nécessaire pour que le processus d’alignement mais réduisent la qualité de l’alignement.
      Remarque : Logiciel accepte des valeurs de mesures fines en micromètres. Par exemple, pour 0,2 µm, les utilisateurs devraient entrer « 0,2 ».
    4. Configurer le « chemin du fichier Excel » et joindre une copie non modifiée du fichier tableur fourni modèle en utilisant l’icône « dossier », accédant à l’emplacement du fichier, en appuyant sur « OK ». Ce fichier contient les données brutes et calculées qui sert à déterminer les angles d’inclinaison stade optimum de la scène.
  5. Ouvrir/exécuter le logiciel de contrôle d’AFM. Accédez à la composante de spectroscopie de ce programme en cliquant sur le bouton « spectroscopie » (selon les instructions du fabricant) et définissez l’AFM scan tête axe des z à osciller de 10 µm de plus de 100 ms, avec un temps de pause de 250 ms, puis pour rentrer à 10 µm plus de 100 ms avec un temps de pause de 250 ms (Figure 3).
  6. Comme la tête de l’AFM est oscillante, cliquez sur le bouton « start » du logiciel alignement pour commencer le processus d’alignement automatisé. Lorsque le programme est en cours d’exécution, le logiciel est écrit et lit des données dans le fichier décrit dans l’étape 4.4.4.
    Remarque : L’alignement dure entre 30 min et 3 h selon la position de l’étape initiale définie à l’étape 4.3 et configuration du logiciel qui ont été saisis à l’étape 4.4.
    ATTENTION : Les consoles de contrôleur de scène sont toujours actifs au cours du processus d’alignement - ne pas les utiliser pendant le processus d’alignement car il interférerait avec l’alignement.
  7. Fin de l’alignement, la zone de feu vert « Alignement complΘtΘ » sur le logiciel d’alignement (de l’étape 4.4) s’allume. Lorsque cela se produit, cliquez sur le bouton « STOP » sur l’interface utilisateur pour terminer le processus d’alignement.
  8. Inspecter les graphiques dans le fichier de modèle de feuille de calcul pour une corrélation entre des points de données enregistrées et la ligne d’ajustement qui est généré par le logiciel. Voir les résultats représentatifs pour obtenir des exemples d’une bonne corrélation, avec des valeurs de2 R > 0,99. Si l’alignement est infructueuse, remplacer le tableau de la sonde avec un tableau nouvellement préparé (étape 2) et répétez l’alignement (étape 4.4).
  9. Déplacer la scène vers le haut dans le z-axe à l’aide de la console du contrôleur stade de cet axe. La scène doit être déplacée en incréments de 500 nm jusqu'à ce que le contact peut être observée de la caméra vue de dessus de l’AFM. Contact entre le tableau et le substrat peut être observée comme un « point blanc » de contraste élevé au sommet des pyramides sonde individuels.
  10. À ce stade, cliquez sur le bouton « stop » sur le logiciel de contrôle d’AFM pour arrêter le programme de spectroscopie de l’étape 4.5. Cela se rétracte le tableau de 10 µm, ce qui laisse 10 µm de prolongement de l’axe z possible. Vérifier l’image de la caméra vue de dessus du manuel de vol pour s’assurer que les sondes ne sont pas en contact avec le substrat.

5. lithographie de stylo polymère (PPL)

  1. Accédez à la composante de lithographie du logiciel de contrôle en cliquant sur « Lithographie » sur le logiciel de contrôle. Choisir le z-modulation mode de fonctionnement et importer un matricielles (bitmap) ou vector image qui sera utilisée comme le modèle de la lithographie. Afin de générer les caractéristiques indiquées dans les résultats représentatifs, utiliser une bitmap composé de 20 x 20 pixels noirs (voir documents supplémentaires), correspondant à la lithographie d’une grille de 20 x 20 points par sonde sur le tableau PPL.
  2. Entrez les paramètres de la lithographie dans la fenêtre « Importation graphique Pixel » du logiciel contrôleur AFM.
    1. Configurer la « taille » de la pattern doit être généré, par exemple, 40 µm de longueur et largeur. Ces paramètres indiquent la largeur et la longueur sur laquelle l’image dans l’image bitmap sera mise à l’échelle. Pour générer les caractéristiques indiquées dans les résultats représentatifs, utilisez une largeur et une longueur de 40 µm dans les deux dimensions.
    2. Définir le « origine » du modèle doit être généré à 25 µm sur l’axe x et de y . Ces paramètres déterminent le centre de l’image par rapport au centre de l’AFM de x/y-axes. Régler ces paramètres afin d’éviter la région de la surface où les sondes ont été en contact au cours du processus d’alignement.
    3. Définir l’impression « Paramètres ». Ces valeurs déterminent comment les sondes doivent être prolongée (c.-à-d. mis en contact avec la surface) en réponse à chaque pixel de l’image bitmap.
      1. Sélectionnez dans le menu déroulant « Modulation Abs Z Pos » et « Simplifier à » deux couches. Ce mode indique à l’AFM d’étendre les sondes par une distance absolue déterminé par seulement deux résultats, « Black (0) » ou champs « Blanc (1) ».
      2. Définissez les valeurs dans les champs de « White (1) » et de « Black (0) » à 5 et -5 µm, respectivement. Ces valeurs déterminent la distance les sondes doivent être déplacés en réponse à un pixel noir ou blanc sur l’image bitmap et sont généralement placés entre 3 et 5 µm pour « Noir » (c.-à-d., étendre les sondes vers le bas de cette distance par rapport au zéro point de cet axe) et -3 à-5 µm pour « White » (c'est-à-dire, retirer les sondes vers le haut de 3 à 5 mm par rapport au point zéro).
        Remarque : Ces distances représentant supposent qu’une extension de 5 µm se traduit par les sondes entrant en contact avec la surface et donc la génération d’une fonction, alors qu’un retrait de 5 µm soulève les sondes à distance de la surface d'où aucun contact. Z-extension affecte la fonction taille en déterminant l’étendue de la sonde de contact avec le résultat de la surface, plus les extensions dans les sondes étant enfoncé davantage dans la surface, résultant en plus grandes fonctionnalités. 10
      3. Cliquez sur le bouton « OK » pour implémenter ces paramètres et fermer la fenêtre.
  3. Entrer dans le « temps de pause » dans la fenêtre de lithographie du logiciel de contrôle AFM, typiquement de 1 s. Ce paramètre détermine la longueur de temps que les sondes restent en position déployée « Noir », qui est généralement située entre 0.1 et 10 s.
    Remarque : Les temps de pause plus longs donne de taille plus longs en raison de la plus grande quantité de MHA transporté à la surface d’or. On trouvera des précisions sur le contrôle de la taille des éléments générés dans d’autres rapports. 20
  4. Préparer le boîtier de contrôle atmosphérique.
    1. Abaissez la chambre d’isolement atmosphérique sur l’AFM et ouvrir/exécuter le logiciel de contrôle atmosphérique fourni par le fabricant (MHG_control.exe).
    2. Configurez le logiciel de contrôle atmosphérique pour maintenir une humidité relative de 45 %, une température de 25 ° C et un échange d’atmosphère « Débit » de 500 mL en entrant ces valeurs dans le logiciel. Cliquez sur « Utiliser » pour implémenter les paramètres. Le module de contrôle atmosphérique commence alors à pomper de l’air humidifié dans la chambre.
      Remarque : Des niveaux plus élevés d’humidité donne dans les grandes tailles de caractéristique due à la formation d’un ménisque de l’eau plu généré entre la surface et les tableaux de stylo. 21 cette valeur est généralement définie entre 40 et 60 %. Le débit est généralement défini entre 300 et 500 mL. Flux plus importants permettent d’atteindre plus rapidement le niveau d’humidité désiré mais est moins précis. Les résultats représentatifs utilisent un débit de 500 mL pour la génération initiale de l’humidité et est réduite à 300 mL en arrivant à l’humidité souhaitée, afin de maintenir un niveau stable et précis au cours de la lithographie.
  5. Une fois l’humidité souhaitée obtenue, démarrer la séquence lithographique en appuyant sur le bouton « Démarrer » sur l’interface du logiciel.
  6. À l’issue de la lithographie, utilisez la console de contrôleur de scène axe z pour déplacer le substrat de la matrice en rétractant la scène de 500 µm. Supprimez la chambre d’isolement atmosphérique de sa monture.
  7. Basculer le levier de dégagement du stade pour verrouiller la scène de l’échantillon et de désactiver les capteurs de force, comme l’indique le manuel de vol du fabricant, puis retirer le substrat de la scène.

6. visualisation du modèle

  1. Modèles peuvent être visualisées à l’aide de l’une des méthodes suivantes, latéral force eau-forte chimiques ou la microscopie de sonde à balayage.
  2. Balayer la surface à motifs sur AFM avec mode de force latérale à l’aide de cantilever mode de contact pour examiner les caractéristiques non destructive.
    Remarque : La microscopie à force latérale peut être utilisée comme une méthode non destructive de visionner les caractéristiques produits par lithographie de polymère de plume ; Cependant, en utilisant cette méthode, seulement une zone relativement petite peut être visualisée (typiquement 100 x 100 µm).
  3. Étant donné que le député provincial déposé peut agir comme une résistance d’etch, gravure chimique peut être utilisée pour enlever la médaille d’or des zones non texturés. Les zones qui en résulte ne peuvent puis être visualisés par microscopie optique, ce qui signifie qu'une vaste zone peut être visualisée à la fois. 18
    NOTE : Substrats qui sont gravés de cette façon ne peuvent ensuite servir pour les expériences de culture de cellules suivantes décrites ci-dessous.
    1. Séparément, préparer les solutions aqueuses de thiourée 40 mM, nitrate de fer (III) de 27 mM et 100 mM d’acide chlorhydrique. Préparer le gel de mordançage en mélangeant 5 mL de chacune de ces trois solutions. Fraîchement mélanger avant chaque utilisation. 22
      ATTENTION : thiourée, nitrate de fer (III) et l’acide chlorhydrique sont toxiques. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
    2. Transvaser le substrat à motifs dans une boîte de Pétri et pipette solution etchant suffisante dans le plat pour couvrir la surface du substrat (généralement 10 mL). Garder le substrat immergé pendant 4-5 min vers etch 15 nm de l’or (à un taux approximatif de 3 nm/min).
    3. Une fois la gravure terminée, retirer le substrat et rincer soigneusement à l’eau puis sécher avec un courant d’azote.
      Remarque : L’achèvement du processus de gravure est déterminé par l’épaisseur d’or surface obtenue (étape 3.1) associée à la vitesse de gravure spécifiée (étape 6.2.2).
    4. Examinez les fonctionnalités or gravées sous microscopie optique lumineux. Les fonctionnalités d’or restantes qui restent doivent apparaître correspondantes au modèle qui a été imprimé (de l’étape 5.2). Si la totalité de la surface apparaît homogène, cela indique qu’il restait une importante quantité d’or et l’étape de gravure (étape suivante 6.2.2) doit être répété pendant 1-2 min.

7. modèle fonctionnalisation avec la fibronectine

  1. Plonger les substrats à motifs dans une solution de 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) dans l’éthanol pendant 1 h. laver le substrat trois fois avec de l’éthanol et sécher sous un courant d’azote. Cette étape Atotech les zones or supprimées.
    ATTENTION : hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
  2. Submerger les substrats dans une solution aqueuse de2 Co (NO3) pendant 5 min de 10 mM. Ensuite, retirez les substrats de la solution, laver trois fois avec de l’eau ultrapure et sèche sous un courant d’azote sec.
    ATTENTION : Co (NO3)2 est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
  3. Plonger le substrat dans une solution de 50 µg/mL de la fibronectine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber à 4 ° C pendant 16 h. laver le substrat trois fois avec du PBS, puis sécher le substrat sous un courant d’azote sec.
    Remarque : La fibronectine est liée à MHA fonctionnalisés au moyen de la chélation du Co (II) par les groupes de terminal acide carboxylique la MHA. La fibronectine lie ensuite à Co (II) via son domaine de liaison au collagène. 23
  4. Si vous le désirez, visualiser la fibronectine de surface-bondissent par étiquetage avec des anticorps fluorescents :
    1. Appliquer une solution de 2 mL d’anticorps primaire d’anti-fibronectine lapin non conjuguée au 1/100 à 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS à la surface et incuber à 4 ° C pendant 16 h. aspirer le surnageant et laver trois fois avec du PBS.
    2. Submerger le substrat dans une solution de 2 mL de conjugué fluorescent anti-lapin anticorps secondaire (à la dilution de spécifiée par le fabricant, 2 gouttes/mL) dans 5 % (p/v) de BSA dans du PBS, couvrir de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h. aspirer le surnageant et laver trois fois avec du PBS.
    3. Enregistrer les images de microscopie d’épifluorescence des fonctionnalités à l’aide d’un microscope à fluorescence selon les instructions du fabricant, avec un filtre d’excitation la valeur 594 nm.

8. cell culture sur surfaces nanofabriquées

  1. Préparer une suspension de CSM bien caractérisé qui se situent entre le 4ème et 6ème passage. 24
    1. Suspendre une fiole confluente de cellules en rinçant une fois 10 ml de PBS, dissocier les cellules adhérentes en ajoutant 5 mL de trypsine/EDTA dans le flacon de culture tissulaire T75 et incuber la fiole dans une chambre humidifiée à 37 ° C, additionnée de 5 % de CO2 jusqu'à 5 min jusqu'à 90 % o les cellules de f sont détachés de la surface.
    2. Par la suite, ajouter 6 mL de milieux de culture fraîche contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) dans la fiole et brièvement rincer le ballon avec les médias ajoutés. Transfert en suspension de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 g à 25 ° C pendant 5 min.
    3. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 3 mL de milieux de culture fraîche.
    4. Compte de la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre25 et ajuster la densité de la suspension cellulaire à 2 x 104 cellules/mL par l’addition d’un volume approprié de milieux de culture.
  2. Les semences des cellules sur des substrats à une densité de 104 cellules/cm2.
    1. Couper le substrat en 1 x 1 cm2 avec scribe diamant et placez-le dans un puits dans la plaque de culture de tissu de 12 puits.
    2. Pipette de 2 mL de suspension cellulaire dans les milieux de culture (de l’étape 8.1.4) dans le puits et incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° C, additionnée de 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Après la croissance des cellules sur les patrons, analyser l’ampleur de la fixation des cellules et qui se propage par immunofluorescence :
    1. Retirez les supports et laver les substrats une fois avec du PBS. Fixer les cellules avec 2 mL d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (préalablement chauffé à 37 ° C) pendant 20 min dans la hotte et les laver trois fois avec du PBS.
      ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. S’il vous plaît lire FS avant de travailler avec cette solution. Équipement de sécurité est obligatoire lors de la manipulation du produit chimique.
    2. Permeabilize les cellules avec 2 mL d’une solution de détergent de 0,5 % (voir la Table des matières) dans du PBS pendant 15 minutes, puis laver trois fois avec du PBS.
    3. Submerger le substrat dans 2 mL d’une solution d’anticorps primaire de lapin non conjugués anti-fibronectine à une dilution de 1/100 avec 5 % (p/v) : BSA dans du PBS et incuber à 4 ° C pendant 16 heures, puis laver trois fois avec 0,1 % (v/v) Tween 20 dans PBS (PBST).
    4. Par la suite submerger le substrat dans 2 mL d’une solution de fluorescent conjugués anticorps secondaire anti-lapin (dilué avec 5 % (p/v) BSA dans du PBS à dilution spécifiée par le fabricant, à 2 gouttes/mL), couvrir de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h, puis laver trois fois avec 0,1 % PBST.
    5. Pour étiqueter les filaments d’actine, submerger 2 mL de phalloïdine fluorescent conjuguée à une dilution de 1/250 en PBS, couvrir de papier d’aluminium et incuber à 4 ° C pendant 30 min puis laver trois fois avec du PBS.
    6. Simultanément, détachant des noyaux cellulaires et monter le substrat en appliquant une goutte de montage moyen contenant DAPI et recouvrir d’un lamelle couvre-objet.
  4. Visualiser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence selon les instructions du fabricant, avec des filtres d’excitation de 365 nm pour les noyaux (DAPI), 488 nm pour l’actine F et 594 nm pour la fibronectine.

Representative Results

Pour vérifier si l’alignement automatisé avait réussi, les graphiques tracés à partir des données de l’alignement (dans la feuille de calcul de l’étape 4,8) ont été examinés. Lorsque le processus d’alignement avait réussi les deux parcelles, correspondant à l’angle par lequel la scène de l’échantillon a été inclinée le long des axes θ et φ, montrent une série en hausse et décroissant de points de données. Dans chacune des parcelles, deux ajustements linéaires des points de données ont montré une intersect bien défini « peak » indiquant le maximum de z-extension et l’angle correspondant au cours de laquelle l’alignement a été obtenue (Figure 4 a et 4 b). Ce processus est répété quatre fois (c'est-à-diredeux fois pour chaque axe) et tracés comme un ensemble de quatre coordonnées. L’intersection de chaque paire de coordonnées montre ainsi les angles globale optimales (Figure 4). 13 dans le cas où l’alignement n’a pas réussi, on peut observer que leur correspondant θ et φ angle parcelles ne donnent pas d’ajustements linéaires de bonne qualité, ou ne se croisent pas (Figure 5). Ces alignements ayant échouées sont généralement à la suite les baies étant mal entretenue ou monté sur le support de sonde (étapes 1.7, 1.8 et 2.2). Dans ces cas, les tableaux ont été rejetées et un nouveau préparé et monté (étapes 1 et 2), et le processus d’alignement répété (étape 4).

Après alignement réussie et lithographie avec MHA par PPL, substrats or à motifs ont été ensuite imagés à l’aide de la microscopie de force latérale afin de déterminer si le dépôt a eu lieu. Un examen de surface plus grand des surfaces imprimées a été également réalisé par microscopie optique des substrats après l’attaque de l’or non protégé par le thiol déposé (Figure 6 et Figure 7). Cependant, les modèles gravées ne peuvent être utilisés pour plus de fonctionnalisation et ne doivent être utilisés que pour confirmer les patrons sur des échantillons représentatifs d’un lot de substrats de surface imprimées. Si les modèles gravées indiquent des zones blanches correspondant à un enclos individuel (Figure 8), ce résultat indique que la production de tableaux de la sonde n’a pas été faite avec succès, et que certaines sondes sont manquantes ou endommagées. Ce manque d’homogénéité des sondes peut être due à l’utilisation d’un vieux maître où le revêtement perfluorés a usé (étape 1.3), ce qui entraîne certaines sondes arrachés lorsque le tableau est séparé du maître. Dans ces cas, on utilisera un nouveau maître. Le résultat peut également être due à la présence d’air, bulles emprisonnées entre le verre support et le capitaine (étape 1.5), ou si le tableau de la sonde ne était pas proprement séparé du maître après durcissement (étape 1.8).

Images de microscopie fluorescente des surfaces fibronectine fonctionnalisée couvés CSM ont également été recueillis (Figure 9). En général, tous les substrats sont demeurés stables dans l’environnement de culture in vitro et les cellules ont adhéré et adapté à leur morphologie pour les patrons imprimés en cas de petit isolé 20 x 20 gamme de fonctionnalités.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la lithographie de stylo de polymère montrant encre moléculaire transport via un ménisque de l’eau sur l’embout de sonde. (A) vue latérale et (B) vue du tableau stylo polymère indiquent que lorsque le tableau de la sonde et la surface substrat sont parfaitement alignés, toutes les sondes entrent en contact avec la surface simultanément, résultant en lithographie parallélisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Diagramme schématique de la lithographie de stylo de polymère mis en place (A) vue latérale élargi d’expérimental mis en place où le tableau préparé sonde est attaché pour sonder le titulaire et monté au scanner de l’AFM. Le substrat est placé sur la scène, au-dessous de laquelle se trouvent les trois capteurs de force. (B) une représentation de l’instrumentation Assemblée, montrant la tête de balayage AFM par rapport à la scène de l’échantillon. Vue du dessous (C) montrant l’emplacement de capteur de force. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Représentation schématique illustrant le programme de la spectroscopie pour la procédure d’alignement. Le scanner de l’AFM est défini pour déplacer les sondes vers l’échantillon par une distance de 10 µm à 100 ms, qui s’est tenue en position pendant 250 ms, suivie d’une rétraction de 10 µm à 100 ms et puis qui s’est tenue pendant 250 ms en position rétractée. La requête est ensuite répétée tout au long du processus d’alignement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Graphiques illustrant un alignement réussi. Graphiques de position z contre les angles d’inclinaison (A) θ et φ (B) pour une harmonisation réussie, où ● indique les valeurs réelles mesurées et + le meilleur ajustement avec la méthode des moindres carrés. (C) graphe de φ contre θ monté angles avec les quatre points où la z-position maximum a été atteint. Le point d’intersection marqué est l’angle d’inclinaison optimal final sur les deux axes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Graphiques illustrant un alignement infructueux. Graphiques de position z contre les angles d’inclinaison (A) θ et φ (B) pour un alignement infructueux, où ● indique les valeurs réelles mesurées et + le meilleur ajustement avec la méthode des moindres carrés. (C) graphe de φ contre θ monté angles avec les quatre points où la z-position maximum a été atteint. Pas clair optima ou point d’intersection sont observées et donc les angles d’alignement optimal ne sont pas résolus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Microscopie optique illustration et images de microscopie de force atomique d’or substrats qui ont modelé avec MHA par les baies de la PPL alignés et puis gravé à l’eau-forte. (A) et (B) sont des images de microscopie optique successivement agrandie des modèles gravées ; (C) est une image AFM de topographie d’une grille unique de modèles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Images illustratives microscopie optique de substrats or qui ont modelé avec MHA par les baies de la PPL alignés et puis gravé à l’eau-forte. (A) et (B) sont des images de microscopie optique successivement agrandie de motifs gravés et (C) est une image de grossissement inférieure qui montre grande surface profils homogènes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Image de microscopie optique illustrative d’un substrat d’or qui était inégalement modelé avec MHA et ensuite gravé à l’eau-forte. Les modèles prévus (illustrées dans le médaillon) redoublaient grilles de 20 lignes de points disposés en 20 lignes, avec tous deux lignes produites en augmentant le z-extension de l’axe de 1 µm (allant de 5 à-5 µm). On voit que dans certaines régions aucune tendance n’est générés, en raison des sondes manquants dans ces lieux. Dans les zones où sont produites les deux lignes de points, ce résultat indique qu’une sonde est présente mais il n’est pas de la même hauteur que les sondes entièrement fonctionnels, donc le seul dépôt dispose lorsque le tableau est étendu à la pleine z-distance axiale. Dans cette image, le contraste a été délibérément modifié pour permettre l’observation des zones partiellement imprimées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Images de microscopie de fluorescence incidente du CSM cultivés sur les baies de la fibronectine basé sur un modèle par PPL. (A) et (B) sont fort grossissement images montrant des cellules individuelles. (C) montre un modèle de l’exemple du tableau la fibronectine sans adhérent cellulaire et (D) est une image de grand champ des cellules cultivées dans un arrangement de grille (une représentation schématique du motif imprimé transparaît aussi dans l’inlay). Les cellules sont colorées pour montrer la fibronectine (rouge), actine F (vert) et (bleu) de noyaux cellulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole sert à fournir aux utilisateurs une méthode pratique pour réaliser rapidement nanolithographic le patterning avec grande uniformité et contrôlables taille plus grande des zones (cm2). Substrats portant ces nanopatterns de grande surface peuvent alors être précisées pour une variété d’applications. Une application majeure de cette technologie est de la génération des surfaces nanofabriquées pour les études sur les interactions de surface cellulaire. Ce rapport montre quelques exemples de culture cellulaire sur ces matériaux, démontrant le contrôle du CSAH morphologie par nanofabriquées substrats.

