Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Otomatik hizalama ve substrat imalat hücre kültür araştırmaları için uygulama tarafından kolaylaştırdı geniş alan tarama prob Nanolithography

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Burada için geniş alan tarama prob nanolithography sonda diziler yinelemeli hizalama gibi hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları için taş desen kullanımı tarafından etkinleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Prob mikroskobu tarama çeşitli yöntemler nanometre-ölçek özellikleri yapıcı ('katkı') yukarıdan aşağıya imalatı için oluşturulmasını sağlamıştır. Tarihsel olarak, sonda litografi tarama büyük bir dezavantaj tek sonda sistemlerin özünde düşük işlem hacmi oldu. Bu artan nanolithography üretilen iş etkinleştirmek için birden çok probları bir dizi kullanımı ile ele vardır. Böylece tüm Probe prob paralelleştirilmiş böyle nanolithography uygulamak için substrat yüzeyli sonda dizilerin doğru hizalama, çok önemlidir aynı anda tekniğinde desenlendirme başladığında yüzeyi ile temas. Bu iletişim kuralı polimer kalem litografi sonda dizileri hızlı, doğru ve otomatik hizalama için bir algoritma kullanılarak kolaylaştırdı, santimetre büyüklüğünde alanlar üzerinde nanometre-ölçek özellikleri üretmek için kullanımını açıklar. Burada, thiols altın yüzeyler üzerinde nanolithography özellikleri nesil ile yüksek homojenlik göstermektedir. Bu kalıpları sonra yüzey Yönetmen: hücre morfolojisi çalışmaların içeriğinde fibronektin ile functionalized.

Introduction

Nanoteknoloji bağlı olarak verimli ve güvenilir bir şekilde nano Özellikler yüzeylerde imalatı yetenekli yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde çalışıyor. 1 , 2 ancak, böyle üreten ve güvenilir bir şekilde geniş alanlara (birden çok cm2) özellikleri olmayan önemsiz bir çaba, nispeten düşük maliyetli. Yarıiletken Endüstrisi türetilmiş çoğu mevcut teknikleri 'sert' malzeme imal etmek ablatif fotolitografi güveniyor. Daha yakın zamanlarda, taş teknikleri prob mikroskobu (SPM) tarama elde edilen nano tasarımları hızlı prototipleme için kullanışlı ve çok yönlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. 3 SPM tabanlı teknikleri rahat ve hızlı bir şekilde 'herhangi bir kullanıcı tarafından tanımlanan desen yazmak ' edebiliyoruz. En iyi bilinen bu Mirkin vd., nerede bir tarama sonda 'kalem' moleküler 'mürekkep' bir şekilde yazmaya benzer özellikler üreten yüzeye aktarmak için kullanılan4 tarafından öncülük daldırma-kalem nanolithography (DPN), olduğunu. Bir sonda bir yüzey üzerinde taranmış ortam koşulları altında 'mürekkep' molekülleri yüzey yolu ile için transfer formları sonda ve yüzey (Şekil 1) arasında bir su menisküs. DPN böylece malzemeler, polimerler ve biomolecules gibi "yumuşak" malzemeler de dahil olmak üzere geniş bir nanolithographic birikimi sağlar. 5 ilgili teknikleri sıvı tesliminde kanalları ile mühendislik probları kullanarak çeşitli anılacaktır 'nanopipettes' ve 'nano-Çeşme kalemler' da bildirilmiştir. 6 , 7 , 8

SPM kaynaklı litografi daha geniş uygulama için ana engel çıktı, tek bir sonda ile desen santimetre çaplı alanlara aşırı uzun bir zaman gerektirir gibidir. Bu sorunu gidermek için erken çabaları ile her ikisi 'tek-boyutlu' ve 'iki boyutlu' (2D) prob diziler santimetre büyüklüğünde alanlar litografi için bildirilen konsol tabanlı DPN parallelization üzerinde duruldu. 5 , 9 ancak, bu konsol diziler oldukça karmaşık multistep imalat yöntemleri ile üretilen ve oldukça kırılgandır. Polimer kalem litografi (PPL) icadı yumuşak siloxane elastomer probları cam slayda gümrüklü 2D bir dizi standart SPM cantilevers değiştirerek bu sorunu ele aldı. 10 bu basit sonda kurulumu önemli ölçüde geniş alanlar, nanolithography daha geniş bir uygulama yelpazesi için açılması biçimlenme karmaşıklığını ve maliyetini azaltır. Bu konsol ücretsiz mimarisi de ipucu zor yumuşak-bahar litografi, yumuşak kullanılarak üretilen modelleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş çözünürlük vermek zor silikon ipuçları ile yumuşak elastomerik destek melez sağlayan11 genişletildi Elastomer ipuçları.

Önemli bir faktör bu 2D array teknolojilerin yürütülmesine böylece litografi kullanılmaktadır zaman tüm probları yüzey temas gelen sonda dizi aynı anda tam olarak yüzey substrat paralel olması gerektiğidir. Diğerleri daha sonra veya hiç kişiye gelecek iken bazı probları ile temas yüzeyi daha önce dizi, iniş sırasında gelecek bu yana bile küçük bir kayma özelliği boyutu büyük bir fark dizinin bir taraftan diğerine, neden olabilir. 12 tam hizalama nerede temas yüzeyi daha önce probları sıkıştırılır, PPL ile özellikle yumuşak elastomer probları deformasyon nedeniyle önemlidir yüzeyinde büyük bir ayak izi bırakarak.

PPL erken çalışmaları tamamen görsel muayene olarak onlar temas yüzeyi getirilen piramit probları deformasyon gözlemlemek için dizinin monte edilmiş bir kamera ile hizalama işlemi size yol istihdam. 10 hizalama sondalar hangi tarafında ilk, yüzeyi ile temas geldi gözlemleyerek sonra açı ayarlama ve sonda her tarafında temas halinde aradaki fark kadar yordamı yinelemeli bir şekilde yinelenen karar oldu gözünün içine bakarak ayırt edilemez. Öznel görsel denetim işleci tarafından bu hizalama yordamı kullanır gibi tekrarlanabilirlik düşüktür.

Daha sonra temas yüzeyi probları, üzerine uygulanan kuvvet ölçmek için belgili tanımlık substrate altında monte bir kuvvet sensör oluşan daha objektif bir yaklaşım geliştirilmiştir. 12 hizalama böylece hangi tüm probları aynı anda temas halinde olduğunu göstermiştir sarf, kuvvet en üst düzeye çıkarmak için tilt açıları ayarlayarak elde edildi. Bu yöntem yüzey paralel 0,004 ° içinde için hizalama mümkün olduğunu gösterdi. Bu 'güç geribildirim tesviye' Şimdi iki bağımsız raporlar tam otomatik sistemlerine uygulanmıştır. 13 , 14 hem kuvvet sensörleri substrat altında veya üstünde dizi takılı bir üçlü kullanın ve temas yüzeyi ve sonda diziler arasında üzerine sarf güç miktarını ölçmek. Bu sistemler yüksek hassasiyetli, 1 cm uzunluk ölçek,14 veya ° sağlamak bu otomatik hizalama sistemleri aynı zamanda 1.4 cm.13 üzerinde büyük tasarruf Operatör süresinin ve tamamlamak için geçen toplam süre ≤ 0,0003 misalignments ≤0.001 ° raporlama vermek taş baskı işlemi.

Bir büyük yüksek üretilen iş yüzey imalat bu teknoloji tarafından etkin hücre kültür yüzeylerde nesil uygulamadır. Şimdi de kurulan bu hücre fenotip hücreler ve yüzey özellikleri arasındaki ilk etkileşim kontrol ederek manipüle edilebilir ve bu-ebilmek var olmak arttırmak nano. 15 özel olarak, tarama prob litografi yöntemleri gibi hücre kültürü deneyleri için nanofabricated yüzeyler çeşitli üretmek için uzun facile yöntemi gösterilmiştir. 16 Örneğin, nano şekillerinin kendi kendine monte monolayers ve hücre dışı matriks proteinleri şablonu esas alan PPL ve DPN nano değiştirilme tarihi malzemeleri malzeme potansiyelini çalışmaya kullanılmıştır sunulması yüzeyler farklılaşma indüklenen. kök hücreler. 17

Bu iletişim kuralı geniş alan PPL sağlar değiştirilmiş atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sistem kullanımını açıklar. Sonda-yüzey teması, yinelemeli hizalama işlemini otomatikleştiren bir algoritması ile birlikte belirleme aracı olarak birden fazla kuvvet sensörleri kullanarak güç tespiti detay. Bu desen hücre dışı matriks proteini fibronektin ile sonraki functionalization ve insan mezenkimal kök hücre (hMSC) kültürü açıklanmıştır, PPL fabrikasyon yüzeyler hücre kültürü için uygulanan bir gösteri olarak.

Protocol

1. PPL kalem dizi imalatı

  1. Polydimethylsiloxane (PDMS) kopolimer karışım hazırlamak için:
    1. Platin (0) - 1,3 - 10 µL eklemek divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane kompleksi çözüm ve 172 µL 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane 250 gr (7-%8 w/w vinylmethylsiloxane) için-dimethylsiloxane kopolimer. Bu bileşenleri homojen karıştırma sağlamak 7 gün döner bir mikser üzerinde iyice karıştırın.
      Dikkat: Platin (0) - 1,3 - divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane zehirli. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
    2. (% 25-35 w/w methylhydrosiloxane) 0.5 g ekleyin-dimethylsiloxane kopolimer karışımı bir 1,7 g bölümüne bir tartı adım 1.1.1 gelen tekne ve iyice bir spatula ile karıştırın.
    3. Bu karışımı bir vakum desiccator aktarma ve gaz kabarcıkları dağılmış kadar 20 min için düşük basınç (200 mTorr, 0.3 mBar) karışıma açığa degas.
  2. Bir plastik şişe vida tepesinde bir 13 x 13 mm cam slayt 20 mL 2-propanol ile dolu yer sonra şişe için herhangi bir büyük enkaz kaldırmak 10 dk ultrasonik bir banyo yer. Slaytları taze 2-propanol (100 mL) slaytları batış tarafından Yıkayıp kurulayın azot gazı akışı altında.
  3. Bir silikon kalıp18 4 cm çapında petri kabına yerleştirin ve yeterli degassed PDMS prepolimer karışımı (Kimden adım 1.1) kadar tamamen kaplı ekleyin. Tipik olarak, 100 µL için bir 20 x 20 mm ana gereklidir. Asıl prepolimer karışımı ile bir vakum dessicator yerleştirin. Polimer karışım aktarım sırasında oluşan herhangi bir gaz kabarcıkları kaldırmak başka bir 5 min için degas. Gaz giderme yer alıyor iken cam slaytlar (adım 1.4 aşağıda) O2 plazma tedavisi yapılmalıdır.
  4. En fazla RF Güç her türlü organik kirlilik ve elastomer yapışma için bardak üzerinde bir üniforma oksit tabaka üretmek için 1 dk için cam kareler O2 plazma (600 mTorr) ile tedavi. 19 kullanımı plazma slaytlar hemen sonraki adımda tedavi.
  5. Dikkatle kare cam slayt (Kimden adım 1.4) asıl (Kimden adım 1.3) prepolymer plazma temiz yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Yavaşça silikon asıl üzerine cam kaymak aşağı herhangi bir kapana kısılmış havayı çıkarmak için ve PDMS Tekdüzen bir filmin asıl ve slayt arasında sandviç olduğunu emin olmak için basın.
  6. Yer gözükeceksin PDMS dizi silikon ile bir petri içinde adım yukarıda altındaki (yani, yukarı bakacak şekilde cam slayt arkası ile) ana ve 70−80 ° C 24−48 h PDMS termal tedavi etmek için bir fırın çanak yerleştirin.
  7. Tedavi dizi Fırından çıkarın ve izin için serin 15 dakika sonra bir tıraş bıçağı ile dikkatli bir şekilde herhangi bir aşırı PDMS arkasından çıkarın ve yan cam slayt ve herhangi bir gevşek PDMS enkaz öldürmeyi kuru azot akışı kullanın.
    Not: sıfırdan tıraş bıçağı ile silikon master Bu yapışmaz kaplama zarar verebilir özen.
  8. Bir jilet 1 mm derinlikte dizinin köşeye kama ve dikkatle master dışında dizi Gözetlemek. Bu eylemi tek bir sürekli kaldırma eylemi gerçekleştirme; Asıl düşmeye diziler izin vermez.
  9. Dikkatle kesin ve uzak bir tıraş bıçağı ile dizinin kenarlarda 0,5 mm PDMS kazımak. Herhangi bir gevşek PDMS enkaz öldürmeyi kuru azot akışı kullanın.
    Not: Bu düzeltme adımı stereoscope veya büyüteç altında gerçekleştirmek daha kolay olabilir. Çizik tıraş bıçağı ile silikon master Bu yapışmaz kaplama zarar verebilir özen.

2. dizi hazırlık ve yüzey montaj

  1. Sonda dizi hidrofilik yüzeyinde O2 plazma tarafından tedavi oluşturmak:
    1. Yer plazma odası bir petri kabına PPL kalem dizide için 600 mTorr vakum uygula. 30 plazma jeneratörü (maksimum ayar) geçiş s.
    2. Vakum yayın, dizi kaldırmak ve onun hydrophilicity dizinin üzerine deiyonize su 20 µL silmek ve hatta su yüzeyi boyunca yayılan olup gözlemleyerek kontrol edin. Bu gerçekleşmezse, dizi plazma tedavisinin ikinci tur için tabi. Daha sonra dizi kuru azot gazı akışı ile iyice kuru.
  2. Karbon çift taraflı bant kullanarak dizi orta sonda sahibinin üzerine ekleyin. Sonda tutucu AFM kinematik tutucu (Şekil 2) üzerine monte.
  3. 16-mercaptohexadecanoic asit (MHA) ('mürekkep') içeren PPL dizi yüklemek için:
    1. 8.6 mg 30 mL etanol bir tüp içinde eriterek, bileşik tamamen erimeye 10 dk ultrasonik bir banyo yerleştirerek 1 mM 16-mercaptohexadecanoic asit (MHA) çözüm hazırlamak.
      Dikkat: 16-mercaptohexadecanoic asit zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
    2. Bir micropipette, mevduat 20 µL damla MHA çözüm üzerinde kullanarak. Pipet ipuçları dizileri ile temastan kaçının. Dizi yayılmış, sonra ortam koşulları altında buharlaşır etanol olanak sağlar.
      Not: hizalama yerini almıştır sonra PPL dizi alternatif olarak Inked. 10
  4. MHA çözüm kuruduktan sonra sonda sahibi PPL dizi üzerine AFM ile bağlayın.

3. altın yüzeylerde hazırlanması için PPL.

  1. Altın yüzeylerde satın veya termal veya elektron içi yaptığı ışınla ifade ve 2 nm titanyum yapışma katmanın 20 tarafından takip inşa nm altın cam veya silikon gofret üzerinde. 18
  2. Gerekli hallerde, yüzeylerde oksijen plazma tedavi 1.4 adımda açıklanan parametreleri kullanarak temizleyin.
  3. Altın substrat AFM örnek sahne ortasında yer ve belgili tanımlık substrate (Şekil 2) sınırları çevresinde yapışkan bant ile güvenli. Sahne Alanı'na doğru yüksekliği zkullanarak üreticinin işletim talimatlarını belirtildiği şekilde ayarlamak-eksen denetleyicisi.

4. otomatik kalem dizi hizalaması

  1. Açık ve sahne alanı denetleyicisi Kur programı (SetupNSF.exe) ('sıfır') tüm eksenlerde sıfırlamak için bilgisayarda çalıştırın ve önceden ayarlanmış için sıfır noktasını açılar o zaman kullanılacak sahne x/y-eksen denetleyicisi konsol için istediğiniz hizalama substrat taşımak için / yazdırma konumu. En iyi sonuçlar için belgili tanımlık substrate sahne, sahne alanı'nın kuvvet sensörleri arasındaki merkezine yakın yerleştirilmelidir.
    Not: modellerinde birkaç bilgisayarının, x/y-eksen denetleyicisi USB sinyal müdahale bununla z-eksen denetleyicisi. Bu durumda, xkesmek /y-eksen denetleyicisi USB kablosu Bu adımdan sonra. Sonra hizalama yordamı (adım 4.7) sonra yeniden.
  2. Sahne serbest bırakma kolunu örnek sahne serbest bırakmak ve kuvvet sensörleri triad AFM üretici yönergelerine tarafından belirtildiği şekilde harekete geçirmek için geçiş. En az 15 dakikadır equilibrate kuvvet sensörleri izin. En iyi sonuçlar için 30-50 dk izin.
  3. Görsel olarak sonda dizi ve yüzey gözlemleyerek yakınlığı ile belgili tanımlık substrate dizi getirmek için z ekseni yüksekliğini artırın.
    Not: Yakın dizi yüzeye, az yineleme böylece zamandan tasarruf hizalama işlemi için gereklidir.
  4. Otomatik hizalama programı (otomatik olarak hizalama v16.exe) Aç/Çalıştır ve programa ilgili hizalama parametreleri girin.
    1. İstenen 'açı adım' parametre değeri, genellikle 0.15° girin. Bu parametre program tarafından belirlenir her eksen için 'en uygun' açıdan mahsup açıdır. Açıları bu aralıktan daha alt açıkça tespit gücü fark sondalar yaklaşımı üzerine yüzeye neden değil gibi 0,1 ve 0.2 ° arasında bu parametreyi ayarlayın.
      Not: Yazılım millidegrees değerleri kabul eder (yani, 1 x 10-3 °). Örneğin, 0.15 ° için kullanıcılar '150.' giriş
    2. İstenen kaba adım girme ' parametre değeri, genellikle 0.6 µm. Bu parametre ilk kaba uyum içinde probları yaklaşırken sahne tarafından kullanılan z ekseni adım boyutudur. 0,2 arasında bu parametreyi ayarlayın ve 1 µm. daha büyük boyutları azalma hizalama işlemi için geçen süre adım ama hizalamayı doğruluğunu azaltmak ve sondalar aşınma artırmak.
      Not: Yazılım mikrometre kaba adımda değerleri kabul eder. Örneğin, 0.6 µm '0,6' kullanıcılar giriş.
    3. İstenen 'İyi adım' parametre değeri, genellikle 0.2 µm girin. Bu parametre en uygun hizalama ince ayar için kullanılan z ekseni adım boyutudur. Çoğu uygulama için 0,1 arasında bu parametreyi ayarlayın ve 0.4 µm. daha büyük değer adım boyutları için hizalama işlemi gerçekleştirilen süreyi azaltmak ancak hizalamayı kalitesini azaltır.
      Not: Yazılım iyi mikrometre adımda değerleri kabul eder. Örneğin, 0.2 µm için kullanıcılar '0,2.' giriş
    4. 'Excel dosya yolu' yapılandırmak ve 'klasör' simgesini kullanarak, dosya konumuna gezinme ve "OK" tuşuna basarak sağlanan elektronik tablo şablonu dosyası değiştirilmemiş bir kopyasını iliştir. Bu dosya sahne alanı optimum sahne tilt açılarını belirlemek için kullanılan ham ve hesaplanan veri içerir.
  5. Aç/Çalıştır AFM kontrol yazılımı. (Göre üretici yönergelerine) 'spektroskopisi' düğmesini tıklatarak bu programı spektroskopisi bileşenine gidin ve 10 µm den fazla 100 ms 250 ms, bir duraklama süresi ile tarafından sonra salınım 10 µm 100 ms geri çekmek için için AFM tarama baş z ekseni ayarlayın ile bir duraklama süresini 250 MS (Şekil 3).
  6. AFM kafa salınan otomatik hizalama işlemine başlamak için hizalama yazılım 'Başlat' düğmesini tıklatın. Program çalışırken yazılım yazma ve 4.4.4. adımda anlatılan dosya veri okuma.
    Not: Hizalama 30 dk ve 4.4 adımda girilen adım 4.3 ve yazılım yapılandırma kümesindeki ilk aşamada pozisyona bağlı olarak 3 h arasında olur.
    Dikkat: Sahne alanı denetleyicisi konsolları hizalama işlemi sırasında halen etkin olan - hizalama ile müdahale edecek gibi onları hizalama işlemi sırasında kullanmayın.
  7. Hizalama tamamlandığında yaktı hizalama yazılım (Kimden adım 4.4) yeşil ışık kutusunu 'Hizalama tamamlandı'. Bu durumda, hizalama işlemi sonlandırmak için Kullanıcı arabiriminde 'STOP' düğmesini tıklatın.
  8. Yazılım tarafından oluşturulan grafikler elektronik tablo şablonu dosyasında kaydedilen veri noktaları ve uygun satır arasında bir ilişki için kontrol edin. Tipik R2 değerleri > 0,99 ile iyi bir ilişki, örnekler için temsilcisi sonuçları görmek. Hizalama başarısız olursa, soruşturma dizi yeni hazırlanan bir dizi (adım 2) ile değiştirin ve (adım 4.4) hizalamayı yinelemek.
  9. Sahne alanı yukarı taşımak içinde z-ekseni o eksen için sahne alanı denetleyicisi konsolunu kullanarak. İlgili kişi AFM üstten görünüm kameradan görülebilir kadar sahne alanı 500 nm aralıklarla taşınması gereken. Dizi ve substrat arasında iletişim bireysel sonda piramitler, tepe, yüksek karşıtlık bir 'beyaz nokta' olarak görülmektedir.
  10. Bu noktada, adım 4.5 gelen spektroskopisi programını durdurmak için AFM kontrol yazılımı 'stop' butonuna tıklayın. Bu dizi bu nedenle olası z ekseni uzantısı 10 µm bırakarak 10 µm tarafından geri çekmek. AFM probları ile temas substrat değildir sağlamak için en iyi görüş kamerası görüntüden denetleyin.

5. polimer kalem litografi (PPL)

  1. Kontrol yazılımı 'litografi' butonuna basarak kontrol yazılımı litografi bileşenine gidin. Zseçin-modülasyon işletim modu ve bir raster (bitmap) alma veya vektör litografi desen olarak kullanılacak görüntü. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen özellikleri oluşturmak için bir kılavuz PPL diziyi sondanın başına 20 x 20 nokta litografi karşılık gelen (bkz. ek malzeme) 20 x 20 siyah piksel, oluşan bit eşlem kullanın.
  2. Litografi parametreleri AFM denetleyicisi yazılım "Pixel grafik al" penceresine girin.
    1. 'Boyut' var olmak oluşturmak için desen, Örneğin, 40 µm uzunluk ve genişlik yapılandırın. Bu parametreler genişlik ve uzunluk üzerinde bit eşlem görüntü ölçeklenir gösterir. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen özellikleri oluşturmak için her iki boyutlu olarak bir genişliği ve uzunluğu 40 µm kullanın.
    2. '25 µm x ve y ekseni üzerinde oluşturulacak kökeni' desen ayarlayın. Bu parametreler AFM xortasına göre resmin merkezine belirlemek /y-eksen. Sondalar hizalama işlemi sırasında temas halinde olduğu bölge yüzeyi önlemek için bu parametreler ayarlayın.
    3. 'Parameters' baskı ayarlayın. Bu değerler sondalar (yani temas yüzeyi getirdi) genişletilmiş şeklini belirler bit eşlem resimdeki her piksele karşılık olarak.
      1. Damla-aşağı yemek listesi 'Modülasyon Abs Z Pos' ve 'Basitleştirin için' iki katmanı seçin. Bu mod yalnızca iki sonuçları, 'kara (0)' ya da 'Beyaz (1)' alanları tarafından belirlenen mutlak bir mesafeye göre probları genişletmek için AFM bildirir.
      2. 'Siyah (0)' ve 'Beyaz (1)' alanlarındaki değerleri sırasıyla 5 ve -5 µm için ayarlayın. Bu değerler sondalar taşınabilir yanıt olarak bir siyah ya da beyaz piksel bitmap görüntüde mesafeyi belirlemek ve genellikle 'Black' için 3 ile 5 µm arasında set (yani, sondalar o eksen sıfır noktasına göreli olarak o mesafeye göre aşağı doğru uzatmak) ve -3-5 µm 'Beyaz' için için (yani, sondalar tarafından 3-5 µm sıfır noktasına göreli olarak yukarı doğru çekilme).
        Not: 5 mikron uzantısı yüzeyi ile temas geliyor probları sonuçlanan temsilcisi bu mesafeleri varsayalım ve bu nedenle 5 mikron çekilme probları yüzey uzak asansörleri iken bir özellik nesil kaynaklanan hiçbir temas halinde. Z-uzantısı daha büyük şekil içinde kaynaklanan yüzey içine daha fazla basýlmasýný probları yüzey, büyük uzantıları sonucu sonda kişiyle ölçüde belirleyerek özellik boyutu etkiler. 10
      3. Bu ayarları uygulayabilir ve pencereyi kapatmak için 'OK' butonuna tıklayın.
  3. 'Duraklama süresini' AFM kontrol yazılımı, genellikle 1 litografi penceresine girin s. Bu ayarı 0.1 ila 10 s arasında genellikle ayarlanmış Genişletilmiş 'Black' pozisyonda sondalar kalır süreyi belirler.
    Not: Altın yüzeye taşınan MHA daha büyük miktarda nedeniyle büyük özelliği boyutlarda uzun duraklama süreleri yol. Başka raporlarda oluşturulan özellikleri boyutunu denetleme üzerinde daha fazla bilgi bulunabilir. 20
  4. Atmosferik denetim muhafaza hazırlayın.
    1. Atmosferik İzolasyon Odası AFM üzerine alt ve Aç/Çalıştır atmosferik kontrol üreticisi tarafından sağlanan yazılımı (MHG_control.exe).
    2. Bağıl nem oranı % 45, sıcaklığı 25 ° C ve bir atmosfer Döviz korumak için atmosferik kontrol yazılımı '500 mL yazılım içerisinde bu değerleri girerek debi' ayarlayın. 'Ayarları uygulamak için kullan' seçeneğini tıklatın. Atmosferik kontrol modülü sonra odanın içine oksijen hava pompası başlayacak.
      Not: Yüksek nem düzeyleri kalem diziler ve yüzey arasında oluşturulan daha büyük bir su menisküs oluşumu nedeniyle büyük özelliği boyutlarda sonuçlanır. 21 bu değer genellikle 40 ile % 60 arasında ayarlanabilir. Akış hızı genellikle 300 ve 500 mL arasında ayarlanabilir. Daha büyük akışı daha hızlı ulaşmak istenen nem seviyesi sağlar ancak daha az doğru. Temsilcisi sonuçları bir akış hızı 500 ml nem oranı ilk üretimi için kullanın ve litografi sırasında doğru ve kararlı bir düzeyde tutmak için istenen nem ulaşan üzerine 300 ml azalır.
  5. İstenilen nemi alındıktan sonra taş sıra yazılım arabiriminde 'Başlat' düğmesini tıklatarak başlatın.
  6. Litografi tamamlandığında, z ekseni sahne alanı denetleyicisi konsol tarafından 500 µm sahne çekiyoruz tarafından dizi uzak substrat taşımak için kullanın. Atmosferik izolasyon odası onun Dağı kaldır.
  7. AFM üretici yönergelerine tarafından belirtildiği şekilde örnek sahne kilitlemek ve kuvvet sensörleri devre dışı bırakmak için sahne serbest bırakma kolunu geçin ve substrat sahne alanı'ndan kaldırın.

6. desen görselleştirme

  1. Desen aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak görüntülenir, tarama prob mikroskobu ya da kimyasal aşındırma gücü lateral.
  2. AFM desenli yüzeye erişerek özelliklerini incelemek için iletişim modu konsol kullanarak yanal kuvvet moduyla inceden inceye gözden geçirmek.
    Not: Lateral kuvvet mikroskobu görüntüleme özellikleri polimer kalem litografi tarafından üretilen zararsız bir yöntem olarak kullanılabilir; Ancak, bu yöntemi kullanarak, yalnızca göreceli olarak küçük bir alanı görüntülenmeyecektir (genellikle 100 x 100 µm) olabilir.
  3. Yatırılan MHA etch resist hareket edebilir, kimyasal aşındırma altın desenli sigara alanlarından kaldırmak için kullanılabilir. Elde edilen unetched alanlarda sonra geniş bir alan-ebilmek var olmak görüş aynı anda anlam optik mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir. 18
    Not: Bu şekilde kazınmış yüzeylerde daha sonra aşağıda açıklanan sonraki hücre kültürü deneyleri için kullanılamaz.
    1. Ayrı ayrı, 40 mM Tioüre, 27 mM demir(III) nitrat ve 100 mM hidroklorik asit sulu çözümler hazırlamak. Etchant 5 mL her üç bu çözümlerin de karıştırarak hazırlayın. Taze her kullanımdan önce karıştırın. 22
      Dikkat: Tioüre, demir(III) nitrat ve hidroklorik asit zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
    2. Desenli yüzey bir petri kabına ve pipet yeterli etchant çözüm substrat (genellikle 10 mL) yüzeyi kapsayacak şekilde çanak içine içine aktarın. 4-5 min için 15 etch batık substrat tutmak nm altın (bir oranda yaklaşık 3 nm/dk).
    3. Gravür tamamlandığında, substrat kaldırmak ve su ile iyice durulayın ve azot bir akışı ile kuru.
      Not: işlem aşındırma tamamlanması gravür oranı (adım 6.2.2) belirtilen ilişkili elde edilen altın yüzey (adım 3.1) kalınlığını belirler.
    4. Parlak alan optik mikroskobu altında kazınmış altın özellikleri inceleyin. Kalır kalan altın özellikleri (adımından 5.2) Yazdırılan desene karşılık gelen görüntülenmesi gerekir. Tüm yüzey homojen görünürse, bu altın önemli miktarda kalır ve gravür adım (aşağıdaki adım 6.2.2) 1-2 min için yinelenmelidir gösterir.

7. desen functionalization fibronektin ile

  1. Desenli yüzeyler için 1 h. yıkama substrat Etanol Etanol ile üç kez 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) çözümde bir çözüm içine sokmak ve azot akışı altında iyice kurulayın. Bu adımı unpatterned altın alanlar passivates.
    Dikkat: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
  2. 10 mm 5 min için Co (NO3)2 sulu çözüm yüzeylerde daldırın. Ardından, çözüm, üç kez Ultrasaf Su ile yıkama ve kuru azot akışı altında kuru yüzeylerde kaldırın.
    Dikkat: Co (NO3)2 zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
  3. Fibronektin fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde bir 50 µg/mL çözüm substrat bırakın ve 16 h. yıkama substrat üç kez ile PBS için 4 ° C'de kuluçkaya sonra kuru bir dere kuru azot altında belgili tanımlık substrate.
    Not: Fibronektin Co(II) şelasyon MHA functionalized alanlarına terminal karboksilik asit grubu tarafından MHA üzerinde bağlıdır. Fibronektin ardından Co(II) üzerinden için kendi kollajen bağlayıcı etki bağlar. 23
  4. İstenirse, yüzey bağlı fibronektin ile floresan antikor etiketleme tarafından görselleştirin:
    1. 1: 100 çekimsiz tavşan anti-fibronektin birincil antikor PBS Sığır serum albumin (BSA) (w/v) % 5, 2 mL solüsyon yüzeye uygulamak ve 16 h. aspiratı süpernatant için 4 ° C'de kuluçkaya ve üç kez PBS ile yıkayın.
    2. 2 mL solüsyon fluorescently konjuge anti-tavşan ikincil antikor (, üreticinin belirtilen seyreltme, 2 damla/mL) % 5 (w/v) PBS BSA, substrat daldırın, kapak kalay folyo ve 1 h. aspiratı için oda sıcaklığında kuluçkaya süpernatant ve üç kez PBS ile yıkayın.
    3. Kayıt epifluorescence mikroskobu görüntüler üreticinin yönergeleri doğrultusunda floresan mikroskop ile bir uyarma filtresini kullanarak özellikleri 594 için ayarlamak nm.

8. hücre kültürü nanofabricated yüzeylerde

  1. 4inci ve 6inci geçit arasında iyi karakterize hMSCs süspansiyon hazırlamak. 24
    1. Hücre konfluent bir şişesi bir kez 10 mL PBS ile durulama tarafından askıya alma, yapıştırılan hücrelerin T75 doku kültürü şişesi 5 mL tripsin/EDTA de ekleyerek ayırmak ve oksijen odası için 5 dakikaya kadar % 5 CO2 ile % 90 o kadar takıma 37 ° C'de şişeye kuluçkaya f hücre yüzeyinden ayrılır.
    2. Daha sonra 6 mL taze kültür balonun % 10 fetal buzağı serum (FCS) içeren medya ekleyin ve kısa bir süre şişeye eklendi Medya ile durulayın. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 400 g 25 ° c de santrifüj içine aktarın.
    3. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 3 mL taze kültür ortamının resuspend.
    4. Hemasitometre25 kullanarak hücre yoğunluğu saymak ve buna ek olarak kültür ortamının uygun bir birimi tarafından hücre süspansiyon 2 x 104 hücre/ml yoğunluğunu ayarlayın.
  2. Tohum hücreleri yüzeylerde 104 hücreleri/cm2yoğunluğu, üzerine.
    1. 1 x 1 cm2 elmas scribe ile belgili tanımlık substrate oyulmuş ve 12-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda yerleştirebilirsiniz.
    2. Hücre süspansiyon kültürü medya (Kimden adım 8.1.4) 2 mL kuyuya pipet ve 24 saat için % 5 CO2 ile takıma 37 ° C'de oksijen odasında kuluçkaya.
  3. Desenleri hücre büyümesini sonra hücre eki ve ayirt tarafından yayılan ölçüde çözümleyin:
    1. Medyayı çıkarın ve yüzeylerde kez PBS ile yıkayın. Hücreler 2 mL lik PBS (37 ° C için önceden ısındı) %4 paraformaldehyde ile duman hood ve yıkama üç kez PBS ile 20 dk fix.
      Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır.
    2. 2 mL lik % 0.5 deterjan hücrelerle permeabilize ( Tablo malzemelerigörmek) 15dk için PBS içinde sonra üç kez PBS ile yıkayın..
    3. 1: %100 5 (w/v) BSA PBS ile seyreltme, çekimsiz tavşan anti-fibronektin birincil antikor lik 2 ml substrat daldırın ve 16 h için 4 ° C'de kuluçkaya sonra %0.1 (v/v) ara 20 PBS (PBST) üç kere yıkayın.
    4. Daha sonra fluorescently konjuge anti-tavşan ikincil antikor (%5 (w/v) BSA PBS, üreticinin belirtilen seyreltme, 2 damla/mL ile seyreltilmiş) lik 2 ml substrat daldırın, kalay folyo kapak ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya, sonra üç kez %0,1 ile yıkayın PBST.
    5. Aktin filamentleri etiketlemek için PBS 1:250 seyreltme, fluorescently konjuge phalloidin 2 mL daldırın, kalay folyo kapatın ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya sonra üç kez PBS ile yıkayın.
    6. Aynı anda hücre çekirdeği leke ve substrat orta içeren DAPI ve bir coverslip ile kapak montaj bir damla uygulayarak monte edin.
  4. Hücrelerin uyarma 365 filtreleriyle üreticinin yönergeleri doğrultusunda floresan mikroskop kullanarak görselleştirmek için çekirdek (DAPI), 488 nm nm F-aktin ve 594 nm fibronektin için.

Representative Results

Otomatik hizalama başarılı olmuştu olup olmadığını denetlemek için hizalama (elektronik tablodaki verilerde adım 4.8) üzerinden çizilen grafikleri incelenmiş. Hizalama işlemi başarılı olmuştu nerede hangi tarafından örnek sahne θ ve φ eksenleri hareket ettirildiğinde açı karşılık gelen iki araziler yükselen ve azalan veri noktaları bir dizi gösterdi. Her araziler, veri noktalarının iki doğrusal uyar iyi tanımlanmış bilgisayar'ın "en büyük zgösteren zirve" gösterdi-uzantısı ve hizalama olduğu karşılık gelen açısı elde (Şekil 4A ve 4B). Bu süreçtir tekrarlanan dört kez (yani, her eksen için iki kez) ve dört koordinatları kümesi olarak çizilen. Koordinatları her çift kesişim böylece genel olarak optimum açı (Şekil 4 c) gösterir. 13 içinde hal nereye hizalama başarısız oldu, bu onların karşılık gelen θ ve φ açısı araziler iyi kalitede doğrusal uyar vermeyin veya (Şekil 5) kesişmiyor görülebilmektedir. Böyle başarısız hizalamaları normal sonucu olarak varlık düzgün kesilmiş ya da sonda sahibine (adım 1.7, 1.8 ve 2.2) monte diziler uygulanır. Bu gibi durumlarda, diziler atılan yeni bir hazır ve (adım 1 ve 2) monte ve hizalama işlemi (adım 4) tekrarladı.

Başarılı hizalama ve litografi MHA PPL tarafından ile desenli altın yüzeylerde sonra ifade yerini almıştı olup olmadığını incelemek için yanal kuvvet mikroskobu kullanarak görüntüsü. Daha büyük bir alan İnceleme yazdırılan yüzeyler, aynı zamanda dağlama yatırılan thiol (Şekil 6 ve Şekil 7) tarafından korunmamasına altın sonra yüzeylerde optik mikroskobu tarafından yapılmıştır. Ancak, kabartma desen daha fazla functionalization için kullanılamaz ve yalnızca yazdırılan yüzey yüzeylerde toplu temsilcisi örnekleri üzerinde desenlendirme onaylamak için kullanılmalıdır. Baskılı desenler bireysel kalemler (Şekil 8) karşılık gelen boş alanları gösterirsen, bu sonuç ve sonda diziler üretimini başarıyla yapıldı değil ki bazı probları hasarlı veya eksik olduğunu gösterir. Sondalar bu inhomogeneity nerede perfluorinated kaplama yıpranmış uzak (adım 1.3), bir eski ana kullanımı nedeniyle olabilir dizi asıl ayrıldığında uzakta paramparça bazı probları sonuçlanan. Bu gibi durumlarda, yeni bir ana kullanılmalıdır. Ayrıca hava varlığı nedeniyle kabarcıklar yedekleme cam ve master (adım 1.5) arasında sıkışıp, ya da sonda dizi temiz bir şekilde asıl slayttan (adım 1.8) kür sonra ayrılmış değil eğer kaynaklanıyor olabilir.

Floresan mikroskopi görüntüleri inkübe hMSCs da vardı fibronektin functionalized yüzeylerin (Şekil 9) toplanan. Genel olarak, tüm yüzeylerde vitro kültür ortamında istikrarlı ve hücreler yapıştırılır ve yazdırılan desenlere daha küçük izole 20 x 20 düzenlemek-in şekil halinde onların morfolojisi adapte.

Figure 1
Şekil 1. Polimer kalem litografi moleküler mürekkep taşıma yolu ile su menisküs sonda ucunda gösterilen şematik gösterimi. (A) yan görünüm ve (B) yukarıdan polimer kalem dizi sonda dizi ve yüzey substrat tam hizalandığında, tüm Probe prob ile temas yüzeyi aynı anda, paralelleştirilmiş litografi kaynaklanan geldiğini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Polimer kalem litografi Şematik diyagramı ayarla yukarıya (A) nerede hazırlanan soruşturma dizi tutucu soruşturma için bağlı ve AFM tarayıcıya monte deneysel ayarlarý genişletilmiş yan görünüm. Belgili tanımlık substrate sahne alanı'nda yer alıyor, hangi bulunan aşağıda üç kuvvet sensörleri. (B) bir temsili örnek sahne göre AFM tarama baş gösteren birleştirilmiş araçları. (C) alt görünümü kuvvet sensör yerini gösteren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Şematik Gösterim hizalama yordamını spektroskopisi programinda resmeden. AFM tarayıcı 10 µm 100 ms içinde düzenlenen 250 ms'ye konumundaki 100 ms içinde 10 µm retraksiyon arkasından ve retrakte konumundaki 250 ms için düzenlenen bir mesafeye göre örnek doğru sonda taşımak için ayarlanır. Hareket daha sonra hizalama süreci boyunca tekrar edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Başarılı bir hizalama gösteren grafikler. ● gerçek değerleri ölçülür ve + en iyi nerede gösterir z konumunda tilt açıları (A) çap ve φ (B) başarılı bir hizalama için grafikleri en küçük kareler yöntemi ile uygun. (C) grafiği φ θ karşı açıları nerede en büyük z-pozisyon ulaşıldı dört puan ile donatılmış. İşaretlenmiş kesişim noktasını her iki eksen son optimum tilt açıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Başarısız bir hizalama gösteren grafikler. ● gerçek değerleri ölçülür ve + en iyi nerede gösterir z konumunda tilt açıları (A) çap ve φ (B) başarısız bir hizalama için grafikleri en küçük kareler yöntemi ile uygun. (C) grafiği φ θ karşı açıları nerede en büyük z-pozisyon ulaşıldı dört puan ile donatılmış. Hiçbir açık OPTIMA veya kavşak noktası gözlenen ve bu nedenle optimum hizalama açıları değil çözümlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Açıklayıcı optik mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskobu ile MHA hizalanmış PPL dizileri tarafından desenli ve sonra kazınmış altın yüzeylerde görüntülerini. (A) ve (B) ardışık olarak büyütülmüş optik mikroskobu görüntüleri baskılı desenler vardır; (C) bir AFM topografya tek ızgara desen görüntüdür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. MHA ile hizalanmış PPL dizileri tarafından desenli ve sonra kazınmış altın yüzeylerde görüntülerini açıklayıcı optik mikroskobu. (A) ve (B) ardışık olarak büyütülmüş optik mikroskobu görüntüleri baskı kalıplarının ve (C) geniş alana homojen desen gösterir daha düşük bir büyütme resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Düzensiz MHA ile desenli ve sonra kazınmış altın bir substrat açıklayıcı optik mikroskobu görüntüsü. (İlave gösterilen) amaçlanan desenleri ızgaralar zartırarak üretilen her iki satır ile 20 satır düzenlenen 20 nokta satır yinelenen-eksen uzantısı 1 µm (5-5 µm arasında değişen) tarafından. Bazı bölgelerde hiçbir desen, o konumlardaki eksik probları nedeniyle oluşturulan olduğunu görebilirsiniz. Alanlarda nerede nokta sadece iki satır üretilmektedir, bu sonuç bir prob var ancak dizi için tam zgenişletildiğinde sadece mevduat özellikleri tam olarak işleyen probları aynı yüksekliğine değil gösterir-ekseni uzaklığı. Bu görüntüde, kontrast bilinçli gözlem kısmen yazdırılan alanların etkinleştirmek için değiştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9. Epifluorescence mikroskobu görüntüleri fibronektin diziler şablonu esas alan PPL tarafından kültürlü hMSCs. (A) ve (B) yüksek büyütme gösteren tek tek hücreler görüntülerdir. (C) bir örnek desen bir yapışık olmadan fibronektin dizinin hücre ve (D) (Yazdırılan deseni şematik de kakma gösterilir) bir kılavuz düzenleme kültürlü hücreleri bir geniş alan görüntüsünü gösterir. Hücreleri ve hücre çekirdeği (mavi) fibronektin (kırmızı), F-aktin (yeşil) göstermek için lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu protokol kullanıcılara hızlı bir şekilde yüksek homojenlik ve kontrol edilebilir özelliği boyut üzerinde büyük biçimlenme nanolithographic gerçekleştirmek için uygun bir metodoloji sağlamak için hizmet vermektedir (cm2) alanları. Bu geniş bir alan nanopatterns taşıyan yüzeylerde sonra daha da çeşitli uygulamalar için gelişmiş. Bu teknolojinin bir büyük uygulama nanofabricated yüzeyler üretimi için hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları mevcuttur. Bu raporu hMSC morfoloji kontrolünü nanofabricated yüzeylerde tarafından gösteren bu malzemeler, hücre kültürü bazı açıklayıcı örnekler gösterir.

Bu protokol anahtar enabler yüzeylerde, hücre kültürü deneyleri hızlı ciro sağlayan nano çözünürlük aşağı özellikleri son derece düzgün ve yüksek üretilen iş üretimini sağlayan otomasyon hizalama yordam (adım 4) olduğunu. Bu hizalama algoritma kullanılarak yapılan polimer kalem litografi yaklaşık 30 dakika içinde Nano özellikleri oluşturmak yapabiliyor. Tekrarlanabilirlik ve otomatik hizalama doğruluğunu ve böylece desenli özellikleri tekdüzelik olduğunu ancak eleştirel üretilen bağımlı olan sonda dizilerin kalitesi için (adım 1 ve 2). Künt, kırık veya eksik probları neden herhangi bir kusurları onların hazırlık; gibi kapana kısılmış hava kabarcıklar (adım 1.5) veya sondalar uygunsuz ayrılması (adım 1.8) yöneticisinden yanlış hizalama ve kalitesiz litografi neden olabilir.

Bu yöntem bir sınırlama güç geribildirim güvenmek diğer hizalama yöntemleri ile ortak hisse bildirdi. Sondalar yüzeyi ile temas olduğunda doğru belirlenmesi arka plan titreşimler ortam çevrenin ve örnek sahne hareketinin neden olduğu için hesap gerektiğinden sınırlıdır. Genel olarak, sensörler bir kuvvet duyarlılık µN rejimi (Bu durumda 2 µN) var, ama hizalama algoritma yalnızca herhangi bir 'yanlış mutlak' resul önlemek için sondalar ve yüzey arasında kesin ilgili kişi olarak en az 490 µN bir kuvvet kaydetmek için tasarlanmıştır arka plan gürültü ting. 13 böylece, bu yöntem büyük özellikleri (1-2 µm) üretmek eğilimi gerekir sondalar genişletilmiş beri büyük bir mesafe üzerinde z-eksen (bir kuvvetle sonucu daha yüksek) amacıyla ilgili kişi kayıt. Telafi etmek için zazaltarak daha küçük özellikler oluşturulabilir-eksen mesafe seyahat sırasında litografi adım (5 mikron yerine 3 µm olarak adım 5.2.3.2 'Siyah' ayarı girerekÖrneğin,).

Hizalama, daha önce en zaman zorlu ve imprecise adımda olduğu gibi yine de, bu sınırlama ile otomasyon algoritması paralelleştirilmiş tarama prob litografi yöntemleri, uygulamada önemli bir özelliği hitap edebilmektedir Bu tekniklerin uygulanması. Şimdi bu Otomasyon imalat işleminin hızı sınırlaması adımı tekniğinde kendisi yazma için hizalama geçer. Bu iletişim kuralı bu hizalama yordamını uygulama PPL gösterir iken, çerçeve lipid-DPN26 ve matris destekli litografi27 yanı sıra potansiyel gelecek katalitik gibi SPL teknikleri bir dizi için uygulanabilir sonda sistemleri. 28

Disclosures

Hizalama algoritma ve yazılım tarafından geliştirilmiş ve Manchester Üniversitesi için özeldir. Http://www.click2go.umip.com/ indirmek için kullanılabilir.

Acknowledgments

Yazarlar çeşitli kaynaklardan İngiltere'de mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (refs ver. dahil olmak üzere mali desteği kabul EP/K011685/1, 1/K024485/EP) ve yüksek lisans öğrencilik için JH; Leverhulme güven (RPG-2014-292); Wellcome Trust kurumsal stratejik destek fonu (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); ve University of Manchester Üniversitesi Manchester Araştırma Enstitüsü (UMRI pompa astar Fonu) ve SW teknik yardım Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) tarafından başkanlık doktora burs için de minnetle kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).
Otomatik hizalama ve substrat imalat hücre kültür araştırmaları için uygulama tarafından kolaylaştırdı geniş alan tarama prob Nanolithography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter