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Bioengineering

広域走査型プローブ ナノリソグラフィ自動配置と細胞培養研究用基板作製への応用

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

広域走査型プローブ ナノリソグラフィ プローブ アレイの反復的な配置として細胞表面の相互作用研究のためのリソグラフィー パターンの利用を有効にするためのプロトコルをご紹介します。

Abstract

走査プローブ顕微鏡と、ナノメートル スケールの特徴の建設的な ('添加物') トップダウン作製法の多様性の創出が有効になります。歴史的には、走査の主な欠点は、単一のプローブ システムの本質的にスループットをされています。これは、増加ナノリソグラフィ スループットを有効にする複数のプローブの配列の使用されてに取り組みました。すべてのプローブを作るので、そのような並列ナノリソグラフィーを実装するために基板表面とプローブ アレイの正確なアライメントが重要なリソグラフィ パターンの開始時に同時に表面と接触。このプロトコルでは、センチ メートル サイズ領域にプローブ アレイの迅速、正確、かつ自動化された配置のアルゴリズムの使用によって容易にわたってナノメータ スケールの機能を生成する高分子ペン リソグラフィの使用率について説明します。ここでは、金基板上のチオール基のナノリソグラフィは高い均一性と機能の生成を示します。これらのパターンは表面に向かう細胞形態研究のコンテキストで使用するためのフィブロネクチンと官能基化します。

Introduction

ナノテクノロジーの発展は、効率的かつ確実に加工表面にナノスケールの機能が可能な技術の開発に依存しています。1,2ただし、生成など広い領域 (複数 cm2) 以上確実に備わりで比較的低コスト以外の些細な努力。半導体産業から派生したほとんどの既存技術は、'ハード' 材料を作製するアブレーション フォトリソグラフィに依存します。最近では、リソグラフィ技術走査プローブ顕微鏡 (SPM) から派生は、ナノスケール デザインのラピッドプロトタイピング用の便利で汎用性の高いアプローチとして浮上しています。3 SPM ベースのテクニックは、便利かつ迅速に '書く' 任意のユーザー定義のパターンことが。ディップペンナノリソグラフィー (DPN) ・ マーキン4分子 'のインクを執筆に類似した方法で機能を生産面に転送する、'ペン' として走査型プローブを使用するによって開拓はこれらの最も有名です。周囲条件下でプローブの表面をスキャン 'インク' 分子に転送されます、表面を介して水のメニスカス プローブと表面 (図 1) を形成します。DPN したがって、'の柔らかい' 等高分子及び生体分子を含む材料の広い範囲の nanolithographic 蒸着を使用できます。5チャネルの流体、設計のプローブを使用して関連の技術いろいろと呼ばれる 'ピペット' と 'ナノ万年筆' も報告されています。6,7,8

SPM 派生リソグラフィの広いアプリケーションに主要な障害は、します一つのプローブ パターン センチ スケール領域に過度に長い時間を必要とするスループット。この問題に対処するための早い努力は、' の 1 つ - 次元 ' とセンチ サイズのエリアの露光が報告される '次元 (2 D) プローブ アレイのカンチレバ型 DPN の並列化に焦点を当てた。5,9ただし、これらカンチレバー アレイに比較的複雑な多段階製造方法により生産されて、比較的壊れやすい。高分子ペン リソグラフィ (PPL) の発明標準 SPM カンチレバーをスライド ガラスに結合ソフト シロキサン エラストマー プローブの 2D 配列に置き換えることでこの問題に対処します。10この単純なプローブのセットアップがアプリケーションの広い範囲にナノリソグラフィ開放に広い領域にパターンの複雑さとコスト大幅低下します。このカンチレバーの無料のアーキテクチャは、先端ハード ソフト スプリング リソグラフィ、柔らかいエラストマー裏付けのハイブリッドは、ソフトを使用して制作のパターンと比較して改良された解像度を与えるハード シリコン チップ11に拡張されています。エラストマーのヒント。

これらの 2D 配列の技術の実行に重大な要因プローブ アレイなければならないことです基板の表面に平行に丁度すべてのプローブが接触表面に露光を利用すると場合、は、同時に。小さなミスアライメントが発生機能サイズに大きな差配列の 1 つの側面から他にいくつかのプローブまたはすべてではない、他が接触に来る間、配列の降下中に表面が付いている接触来る。12正確なアライメントはソフトなエラストマー プローブの変形による PPL で特に重要なプローブの表面を以前連絡を圧縮する表面に大きな足跡を残しています。

PPL の初期の作品は、表面が付いている接触を持っていたピラミッド型のプローブの変形を観察するアレイ上に取付けられるカメラを使用して配置プロセスをガイドする純粋に視覚的検査を採用しました。10配置はプローブのどちら側に触れた表面最初に、観察し、角度を調整するまで接触プローブの各側の差は、反復的な方法で手順を繰り返してによって判断されました。目に区別がつかない。この配置の手順は、オペレーターによって主観的な検査に依存する、再現性が低いです。