L’élément clé de ce protocole est l’automatisation de la procédure d’alignement (étape 4) qui permet une production très uniforme et à haut débit des caractéristiques sur les surfaces, jusqu'à résolution nanométrique, qui permet la rotation rapide des expériences de culture cellulaire. La lithographie de stylo de polymère réalisée à l’aide de cet algorithme d’alignement est capable de générer les caractéristiques d’échelle nanométrique dans environ 30 min. La reproductibilité et la précision de l’alignement automatique et donc l’uniformité des motifs caractéristiques, est cependant critique dépend de la qualité des tableaux sonde qui sont produites (phases 1 et 2). Les défauts dans leur préparation qui donnent lieu à des sondes émoussés, cassées ou manquantes ; tels que l’air emprisonné bulles (étape 1.5) ou une mauvaise séparation des sondes du maître (étape 1.8) peut entraîner l’alignement imprécis et lithographie de mauvaise qualité.

Cela rapporté méthode partage une limitation en commun avec d’autres méthodes d’alignement qui s’appuient sur le retour de force. La détermination précise de quand les sondes sont en contact avec la surface est limitée par la nécessité de tenir compte de vibrations de fond causées par l’environnement ambiant et le mouvement de la scène de l’échantillon. En général, les capteurs ont une sensibilité de force dans le régime µN (2 µN dans ce cas), mais l’algorithme d’alignement est conçu pour enregistrer seulement une force d’au moins 490 µN définitif de contact entre la sonde et la surface, afin d’éviter toute resul « faux positifs » Ting du bruit de fond. 13 par conséquent, cette méthode tend à produire des grandes fonctions (1 à 2 µm) puisque les sondes doit étendre une grande distance sur le z-axe (avec une force plue conséquente) afin d’enregistrer le contact. Pour compenser, petits éléments peuvent être générés en réduisant le z-axe distance parcourue pendant l’étape de la lithographie (p. ex., entrant dans le paramètre « Noir » à l’étape 5.2.3.2 comme 3 µm au lieu de 5 µm).

Néanmoins, même avec cette restriction, l’algorithme d’automatisation est capable d’aborder un aspect essentiel dans l’application des méthodes de la lithographie de sonde à balayage parallélisée, comme alignement c’était auparavant le plus exigeant et imprécis pas de temps dans la mise en œuvre de ces techniques. Cette automatisation maintenant décale l’étape cinétiquement limitante du processus de fabrication de l’alignement à l’écriture lithographique lui-même. Alors que ce protocole illustre l’application de cette procédure d’alignement à PPL, le cadre pourrait être appliqué à un certain nombre de techniques SPL comme lipides-DPN26 et Lithographie assistée par matrice27 ainsi que futur potentiel catalytique systèmes de sonde. 28

Disclosures

L’algorithme d’alignement et les logiciels ont été développés par et sont la propriété de, l’Université de Manchester. Il est disponible en téléchargement sur http://www.click2go.umip.com/.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent l’aide financière de diverses sources, y compris l’UK Engineering and Physical Sciences Research Council (refs de subventions. EP/K011685/1, EP/K024485/1) et une bourse d’étude universitaire pour JH ; le Leverhulme Trust (RPG-2014-292) ; le Fonds de soutien stratégique institutionnel du Wellcome Trust (105610/Z/14/Z) ; le British Council (216196834) ; et l’Université de Manchester pour une Université de Manchester Research Institute (fonds d’amorçage pompe UMRI) et une bourse de doctorat présidentielle à l’assistance technique de SW. par Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) est également grandement appréciées.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).

Tags

Bioingénierie numéro 136 scanning probe lithographie lithographie de stylo de polymère alignement automatisé parallélisation nanolithographie culture cellulaire les cellules souches cellules souches mésenchymateuses interactions cellule-surface
Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S.,… More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter