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Bioengineering

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

Abstract

스캐닝 프로브 현미경 다양 한 나노미터 스케일 기능 건설 ('첨가제') 하향식 제조 방법의 창조를 수 있게 되었습니다. 역사적으로, 스캐닝 프로브 리소 그래피의 주요 단점은 단일 프로브 시스템의 본질적으로 낮은 처리량 되었습니다. 이 배열의 증가 나노리 처리량 수 있도록 여러 개의 프로브를 사용 하 여 태 클 되어 있다. 이러한 병렬된 나노리를 구현 하기 위해 기판 표면 프로브 배열의 정확한 줄 맞춤은 중요 한, 모든 프로브 있도록 리소 그래피 패터 닝 시작 하는 때에 동시에 표면에 접촉. 이 프로토콜 센티미터 크기의 지역, 프로브 배열, 정확, 신속 하 고 자동 맞춤 알고리즘의 사용에 의해 촉진 된 나노미터 스케일 기능을 생산 하기 위해 폴리머 펜 리소 그래피의 활용을 설명 합니다. 여기, 나노리 골드 기판에 thiols의 높은 균등 성에 생성 기능을 보여 줍니다. 이러한 패턴은 다음 기능성 표면 감독 셀 형태학 연구의 맥락에서 사용 하기 위해 fibronectin 함께.

Introduction

나노기술에서 발전 기술 효율적이 고 안정적으로 표면에 나노 기능 조작 능력의 개발에 따라 달라 집니다. 1 , 그러나 2 , 등을 생성 하는 것은 큰 지역 (여러 cm2) 안정적으로 기능과에서 상대적으로 저가 아닌 사소한 것은 노력 이다. 대부분 기존 기술, 반도체 산업에서 파생 된 '하드' 자료 조작 하 절제 사진 평판에 의존 합니다. 더 최근에, 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)에서 파생 된 석판 기법 나노 디자인의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리 하 고 다양 한 방법으로 떠오르고 있다. 3 SPM 기반 기술을 편리 하 고 빠르게 '쓰기' 어떤 사용자 정의 패턴 수 있습니다. 이들 중 가장 유명한 딥 펜 나노리 (DPN) Mirkin 외.,4 스캐닝 프로브 패션 글을 유사한 기능을 생산 하는 표면에 분자 '잉크'를 전송 하는 '펜'으로 사용 됩니다 어디에 의해 개척 이다. 주위 조건 하에서 조사는 표면에 걸쳐 스캔으로 '잉크' 분자는 표면를 통해 에 전송 됩니다 프로브 및 표면 (그림 1) 사이 형성 하는 물 초승달 모양. DPN 따라서 다양 한 자료를 포함 한 '부드러운' 생체 고분자 등의 nanolithographic 증 착을 수 있습니다. 5 관련된 기술 공학 유체 배달 채널 프로브를 사용 하 여 각종 라고도 'nanopipettes'와 '나노-만년필' 또한 보고 되었습니다. 6 , 7 , 8

SPM 파생 리소 그래피의 광범위 한 응용 프로그램에 주요 장애물은 처리량, 단일 프로브 패턴 센티미터 규모 영역에 지나치게 오랜 시간이 필요 합니다. 이 문제를 해결 하려면 초기 노력 ' 한-차원 '과 '2 차원' (2D) 프로브 배열 센티미터 크기의 지역의 리소 그래피에 대 한 보고 되 고 캔틸레버 기반 DPN의 병렬화에 집중 했다. 5 , 그러나 9 , 이러한 캔틸레버 어레이 상대적으로 복잡 한 다단계 제조 방법을 통해 생산 되며 상대적으로 깨지기 쉬운. 폴리머 펜 리소 그래피 (PPL)의 발명 소프트 실록 탄성 프로브는 유리 슬라이드에 보 세의 2D 배열 표준 SPM 캔틸레버를 대체 하 여이 문제를 해결. 10 비용 및 나노리 애플 리 케이 션의 넓은 범위를 개방, 넓은 영역을 패턴화의 복잡성이 간단한 프로브 설치는 크게 감소 합니다. 이 외팔보 무료 아키텍처 또한 하드 팁 소프트 봄 리소 그래피,11 하드 실리콘 팁 주는 소프트를 사용 하 여 생산 하는 패턴에 비해 향상 된 해상도와 부드러운 탄성 지지의 하이브리드를 제공 하도록 확장 되었습니다. 고무 팁입니다.

이러한 2D 배열 기술의 실행에 중요 한 요소는 프로브 배열 정확 하 게 평행 해야 표면 기판 리소 그래피를 활용 하면 모든 프로브 표면 접촉 되도록 동시에입니다. 심지어 작은 오차 발생할 수 있습니다 기능 크기에서 큰 차이 배열의 1 개의 측에서 다른, 이후 일부 프로브 것 이다 접촉 표면 배열, 하강 하는 동안 이전 이후 또는 전혀 다른 접촉으로 올 것 이다 하는 동안. 12 이전 표면 접촉 프로브 압축 될 정확한 맞춤 부드러운 탄성 중합체 프로브 deformability 때문 PPL로 특히 중요 하다 표면에 큰 발자국을 떠나.

PPL에 대 한 초기 작업 정렬 프로세스, 그들은 표면에 접촉으로 주어졌다 피라미드 프로브 변형의 관찰을 배열 위에 장착 된 카메라를 사용 하 여 순전히 시각적인 검사를 고용. 10 맞춤 프로브의 측면을 먼저, 표면 접촉으로 온 관찰 하 고 다음 각도 조정 하 고 접촉 프로브 양쪽에 차이 때까지 반복 방식으로 절차를 반복 하 여 판단 했다 눈에 구별. 이 정렬 프로시저 연산자에서 주관적인 육안 검사에 의존, 재현성이 낮습니다.

그 후, 좀 더 객관적인 접근 개발 되었습니다, 기판의 표면에 프로브 접촉 시 적용 되는 힘 측정 아래 장착 힘 센서의 구성. 12 맞춤 따라서 모든 프로브 동시에 접촉에 지적 발휘, 힘을 최대화 하기 위해 경사 각도 조정 하 여 달성 되었다. 이 방법은 표면 병렬의 0.004 ° 이내에 맞춤 가능 했다 보여주었다. 이 '힘 피드백 평등 화'는 지금 두 개의 독립적인 보고서에 완전 자동화 된 시스템으로 구현 되었습니다. 13 , 14 모두 탑재 기판 아래 또는 위에 배열 하는 힘 센서의 트라이 어 드를 사용 하 고 프로브 배열 및 표면 사이의 접촉 시가 해지는 힘의 양을 측정. 이러한 시스템 제공 높은 정밀도, 1cm 길이 규모,14 또는 ≤ 0.0003 ° 1.4 cm.13 이러한 자동된 맞춤 시스템 제공을 통해 주요 절감 연산자 시간과 완료에 소요 된 전체 시간 ≤0.001 °의 부정합을 보고는 리소 그래피 과정입니다.

이 기술에 의해 사용 하는 높은 처리량 표면 제조의 주요 응용 프로그램은 셀 문화 기판의 세대입니다. 지금은 잘 설립 초기 세포 표면 기능, 상호작용을 제어 하 여 그 세포 표현 형을 조작할 수 있습니다 그리고이 나노 크기에서 강화 될 수 있다. 15 특히 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법은 표시 되었습니다 다양 한 nanofabricated 표면 같은 세포 배양 실험에 대 한 생산 하는 손쉬운 방법. 16 예를 들어 자기 조립된 monolayers와 세포 외 기질 단백질 PPL와 DPN 템플릿 소재 나노 수정 자료의 가능성을 공부 하 사용 되었습니다의 나노 패턴을 제시 하는 표면 유도의 차별화 줄기 세포입니다. 17

이 프로토콜 수정된 원자 힘 현미경 (AFM) 시스템입니다 큰 지역 PPL의 활용을 설명 합니다. 우리 선발 프로브 표면 접촉, 반복적인 정렬 프로세스를 자동화 하는 함께 결정 하는 수단으로 여러 힘 센서를 사용 하 여 힘의 탐지. 세포 외 기질 단백질 fibronectin 이러한 패턴의 후속 기능화와 인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSC)의 문화는 설명, PPL 조작 표면 세포 배양에 대 한 적용의 데모.

Protocol

1입니다. PPL 펜 배열의 제작

  1. 입니다 (PDMS) 공중 합체 혼합물 준비:
    1. 백 금 (0)-1, 3-10 µ L을 추가 divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane (7-8 %w / w vinylmethylsiloxane)의 250 g의 172 µ L 및 복잡 한 솔루션-dimethylsiloxane 공동 폴리머. 균질 혼합 되도록 7 일에 대 한 회전 믹서에 철저 하 게 이러한 구성 요소를 믹스.
      주의: 백 금 (0)-1, 3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane는 독성. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
    2. 0.5 g (25-35 %w / w methylhydrosiloxane)의 추가-1.1.1 단계는 무게에서 혼합물의 1.7 g 부분에 dimethylsiloxane 공동 폴리머 보트와 주걱으로 철저 하 게 혼합.
    3. 이 혼합물을 진공 desiccator에 전송 하 고 모든 가스 거품이 방출 될 때까지 20 분에 대 한 낮은 압력 (200 mTorr, 0.3 mBar) 혼합물을 노출 하 여 드.
  2. 20 mL 2-프로 판 올, 13 x 13 mm 유리 슬라이드 플라스틱 나사 장식 유리병에 가득 장소 다음 10 분 어떤 큰 파편을 제거 하는 초음파 목욕에 유리병을 놓습니다. 신선한 2-프로 판 올 (100 mL)에 슬라이드를 잠수 하 여 슬라이드를 세척 하 고 건조 한 질소 가스의 흐름에서.
  3. 4 cm 직경 페 트리 접시에 실리콘 마스터18 을 놓고 완전히 덮여 충분 한 degassed PDMS 중합체 혼합물 (에서 단계 1.1)까지 추가 합니다. 일반적으로, 100 µ L는 20 x 20 m m 마스터에 대 한 필요 합니다. 장소 진공 dessicator에 중합체 혼합물으로 마스터. 혼합물을 전송 하는 동안 형성 된 가스 거품을 제거 하는 추가 5 분에 대 한 고분자 드 O2 플라즈마 처리 유리 슬라이드 (아래 단계 1.4)의 일어나는 기체 제거 하는 동안 수행 되어야 합니다.
  4. 모든 유기 오염 제거 하 고는 고무의 접착을 위한 유리에 균일 한 산화물 층 생성 1 분 동안 최대 RF 전력에서 O2 플라즈마 (600 mTorr)와 유리 사각형을 취급 합니다. 19 는 플라즈마를 사용 하 여 다음 단계에서 바로 슬라이드를 취급.
  5. 조심 스럽게 플라즈마-청소 면 (1.3 단계)에서 마스터에 prepolymer 사각형 유리 슬라이드 (1.4 단계)에서 장소. 어떤 덫을 놓은 공기를 제거 하 고 PDMS의 균일 한 필름 마스터와 슬라이드 사이 끼여 되도록 부드럽게 실리콘 마스터에 유리 슬라이드 아래로 누릅니다.
  6. 장소는 실리콘 페 트리 접시에 단계에서 어떻게 PDMS 배열 (, 위쪽으로 향하게 하는 유리 슬라이드의 뒤쪽으로) 하단에 마스터 및 열 치료는 PDMS 24−48 h 70−80 ° C 오븐에 접시를 놓고.
  7. 치료 배열 오븐에서 제거 하 고 뒤에서 어떤 과잉 PDMS를 제거 및 유리의 측면 슬라이드 건조 질소의 스트림을 사용 하 여 어떤 느슨한 PDMS 파편을 날 려 신중 하 게 면도날으로 그 후 15 분 동안 냉각 허용.
    참고: 주의 하지 스크래치, 면도날으로 실리콘 마스터가 아닌 스틱 코팅을 손상 수 있습니다.
  8. 1 m m의 깊이에서 배열의 구석으로 면도날을 쐐기와 마스터를 제외 하 고 배열 놀 리 려는 신중 하 게. 단일 연속 드는 액션;에서이 작업을 수행 마스터에 다시가을 배열을 허용 하지 않습니다.
  9. 신중 하 게 잘라내어 면도날으로 배열의 가장자리에서 멀리는 PDMS의 0.5 m m를 다쳤어요. 건조 질소의 시내를 사용 하 여 어떤 느슨한 PDMS 파편 든 지 멀리 날 려.
    참고: stereoscope 또는 돋보기가 트리밍 단계를 수행 하려면 쉽게 수 있습니다. 알아서 하지 스크래치, 면도날으로 실리콘 마스터가 아닌 스틱 코팅을 손상 수 있습니다.

2. 배열 준비 및 기판 장착

  1. O2 플라즈마 처리에 의해 친수성 표면 프로브 배열에 생성 합니다.
    1. 다음 장소 플라즈마 챔버로 페 트리 접시에 PPL 펜 배열 600 mTorr 진공을 적용 됩니다. 플라즈마 발생기 (최대 설정) 30에 스위치 s.
    2. 진공 해제, 배열을 제거 하 고 배열에 이온된 수의 20 µ L를 삭제 하 고 심지어는 물 표면에 걸쳐 확산 있는지 여부를 관찰 하 여 그것의 화란을 확인. 이 발생 하지 않으면, 플라즈마 처리의 두 번째 라운드에 배열을 주제. 그 후, 철저 하 게 건조 질소 가스의 흐름과 함께 배열 건조.
  2. 탄소 이중 면 테이프를 사용 하 여 프로브 홀더의 중간에 배열을 연결 합니다. AFM 운동학 홀더 (그림 2)에 프로브 홀더를 탑재 합니다.
  3. 16-mercaptohexadecanoic 산 (MHA) ('inking') PPL 배열 로드:
    1. 8.6 mg 튜브에서 30 mL 에탄올에 용 해 하 고 10 분 완전히 화합물을 분해 하는 초음파 목욕에서 그것을 배치 하 여 1 m m 16-mercaptohexadecanoic 산 (MHA) 솔루션을 준비 합니다.
      주의: 16 mercaptohexadecanoic 산 독성이 있다. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
    2. 배열에는 micropipette, 보증금 20 µ L 방울 MHA 솔루션을 사용 하 여. 배열 함께 피 펫 팁의 접촉을 피하십시오. 배열에 걸쳐 확산 다음 주위 조건 하에서 증발 하는 에탄올을 허용 하실 수 있습니다.
      참고: 맞춤 자리를 차지 하는 후 PPL 배열 또는 체결 수 있습니다. 10
  4. MHA 솔루션은 건조 되 면 프로브 홀더 AFM에 PPL 배열을 탑재 합니다.

3입니다. PPL에 대 한 골드 기판의 준비입니다.

  1. 금 기판 구입 하거나 수 만든 내부 열 또는 전자 빔 증 착, 그리고 다음 20 2 nm 티타늄 접착 층의 건설 유리 또는 실리콘 웨이퍼에 골드의 nm. 18
  2. 필요한 경우, 산소 플라즈마 처리 단계 1.4에서에서 설명한 매개 변수를 사용 하 여 여는 기판 청소.
  3. AFM 샘플 단계 중간 금 기판 놓고 (그림 2) 기판의 테두리 주위에 접착 테이프로 고정 합니다. Z를 사용 하 여 제조업체의 설명서에 표시 된 대로 올바른 높이에 단계를 조정-축 컨트롤러.

4. 자동 맞춤 펜 배열

  1. 및 모든 축 ('0')를 다시 설정 하려면 컴퓨터에 설치 프로그램 (SetupNSF.exe) 무대 컨트롤러를 실행 및 영점, 미리 보정 하 각도 열고 무대 x를 사용 하 여 /y-축 원하는 맞춤 기판 이동 하려면 컨트롤러 콘솔 / 인쇄 위치입니다. 최적의 결과 대 한 기판 무대의 힘 센서 사이의 무대의 중앙에 배치 되어야 합니다.
    참고: 컴퓨터, x의 일부 모델에서 /y-축 컨트롤러 USB 신호를 방해할 수 있습니다 하는 z-축 컨트롤러. 이 경우 분리 x/y-축 컨트롤러 USB 케이블이 단계 후에. 그것은 다음 정렬 절차 (단계 4.7) 후 다시 연결 해야 합니다.
  2. 전환 단계 릴리스 레버를 샘플 단계를 AFM 제조업체의 지침에 표시 된 대로 힘 센서의 트라이 어 드를 활성화 합니다. 적어도 15 분 동안 equilibrate에 힘 센서를 허용 합니다. 최적의 결과 위해 30-50 분을 허용 합니다.
  3. 기판으로 근접 프로브 배열 및 표면 시각적으로 관찰 하 여 배열을가지고 z 축 높이 늘립니다.
    참고: 가까이 배열 표면에, 적은 반복은 시간 절약 맞춤 과정에 필요한.
  4. 열기/실행 자동 정렬 프로그램 (자동 정렬 v16.exe) 고 프로그램에 관련 된 정렬 매개 변수를 입력 합니다.
    1. 일반적으로 0.15 °, 원하는 ' 각도 단계 ' 매개 변수 값을 입력 합니다. 이 매개 변수는 프로그램에 의해 결정 되는 각 축에 대 한 '최적의' 각도에서 오프셋된 각도입니다. 이 범위 보다 낮은 각도 할 하지 발생할 프로브에의 접근에 따라 명확 하 게 감지 힘 차이 표면에 0.2 °, 0.1 사이의이 매개 변수를 설정 합니다.
      참고: 소프트웨어 허용 값 millidegrees에 (즉,, 1 x 10-3 °). 예를 들어 0.15 °에 대 한 사용자가 '150.'를 입력 한다
    2. 원하는 거친 단계를 입력 ' 매개 변수 값, 일반적으로 0.6 µ m. 이 매개 변수는 초기 거친 정렬에 프로브 접근 단계에서 사용 되는 z 축 단계 크기. 0.2 사이이 매개 변수를 설정 하 고 1 µ m입니다. 크게 크기 감소 시간 맞춤 과정에 대 한 단계 하지만, 맞춤의 정확도 감소 프로브에 착용을 증가.
      참고: 소프트웨어의 마이크로미터 거친 단계 값을 허용합니다. 예를 들어 0.6 µ m에 대 한 사용자가 '0.6'을 입력 한다.
    3. 원하는 ' 좋은 단계 ' 매개 변수 값, 일반적으로 0.2 µ m을 입력 합니다. 이 매개 변수는 최적의 맞춤의 정밀한 조정을 위해 사용 되는 z 축 단계 크기. 대부분의 응용 프로그램에 대 한 0.1 사이이 매개 변수를 설정 하 고 0.4 µ m. 큰 값 단계 크기 맞춤 프로세스에 걸리는 시간을 줄일 것입니다 하지만 맞춤의 품질을 감소.
      참고: 소프트웨어 마이크로미터에서 고급 단계의 값을 허용합니다. 예를 들어 0.2 µ m에 대 한 사용자가 '0.2'를 입력 한다
    4. 'Excel 파일 경로'를 구성 하 고 '폴더' 아이콘을 사용 하 여 파일 위치를 탐색 하 고 '확인'을 누르면 하 여 제공 된 스프레드시트 템플릿 파일의 수정 되지 않은 복사본을 연결 합니다. 이 파일에는 원시 및 계산 데이터를 스테이지의 최적의 단계 기울기 각도 확인 하는 데 사용 되는 포함 되어 있습니다.
  5. 열기/실행 AFM 제어 소프트웨어. 이 프로그램의 분광학 구성 요소 (제조 업체의 지침)에 따라 '분광학' 버튼을 클릭 하 여 이동한 다음 철회 10 µ m 이상의 100 ms에 10 µ m 250 ms의 일시 중지 시간을 100 밀리초 이상으로 발진을 AFM 스캔 헤드 z 축 설정 와 250 ms (그림 3)의 일시 중지 시간.
  6. AFM 머리 진동으로 자동된 정렬 프로세스를 시작 하려면 정렬 소프트웨어의 '시작' 버튼을 클릭 합니다. 프로그램이 실행 되는 소프트웨어 작성 이며 4.4.4 단계에서 설명한 파일에서 데이터를 읽을.
    참고: 맞춤이 걸립니다 30 분 3 h 단계 4.4에서에서 입력 된 단계 4.3 및 소프트웨어 구성에서 설정 하는 초기 위치에 따라.
    주의: 단계 컨트롤러 콘솔은 여전히 활성 맞춤 과정-사용 하지 않는 맞춤 과정 맞춤을 방해 합니다.
  7. 정렬이 완료 되 면, 녹색 불빛이 상자 ' 맞춤 완료 ' (4.4 단계)에서 맞춤 소프트웨어에 점화 해야. 이 경우 정렬 프로세스를 종료 하는 사용자 인터페이스에 '정지' 버튼을 클릭 합니다.
  8. 기록 된 데이터 포인트와 맞는 선 사이의 상관 관계에 대 한 스프레드시트 서식 파일에는 소프트웨어에 의해 생성 되는 그래프를 검사 합니다. > 0.99의 전형적인 R2 값으로 좋은 상관 관계의 예제에 대 한 대표적인 결과 참조 하십시오. 맞춤 성공 하지 않으면 새로 준비 된 배열 (2 단계)와 프로브 배열을 장착 하 고 맞춤 (4.4 단계)를 반복.
  9. Z에서 무대를 위쪽으로 이동-축 스테이지 컨트롤러 콘솔을 사용 하 여 그 축에 대 한. 접촉 AFM의 상위 뷰 카메라에서 관찰 될 수 있다 때까지 500 nm 단위로 무대를 이동 해야 합니다. 배열 및 기판 사이의 접촉 점으로' 화이트' 개별 프로브 피라미드의 꼭대기에서 높은 콘트라스트의 관찰 될 수 있다.
  10. 이 시점에서 단계 4.5에서에서 분광학 프로그램을 중지 AFM 제어 소프트웨어에 '정지' 버튼을 클릭 합니다. 이 따라서 가능한 z 축 확장의 10 µ m를 떠나 10 µ m에 의해 배열을 철회 합니다. AFM 프로브는 기판에 접촉 되도록의 상위 뷰 카메라에서 이미지를 확인 하십시오.

5. 폴리머 펜 리소 그래피 (PPL)

  1. 제어 소프트웨어에 있는 '리소 그래피' 버튼을 클릭 하 여 제어 소프트웨어의 리소 그래피 구성 요소를 이동 합니다. Z선택-변조 운영 모드 및 래스터 (비트맵)를 가져오거나 리소 그래피 패턴으로 사용 될 이미지를 벡터. 대표 결과에 표시 하는 기능을 생성 하기 위해 구성 된 20 x 20 검은 픽셀 (보충 자료 참조), 해당 PPL 배열에 조사 당 20 x 20 점의 격자의 리소 그래피 하는 비트맵을 사용 합니다.
  2. AFM 컨트롤러 소프트웨어의 ' 픽셀 그래픽 가져오기 ' 창에 리소 그래피 매개 변수를 입력 합니다.
    1. 길이 폭에서 생성 될 패턴, 예를 들면, 40 µ m의 '크기'를 구성 합니다. 이 매개 변수는 너비와 길이는 비트맵에서 이미지 조절 됩니다 나타냅니다. 대표 결과에 표시 하는 기능을 생성 하려면 두 차원에서 폭과 40 µ m의 길이 사용 합니다.
    2. Xy 축에 25 µ m에서 생성 되는 패턴의 '원점'을 설정 합니다. 이러한 매개 변수가 AFM x의 중심을 기준으로 이미지의 중심을 결정 /y-축. 프로브 접촉에 맞춤 과정은 표면에의 영역을 피하기 위해이 매개 변수를 설정 합니다.
    3. '매개 변수' 인쇄를 설정 합니다. 이러한 값 결정 어떻게 프로브 (즉 표면 접촉 가져온) 확장 될 비트맵 이미지의 각 픽셀에 대 한 응답에서.
      1. 드롭-다운 메뉴 ' 변조 Abs Z 포스 '와 '단순화에 ' 두 개의 레이어를 선택 합니다. 이 모드는 두 결과, '블랙 (0)' 또는 '화이트 (1)' 필드에 의해 결정 하는 절대 거리에 의해 프로브 연장 AFM을 지시 합니다.
      2. 각각 5,-5 µ m, '블랙 (0)'에 '화이트 (1)' 필드 값 설정. 이러한 값 프로브 비트맵 이미지에 검은색 또는 흰색 픽셀에 대 한 응답에 이동 해야 하는 거리를 결정 하 고 일반적으로 '블랙'에 대 한 3과 5 µ m 설정 (, 그 거리 그 축의 0 지점 기준으로 하 여 아래쪽으로 프로브를 확장) 그리고 '화이트'에 대 한-5 µ m-3 (, 0 포인트를 기준으로 3 ~ 5 µ m에 의해 위쪽으로 프로브를 철회).
        참고: 이러한 대표적인 거리 가정 5 µ m 확장 표면에 접촉으로 오는 프로브 귀착되 고 접촉 생성 기능, 5 µ m 철수 표면에서 프로브를 리프트 하는 동안 발생 하는 따라서. Z-확장 기능 크기를 영향을 줍니다 큰 특징의 결과로 표면에 더 눌러 프로브에 표면, 큰 확장 결과와 프로브 접촉의 범위를 결정 하 여. 10
      3. 이러한 설정을 구현 하 여 창을 닫고 '확인' 버튼을 클릭 합니다.
  3. AFM 제어 소프트웨어, 일반적으로 1의 석판 인쇄 창에서 '정지 시간'을 입력 s. 이 설정은 프로브 0.1 그리고 10 s 사이 설정 일반적으로 확장 된 '블랙' 위치에 유지 하는 시간의 길이 결정 합니다.
    참고: 더 이상 중지 시간 금 표면으로 이송 하는 MHA의 큰 금액으로 인해 더 큰 기능 크기 결과. 기능 생성의 크기 제어에 자세한 내용은 다른 보고서에서 찾을 수 있습니다. 20
  4. 대기 제어 인클로저를 준비 합니다.
    1. AFM에 대기 절연 챔버를 낮추고 열기/실행 대기 제어 제조업체에서 제공한 소프트웨어 (MHG_control.exe).
    2. '유량' 500 mL의 소프트웨어에 이러한 값을 입력 하 여 45%의 상대 습도, 25 ° C의 온도 및 대기 교류를 유지 하기 위해 대기 제어 소프트웨어를 설정 합니다. '사용' 설정을 구현을 클릭 합니다. 대기 제어 모듈 다음 챔버로 습도 공기 펌프를 시작 합니다.
      참고: 높은 습도 레벨 펜 배열 및 표면 사이 생성 된 큰 물 초승달의 형성 때문에 큰 기능 크기 결과. 21 이 값은 일반적으로 40와 60% 사이 설정 됩니다. 유량은 300과 500 mL 사이 일반적으로 설정 됩니다. 큰 흐름 원하는 습도 수준을 더 빠르게 도달 하지만 덜 정확 하다. 대표 결과 습도의 초기 세대에 대 한 500 mL의 유량을 사용 하 고 리소 그래피 동안 정확 하 고 안정적인 수준 유지를 원하는 습도 도달 시 300 mL로 감소.
  5. 일단 원하는 습도 얻은 소프트웨어 인터페이스에 '시작' 버튼을 누르면 석판 시퀀스를 시작 합니다.
  6. 완료 되 면는 리소 그래피, z 축 스테이지 컨트롤러 콘솔 사용 하 여 배열에서 기판 500 µ m에 의해 단계를 축소 하 여 이동. 그 산에서 대기 절연 챔버를 제거 합니다.
  7. AFM 제조업체의 지침에 표시 된 대로 샘플 단계 힘 센서를 비활성화를 단계 분리 레버 전환 다음 무대에서 기판 제거 합니다.

6. 패턴 시각화

  1. 패턴 다음 방법 중 하나를 사용 하 여 구상 될 수 있다, 옆쪽 힘 스캐닝 조사 현미경 검사 법 또는 화학 에칭.
  2. 기능을 비파괴적 검사 연락처 모드 캔틸레버를 사용 하 여 측면 힘 모드와 AFM에 패턴화 된 표면 스캔.
    참고: 측면 힘 현미경 검사 법은 폴리머 펜 리소 그래피;에 의해 생성 하는 기능을 보는 비파괴 방법으로 사용 될 수 있다 그러나,이 방법을 사용 하 여, 상대적으로 작은 영역만 시각된 (일반적으로 100 x 100 µ m) 수 있습니다.
  3. 때문에 예금 된 MHA etch 레지스트로 작동할 수 있다, 화학 에칭 무늬 비 지역에서 금을 제거 하 사용할 수 있습니다. 결과 unetched 영역 다음 광학 현미경 검사 법, 광역을 한 번에 볼 수 있습니다 의미에 의해 구상 될 수 있습니다. 18
    참고:이 방법으로 에칭 기판 다음 아래에 설명 된 후속 세포 배양 실험을 위해 사용할 수 없습니다.
    1. 별도로, 40mm thiourea, 27 m m iron(III) 질 산 및 염 산 100 m m의 수성 해결책을 준비 합니다. 이러한 세 가지 솔루션의 5 mL를 혼합 하 여는 현상을 준비 합니다. 갓 각 사용 전에 혼합. 22
      주의: thiourea, iron(III) 질 산 및 염 산 독성이 있다. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
    2. (일반적으로 10 mL) 기판의 표면을 커버를 접시에 배양 접시와 피 펫 충분 한 현상 솔루션으로 패턴화 된 기판 전송. 4-5 분 15 엣지 빠져들 기판 유지 금 (대략의 속도로 3 nm/min) nm.
    3. 에칭이 완료 되 면 기판 제거와 철저 하 게 물으로 씻어 건조 한 질소의 흐름.
      참고: 에칭 과정의 완료 금 표면 얻은 (3.1 단계) 에칭 속도 지정 (6.2.2 단계)와 관련 된의 두께 의해 결정 됩니다.
    4. 밝은 분야 광학 현미경 검사 법에서 에칭된 골드 기능을 검사 합니다. 남아 있는 나머지 금 기능 (5.2 단계)에서 인쇄 된 패턴에 해당 표시 됩니다. 전체 표면 균질 나타나면이 나타냅니다 골드의 상당한 양이 에칭 단계 (다음 단계 6.2.2) 1-2 분 반복 한다.

7. 패턴 기능화 fibronectin 함께

  1. 에탄올 1 h. 세척 기판에 대 한 에탄올과 3 번에서에서 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) 솔루션의 솔루션으로 패턴화 된 기판 담가 그리고 질소의 스트림 아래 철저 하 게 건조. 이 단계는 총칭된 골드 지역 passivates.
    주의: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) 독성이 있다. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
  2. 10 m m 5 분 Co (3)2 용액 기판 잠수함 다음으로, 솔루션, 초순 물으로 세 번 세척 및 건조 질소의 스트림 아래 건조에서 기판 제거 합니다.
    주의: 공동 (3)2 독성이 있다. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
  3. 기판 fibronectin 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에서 50 µ g/mL 용액에 담가 16 h. 세척 기판 세 번 PBS, 4 ° C에서 품 어 다음 건조 질소의 스트림 아래 기판 건조.
    참고: Fibronectin 바인딩됩니다 Co(II)의 chelation 통해 MHA 공업화 지역에 터미널 carboxylic 산 그룹은 MHA에. 다음 Fibronectin 콜라겐 바인딩 도메인을 통해 Co(II)에 바인딩합니다. 23
  4. 원하는 경우, 형광 항 체와 라벨에 의해 표면 바인딩된 fibronectin 시각화:
    1. 표면에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에서의 5% (w/v)에 1: 100 결합형된 토끼 안티 fibronectin 기본 항 체의 2 mL 솔루션을 적용 하 고 16 h. Aspirate는 상쾌한 4 ° C에서 품 어 PBS로 3 회 세척.
    2. 붙일 활용된 반 토끼 보조 항 (제조 업체의 지정 된 희석, 2 방울/mL)에서 PBS에 BSA의 5% (w/v)의 2 mL 해결책에서 기판 잠수함, 깡통 호 일에 커버 및 1 h. Aspirate에 대 한 실 온에서 품 어는 상쾌한 고 PBS로 3 회 세척입니다.
    3. 기록 epifluorescence 현미경 이미지 여기 필터 제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 사용 하 여 기능의 설정 594 nm.

8. 세포 배양 nanofabricated 표면에

  1. 4 와 6 통로 사이 있는 잘 특징된 hMSCs의 정지를 준비 합니다. 24
    1. 10 mL PBS로 한 번 헹 궈 서 셀의 confluent 플라스 크를 일시 중단, T75 조직 배양 플라스 크에 트립 신/EDTA의 5 mL을 추가 하 여 준수 세포를 해리 하 고 90%까지 최대 5 분의 5% CO2 보충 하는 37 ° C에서 습도 챔버에 플라스 크를 품 어 f 세포 표면에서 분리 됩니다.
    2. 그 후, 6 mL 플라스 크에 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)를 포함 된 신선한 문화 미디어를 추가 하 고 간단히 추가 미디어로 플라스 크를 씻어. 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브와 5 분 400g 25 ° c에서 원심 분리기로 전송 합니다.
    3. 상쾌한을 제거 하 고 신선한 문화 미디어의 3 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
    4. Hemocytometer25 를 사용 하 여 셀 밀도 계산 하 고 문화 미디어의 적절 한 볼륨의 추가 의해 2 × 104 셀/mL로 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.
  2. 시드 104 셀/c m2의 조밀도에 기판에 셀입니다.
    1. 다이아몬드 스크와 1 x 1 c m2 으로 기판을 잘라내어 12 음 조직 문화 접시에 잘에서.
    2. 우물에 (에서 단계 8.1.4) 문화 미디어에 세포 현 탁 액 2 mL를 플라스틱 하 고 5% CO2 24 h에 대 한 보완 하는 37 ° C에서 습도 챔버에 품 어.
  3. 패턴에 세포 성장, 후 셀 첨부와 면역 형광에 의해 확산의 정도 분석:
    1. 미디어를 제거 하 고 한 번 PBS와 기판 세척. 셀 4% paraformaldehyde PBS (37 ° C에 미리 예 열)에서 솔루션의 2 mL와 함께 증기 두건에 PBS 가진 세 번 씻어 20 분 수정.
      주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 이 솔루션으로 작업 하기 전에 MSDS를 읽어 보시기 바랍니다. 화학 물질을 처리 하는 동안 안전 장비를 착용 해야 합니다.
    2. 0.5% 세제의 솔루션의 2 mL로 세포를 permeabilize ( 재료의 표참조)에서 15 분 동안 PBS, 다음 PBS 세 번 씻어.
    3. 결합형된 토끼 안티 fibronectin 1 차적인 항 체의 5% (w/v) BSA PBS에서 1: 100 희석에의 한 솔루션의 2 mL에 기판 잠수함 16 h, 4 ° C에서 품 어 다음 0.1% (v/v) 트윈 20 PBS (PBST)로 세 번 세척.
    4. 이후 잠수함 붙일 활용된 반 토끼 이차 항 체 (5% (w/v) BSA PBS에 제조 업체의 지정 된 희석, 2 방울/mL에 희석)의 솔루션의 2 mL에 기판, 깡통 호 일에 커버와 1 시간 실 온에서 품 어 다음 0.1%로 세 번 세척 PBST.
    5. 말라 필 라 멘 트를, 2 mL PBS에서 1: 250의 희석에 놓여있는지 활용된 phalloidin의 잠수함, 깡통 호 일에 커버 30 분 동안 4 ° C에서 품 어 그리고 PBS로 3 회 세척.
    6. 동시에 세포 핵 얼룩 하 고 중간 포함 DAPI와는 coverslip로 커버를 장착 한 방울을 적용 하 여 기판 탑재.
  4. 365의 여기 필터 제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 시각화 nm 핵 (DAPI), 488에 대 한 F-말라 및 594 nm nm fibronectin에 대 한.

Representative Results

자동된 맞춤 성공 했다 여부 확인, (단계 4.8에서에서 스프레드시트)의 맞춤 데이터에서 플롯 그래프 시험 되었다. 맞춤 과정 성공 했다 어디에 해당 하는 샘플 단계 θ와 φ 축 따라 기울어져 되었습니다 있다 각도 두 개의 플롯 일련의 상승 및 하강 하는 데이터 요소를 보여주었다. 음모의 각 데이터 포인트의 2 개의 선형 맞는 보였다 "피크" 최대 z를 나타내는 잘 정의 된 교차-확장 및 해당 각도를 맞춤은 달성 (그림 4A 및 4B). 이 과정은 반복된 4 시간 (, 각 축에 대 한 두 번)와 4 개의 좌표 집합으로 꾸몄다. 좌표의 각 쌍의 교차로 따라서 전반적으로 최적의 각도 (그림 4C)을 보여 줍니다. 13 경우 맞춤은 성공 하지, 그것은 관찰할 수 있습니다 그들의 해당 θ와 φ 각도 플롯 좋은 품질 선형 적합에 영향을 주지 않는다 또는 (그림 5) 교차 하지 않습니다. 같은 실패 한 정렬 잘못 손질 또는 프로브 홀더 (단계 1.7, 1.8, 2.2)에 장착 되 고 배열 결과로 일반적으로 있다. 이 경우 배열 삭제 된 새로운 하나를 준비 하 고 (단계 1 및 2)를 탑재, 그리고 맞춤 과정 (4 단계)를 반복.

성공적인 정렬 및 ppl MHA와 리소 그래피, 패턴된 골드 기판 했다 다음 측면 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 증 착 했다 자리를 차지 하 고 있다 여부를 확인할 하 몇 군데. 인쇄 표면의 더 큰 지역 시험 또한 입금된 thiol (그림 6그림 7)에 의해 보호 되지 골드의 에칭 후는 기판의 광학 현미경에 의해 실시 되었다. 그러나, 에칭된 패턴 추가 기능화에 사용할 수 없습니다 그리고만 인쇄 표면 기판의 배치의 대표 샘플에 패턴을 확인 하는 데 사용 한다. 에칭된 패턴 개별 펜 (그림 8)에 해당 하는 빈 영역을 표시,이 결과 프로브 배열의 생산 성공적으로 완료 하지 않은 그리고 몇몇 프로브는 손상 되거나 손실 된 나타냅니다. 프로브의이 이질성이 어디 perfluorinated 코팅은 마모 (1.3 단계)는 옛 마스터의 사용 될 수 있습니다 일부 프로브 배열 마스터에서 분리 될 때 멀리 찢어진 되 고 그 결과. 이러한 경우에는 새 마스터를 사용 해야 합니다. 거품 유리 백업 및 마스터 (1.5), 단계 사이 갇혀 또는 경우 프로브 배열 하지 완전히 분리 된 마스터에서 (단계 1.8) 치료 후 결과 공기의 존재로 인해 수도 있습니다.

Fibronectin 기능성된 표면 incubated hMSCs는 또한의 형광 현미경 이미지 수집 (그림 9). 일반적으로, 모든 기판 했다 생체 외에서 문화 환경 내에서 안정 하 고 셀 준수 작은 고립 된 20 x 20 배열 기능의 경우 인쇄 패턴에 그들의 형태를 적응.

Figure 1
그림 1입니다. 프로브 팁에 물 초승달 모양 분자 잉크 전송 통해 보여주는 폴리머 펜 리소 그래피의 도식 대표. (A) 측면도 및 (B) 고분자 펜 배열 평면도 프로브 배열 및 표면 기판 완벽 하 게 정렬 하 고 때 모든 프로브 접촉 표면 동시에 병렬된 리소 그래피 결과 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 폴리머 펜 리소 그래피의 회로도 설정 최대 (A) 확장된 측 준비 조사 배열 홀더 프로브에 연결 되 고 AFM 스캐너에 장착 되 실험 설정 보기 기판에 스테이지에 배치, 위치는 아래 3 개의 힘 센서. (샘플 단계 상대적인 AFM 스캔 헤드를 보여주는 조립된 계측 B) 한 표현입니다. (C) 아래 보기 힘 센서 위치를 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 회로도 표현을 정렬 절차에 대 한 분광학 프로그램 묘사. AFM 스캐너는 10 µ m 100 ms 이내 250 ms에 대 한 위치에서 개최 100 ms 이내 10 µ m의 철회 및 끌어 넣어진된 위치에서 250 ms에 대 한 개최의 거리에 의해 샘플을 향해 프로브를 이동 하도록 설정 됩니다. 모션 다음 맞춤 과정을 통해 반복 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 그래프 보여주는 성공적인 정렬. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B) 성공적인 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 교차점 표시 두 축에 걸쳐 최종 최적 기울기 각도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 실패 한 줄 맞춤을 설명 하는 그래프. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B)는 실패 한 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 아니 분명 옵 티 마 또는 교차점 관찰 되 고 따라서 최적의 정렬 각도 확인 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. 설명 광학 현미경, 원자 힘 현미경 이미지 MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의. (A)와 (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 이미지 에칭 패턴; (C)는 패턴의 단일 격자의 AFM 지형 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (A) (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 에칭된 패턴의 이미지와 (C)는 낮은 확대 이미지 균질 패턴 큰 영역 표시입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8입니다. 하 여 균등 하지 MHA 패턴 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (표시는 삽입) 의도 패턴 z증가 제작한 모든 두 라인 20 줄 정렬 20 도트 라인의 격자를 반복 했다-1 µ m (5에서-5 µ m에 배열 되는)에 의해 축 확장. 그것은 그 일부 지역에서 아무 패턴 생성 되, 그 위치에 누락 된 프로브 때문 볼 수 있습니다. 점의 두 라인은 생산 영역에서이 결과 나타냅니다 프로브는 존재 하지만 그것은 완벽 하 게 작동 프로브와 같은 높이의 유일한 예금 배열의 전체 z확장 기능-축 거리. 이 이미지에서 대비 의도적으로 부분적으로 인쇄 영역의 관찰 수 있도록 변경 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9입니다. PPL에 의해 템플릿 fibronectin 배열에 경작 하는 hMSCs의 Epifluorescence 현미경 이미지. (A)와 (B)는 고배율 이미지 표시 개별 셀. (C) 셀와 (D)은 (인쇄 된 패턴의 회로도 속지에도 표시) 그리드 배열에서 경작 하는 세포의 넓은 필드 이미지를 부착 하지 않고 fibronectin 배열의 예제 패턴 보여준다. 셀은 fibronectin (빨강), F-말라 (녹색)으로 표시 하 여 세포 핵 (블루) 얼룩이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜 nanolithographic 대형에 높은 균일성 및 제어 기능 크기 패턴화 빠르게 수행 하기 위해 편리한 방법을 사용자에 게 제공 하는 역할 (cm2) 지역. 이러한 큰 지역 nanopatterns 베어링 기판 다양 한 응용 프로그램에 대 한 더 정교 수 다음. 이 기술의 주요 응용 프로그램 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 nanofabricated 표면에의 세대입니다. 이 보고서는 nanofabricated 기판에 의해 hMSC 형태학의 제어를 보여주는 이러한 자료에 세포 배양의 몇 가지 설명을 예를 보여줍니다.

이 프로토콜의 주요 원동력은 허용 매우 균일 하 고 높은 처리량 생산 기능의 표면, 세포 배양 실험의 급속 한 회전율을 가능 하 게 나노 해상도 아래에 정렬 절차 (4 단계)의 자동화. 이 정렬 알고리즘을 사용 하 여 실시 하는 폴리머 펜 리소 약 30 분 이내 나노 기능을 생성 할 수 있다. 그러나 재현성 및 자동된 정렬의 정확도 그리고 이렇게 꽃무늬 기능의 균일성은 프로브 배열의 품질에 따라 (단계 1 및 2)를 생산 하는 비판적 이다. 무딘, 손상 또는 누락 된 프로브; 귀착되는 그들의 준비에 어떤 결함 갇힌된 공기 등 거품 (1.5 단계) 또는 마스터 (단계 1.8)에서 프로브의 부적절 한 분리는 부정확 한 정렬 및 품질이 리소 그래피에서 발생할 수 있습니다.

이 포스 피드백에 의존 하는 다른 정렬 방법 함께 제한을 공유 하는 방법 보고. 표면 접촉 프로브는 때의 정확한 결정은 주변 환경 및 샘플 무대의 움직임으로 인 한 배경 진동에 대 한 계정이 필요에 의해 제한 됩니다. 일반적으로 센서 µN 정권 (이 경우 2 µN)에 있는 힘 감도 있지만 정렬 알고리즘은만 어떤 '오판' resul 피하기 위해 프로브, 표면 사이의 확실 한 접촉으로 적어도 490 µN의 힘을 등록 하도록 배경 잡음 으로부터 ting 보통. 13 따라서,이 메서드는 큰 특징 (1-2 µ m)를 생산 하 경향이 있다. 프로브 z에 큰 거리를 확장 해야 합니다 이후-축 (결과 높은 힘)와 연락처를 등록 하기 위하여. 보상 하기 위하여 더 작은 기능 z를 줄임으로써 생성 될 수 있습니다-축 거리 여행 단계에서 리소 그래피 (예를 들어, 5 µ m 대신 3 µ m로 '검은' 설정 단계 5.2.3.2에서에서 입력).

그럼에도 불구 하 고, 심지어이 제한 자동화 알고리즘은 병렬화 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법의 응용 프로그램에서 중요 한 측면을 해결할 수 정렬 가장 시간을 요구 하 고 부정 확 한 단계에 이전 되면서는 이러한 기술 구현 합니다. 지금이 자동화 석판 작성 자체는 정렬에서 제조 프로세스의 속도 제한 단계를 이동 합니다. 이 프로토콜은 ppl이 정렬 절차의 응용 프로그램을 보여 줍니다, 하는 동안 프레임 워크 다양 한 지질 DPN26 매트릭스를 이용한 리소 그래피27 뿐만 아니라 잠재적인 미래 촉매 SPL 기법에 적용 될 수 있습니다. 프로브 시스템입니다. 28

Disclosures

정렬 알고리즘 및 소프트웨어에 의해, 개발 되었다 고 독점, 맨체스터 대학. 그것은 http://www.click2go.umip.com/에서 다운로드할 수 있습니다.

Acknowledgments

저자 인정 소스는 영국 공학 및 물리 과학 연구 협의회 (부여 심판 등의 다양 한 금융 지원. EP/K011685/1, EP/K024485/1)와 JH;에 대 한 대학원 재학 Leverhulme 트러스트 (롤플레잉-2014-292); Wellcome 신뢰 기관 전략적 지원 기금 (105610/Z/14/Z); 영국 문화원 (216196834); 그리고 맨체스터 대학의 맨체스터 연구소 (하루 펌프 못쓰게 기금)와 박사 안드레아스 리브 (Nanosurf AG)에 의해 남서 기술 원조에 대통령 박사 장학금 대학에 대 한 또한 기꺼이 인정 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진
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Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

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