その後、表面にプローブの接触時に適用される力を測定するための基板の下に装着した力センサーから成るより客観的なアプローチを開発されています。12配置すべてのプローブを同時に接触したが、加えられた力を最大化する角度を調整することによって達成されました。この方法を示した表面の平行の 0.004 ° 以内に配置が可能であります。この '力フィードバック水準測量の今 2 つの独立したレポートで完全に自動化されたシステムに実装されています。13,14両方力センサー基板の下にまたはアレイ上にマウントのトライアドを使用し、力発揮にプローブのアレイと表面間の接触の量を測定します。これらのシステムは、高精度、1 cm の長さのスケール、14 ≦ 0.0003 1.4 cm13これらの自動アライメント システムも提供上 ° オペレーター時間と完了にかかる全体的な時間の節約の主要な以上 ≤0.001 ° のずれを報告を与える、リソグラフィ プロセス。

この技術により高スループット表面加工の 1 つの主要なアプリケーションは、細胞培養基板の世代です。それはよく確立されて今細胞と表面機能の間の最初の相互作用を制御することによってその細胞の表現型を操作できる、これはナノスケールで高めることができます。15具体的には、走査型プローブのリソグラフィ手法が示されている様々 なこのような細胞培養実験のナノファブリケーション表面を生成する安易な方法であること。16などの分化誘導される表面のナノスケール材料のナノ改質材の可能性を研究する PPL と DPN によるタンパク質のテンプレートが使用されている自己組織化単分子膜と細胞外マトリックスのパターンを紹介幹細胞。17

このプロトコルでは、大面積の PPL を可能にする変更された原子間力顕微鏡 (AFM) システムの使用率について説明します。我々 は、繰り返し配置プロセスを自動化するアルゴリズムと組み合わせてのプローブ表面接触を判断する手段として複数の力センサーを用いた力の検出を詳しく説明します。細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチンでこれらのパターンの後続機能化とヒト間葉系幹細胞 (立体的) の文化は、細胞培養の応用 PPL 加工表面のデモンストレーションとして記述されます。

Protocol

1. PPL ペン アレイの作製

  1. ポリジメチルシロキサン (PDMS) 共重合体の混合物を準備するには。
    1. プラチナ (0) - 1, 3 - 10 μ l 添加ジビニル-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane 複雑なソリューションと 172 μ L (7- 8%/w vinylmethylsiloxane) の 250 g に 1357-テトラメチル-1357-tetravinylcyclotetrasiloxane の-ジメチルシロキサン共重合体。均一な混合を確実に 7 日間のロータリー ミキサーに徹底的にこれらのコンポーネントをミックスします。
      注意: プラチナ (0) - 1, 3 - ジビニル-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane は有毒であります。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
    2. (25- 35%/w methylhydrosiloxane) 0.5 g を追加・ ジメチルシロキサン共重合体混合物の 1.7 g の部分に重量を量る 1.1.1 のステップからボートやヘラを使って徹底的にミックスします。
    3. この混合物を脱ガス、真空デシケータに転送し、すべてのガス泡は消えてまで 20 分の低圧 (200 mTorr、0.3 mBar) の混合物を公開します。
  2. 20 mL 2-プロパノールに満ちたプラスチックねじ突破バイアルで 13 x 13 mm ガラス スライドし、大きなごみを取り除くに 10 分間、超音波のお風呂にバイアルを配置します。新鮮な 2-プロパノール (100 mL) にスライドを水没によってスライドを洗浄し、乾燥窒素ガスの流れの下で。
  3. シリコン マスター18を 4 cm 径シャーレに置き、十分な脱 PDMS プレポリマー混合物を追加 (手順 1.1) からまで完全に覆われています。通常は、100 μ L は 20 × 20 mm マスターに必要です。真空デシケーターにプレポリマーの混合物とマスターを配置します。ドガの高分子混合物の転送中にガス気泡を削除してさらに 5 分。脱ガスが行われている間、スライド ガラス (以下手順 1.4) の O2プラズマ処理を行わなければなりません。
  4. 1 分の任意の有機物汚染を削除してエラストマーの接着用ガラスに均一な酸化層を生成する最大の RF 電力で O2プラズマ (600 mTorr) でガラスの正方形を扱います。19使用プラズマは、次の手順で、スライドをすぐに治療。
  5. 慎重に (手順 1.3) からマスターのプレポリマーをプラズマ洗浄面をに向けて (手順 1.4) から正方形のガラス スライドを配置します。優しくシリコン マスター中の空気を削除して PDMS の均一な膜を確保するためにスライド ガラスを押して、マスターとスライドの間に挟まれています。
  6. 上記のシリコン ペトリ皿でステップに挟ま PDMS 配列下部 (すなわち、上向きスライド ガラスの背面に) マスターし、熱、PDMS を治す 24−48 h の 70−80 ° C のオーブンで料理を置く場所です。
  7. オーブンから硬化のアレイを削除し、冷却できるように、15 分間、かみそりの刃で慎重に後ろから任意の過剰の PDMS を外し、ガラスの両側スライドし緩い PDMS エアダスターを吹き飛ばす乾燥窒素のストリームを使用します。
    注: ノンスティック コーティングを損傷する可能性がありますこのシリコン マスターかみそりの刃で傷をつけないように注意してください。
  8. 1 mm の深さで配列のコーナーにかみそりの刃をくさびし、マスターから離れて配列を慎重に持ち上げます。単一の連続昇降操作でこのアクションを実行します。マスターにフォールバックする配列できないようにします。
  9. 慎重にカット、かみそりの刃の配列の端、PDMS の 0.5 mm を削り取る。緩い PDMS エアダスターを吹き飛ばす乾燥窒素のストリームを使用します。
    注: それは万国実体写真または虫眼鏡の下このトリミング手順を実行する方が簡単かもしれません。ノンスティック コーティングを損傷する可能性がありますこのシリコン マスターかみそりの刃で傷をつけないように注意してください。

2. 配列の作製と基板実装

  1. O2プラズマ処理によるプローブ アレイの親水性表面を生成します。
    1. PPL ペン アレイをペトリ皿にプラズマ室に配置し、600 mTorr に真空を適用します。30 のプラズマ発電機 (最大設定) スイッチ s。
    2. 真空を解放、アレイを削除し、配列に脱イオン水の 20 μ L を削除し、表面に水の広がりもあるかどうかを観察することによって、親水性を確認します。これが発生しない場合は、プラズマ処理の第 2 ラウンドの配列を対象します。その後、乾燥した乾燥窒素ガスのストリームを徹底的に配列。
  2. カーボンの両面テープを使用して、配列をプローブ ホルダーの中央に取り付けます。原子間力顕微鏡運動ホルダー (図 2) にプローブ ホルダーをマウントします。
  3. 16 mercaptohexadecanoic 酸 (MHA) (インク) PPL 配列をロードします。
    1. チューブで 30 mL のエタノールで 8.6 mg を溶解し、化合物を完全に溶解する 10 分の超音波風呂に置くことにより 1 mM 16 mercaptohexadecanoic 酸 (MHA) ソリューションを準備します。
      注意: 16 mercaptohexadecanoic 酸は有害です。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
    2. マイクロ ピペットを使用して、アレイの MHA 溶液 20 μ L ドロップを入金します。ピペット チップ アレイとの接触を避けます。アレイ全体に広がるし、周囲の条件の下で蒸発するエタノールを許可することができます。
      注: 配置が行われた後は、PPL 配列を結んだまたはすることができます。10
  4. 一度 MHA ソリューションが乾燥している、AFM に PPL 配列をプローブ ホルダーをマウントします。

3 PPL の金基板の準備。

  1. 金基板できますいずれか購入、または熱または電子による自社製ビーム蒸着、および 20 に続いて 2 nm チタン接着層の組み立てられるガラスやシリコン基板上の金の nm。18
  2. 必要に応じて、手順 1.4 で説明したパラメーターを使用して酸素プラズマ処理による基板をクリーニングします。
  3. 原子間力顕微鏡試料ステージの真ん中に金の基板を置き、基板 (図 2) の境界線の周りの粘着テープで固定します。Zを使用して製造元の取扱説明書に記載されている正しい高さにステージを調整する-軸コント ローラーです。

4. 自動位置合わせペン配列の

  1. 開いた、('0') のすべての軸をリセットするコンピューターでステージ コント ローラー セットアップ プログラム (SetupNSF.exe) を実行、ゼロ点を事前に校正された角度しステージxを使用して/y-軸コント ローラー コンソール基板を希望の位置に移動する/印刷位置。最適な結果を得るのため、基板はステージの力センサー間の段階の中心に近い配置必要があります。
    注: コンピューター、 xの一部のモデルに/yz軸コント ローラー USB 信号が干渉すること-軸コント ローラー。この場合、切断xy-軸コント ローラー USB ケーブルこのステップの後。配置手順 (ステップ 4.7) 後再接続する必要があります。
  2. サンプル ステージを解放し、原子間力顕微鏡の製造元の指示に従って、力センサーのトライアドをアクティブ化段階リリース レバーを切り替えます。少なくとも 15 分間平衡に力センサーを許可します。最適な結果を得るのためには、30-50 分を許可します。
  3. プローブ アレイと表面を視覚的に観察することによって、基板の近くに配列させる z 軸高さを増加します。
    注: 配列近づくは表面に、反復回数が少ない、そのため時間節約、配置プロセスに必要です。
  4. 開く/実行自動配置プログラム (自動位置合わせ v16.exe) しプログラムに関連する線形パラメーターを入力します。
    1. 望ましい角度ステップ パラメーター値、通常 0.15 ° を入力します。このパラメーターは、プログラムによって決定される各軸の '最適' の角度からのオフセット角度です。この範囲よりも低い角度は、表面にプローブのアプローチに明確に検出力の違いで発生しないとは、0.1 と 0.2 の ° の間このパラメーターを設定します。
      注: ソフトウェアは、millidegrees の値を受け入れる(すなわち、1 x 10-3 °)。たとえば、0.15 ° のユーザーは '150' を入力する必要があります。
    2. 必要な粗ステップを入力 ' パラメーター値、通常 0.6 μ m。このパラメーターは、初期の大まかな配置にプローブが近づくにつれステージによって使用される z 軸ステップ サイズです。0.2 の間このパラメーターを設定、1 μ m. 大きいステップ サイズ減少の配置プロセスの所要時間しますが、アライメントの精度の低下しプローブの摩耗を増加します。
      注: ソフトウェアは、マイクロメータの粗いステップの値を受け取ります。たとえば、0.6 μ m のユーザーは '0.6' を入力する必要があります。
    3. 必要な '罰金一歩' パラメーター値、通常 0.2 μ m を入力します。このパラメーターは、最適なアライメントの微調整に使用する z 軸ステップ サイズです。ほとんどのアプリケーション 0.1 の間このパラメーターを設定し、0.4 μ m より大きい値ステップ サイズは配置プロセスにかかる時間の量を減らすが、線形の品質が低下します。
      注: ソフトウェアは、マイクロメータの細かいステップの値を受け取ります。たとえば、0.2 μ m のユーザーは '0.2' を入力する必要があります。
    4. 'Excel ファイル パス' を構成し、「フォルダー」アイコンを使用してファイル場所に移動すると「OK」を押す指定したスプレッドシートのテンプレート ファイルの変更されていないコピーを添付します。このファイルには、ステージの最適なステージの角度を決定するために使用生と計算されるデータが含まれています。
  5. 原子間力顕微鏡制御ソフトウェアを開く/実行します。(製造元の指示に従って)、'分光' ボタンをクリックしてこのプログラムの分光成分に移動し、100 ms 以上 10 μ m を撤回する、10 μ m、一時停止時間は 250 ms、100 ms 以上で振動する原子間力顕微鏡スキャン ヘッド z 軸を設定一時停止時間は 250 ms (図 3)。
  6. AFM として頭が不安定になって、自動配置プロセスを開始する配置ソフトウェアの「スタート」ボタンをクリックしますします。プログラムを実行するとき、ソフトウェアは書く、4.4.4 のステップで説明したファイルのデータを読み込みます。
    注: 30 分と 4.4 の手順で入力された手順 4.3 およびソフトウェア構成で設定された初期位置に応じて 3 h の配置になります。
    注意: ステージ コント ローラー コンソールがまだアクティブの配置処理中 - 使用しないでくださいそれらの配置プロセス中に配置が妨害されます。
  7. 配置が完了すると、(ステップ 4.4) からアライメント ソフトウェアに '配置' 完了した緑色のライト ボックスが点灯します。これが発生すると、配置プロセスを終了するユーザー インターフェイスに '停止' ボタンをクリックします。
  8. ソフトウェアによって生成される記録されたデータ ポイントと合わせてライン相関に関するスプレッドシート テンプレート ファイルにグラフを確認します。> 0.99 の典型的な R2値と良い相関の例について代表的な結果を参照してください。配置に失敗した場合 (ステップ 2) 新しく準備された配列プローブの配列で置換し、配置 (ステップ 4.4) を繰り返します。
  9. Zのステージを上向きに移動-ステージ コント ローラーのコンソールを使用してその軸の軸。接触 AFM のトップビュー カメラから観測できるまで、500 nm 刻みでステージを移動する必要があります。配列と基板の接点それぞれのプローブのピラミッドの頂点に高コントラストの '白ドット' として観察することができます。
  10. この時点で、ステップ 4.5 から分光法プログラムを停止する原子間力顕微鏡制御ソフトウェアの '停止' ボタンをクリックします。これは 10 μ m、それゆえ可能な z 軸延長の 10 μ m を残してによって配列を撤回します。原子間力顕微鏡プローブが基板と接触していないことを確認するためのトップビュー カメラからの画像を確認します。

5. 高分子ペン リソグラフィ (PPL)

  1. コントロール ソフトウェアに 'リソグラフィ' ボタンをクリックしてコントロール ソフトウェアのリソグラフィのコンポーネントに移動します。Zを選択-変調動作モードをラスター (ビットマップ) をインポートまたはリソグラフィ パターンとして使用する画像をベクトルします。代表的な結果に表示機能を生成するために 20 x 20 ブラック ピクセル (補足資料を参照してください)、PPL のアレイのプローブあたり 20 × 20 ドットのグリッドのリソグラフィーに対応するをで構成されるビットマップを使用します。
  2. AFM コント ローラー ソフトウェアの「ピクセル グラフィック インポート」ウィンドウに露光パラメーターを入力します。
    1. 長さと幅で生成されるパターン、例えば、40 μ m の 'サイズ' を構成します。これらのパラメーターを示す幅と長さをビットマップ イメージが縮小されます。代表の結果に表示される機能を生成するには、両方の寸法で幅、40 μ m の長さを使用します。
    2. Xyの両方の軸に 25 μ m に生成されるパターンの '原点' を設定します。これらのパラメーターは、原子間力顕微鏡xの中心を基準にしてイメージの中心を決定/y-軸。プローブが配置プロセス中に接触したサーフェスの領域を避けるためにこれらのパラメーターを設定します。
    3. 印刷 'パラメーター' を設定します。これらの値を決定どのようにプローブ (すなわちもたらされた表面が付いている接触) を拡張するビットマップ イメージ内の各ピクセルに対応します。
      1. ドロップ ダウン メニュー ' 変調 Abs Z Pos' から '簡略化する「2 つレイヤーを選択します。このモードでは、唯一の 2 つの結果、'黒 (0)' または 'ホワイト (1)' フィールドによって決まりますの絶対距離によってプローブを拡張する AFM を指示します。
      2. それぞれ 5、-5 μ m 'ブラック (0)' と 'ホワイト (1)' フィールドに値を設定します。これらの値はビットマップ イメージに黒または白のピクセルに対応プローブを移動する必要があります距離を決定する、'黒' の 3 と 5 μ m の間通常セット (すなわち、その軸のゼロ点を基準にして、この距離で下方プローブを拡張)'白'-5 μ m-3 (すなわち、ゼロ点を基準にして 3 に 5 μ m で上向きにプローブを撤回)。
        注: これらの代表的な距離は、5 μ m の拡張が表面に接触プローブの結果を想定して、それ故に機能、5 μ m 撤退リフト表面かプローブ間の世代が接触しない結果します。Z-拡張子より大きい機能の結果、表面にさらに押されているプローブの表面、大きい拡張結果とプローブの接触の程度を決定することにより機能のサイズに影響します。10
      3. これらの設定を実装して、ウィンドウを閉じるするには、'OK' をクリックします。
  3. 原子間力顕微鏡制御ソフトウェア、通常 1 の露光ウィンドウで「一時停止時間」を入力 s。この設定は、プローブが通常は 0.1 と 10 秒間設定拡張の 'ブラック' 位置に残る時間の長さを決定します。
    注: 長い休止時間は、金の表面に運ばれる MHA の大きい量のため大きいサイズあります。生成機能のサイズの制御に関する詳細については、他のレポートで見つけることができます。20
  4. 大気制御エンクロー ジャーを準備します。
    1. AFM に大気分離室を下げ、開く/実行大気コントロールの製造元から提供されたソフトウェア (MHG_control.exe)。
    2. '流れ率' 500 mL のソフトウェアにこれらの値を入力して 45% の相対湿度、25 ° C の温度と雰囲気の中交流を維持する雰囲気制御ソフトウェアを設定します。設定を実装する ' Use' をクリックします。大気制御モジュールは、商工会議所に加湿空気をポンプを開始します。
      注: 高い湿度は、ペン アレイと表面の間に生成された大きな水のメニスカスの形成のためのより大きい機能サイズ。21この値は、通常の 40 ~ 60% に設定します。流量は、300 と 500 の mL の間通常設定されます。大きな流れになりより迅速に必要な湿気のレベルを許可するが精度が劣る。代表的な結果は、湿度の初期世代のため 500 mL の流量を使用し、露光中に正確で安定したレベルを維持するために必要な湿度に到達すると 300 mL に減少しました。
  5. 必要な湿度を取得した後は、ソフトウェア インターフェイスの「スタート」ボタンを押すことによって石版シーケンスを開始します。
  6. リトグラフを修了すると、500 μ m でステージを取り消しによって配列から基板を移動するのに z 軸ステージ コント ローラーのコンソールを使用します。そのマウントから大気分離室を削除します。
  7. 原子間力顕微鏡の製造元の指示に従ってサンプル ステージを固定し、力センサーを非アクティブ化段階リリース レバーを切り替え、ステージから基板を取り外します。

6 パターンの可視化

  1. パターンは、次の方法のいずれかを使用して視覚化することができます、水平走査プローブ顕微鏡や化学エッチング力。
  2. 横力モードで非破壊的機能を調べるコンタクト モード カンチレバーを用いた AFM に関するパターン付きのサーフェスをスキャンします。
    注: 水平力顕微鏡は高分子ペン リソグラフィー; によって生成される機能を表示する非破壊方法として使用できます。ただし、このメソッドを使用して、比較的小さい区域だけの可視化 (通常 100 x 100 μ m) することができます。
  3. 堆積 MHA etch レジストとして使用できます、のでエッチングは非パターン化エリアから金を削除する使用できます。結果研削領域は、顕微鏡、広い領域を一度に見ることができますを意味し、視覚化できます。18
    注: この方法でエッチング基板は、下記以降の細胞培養試験のため、使用できません。
    1. チオ尿素 40 mM、27 mM 鉄硝酸と 100 mM 塩酸の水溶液を別々 に準備します。これらの 3 つのソリューション 5 mL を混ぜて、エッチング液を準備します。挽きたてを使う前に混ぜます。22
      注意: チオ尿素、硝酸鉄 (iii)、塩酸、有毒です。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
    2. (通常 10 mL) 基板の表面をカバーする皿にペトリ皿とピペット十分なエッチング液にパターンの基板を転送します。15 をエッチングする 4-5 分の冠水した基板を保持 (3 nm/分のおおよその速度) で金の nm。
    3. エッチングが完了したら、基板を削除徹底的にすすぎ水と窒素の流れと乾燥します。
      注: エッチング プロセスの完了は、金表面の取得 (ステップ 3.1) エッチング レートを指定 (ステップ 6.2.2) に関連付けられている厚さによって決定されます。
    4. 明視野光学顕微鏡下ゴールド エッチングの特徴を調べます。まま残りのゴールドの特徴は印刷されたパターンに対応する (ステップ 5.2) から表示されます。表面全体が均一なある場合、金のかなりの量が残っているし、1-2 分のエッチング ・ ステップ (6.2.2 次ステップ) を繰り返す必要があります。

7. フィブロネクチンの機能化をパターンします。

  1. エタノールで 3 回 1 h. 基板の洗浄のためのエタノールの 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) ソリューションのソリューションにパターンの基板を浸すし、窒素の流れの下で完全に乾燥します。この手順は、/なしの金分野を不動態化します。
    注意: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) は有毒です。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
  2. 10 mM 5 分の Co (3)2水溶液に基板を浸します。次に、ソリューションは、3 回、超純水で洗浄、乾燥窒素の流れの下で乾燥から基板を取り外します。
    注意: (3) Co2は有毒です。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
  3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) におけるフィブロネクチンの 50 μ g/mL の溶液に基板を浸漬し、, 16 h. 3 回、PBS で洗浄、基板の 4 ° C で乾燥した乾燥窒素の流れの下で基板。
    注: フィブロネクチンに連結されたコバルト (ii) のキレートを介してマイクロ血球機能エリア ターミナル カルボン酸基 MHA に。フィブロネクチン、コバルト (ii)を経由する、コラーゲン結合ドメインにバインドします。23
  4. 必要に応じて、蛍光抗体とラベリングによって表面結合フィブロネクチンを可視化します。
    1. 表面に PBS でウシ血清アルブミン (BSA) の 5% (w/v) で 1: 100 非ウサギ抗フィブロネクチン一次抗体の 2 mL の溶液を適用し、, 16 h. 吸引上清の 4 ° C で PBS にて 3 回洗浄します。
    2. 蛍光共役抗家兎二次抗体 (製造元の指定された希釈、2 滴/ml) PBS の BSA の 5% (w/v) での 2 mL の溶液に基板を水没、スズ箔でカバー、1 h. 吸引室温で孵化させなさい、上澄みと PBS で 3 回洗ってください。
    3. レコードの製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を用いた励起フィルター機能の落射蛍光顕微鏡画像に 594 nm。

8. ナノファブリケーション表面培養

  1. 4番目と 6番目の通路の間がよく特徴付けられて hMSCs の懸濁液を準備します。24
    1. 10 mL の PBS で 1 回洗浄によって細胞の合流フラスコを中断、コート t75 フラスコ培養フラスコに 5 mL のトリプシン/EDTA を加えることによって付着細胞を分離、37 ° C 90% まで 5% CO2を 5 分程度の補足の加湿チャンバーにフラスコを孵化させなさいf 細胞は表面から切り離されます。
    2. その後、新鮮な培地フラスコに 10% 牛胎児血清 (FCS) を含む 6 mL を加えるし、簡単に追加されたメディアとフラスコをすすいでください。25 ° C で 400 g で 5 分間遠心 15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
    3. 上澄みを除去し、新鮮な培地 3 mL に細胞ペレットを再懸濁します。
    4. 検定25を使用して細胞密度をカウントし、文化メディアの適切な量の添加による 2 × 104セル/mL に細胞懸濁液の密度を調整します。
  2. 104セル/cm2の密度で基板上に細胞を播きます。
    1. ダイヤモンド ・ スクライブと 1 × 1 cm2に基板をカットし、12 ウェル培養プレートのウェルに配置。
    2. 井戸の中に (ステップ 8.1.4) から培養液で細胞を懸濁液 2 mL をピペットし、37 ° c 24 時間 5% CO2を添加した加湿チャンバーで孵化させなさい。
  3. パターンの増殖後、細胞接着および蛍光抗体法によって広がりの程度を分析します。
    1. メディアを取り出し、一度 PBS で基板を洗浄します。ヒューム フードと PBS で 3 回洗浄で 20 分間、PBS (37 ° C に加温) で 4% パラホルムアルデヒド溶液 2 mL でセルを修復します。
      注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。このソリューションを使用する前に MSDS をお読みください。安全装置は、化学物質の処理中に着用しなければならない.
    2. 0.5% 洗剤の溶液 2 mL とセルを permeabilize (材料表参照) 15 分の pbs は、PBS で 3 回を洗い流し。
    3. 5% (w/v) BSA PBS で 1: 100 希釈で非ウサギ抗フィブロネクチン一次抗体の溶液 2 mL で基板が水没し、, 16 h のための 4 ° C で、0.1% (v/v) トゥイーン 20 PBS (PBST) にて 3 回洗浄します。
    4. その後 (5% (w/v) BSA PBS で製造元の指定された希釈、2 滴/mL で希釈) 共役蛍光抗家兎の二次抗体の溶液 2 mL で基板が水没、スズ箔で蓋をして 1 時間室温で孵化させなさい0.1% で 3 回を洗って pbst;。
    5. アクチン フィラメントをラベルに 2 mL の PBS で 1: 250 の希釈で共役蛍光ファロイジンを水没、スズ箔でカバーし、, 30 分のための 4 ° C で、PBS にて 3 回洗浄します。
    6. 同時に細胞核を染色し、取付中含む DAPI とカバー、coverslip の滴を適用することによって、基板をマウントします。
  4. 365 の励起フィルターが製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を用いた細胞を可視化する核 (DAPI) 488 nm F アクチンの 594 nm フィブロネクチンの nm。

Representative Results

自動配置が成功したかどうかをチェックするには、(ステップ 4.8 からスプレッドシート) のアライメント データからプロット グラフを調べた。配置プロセスが成功した場合、試料ステージ、θ と φ の軸に傾いています角度に対応する 2 つのプロットはの上昇と下降のデータ ポイントのシリーズを示した。各プロット、データ ポイントの 2 つの線形近似を示した明確に定義された交差を示すzの最大の「ピーク」の拡張子と対応する角度で配置された実現 (図 4 a および 4 b)。このプロセスは繰り返し 4 回 (すなわち、軸ごとに 2 回) と 4 つの座標のセットとしてプロットします。座標の各ペアの積集合はこうして全面的な最適角度 (図 4) を示しています。13配置が成功しなかった場合、それが観察できること彼らの対応する θ と φ 角度プロット良質の直線近似を与えるかまたは (図 5) を交差していません。このような失敗した線形は、通常正しくトリムまたはプローブ ホルダー (1.7, 1.8 と 2.2 の手順) にマウントされている配列の結果として。これらのケースで配列が破棄された新しいもの用意して (手順 1 と 2) をマウントし、配置プロセスを繰り返す (ステップ 4)。

パターン化された金基板は成功した配置と PPL によって MHA とリソグラフィ、時に、沈着が起こったかどうかを調べる水平力顕微鏡を用いたをイメージしました。印刷面の大きい領域検討は基板の光学顕微鏡によって堆積したチオール (図 6および図 7) によって保護されていない金のエッチング後も行われました。しかし、エッチングのパターンはさらに高機能化は使用できません、パターニングを用いたプリント基板の表面用のバッチの代表的なサンプルを確認にのみ使用してください。エッチングのパターンは、個々 のペン (図 8) に対応する空白の領域を示す、この結果はプローブ アレイの生産は正常に行われていないと、いくつかのプローブが破損または不足していることを示します。フッ素コーティングが離れて着用する (手順 1.3)、古いマスターの使用のためこの不均質性プローブの可能性がありますいくつかのプローブの配列は、マスターから分離されている場合離れて引き裂かれての結果します。これらの場合、新しいマスターを使用してください。ガラス基材とマスター (ステップ 1.5) の間閉じ込められた泡またはかどうかプローブ アレイないきれいに分離されたマスターから (ステップ 1.8) 硬化後、空気の存在によりその結果にはあります。

培養 hMSCs もフィブロネクチンの機能面の蛍光顕微鏡観察画像収集 (図 9)。一般に、すべての基板は体外培養環境の中で安定していた、セルが付いていて、機能の小さい隔離された 20 x 20 配列の場合プリント パターンに彼らの形態を適応しました。

Figure 1
図 1。プローブ先端に分子インク トランスポートを介して水のメニスカスを示す高分子ペン リソグラフィの略図。(A) 図、(B) ポリマー ペン配列の平面図、プローブと基板表面が完全に整列する、すべてのプローブ接触表面同時に並列化リソグラフィにおける結果を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。高分子ペン リソグラフィの模式図を設置す(実験のセットアップ準備プローブ アレイのプローブ ・ ホルダーに接続されているし、AFM スキャナーにマウントされているどこの A) 拡張の側面図です。ステージに基板を配置、センサーを強制的に 3 つ下に位置しています。(B) 試料ステージを基準にして原子間力顕微鏡のスキャン ヘッドを示す組み立て計装の表現。(C) 底面力センサー位置を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。配置手順の分光法プログラムを描いた略図。AFM スキャナーは、10 μ m、100 ミリ秒以内 250 ms の位置にある 100 ms 以内で 10 μ m の後退に続いて、開催引っ込んだ位置に 250 ms の距離によってサンプルに向かってプローブを移動する設定です。動きが配置プロセス全体で繰り返されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。成功した配置を示すグラフ。● は、実際の値の測定を表し+ 、最高を示して傾斜角度 (A) θ と φ (B) 正常なアライメントの z 位置のグラフは、最小二乗法と合います。(C) θ と φ のグラフは、最大の z 位置が到達した 4 つのポイントで角度を装着しました。マーク交点、両方の軸にまたがる最終的な最適傾斜角度です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5。失敗した配置を示すグラフ。● は、実際の値の測定を表し+ 、最高を示して傾斜角度 (A) θ と φ (B)、失敗した配置の z 位置のグラフは、最小二乗法と合います。(C) θ と φ のグラフは、最大の z 位置が到達した 4 つのポイントで角度を装着しました。ない明確なオプティマまたは交点を観察、したがって最適な位置合わせ角度は解決されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6。例示の光学顕微鏡と整列 PPL 配列による MHA とパターン化され、エッチング、金基板の原子間力顕微鏡像。(A) と (B) は、エッチングされたパターンの順次拡大光学顕微鏡画像(C) パターンの単一のグリッドの原子間力顕微鏡トポグラフィ画像です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7。金基板整列 PPL 配列による MHA とパターン化され、エッチングの説明光学顕微鏡画像。(A) と (B) は、エッチングされたパターンの順次拡大光学顕微鏡画像と (C) は、大面積に均一なパターンを示しています下の拡大画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8。均等にない MHA でパターン化され、エッチング、金基板表面の例示の光学顕微鏡画像。(挿入図に示すように) 意図されていたパターンが、 zの増加によって生成されるすべての 2 行、20 行に配置された 20 のドット線のグリッドを繰り返し-1 μ m (5 に至る-5 μ m) による軸延長。いくつかのエリアのパターンは生成されません、それらの場所で不足しているプローブのため見ることができます。ドットの 2 つだけの行が生成されるエリアでこの結果を示しますだけ預金機能フルz配列を拡張するとき、完全に機能プローブと同じ高さではありませんが、プローブが存在-軸距離。この画像のコントラストを意図的に部分的な印刷領域の観測を有効にするのに変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9。落射蛍光顕微鏡画像の hMSCs PPL によってテンプレートのフィブロネクチン アレイ上で培養した。(A) と (B) は高倍率画像表示個々 のセル。(C) 細胞および (D) は (印刷されたパターンの模式図は、インレーにも表示されます) のグリッド配置で培養された細胞の広視野画像付着せずフィブロネクチン配列のパターン例を示しています。細胞はフィブロネクチン (赤), F-アクチン (緑) を表示し、セルの核 (ブルー) ステンド グラスします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

このプロトコルは nanolithographic 高い均一性と制御機能のサイズ大きい上パターンを迅速に行う便利な方法をユーザーに提供する機能 (cm2) エリア。これらの大面積 nanopatterns を支持基板はことができますさまざまなアプリケーションの更なる精緻化。この技術の 1 つの主要なアプリケーションは、細胞表面の相互作用研究のナノファブリケーション曲面の生成です。このレポートは、ナノファブリケーション基板によって立体的形態制御を示すことこれらの材料に細胞培養のいくつかの実例を示します。

このプロトコルの主要な enabler は、表面に、細胞培養実験急速な売り上げ高をできるナノ分解能を特徴の非常に均一で高スループットの生産を可能にする配置手順 (手順 4) の自動化です。この配置のアルゴリズムを使用して実施高分子ペン リソグラフィは約 30 分以内のナノスケールの機能を生成することができます。自動位置合わせの精度とこうしてパターン フィーチャーの均一性と再現性はしかし批判的に、プローブのアレイの品質に依存生産 (手順 1 と 2)。鈍、破損または不足しているプローブ; 場合は、準備の任意の欠陥閉じ込められた空気など泡 (ステップ 1.5) またはマスター (ステップ 1.8) からプローブの不適切な分離は、不正確な配置と質の悪いリソグラフィで起因できます。

これは、メソッドを共有共通のフォース フィードバックに依存するその他の配置方法の制限を報告しました。プローブが表面と接触しているときの正確な定量は、周囲の環境、サンプル段階の動きによって引き起こされる背景の振動を考慮する必要性によって制限されます。一般に、センサー フォース感度 µN 政権 (この場合は 2 µN) がだけ任意の 'の偽陽性の結果を避けるために、プローブと表面の間の決定的な連絡先として少なくとも 490 µN の力を登録する配置アルゴリズムを設計バック グラウンド ノイズからティンします。大特集 (1-2 μ m) を生成する傾向がある13したがって、このメソッド プローブは、 zに大きな距離を拡張する必要がありますので-軸 (結果として高い力) 連絡先を登録するために。Zを減らすことによって補うために、小さな機能を生成できます-軸距離旅リソグラフィ段階 (例えば、5 μ m の代わりに 3 μ m ステップ 5.2.3.2 で '黒' の設定を入力)。

それにもかかわらず、この制限があっても自動化アルゴリズム、並列スキャン プローブ リソグラフィー法のアプリケーションの重要な側面に対処することができる配置された以前、最も要求の厳しい、不正確なの時間ステップ、これらのテクニックを実装します。今この自動化は、平版の執筆自体に配置から作製プロセスの律速段階をシフトします。このプロトコルは、皆さんにこの配置手順のアプリケーションを示します、フレームワークが脂質 DPN26マトリックス支援リソグラフィ27と潜在的な未来の触媒など SPL テクニックの数に適用されます。プローブ システム。28

Disclosures

アライメント アルゴリズムとソフトウェアによって、開発された、マンチェスター大学に独自します。それは http://www.click2go.umip.com/ でダウンロード可能です。

Acknowledgments

著者認める支援から各種ソースなど英国工学物理科学研究会議 (refs を付与します。EP/K011685/1, EP/K024485/1) と JH; の大学院学生の身分Leverhulme 信頼 (RPG-2014-292);Wellcome の信頼機関の戦略的支援ファンド (105610/Z/14/Z);ブリティッシュ ・ カウンシル (216196834);マンチェスターの研究所 (UMRI ポンプのプライミング基金) と博士アンドレアス Lieb (ナノサーフ AG) によって南西技術支援する大統領博士奨学金の大学、マンチェスター大学が認められても感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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References

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広域走査型プローブ ナノリソグラフィ自動配置と細胞培養研究用基板作製への応用
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Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

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