Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Stor-området skanning sonde Nanolithography tilrettelagt av automatiserte justering og dens anvendelse til underlaget fabrikasjon for cellen kulturstudier

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for regionnett skanning sonde nanolithography aktiveres av iterativ justeringen av sonden matriser, samt bruken av litografiske mønstre for celle-overflate samhandling studier.

Abstract

Skanning sonde mikroskopi har aktivert etableringen av en rekke metoder til konstruktiv ('additiv') topp-ned fabrikasjon av nanometer-funksjonen. Historisk, har en stor ulempe skanning sonde litografi vært det egentlig lav overføringshastighet enkelt sonde systemer. Dette har blitt håndtert ved bruk av matriser med flere sonder aktivere økt nanolithography gjennomstrømning. For å implementere slike parallelized nanolithography, nøyaktig justering av sonden matriser med substrat overflate er viktig, slik at alle sonder kontakt med overflaten samtidig når litografisk mønstre begynner. Denne protokollen beskriver bruken av polymer penn litografi å produsere nanometer-funksjonen over centimeter store områder, tilrettelagt av bruk av en algoritme for rask, nøyaktig og automatisk justering av sonden matriser. Her viser nanolithography av thiols på gull underlag generering av funksjoner med høy ensartethet. Disse mønstrene er så functionalized med fibronectin for bruk i forbindelse med overflaten-rettet cellen morfologi studier.

Introduction

Fremgang i nanoteknologi er avhengig av utviklingen av teknikker i stand til å effektivt og pålitelig fabrikere nanoskala funksjoner på overflater. 1 , 2 imidlertid generere slike funksjoner over store områder (flere cm2) pålitelig og relativt lav kostnad er en ikke-triviell oppgave. De fleste eksisterende teknikker, avledet fra semiconductor industry, stole på ablative klima og jordsmonn å dikte "harde" materialer. Flere nylig, litografisk teknikker utledet fra skanning sonde mikroskopi (SPM) har dukket opp som en praktisk og allsidig tilnærming for rask prototyping nanoskala design. 3 SPM-baserte teknikker kan enkelt og raskt 'skrive' alle brukerdefinerte mønster. Den mest kjente av disse er dip-penn nanolithography (DPN), utviklet av Mirkin et al.,4 der en skanning probe brukes som en 'Penn' overføre en molekylær "blekk" til overflaten produsere funksjoner på en måte analog til skriving. Under forholdene, som en sonde er skannet på en overflate "blekk" molekylene er overført til den overflate via en vann menisk som danner mellom sonden og overflaten (figur 1). DPN dermed lar nanolithographic avsetning av en rekke materialer, inkludert "myke" materialer som polymerer og biomolecules. 5 relaterte teknikker bruker sonder konstruert med kanaler for væskestrømmen, blant annet referert til som "nanopipettes" og 'nano-fountain penner', har også blitt rapportert. 6 , 7 , 8

Den største hindringen til bredere anvendelse av SPM-avledet litografi er produksjon, som det krever en svært lang tid å mønster centimeter skala områder med en enkelt sonde. Tidlige forsøk på å løse dette problemet fokusert på parallelization av cantilever-baserte DPN, med både "en-dimensjonale" og "to-dimensjonale" (2D) sonde matriser rapporteres for litografi centimeter store områder. 5 , 9 men disse cantilever matriser er produsert gjennom relativt komplisert må fabrikasjon metoder og er relativt skjøre. Oppfinnelsen av polymer penn litografi (PPL) adressert dette problemet ved å erstatte de standard SPM utkragning med en 2D rekke myk siloxane elastomer sonder limt til et glass lysbilde. 10 enkle sonde installasjonen betydelig reduserer kostnadene og kompleksiteten av mønstre store områder, åpne opp nanolithography for flere programmer. Denne cantilever-fri arkitekturen har også blitt utvidet til hard-tip myk våren litografi,11 som gir en hybrid av myke cellegummi støtte vanskelig silisium tips gir forbedret oppløsning i forhold til mønstre produsert med myke elastomer tips.

En avgjørende faktor i utførelsen av disse 2D matrise teknologiene er at sonden matrisen må være nøyaktig parallell til overflaten underlaget slik at når litografi benyttes, alle sonder kommer i kontakt med overflaten samtidig. Selv en liten forskyvning kan føre til en stor aldersforskjell mønsterstørrelsen fra en side av matrisen til den andre, siden noen sonder komme i kontakt med overflaten tidligere under nedstigningen av array, mens andre vil komme i kontakt senere eller ikke i det hele tatt. 12 nøyaktig justering er spesielt viktig med PPL på grunn av deformability av myke elastomer sonder, der sonder kontakter overflaten tidligere komprimeres, forlate en større fotavtrykk på overflaten.

Det tidlige arbeidet på PPL ansatt rent visuell inspeksjon til justering prosessen, bruker et kamera montert over array for å observere deformasjon av pyramideformet sonder som de ble ført i kontakt med overflaten. 10 justeringen ble dømt av observere hvilken side av sonder kom i kontakt med overflaten først, og deretter justere vinkelen og gjenta prosedyren i en iterativ måte før forskjellen i kontakt på hver side av sonden var utvisket til øyet. Som denne justeringsprosedyren er avhengig av subjektive visuell inspeksjon av operatøren, er reproduserbarhet lav.

Deretter er en mer objektiv tilnærming utviklet, bestående av en kraft-sensor montert i substratet måle kraften ved kontakt av sonder på overflaten. 12 justeringen ble dermed oppnådd ved å justere tilt vinkler for å maksimere kraften, som indikerte at alle sonder hadde samtidig kontakt. Denne metoden viste at justeringen til innen 0.004° av overflaten parallell var mulig. Denne 'force feedback flate"er nå implementert i helautomatisk systemer i to uavhengige rapporter. 13 , 14 både bruke en triaden av force sensorer montert i substratet eller over matrisen og måle mengden av kraft ved kontakt mellom sonde matriser og overflaten. Disse gir høy presisjon, rapportering avvik ≤0.001 ° 1 cm lengde skala,14 eller ≤ 0.0003 ° over 1.4 cm.13 systemene automatisk justering gir også store besparelser i operatørtiden og totale tiden det tar å fullføre den Litografi prosessen.

En stor anvendelse av høy gjennomstrømming overflaten fabrikasjon aktiveres av denne teknologien er generasjon av celle kultur underlag. Det er nå godt etablert at cellen fenotypen kan manipuleres ved å kontrollere første samspillet mellom cellene og overflaten, og at dette kan forsterkes på nanoskala. 15 spesielt sonde litografi skannemetoder har vist seg å være en lettvint metode for å produsere en rekke nanofabricated overflater for slike cellekulturer eksperimenter. 16 For eksempel overflater presentere nanoskala mønstre selv montert monolayers og ekstracellulær matrix proteiner mal av PPL og DPN har blitt brukt til å studere potensialet i nano-endret materialer i materiale indusert differensiering av stamceller. 17

Denne protokollen beskriver bruken av et modifisert atomic force mikroskopet (AFM) system som gjør store området PPL. Vi detalj påvisning av kraft med flere makt sensorer som middel for å bestemme probe-overflate kontakt, sammen med en algoritme som automatiserer repeterende justering. Påfølgende functionalization av disse mønstrene med ekstracellulær matrix proteiner fibronectin og kultur menneskelige mesenchymal stamceller (hMSC) er beskrevet, som en demonstrasjon av PPL-fabrikkert flater brukes for cellekultur.

Protocol

1. fabrikasjon av PPL penn matrisen

  1. Forberede polydimethylsiloxane (PDMS) copolymer blandingen:
    1. Legge til 10 µL av platina (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane kompleks løsning og 172 µL av 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane til 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane co polymer. Bland disse komponentene grundig på en roterende mikser i 7 dager for å sikre at homogen blanding.
      FORSIKTIG: platinum (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane er giftig. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
    2. Legge til 0,5 g (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane co polymer en 1,7 g delen av blanding fra trinn 1.1.1 en veiing båt og bland godt med en slikkepott.
    3. Degas denne blandingen av overfører den til et vakuum desiccator og utsette blandingen til lavt trykk (200 mTorr, 0,3 mBar) for 20 min før alle gassboblene har borte.
  2. Sted et 13 x 13 mm glass lysbilde i en plast skruen-toppet hetteglass fylt med 20 mL 2-propanol, deretter plassere ampullen i ultralydbad i 10 min å fjerne eventuelle store rusk. Vask lysbildene av submerging lysbildene i fersk 2-propanol (100 mL) og tørr under en strøm av nitrogen gass.
  3. Plassere en silicon master18 i en 4 cm diameter Petriskål og Legg tilstrekkelig degassed PDMS prepolymer blanding (fra trinn 1.1) til helt dekket. Vanligvis kreves 100 µL for en 20 x 20 mm master. Plass originalen med prepolymer blandingen i et vakuum dessicator. Degas polymer for ytterligere 5 min fjerne gassbobler dannet under overføring av blandingen. O2 plasma behandling av glass lysbilder (trinn 1.4 nedenfor) skal utføres mens avgassing pågår.
  4. Behandle glass rutene med O2 plasma (600 mTorr) på maks RF effekt for 1 min å fjerne alle organisk forurensning og generere et ensartet oksid lag på glass for vedheft av elastomer. 19 bruk plasma behandlet lysbilder umiddelbart i neste trinn.
  5. Forsiktig plassere den firkantede objektglass (fra trinn 1.4) over prepolymer i malen (fra trinn 1.3) med plasma-renset side ned. Trykk forsiktig ned av objektglass på silisium master å fjerne alle innestengte luften og sikre en ensartet film av PDMS er klemt mellom master og lysbildet.
  6. Sted klemt PDMS matrisen ovenfra skritt i en Petriskål med silisium mestre nederst (dvs.med baksiden av objektglass vendt oppover) og plasser rett i en ovn ved 70−80 ° C 24−48 h termisk Cure PDMS.
  7. Fjerne herdet matrisen fra ovnen og la avkjøles 15 min, og med et barberblad nøye fjerne alle overflødig PDMS fra baksiden og sidene av glasset Skyv og bruke en strøm av tørr nitrogen til å blåse bort alle løs PDMS partikler.
    Merk: Sørg for ikke å avlyse silisium mesteren med barberblad, da dette kan skade non-stick belegg.
  8. Kile et barberblad i hjørne av matrisen i en dybde på 1 mm og forsiktig lirke matrisen fra master. Utfør denne handlingen i et enkelt sammenhengende løfte handling. Tillat ikke matriser til å falle tilbake på master.
  9. Nøye klipp og skrape bort 0,5 mm i PDMS på kantene av matrise med et barberblad. Bruk en strøm av tørr nitrogen til å blåse bort alle løs PDMS partikler.
    Merk: Det kan være enklere å utføre denne trimming trinn under stereoscope eller et forstørrelsesglass. Ta vare ikke å klø silisium mesteren med barberblad, da dette kan skade non-stick belegg.

2. array forberedelse og underlaget montering

  1. Generere en hydrofile overflate sonde matrisen ved O2 plasma behandling:
    1. Plasser PPL penn matrisen i en Petriskål i plasma kammeret deretter bruke vakuum til 600 mTorr. Slå på plasma generator (maksimal innstilling) for 30 s.
    2. Frigi vakuum, fjerne matrisen og kontrollere sin hydrophilicity ved å slippe 20 µL deionisert vann på matrisen og observere om det er selv spredning av vannet over overflaten. Hvis dette ikke skjer, underlagt matrisen til en ny runde med plasma behandling. Etterpå tørr matrise grundig med en strøm av tørr nitrogen gass.
  2. Bruke dobbeltsidig karbon bånd, knytte matrise på midten av sonden holderen. Montere sonde abonnenten til AFM Kinematisk holderen (figur 2).
  3. Laste PPL matrisen med 16-mercaptohexadecanoic syre (MHA) ("håndskrift"):
    1. Klargjør 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA) løsning ved oppløsning 8.6 mg i 30 mL etanol i et rør og plassere den i ultralydbad for 10 min å fullstendig løse opp sammensatt.
      FORSIKTIG: 16-mercaptohexadecanoic syre er giftig. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
    2. Bruker brønnene, innskudd 20 µL dråpe MHA løsningen på matrisen. Unngå kontakt med pipette-spisser med arrayene. La det spredt over hele matrisen, og at etanol å fordampe under forholdene.
      Merk: PPL matrisen kan også bli svertet etter justeringen har funnet sted. 10
  4. Når MHA løsningen har tørket, montere sonde holderen med PPL matrise på AFM.

3. forberedelse av gull underlag for PPL.

  1. Gull underlag kan enten kjøpt eller laget internt av termisk eller elektron strålen avsetning, og er laget av et 2 nm Titan vedheft lag etterfulgt av 20 nm gull på et glass eller silisium wafer. 18
  2. Der det er nødvendig, rent substrater av oksygen plasma behandling med parameterne som beskrives i trinn 1.4.
  3. Plasser gull underlaget i AFM utvalg scenen og sikre med teip grenser av underlaget (figur 2). Juster prosjektstadium til riktig høyde som angitt i produsentens bruksanvisningen bruker z-aksen kontroller.

4. automatisk justering av pennen matrise

  1. Åpne og kjøre scenen kontrolleren installasjonsprogrammet (SetupNSF.exe) på datamaskinen for å tilbakestille ('null') alle akser og vinkler til en pre kalibrert nullpunktet, så bruker du trinn x/y-aksen kontroller konsollen flytte underlaget til ønsket justering / utskriftssted. For optimale resultater plasseres underlaget nær sentrum av scenen, mellom scenens kraft sensorer.
    Merk: I enkelte modeller av datamaskinen, x/y-aksen Kontroller USB signal kan forstyrre som fra z-aksen kontroller. Hvis dette skjer, koble x/y-aksen Kontroller USB kabel etter dette trinnet. Det bør deretter kobles etter justeringsprosedyren (trinn 4.7).
  2. Bytte scenen utløserspaken for å frigi utvalg scenen og aktivere triaden av force sensorer som indikert av AFM produsentens instruksjoner. Tillate kraft sensorer til equilibrate i minst 15 min. For optimale resultater, tillate 30-50 minutter.
  3. Øke z høyden for å få matrisen i nærheten med underlaget ved visuelt observere sonde matrise og overflate.
    Merk: Jo nærmere matrisen er til overflaten, færre gjentakelser er nødvendige for justeringen prosessen, og dermed spare tid.
  4. Åpne/kjøre programmet automatisk justering (automatisk justering v16.exe) og skriv inn relevante justering parametere i programmet.
    1. Angi ønsket "vinkel trinn" parameterverdi, vanligvis 0,15 °. Denne parameteren er forskjøvet vinkelen fra "optimal" vinkelen for hver akse som bestemmes av programmet. Angi denne parameteren mellom 0,1 og 0,2 °, som vinkler lavere enn dette området ikke resultere i en tydelig synlig kraft forskjell på tilnærming av sonder til overflaten.
      Merk: Programvaren godtar verdiene i millidegrees (dvs., 1 x 10-3 °). For eksempel for 0,15 °, bør brukere input "150."
    2. Innstigning det ønsket grov trinnet ' parameterverdi, vanligvis 0.6 µm. Denne parameteren er størrelsen på z-trinn brukes av scenen som den nærmer sonder i første grov justeringen. Setter parameteren mellom 0,2 og 1 µm. større trinn størrelser redusere tiden justeringen prosessen men redusere nøyaktigheten av justeringen og øke slitasjen på sonder.
      Merk: Programvaren godtar verdier av grov trinnene i mikrometer. For eksempel for 0.6 µm inn brukere '0,6'.
    3. Angi ønsket "Fine trinn" parameterverdien, vanligvis 0,2 µm. Denne parameteren er størrelsen på z-trinn brukes for finjustering av optimale justeringen. De fleste programmer setter parameteren mellom 0,1 og 0,4 µm. større verdi trinn størrelser vil redusere tiden det tar for justeringen prosessen, men redusere justeringen.
      Merk: Programvaren godtar verdier av fine trinnene i mikrometer. For eksempel for 0,2 µm, bør brukere input "0,2."
    4. Konfigurere den Excel filbanen og fest en uendret kopi av malfilen gitt regneark ved å bruke ikonet "mappen", navigerer til filplasseringen og trykke "OK". Denne filen inneholder rå og beregnede dataene som brukes til å bestemme optimal scenen tilt vinkler av scenen.
  5. Åpne/kjøre Kontrollprogramvaren AFM. Naviger til komponenten spektroskopi av dette programmet ved å klikke "spektroskopi" (i henhold til produsentens instruksjoner), og angi AFM skanning hodet z å svinge av 10 µm over 100 ms, med en pause av 250 ms, deretter for å trekke 10 µm over 100 ms med en pause av 250 ms (Figur 3).
  6. Som AFM hodet er oscillerende, klikker du "start"-knappen for justering programvaren å starte automatisk justering prosessen. Når programmet kjører er programvaren skrive og lese data i filen beskrevet i trinn 4.4.4.
    Merk: Justering tar mellom 30 min og 3 timer avhengig av innledende stadium posisjon i trinn 4.3 og programvarekonfigurasjon som ble angitt i trinn 4.4.
    FORSIKTIG: Scenen kontrolleren konsollene er fortsatt aktiv i justeringen prosessen - bruk ikke dem i justeringen prosessen som det vil forstyrre justeringen.
  7. Når justeringen er ferdig, vil du lyse grønt lys boksen 'Justering fullført' justering programvaren (fra trinn 4.4). Når dette skjer, klikker du på "Stopp" knappen i brukergrensesnittet til slutt justeringen prosessen.
  8. Inspisere av grafene i regneark malfilen for en sammenheng mellom registrerte data og linjen passer som genereres av programvaren. Se representant resultater for eksempler på en god sammenheng, med R2 verdiene i > 0,99. Hvis justeringen er vellykket, erstatte sonde matrisen med en nylig utarbeidet matrise (trinn 2) og gjenta justeringen (trinn 4.4).
  9. Flytte scenen oppover i z-aksen ved hjelp av scenen kontrolleren konsollen for denne aksen. Scenen skal flyttes i 500 nm intervaller før kontakten kan observeres fra topp utsikt kameraet av AFM. Kontakt mellom matrise og underlaget kan observeres som en "hvit prikk" av høy kontrast på toppen av personlige sonde pyramidene.
  10. På dette punktet, klikk 'opphøre' på AFM kontroll programvare å stoppe programmet spektroskopi fra trinn 4.5. Dette vil trekke matrisen av 10 µm, derfor forlate 10 µm mulig z-utvidelsen. Sjekk bildet fra topp utsikt kameraet av AFM slik at sonder ikke er i kontakt med underlaget.

5. polymer penn litografi (PPL)

  1. Naviger til komponenten litografi av Kontrollprogramvaren ved å klikke 'litografi' på programvare. Velg z-modulering driftsmodus og importere en rasterbilder (punktgrafikkbilder) eller vektor bilde som skal brukes som litografi mønsteret. For å generere funksjonene i representant resultatene, kan du bruke punktgrafikk består 20 x 20 svart piksler (se supplerende materiale) tilsvarer litografi av et rutenett med 20 x 20 punkter per sonde på PPL matrisen.
  2. Angi parameterne litografi i vinduet "Pixel Grafikkimport" av den AFM programvaren.
    1. Konfigurere nummeret '' av mønsteret skal genereres, f.eks, 40 µm i lengde og bredde. Parameterne angir bredde og lengde som bildet i bildet skal skaleres. Vil generere funksjoner vises i representant resultatene, kan du bruke en bredde og lengde på 40 µm i begge dimensjoner.
    2. Angi "Opprinnelsen" til mønsteret skal genereres på 25 µm på både x - og y -aksen. Disse parameterne bestemmer midten av bildet i forhold til midten av AFM x/y-akser. Angi parameterne å unngå regionen overflaten der sonder var i kontakt under justering prosessen.
    3. Angi utskrift "Parameters". Disse verdiene avgjør hvordan sonder skal utvides (altså brakt i kontakt med overflaten) svar på hvert bildepunkt i punktgrafikkbildet.
      1. Velg fra rullegardinmenyen 'Modulering Abs Z Pos' og 'Forenkle til' to lag. Denne modusen instruerer AFM utvide sonder en absolutt avstanden bestemmes av bare to resultater, enten "Svart (0)" eller "Hvit (1)" felt.
      2. Angi verdier i feltene "Svart (0)" og "Hvit (1)" til 5 og-5 µm, henholdsvis. Disse verdiene bestemmer avstanden sonder skal flyttes som svar på en svart eller hvit piksel på punktgrafikkbildet og er vanligvis mellom 3 og 5 µm for 'Svart' (dvs., utvide sonder nedover etter at avstanden i forhold til nullpunktet aksen) og 3 til-5 µm for 'Hvit' (dvs.ta ut sonder oppover av 3 til 5 µm i forhold til nullpunktet).
        Merk: Disse representant avstander anta at filtypen 5 µm resulterer i sonder kommer i kontakt med overflaten og dermed generering av en funksjon, mens en 5 µm tilbaketrekning løfter sonder fra overflaten resulterer i noen kontakt. Z-utvidelse påvirker mønsterstørrelsen ved fastsettelsen av omfanget av sonden kontakt med overflaten, større utvidelser resultatet i sonder trykkes videre til overflaten, noe som resulterer i større funksjoner. 10
      3. Klikk "OK" for å implementere disse innstillingene og lukke vinduet.
  3. Angi "pausetid" i vinduet litografi av AFM kontroll programvare, vanligvis 1 s. Denne innstillingen bestemmer hvor lenge sonder stå i utvidet 'Black' stilling, som ligger vanligvis mellom 0,1 og 10.
    Merk: Lengre pause tid føre til større funksjonen str pga den store mengden av MHA transportert til gull overflaten. Ytterligere detaljer om kontroll av størrelsen av funksjoner generert kan finnes i andre rapporter. 20
  4. Forberede atmosfæriske kontroll skapet.
    1. Redusere atmosfæriske isolasjon kammeret til AFM, og åpne/kjøre programmet leverandørleverte atmosfæriske kontroll (MHG_control.exe).
    2. Angi den atmosfæriske programvaren for å opprettholde relativ luftfuktighet på 45%, en temperatur på 25 ° C og en atmosfære utveksling "Flow rate' 500 ml ved å angi disse verdiene i programvaren. Klikk "Bruk" for å implementere for. Atmosfærisk kontrollmodulen vil da begynne å pumpe fuktet luft inn i kammeret.
      Merk: Høyere fuktighet nivåer medføre større funksjonen str pga dannelsen av en større vann menisk generert mellom pennen matriser og overflaten. 21 denne verdien angis vanligvis mellom 40 og 60%. Infusjonshastigheten ligger vanligvis mellom 300 til 500 mL. Større vannmengder tillate ønsket luftfuktigheten nås raskere, men er mindre nøyaktige. Representant resultatene bruk en strømningshastighet på 500 mL for første generasjon av fuktighet og senkes til 300 mL ved å nå ønsket fuktighet, for å opprettholde en nøyaktig og stabil under litografi.
  5. Når ønsket fuktighet er oppnådd, kan du starte litografisk sekvensen ved å trykke på "start"-knappen på port.
  6. Ved ferdigstillelse av litografi, bruke z scenen kontrolleren konsollen flytte underlaget fra matrisen ved trekke scenen av 500 µm. Deretter fjerne atmosfæriske isolasjon kammeret fra sin mount.
  7. Skru scenen utløserspak å låse utvalg scenen og deaktivere force sensorene, som indikert av AFM produsentens instruksjoner, så fjerne underlaget fra scenen.

6. mønster visualisering

  1. Mønstre kan visualiseres ved hjelp av en av følgende metoder, lateral kraft skanning sonde mikroskopi eller kjemisk etsing.
  2. Skanne mønstret overflaten på AFM med kraft modus bruker kontakt modus cantilever undersøke funksjonene nondestructively.
    Merk: Lateral force mikroskopi kan brukes som en ikke-ødeleggende visningsfunksjonene produsert av polymer penn Litografi; Imidlertid kan bruker denne metoden, bare et relativt lite område være visualisert (vanligvis 100 x 100 µm).
  3. Siden det avsatt MHA kan fungere som et etch motstå, kan kjemisk etsing brukes til å fjerne gull fra ikke-mønstret områdene. De resulterende unetched områdene kan deretter visualiseres optisk mikroskopi, betyr et stort område kan vises samtidig. 18
    Merk: Underlag som er gravert på denne måten kan deretter brukes til de påfølgende cellekulturer eksperimentene beskrevet nedenfor.
    1. Separat, forberede vandige løsninger 40 mM thiourea, 27 mM iron(III) nitrat og 100 mM saltsyre. Forberede etsematerialet ved å blande 5 mL av hver av disse tre løsninger. Fersk bland før bruk. 22
      Advarsel: thiourea, iron(III) nitrat og saltsyre er giftig. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
    2. Overføre mønstret underlaget i en Petriskål og pipette tilstrekkelig etsematerialer løsning i retten å dekke overflaten av underlaget (vanligvis 10 mL). Holde underlaget neddykket i 4-5 min til etch 15 nm gull (i en omtrentlig hastighet på 3 nm/min).
    3. Når etsing er fullført, Fjern underlaget og rense med vann og tørk med en strøm av nitrogen.
      Merk: Ferdigstillelse av etsing prosessen bestemmes av tykkelsen på gull overflaten innhentet (trinn 3.1) tilknyttet etsing hastigheten angitt (trinn 6.2.2).
    4. Inspisere etset gull funksjonene under lysende felt optisk mikroskopi. De gjenværende gold funksjonene som forblir vises tilsvarende mønsteret som ble skrevet ut (fra trinn 5.2). Hvis hele overflaten vises homogen, angir at en betydelig mengde gull er og etsing trinn (følgende trinn 6.2.2) må gjentas for 1-2 min.

7. mønster functionalization med fibronectin

  1. Dyppe mønstret substrater i en løsning av 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) løsning i etanol for 1 h. vask underlaget tre ganger med etanol og tørk godt under en strøm av nitrogen. Dette trinnet passivates unpatterned gull områdene.
    FORSIKTIG: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) er giftige. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
  2. Senk substrater i en 10 mM Co (ingen3)2 vandig løsning for 5 min. Deretter fjerne substrater fra løsningen, vask tre ganger med ultrapure vann, og tørr under en strøm av tørr nitrogen.
    FORSIKTIG: Co (ingen3)2 er giftig. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
  3. Fordype underlaget i en 50 µg/mL løsning av fibronectin i fosfat bufret saltvann (PBS) ruge ved 4 ° C i 16 h. vask underlaget tre ganger med PBS, og tørr underlaget under en strøm av tørr nitrogen.
    Merk: Fibronectin er bundet til MHA-functionalized områder gjennom chelation av Co(II) av terminal karboksylsyre grupper på MHA. Fibronectin deretter binder til Co(II) via sitt kollagen-bindende domene. 23
  4. Eventuelt kan du visualisere overflaten-bundet fibronectin ved merking det med fluorescerende antistoffer:
    1. Bruker en 2 mL løsning av 1: 100 unconjugated kanin anti-fibronectin primære antistoff 5% (w/v) av bovin serum albumin (BSA) i PBS til overflaten og ruge ved 4 ° C i 16 h. leveringstanken nedbryting og vask tre ganger med PBS.
    2. Senk underlaget i en 2 mL løsning fluorescently konjugert anti-kanin sekundære antistoff (på produsentens angitte fortynning, 2 dråper/mL) på 5% (w/v) av BSA i PBS dekke i tinn folie og ruge ved romtemperatur for 1 h. leveringstanken den nedbryting og vask tre ganger med PBS.
    3. Posten epifluorescence mikroskopi bilder av funksjonene bruker fluorescens mikroskop i henhold til produsentens instruksjoner, med en eksitasjon filteret satt til 594 nm.

8. celle kultur på nanofabricated overflater

  1. Forberede en suspensjon av godt preget hMSCs mellom de 4th og 6th passasje. 24
    1. Suspendere en confluent kolbe celler av skylling en gang med 10 mL PBS distansere overholdt celler ved å legge til 5 mL av trypsin/EDTA i MT75 vev kultur flasken og ruge flasken i en fuktet kammer på 37 ° C supplert med 5% CO2 for opptil 5 min til 90% o f celler er løsrevet fra overflaten.
    2. Deretter legge 6 mL av fersk kultur medier som inneholder 10% fosterets kalv serum (FCS) i flasken og skyll kort kolbe med media lagt. Overføre celle suspensjon i en 15 mL sentrifuge rør og sentrifuger 400 g ved 25 ° C i 5 min.
    3. Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 3 mL frisk kultur medier.
    4. Telle celle tettheten ved hjelp av en hemocytometer25 og justere tettheten av cellen suspensjon til 2 x 104 celler/mL med tillegg av en passende mengde kultur medier.
  2. Ætt cellene på underlag på en tetthet av 104 celler/cm2.
    1. Skjær underlaget i 1 x 1 cm2 med diamant skriftlærde og plasserer den i en brønn i 12-vel vev kultur plate.
    2. Pipetter 2 mL celle suspensjon i kultur medier (fra trinn 8.1.4) inn i brønnen og ruge i en fuktet kammer på 37 ° C med 5% CO2 24 h.
  3. Etter cellevekst på mønstre, analysere omfanget av cellen vedlegg og spredning av immunofluorescence:
    1. Fjerne media og vask underlag når med PBS. Løsning celler med 2 mL i en løsning av 4% paraformaldehyde i PBS (pre oppvarmet til 37 ° C) 20 min i avtrekksvifte og vask tre ganger med PBS.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftige. Les Sikkerhetsdatabladet før du arbeider med denne løsningen. Sikkerhetsutstyr må bæres under behandling av kjemiske.
    2. Permeabilize cellene med 2 mL i en løsning av 0,5% vaskemiddel (se Tabell for materiale) i PBS i 15 min, så vaske tre ganger med PBS.
    3. Senk underlaget i 2 mL i en løsning av unconjugated kanin anti-fibronectin primære antistoff på fortynning av 1: 100 med 5% (w/v) BSA i PBS ruge på 4 ° C 16 h, og vask tre ganger med 0,1% (v/v) mellom 20 i PBS (PBST).
    4. Senere dukke underlaget i 2 mL i en løsning av fluorescently konjugert anti-kanin sekundære antistoff (utvannet med 5% (w/v) BSA i PBS på produsentens angitte fortynning, 2 dråper/mL), dekk i tinn folie og ruge ved romtemperatur 1t, deretter vaske tre ganger med 0,1% PBST.
    5. Hvis etiketten begrepsordbok filamenter, senke 2 mL fluorescently konjugert phalloidin på en fortynning av 1:250 i PBS, dekke i tinn folie og ruge på 4 ° C i 30 min så vask tre ganger med PBS.
    6. Samtidig flekken celle kjerner og montere underlaget ved å bruke en dråpe montering medium som inneholder DAPI og dekk med en dekkglassvæske.
  4. Visualisere celler med fluorescens mikroskop i henhold til produsentens instruksjoner, eksitasjon filtre 365 nm for kjerner (DAPI), 488 nm for F-utgangen og 594 nm for fibronectin.

Representative Results

For å sjekke om den automatiske justeringen hadde vært vellykket, ble grafene plottet fra justering data (i regnearket fra trinn 4.8) undersøkt. Hvor justeringen prosessen hadde vært vellykket to tomter, tilsvarende vinkelen som eksempel scenen har blitt vippet langs θ og φ akser, viste en rekke stigende og synkende datapunkt. I hver av tomter, to lineær passer datapunktene viste en veldefinert skjærer "peak" Angir maksimal z-utvidelse og den tilsvarende vinkelen som justeringen ble oppnådd (figur 4A og 4B). Denne prosessen er gjentatt fire ganger (dvs., to ganger for hver akse) og plottet som et sett med fire koordinater. Skjæringspunktet mellom hvert par av koordinater dermed viser samlet optimal vinkler (figur 4C). 13 i tilfeller der justeringen ikke var vellykket, det kan observeres at deres tilsvarende θ og φ vinkel tomter gir ikke god lineær passer, eller overlapper ikke (figur 5). Slike mislykkede justeringer er vanligvis som følge av matriser blir feil trimmet eller montert til sonde abonnenten (trinn 1.7, 1,8 og 2.2). I disse tilfellene arrayene ble forkastet en ny forberedt og montert (trinn 1 og 2) og justeringen prosessen gjentas (trinn 4).

Vellykket justering og Litografi med MHA av PPL, ble mønstret gull underlag deretter fotografert med kraft mikroskopi for å undersøke om avsettelse hadde funnet sted. En større området undersøkelse av utskrevet flatene ble også utført av optisk mikroskopi av underlagene etter etsing av gull ikke beskyttet av avsatt thiol (figur 6 og figur 7). Imidlertid etset mønstre kan ikke brukes for videre functionalization og bør bare brukes til å bekrefte mønstre på representative utvalg av en gruppe med trykte overflaten underlag. Hvis etset mønstre viser tomme områder tilsvarer personlige penner (Figur 8), angir dette resultatet at produksjonen av sonden matriser ikke er gjort med hell, og at noen sonder er skadet eller mangler. Denne inhomogeneity av sonder kan skyldes bruk av en gammel master hvor det perfluorinated belegget har slitt bort (trinn 1.3), som resulterer i noen sonder revet bort når matrisen er atskilt fra master. I disse tilfellene, skal en ny mal brukes. Resultatet kan også skyldes tilstedeværelse av luft bobler fanget mellom glasset oppbakking og master (trinn 1.5), eller hvis sonde matrisen ikke var rent atskilt fra master etter (trinn 1.8).

Fluorescerende mikroskopi bilder av fibronectin functionalized overflater inkubert hMSCs var også samlet (figur 9). Generelt alle underlag var stabile i i vitro kultur miljøet og cellene overholdt og tilpasset deres morfologi mønstrene i mindre isolert 20 x 20 utvalg av funksjoner.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av polymer penn litografi viser molekylær blekk transport via en vann menisk på probespissen. (A) siden og (B) ovenfra polymer penn matrisen angir at når sonde matrise og overflate underlaget er fullt justert, alle sonder kommer i kontakt med overflaten samtidig, noe som resulterer i parallelized litografi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Skjematisk diagram av polymer penn litografi satt opp (A) utvidet sidevisning av eksperimentelle satt opp hvor forberedt sonde matrisen er festet for å undersøke holderen og montert til AFM skanner. Underlaget er plassert på scenen, under som ligger tre tvinge sensorer. (B) en representasjon av sammensatte instrumentering, viser AFM Skannerhodet i forhold til prøven scenen. (C) nedenfra viser force sensor plasseringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Skjematisk fremstilling viser programmet spektroskopi fremgangsmåten for justering. AFM skanneren er satt til flytte sonder mot prøven ved en avstand på 10 µm innen 100 ms, holdt i posisjon for 250 ms, etterfulgt av en tilbakekalling av 10 µm innen 100 ms, og deretter holdt i 250 ms trukket inn der. Bevegelse gjentas deretter gjennom justeringen prosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Diagrammer illustrerer en vellykket justering. Grafer av z posisjon mot tilt vinkler (A) θ og (B) φ for en vellykket justering, der ● angir de faktiske verdiene målt og + angir best passer med minste-kvadraters-metode. (C) graf φ mot θ utstyrt vinkler med fire poeng der maksimal z-posisjonen ble nådd. Krysningspunktet merket er den siste optimal vinkelen over begge aksene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Diagrammer illustrerer en mislykket justering. Grafer av z posisjon mot tilt vinkler (A) θ og (B) φ for en mislykket justering, der ● angir de faktiske verdiene målt og + angir best passer med minste-kvadraters-metode. (C) graf φ mot θ utstyrt vinkler med fire poeng der maksimal z-posisjonen ble nådd. Ingen klart optima eller skjæringspunkt er observert og derfor optimal justering vinkler ikke løses. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Illustrerende optisk mikroskopi og atomic force mikroskopi bilder av gull underlag som ble mønstret med MHA av justert PPL arrayene og deretter etset. (A) og (B) er sekvensielt forstørret optisk mikroskopi bilder etset mønstre; (C) er et AFM topografi bilde av et enkelt rutenett av mønstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Illustrerende optisk mikroskopi bilder av gull underlag som ble mønstret med MHA av justert PPL arrayene og deretter etset. (A) og (B) er sekvensielt forstørret optisk mikroskopi bilder av etset mønstre og (C) er en lavere forstørrelse bilde som viser stort område homogen oppskrifter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Illustrerende optisk mikroskopi bildet av en gull substrat som var ujevnt mønstret med MHA og deretter etset. Den tiltenkte mønsteret (vises i innfelt) var gjenta rutenett 20 dot linjer ordnet i 20 linjer, med hver to linjer produsert ved å øke z-aksen utvidelse med 1 µm (alt fra 5 til-5 µm). Det kan sees at i enkelte områder ikke mønstre genereres, på grunn av manglende sonder på disse stedene. I områder hvor bare to linjene med prikker er produsert, dette resultatet indikerer at en sonde finnes, men det er ikke av samme høyde som fullt fungerende sonder, så bare innskudd har når matrisen er utvidet til full z-aksen avstand. I dette bildet har kontrasten vært bevisst endres for å aktivere observasjon av delvis utskrevne områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9. Epifluorescence mikroskopi bilder av hMSCs kultivert på fibronectin arrayene mal av PPL. (A) og (B) er høy forstørrelse bilder viser individuelle celler. (C) viser et eksempel mønster av fibronectin array uten en tilhenger cellen og (D) er et bredt felt av cellene kultivert i et rutenett (en skjematisk av det utskrevne mønsteret blir også vist på i innlegget). Cellene er farget for å vise fibronectin (rød), F-utgangen (grønn) og celle kjerner (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen serverer å gi brukerne en praktisk metode for å raskt utføre nanolithographic mønstre med høy ensartethet og kontrollerbar mønsterstørrelsen over store (cm2) områder. Underlag bærer disse store området nanopatterns kan deretter bli ytterligere utdypes for en rekke applikasjoner. En stor anvendelse av denne teknologien er i generering av nanofabricated overflater for celle-overflate samhandling studier. Denne rapporten viser illustrerende eksempler med cellekulturer disse materialene, demonstrere kontroll over hMSC morfologi av nanofabricated underlag.

Avgjørende for denne protokollen er automatisering av justeringsprosedyren (trinn 4) som tillater svært ensartet og høy gjennomstrømming produksjon av funksjoner på overflater, ned nanoskala oppløsning, som muliggjør rask omsetning med cellekulturer eksperimenter. Den polymer penn litografi gjennomført med denne justeringen algoritmen er kjøpedyktig utvikle nanoskala funksjoner i ca 30 min. Reproduserbarhet og nøyaktigheten av automatisk justering, og dermed ensartetheten i mønstret funksjonene, er imidlertid kritisk avhengig av kvaliteten på sonde matriser som er produsert (trinn 1 og 2). Eventuelle feil i forberedelsen som resulterer i sløv, ødelagte eller manglende sonder; som fanget luft kan bobler (trinn 1.5) eller uriktig separasjon av sonder fra master (trinn 1.8) resultere i feil justering og dårlig kvalitet litografi.

Dette rapportert metoden aksjer en begrensning i likhet med andre justering metoder som er avhengige av force feedback. Nøyaktig bestemmelse av når sonder er i kontakt med overflaten er begrenset av behovet for å ta hensyn til bakgrunnen vibrasjoner forårsaket av ambient miljøet og bevegelse av prøven scenen. Generelt, sensorer har en force sensitivitet i µN regime (2 µN i dette tilfellet), men justering algoritmen er utformet for å bare registrere en styrke på minst 490 µN som endelig kontakt mellom sonder og overflaten, for å unngå eventuelle 'false positiv' resul ting fra bakgrunnsstøy. 13 derfor, denne metoden har en tendens til å produsere store funksjoner (1-2 µm) siden sonder må utvidet en stor avstand på z-aksen (med en påfølgende høyere styrke) for å registrere kontakt. For å kompensere, mindre funksjoner kan genereres ved å redusere z-aksen avstand reist under litografi trinnet (e.g.inn innstillingen "Svarte" i trinn 5.2.3.2 som 3 µm i stedet for 5 µm).

Likevel, selv med denne begrensningen automatisering algoritmen er stand til å ta en viktig del i anvendelsen av parallelized sonde litografi skannemetoder justering var tidligere mest tid krevende og upresise skritt i den implementering av disse teknikkene. Automatiseringen nå flytter hastighetsbegrensning trinnet av fabrikasjon prosessen fra justeringen av litografiske skrive selv. Mens denne protokollen demonstrerer bruken av denne justeringsprosedyren til PPL, kan rammen brukes til en rekke SPL teknikker som lipid-DPN26 og matrix-assistert litografi27 , samt mulige fremtidige katalytisk sonden systemer. 28

Disclosures

Justering algoritme og programvaren ble utviklet av, og er eies, Universitetet i Manchester. Det er tilgjengelig for nedlasting på http://www.click2go.umip.com/.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra en rekke kilder, inkludert UK Engineering og Physical Sciences Research Council (gi refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) og en utdannet studentship for JH; Leverhulme tillit (RPG-2014-292); Wellcome Trust institusjonell strategisk støtte fondet (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); og ved University of Manchester for et universitet Manchester Research Institute (UMRI pumpe grunning fund) og en Presidential doktorgrad stipend til SW. teknisk assistanse av Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) er også takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).
Stor-området skanning sonde Nanolithography tilrettelagt av automatiserte justering og dens anvendelse til underlaget fabrikasjon for cellen kulturstudier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter