Summary
타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복의 연쇄 상 구 균 pyogenes (CRISPR) 시스템의 다양 한 유전자 수정을 빠르게 생성 하는 사용자 정의 플랫폼의 개발 활성화 생물, zebrafish를 포함 하 여 CRISPR 기반 게놈 편집 사용 하 여 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 관심, genomic DNA (gDNA) 대상에 CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 대상 Cas endonuclease 두 배 물가 틈 (DSB)을 생성. 삽입 또는 삭제 (indels) 오류가 메커니즘 리드에 의해 DSBs의 수리. 이 종종 소개 함으로써 단백질 null 대립 유전자를 만드는 코딩 시퀀스 내에서 조 숙한 정지 codon frameshift 돌연변이 일으킬 수 있습니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링만 몇 분자 구성 요소를 필요로 하 고 쉽게 microinjection에 의해 zebrafish 태아에 도입. 이 프로토콜 zebrafish microinjection에 대 한 시 약 CRISPR를 생성 하 고 CRISPR 수정 유전자의 생식 전송 전시 물고기를 식별 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 sgRNAs, microinjection CRISPR 시 약의 indels heteroduplex 이동성 분석 결과 (HMA), 및 특성화는 indels의 PCR 기반 메서드를 사용 하 여 대상 사이트에 유도의 식별에 생체 외 녹음 포함 낮은 처리량 및 강력한 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여-기반 접근 heterozygous 물고기에서 수집 하는 여러 PCR 제품을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필요한 물고기의 수와 종류의 분석을 수행 하는 데 필요한 장비를 최소화 하기 위해 유선형의. 또한,이 프로토콜은 되도록 설계 되었습니다 사용에 대 한 의무가 학부생, CRISPR 기반 수행에 관심이 있는 연구 그룹에 의해 경제적으로 고용 될이 강력한 도구를 사용 하면 포함 하는 경험의 모든 수준의 실험실 개인에 의해 제 브라에 게놈 수정입니다.
Introduction
진핵생물에서 분자 기계의 보전 기초 연구를 위한 모형 유기 체를 사용 하 여 전원. 이러한 모델 시스템의 많은 타겟된 유전자 녹아웃 유전자 제품의 생물 학적 또는 질병 과정에의 기여 하 등 역 유전 접근의 사용을 촉진 한다. 제 브라와 같은 유기 체에서 유전자 중단 기법 역사적 DSBs1,2의 부정확 한 수리 결과 frameshift 돌연변이의 대상된 도입에 의존 했습니다. 보편적으로 거의 모든 세포 유형 및 유기 체에 존재 하는 두 경로 중 하나를 통해 DNA 병 변 복구는 DSB 게놈에 도입 하는 경우: 비 동종 끝 결합 (NHEJ)과 상 동 감독 수리 (HDR)3,4 . NHEJ 기계의 정확 하지 않은 자연 자주 다양 한 길이5,6,7,,89의 indels를 생성합니다. Frameshift 돌연변이 유전자의 코딩 순서에의 소개는 종종 유전자 작동 하지 않는 렌더링 조 숙한 정지 codon를 생성할 수 있습니다.
초기 게놈 엔지니어링 전략 홍보 indels zebrafish 포함 meganucleases, 아연 손가락 nucleases, 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases, nuclease 특정 게놈을 대상으로 DNA 단백질 상호 작용을 활용 하는 모두의 대상 DSB10,11,12,13,,1415를 도입. 그러나, 이러한 기술은 종종 힘들고 복잡 한 엔지니어링 nuclease을 대상으로 관심사의 DNA 순서를 생성 하는 데 필요한 때문에 적용 하기 어려운 있습니다. 이전 전략, 달리 CRISPR 기반 유전자 편집 하지 대상에 대 한 단백질 DNA 상호 작용에 의존지 않습니다. 대신, CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 관심16,,1718,19의 게놈 사이트 대상 염기 기본 쌍 상호 작용을 사용 하는 RNA 가이드를 통해 감독 ,,2021. 설계는 RNA의 단순 그것을 대상에 대 한 상호 작용을 페어링 원하는 자료와 가이드는 상대적으로 쉽게 원하는 장소에 Cas endonuclease 대상입니다. 유형 II CRISPR 시스템 특히 널리 개발 되었습니다는 단일 다중 도메인 Ca nuclease (Cas9) endonuclease 활동을 자극 하는 DNA와 상호 작용을 필요로 하는의 사용을 포함 한 여러 유리한 기능 게놈 편집 응용 프로그램에 대 한 사용 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 동족 DNA 시퀀스18대상. 동족 sgRNA의 대상에 대 한 필요한 순서 요구 사항을 잘 이해19, 고 원하는 sgRNA 쉽게 체 외에 전사에 의해 생성 된. 단순 하 고 CRISPR/Cas9 접근의 견고성 크게 zebrafish 및 다양 한 다른 유기 체에 타겟된 유전자 조작 용이.
크게는 타겟된 게놈 CRISPR 기반 시 약 개발의 결과로 제 브라에서 편집을 수행 하는 향상 된 능력 증가 프로세스 중앙 신경의 개발 같은 척추 생물의 상징을 공부 하는 기회 시스템입니다. Zebrafish 게놈 orthologs를 뿐만 아니라 인간22질병와 관련 된 유전자의 84%는 인간 게놈에서 발견 단백질 코딩 유전자의 70% 포함 되어 있습니다. Zebrafish 개발 전시 역 유전자 연구에 그것의 사용을 강화 하는 몇 가지 주요 자질: 배아 큰 클러치에서 누워 있다, microinjection, 및 성인 zebrafish 의무가 유전자 조작 하는 어머니 로부터 외부 개발 3 개월, 원하는 라인23의 급속 한 전파에 대 한 허용에 의해 성적으로 성숙.
수많은 프로토콜 사용할 수 있는 다양 한 생성 하 고 식별 zebrafish24,25,26,,2728,29 CRISPR 파생 indels 접근법을 설명 하는 ,,3031. 그러나,이 절차의 많은 시간 집중, 고가의 장비에 대 한 액세스를 필요 되며 제한 된 전문 기술 연구소에 대 한 일 수 있다. 여기 설명 하는 단계는 간단 하 고 강력 하 고 경제적인 CRISPR/Cas9-전략 엔지니어 zebrafish 녹아웃 라인을 제공 합니다. SgRNAs DNA oligonucleotides (oligos)를 사용 하 여 합성 하는 매우 효율적인 키트를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 되었습니다 다른 접근 비슷합니다 이전32설명. 설명된 프로토콜 포함 두 단계 특히 크게 라인 CRISPR 돌연변이의 분석을 단순화 하는: 쉽게 결정 게놈 수정의 존재 및 시퀀싱 분석의 PCR 기반 HMA33 의 단계별 사용 heterozygous zebrafish 신속 하 고 쉽게 여러 indels 경제적인 방식으로의 성격을 결정 하. 또한, 단계별 지침은 강력한 선택, 믿을 수 있는 생산 및 가이드 RNAs의 주입에 대 한 포함 되어 있습니다. 여기에 제공 된 단계에는 다양 한 전문 실험실 인원 zebrafish에 유전자 녹아웃의 식별을 가능 하 게 강력 하 고 상대적으로 저렴 한 프로토콜을 예증 하다.
Protocol
이 연구는 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장에 따라 실시 됐다. 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC 번호 08-031-11)에 의해 승인 되었다.
1. 디자인 템플릿-특정 Oligos의 가이드 RNA 생산에 대 한
- 유전자의 코딩 지구에서 수정할 관심 대상 영역을 선택 합니다. 이 잘린된 단백질을 생성 하지만 그리 가까이 되도록 후속 프레임 시작 codon 수 겸손 한 N 맨끝 잘림와 단백질의 생산 유전자의 5' 끝에 가까이 있어야 한다.
참고:이 가능성을 배제 하는 편도 프레임 시작 codon 유전자의 하류 코딩 영역을 검사 하는. 또한, 가이드 큰 exon의 중간 표적 RNA를 사용 하 여 결과 indel의 후속 득점을 위한 PCR 뇌관을 식별 하기 위해 도울 수 있다. - 관심 RNA 선택 가이드를 사용 하 여 게놈 영역에 잠재적인 가이드 사이트 식별 ( 테이블의 자료참조)34,,3536프로그램. Danio rerio NGG-3-5'에 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 브라우저 데이터 설정 '.
참고: 이상적인 gRNA 시퀀스 포함 녹음 방송 생체 외에서 효율적인 t 7에 대 한 gRNA의 첫 번째 위치에 5 '-G. 다른 가이드의 5 ' 자료를 변경할 수 있습니다 받아들일 수 없는 가이드 g 5 ' 위치에 있으면 G 또는 G 가이드 RNA의 5 ' 끝에 추가할 수 있습니다 하지만이 절단 효율성37을 줄일 수 있습니다. 절삭 효율을 극대화 하는 최적의 가이드 시퀀스는 40-80 %GC 내용 (더 높은 더 나은 이다), 그리고 G 20번째 위치, PAM에 인접 한에 포함 되어 있지만 필요한38아니다. 이상적인 대상 시퀀스의 예: 5 '-G (N)18 G-3 '-NGG (NGG는 PAM). 최적의 가이드 RNAs 위에서 설명한 대로 식별 가이드 RNA 선택 프로그램에서 결과 검사, 이외에 케어 가이드 RNAs 크게 다운스트림 분석을 복잡 하 게 강한 예측된 대상 오프 효과 피하기 위하여 취해야 한다. 특히, 예측 대상 오프 효과 코딩 영역 내에서을, 제외 하 고 예상 총 오프 대상 사이트를 최소화 해야 RNAs를 가이드. - 가이드 RNA 디자인 도구 출력에서 제외 팸 시퀀스 (NGG 5 '-3 '); 그것은 대상에 대 한 사용 되지 않습니다 하지만 Cas9 분열에 대 한 인식 시퀀스를 구성.
- 나머지 20 뉴클레오티드 (국세청), T7 발기인 순서와 겹치는 순서 (지역 권장 생체 외에서 전송 키트에서 제공 하는 전체 길이 sgRNAs를 합성 하는 데 사용 되는 비 계 올리고 보완) 추가 표시 순서 대로 54 nt oligo를 아래: T7 발기인 순서: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; 가이드 RNA 순서 5 '-G (N)18 G-3 '; 중첩 시퀀스: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3
- 예측된 컷된 사이트 측면 PCR 뇌관을 식별 (Cas9 앞 3 상류 팸 시퀀스의 nt) 50-150의 기본적인 쌍 (bp) 각 웹 기반 소프트웨어를 사용 하 여 컷에서의 거리에서 ( 재료의 표참조).
참고: 이러한 사용 됩니다 나중 단계에서 절단 효율성의 측정을 위한. 없는 적당 한 뇌관 이러한 제약 조건을 사용 하 여 식별 하는 경우 다른 가이드 RNA 사이트 간주 해야 합니다. - 주문 생산 가이드 54 nt oligonucleotides 분석 ( 재료의 표참조) 대상 사이트를 위한 RNA와 PCR 뇌관.
참고: 선택적 긍정적인 컨트롤로, 쉽게 득점된 시각적 표현 형을 사용 하 여이 프로토콜의 성능을 확인 하는 안료의 생산에 필요한 유전자를 대상으로 sgRNA를 생산 하기 위해 도움이 될 수 있습니다 (대표 결과 그림 1 참조). 일반적인 목표는는 유전자 tyrosinase, 사용 하는 올리고 (가이드 RNA 순서 밑줄이)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3
2. 태아 Microinjection CRISPR 시 약의 준비
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상용 Cas9 단백질 주문 (재료의 표 참조).
그러나 참고: Cas9 mRNA의 주입도 사용할 수 있습니다 indels zebrafish40,41, 생성 하 zebrafish 태아 microinjection Cas9 단백질으로 더 효율적인32,42로 표시 되었습니다.- 1 mg/mL 해결책을 생성 하기 위해 제공 된 버퍼에 Cas9 단백질을 일시 중단 합니다. Freeze-thaw 주기 수를 최소화 하기 위해-80 ° C에서 PCR 튜브에 주입 준비 aliquots에서 솔루션을 저장 합니다. 5 µ L 주입 솔루션, 1 mg/mL Cas9 솔루션 사용의 2 µ L를 생성 하기 위해 따라서는 Cas9 수 PCR 스트립-튜브를 사용 하 여 2 µ L aliquots에 aliquoted.
- 녹음 방송 생체 외에서 sgRNA를 사용 하 여 sgRNA 종합 키트 ( 재료의 표참조). 녹음 방송 생체 외에서 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
참고: 모든 종합, 정리, 및 주입 솔루션 준비 단계 동안 RNase 무료 기법을 유지 합니다. 예를 들어 일회용 장갑을 사용 하 고 자주 그들을 변경, 튜브는 RNase 무료 인증 하 고 깨끗 한 표면 오염을 제거 기구를 상용 솔루션 펫 팁을 사용 하 여 ( 재료의 표참조). -
RNase 무료 기술을 사용 하 여 암모늄/아세테이트 강수량을 사용 하 여 합성된 sgRNA 정화.
참고: 또는, sgRNAs 수 수 정화 키트 청소 상용 열 기반 RNA의 다양 한을 사용 하 여 상대적으로 겸손 한 비용에 대 한.- 5 M 염화 아세테이트와 철저 하 게 혼합 하는 소용돌이의 25 µ L를 추가 합니다.
참고: 암모늄 아세테이트 솔루션은 상용 ( 재료의 표참조), 또는 5 M 솔루션 RNase 무료 물 1 mL를 분자 학년 암모늄 아세테이트의 385.4 mg을 추가 하 여 집에서 만든 고-20 ° c.에 저장 될 수 있습니다. - 각 샘플에 200 증거 nuclease 무료 에탄올의 150 µ L를 추가 합니다. 최소 20 분의-80 ° C 냉동 고에 반응을 놓습니다.
참고: 샘플-80 ° C에서 밤새 껏 저장 될 수 있지만 총 RNA 수율을 크게 증가 하지 않습니다. - 최대 속도로 샘플 원심 (> 16000 x g) 20 분 4 ° C microcentrifuge에.
- 천천히 RNA 펠 렛을 방해 하지 보장 액체를 pipetting 여는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다.
- 70% 에탄올 (nuclease 무료 에탄올 RNase 무료 물에 희석 하 여 만든)의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 튜브에서 잔여 소금을 씻어 여러 번 그것을 반전 하 여 튜브를 혼합.
- 7 분 동안 원심 분리 단계를 반복 합니다.
- 첫 번째 pipetting P1000 피 펫을 사용 하 여 솔루션의 대부분을 여는 상쾌한 다음 P200 피 펫을 사용 하 여 perturbing 펠 릿 하지 않고 가능한 많은 솔루션을 제거. 층 류 두건 또는 RNase 오염 되지 않도록 주의 하면서 벤치 탑 같은 깨끗 한 공간에서 RNA 펠 릿 건조, 15 분 또는 때까지 아니 더 많은 액체 방울 튜브에서 볼 수 있습니다.
- RNase 무료 물 30 µ L에 펠 릿을 resuspend, 계량 (예를 들어 사용 하 여 제품을 분 광 광도 계), 그리고 약 수-80 ° C 냉동 고에서 장기 저장을 위한 솔루션.
참고: 800-2500 ng / µ L에서 전형적인 농도 범위.
- 5 M 염화 아세테이트와 철저 하 게 혼합 하는 소용돌이의 25 µ L를 추가 합니다.
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(선택 사항) 전장 RNA 요소/페이지를 사용 하 여 생성 되는 확인 합니다. 또는, agarose 젤을 사용 하 여 RNA를 확인.
참고: 그러나, agarose 젤을 사용 하 여 시각화 RNA, gRNA의 큰 금액을 실행 해야 합니다 및 길이 정확 하 게 확인할 수 없습니다. 아니오 또는 약간 절단 현재 경우 대상, 물고기에는 시 약의 주입 후 절단의 효율성을 분석할 때 성능 저하는 sgRNA는 검사 되어야 한다.- 40 %polyacrylamide (19:1)와 솔루션 및 장비43RNAse 무료 기법을 사용 하 여 8 M 요소 TBE에 8 %polyacrylamide 젤을 캐스팅.
참고: 상용 자료 청소 장비를 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). - 후 젤 (약 30 분) 경화 완전히 했다, 그것을 배치 하 여 젤 equilibrate TBE 버퍼를 실행 하 고 5 V/cm에서 30 분 동안 전기 영동을 수행에.
- 믹스는 동일한 양의 RNA 젤 로드 x 2와 sgRNA의 300-500 ng 염색 ( 재료의 표참조). P1000 사용 하 여, 모든 파편의 우물 pipetting 각 잘 여러 번에 버퍼를 실행 하 여 선택을 취소 합니다. 솔루션을 로드 하 고 2.5 h에 대 한 10 V/cm에 젤을 실행 합니다.
참고: 표시자 레인 여기 RNA의 길이 시각화 하는 데 유용 하지만 필요; 하지 않습니다. 일반적으로 그것은 쉽게 명백한 경우 전체 길이 되었습니다 RNA 합성 (그림 2). - 시각화는 핵 산을 사용 하 여 밴드 얼룩 ( 재료의 표참조).
참고: sgRNA 밴드 나타납니다 단일 밴드, 반면 번짐 RNA 저하 (그림 2)를 나타냅니다.
- 40 %polyacrylamide (19:1)와 솔루션 및 장비43RNAse 무료 기법을 사용 하 여 8 M 요소 TBE에 8 %polyacrylamide 젤을 캐스팅.
3. microinjection CRISPR 컴포넌트의 Zebrafish 태아에
- 사육 탱크 원하는 남성과 여성 수를 배치 하 여 주입 전에 밤 설정 (일반적으로 2 명의 여성 및 1 개 또는 2 남성) 사육 탱크에서 분배기에44장소.
- 10 cm 배양 접시에 녹은 agarose의 붓는 35 mL에 의해 0.01% 메 틸 렌 파랑 (균) 1 x E3 미디어 ( 재료의 표참조)에 1.5% agarose microinjection 플레이트를 준비 하 고 부드럽게 만드는 모양 골짜기에 플라스틱 금형을 하다는 솔루션, 공기 방울을 제거 하기 위해 금형을 도청.
- 설정, 저장 미디어의 작은 양의 요리를 agarose를 허용 하 고 접시 4 ° c.에 밖으로 건조 하지 않도록 파라핀 영화에 싸여
참고: 주입 판 우물 변형 또는 건조, 또는 접시 형 성장 하기 시작 때까지 몇 주 동안 다시 사용할 수 있습니다. - 주입의 아침에 순화 된 sgRNA 및 Cas9 단백질에 얼음을 녹여. 장갑 RNase 오염을 방지 하 고 RNase 무료 팁 및 튜브를 사용 하는 모든 자료를 처리 하기 위해 기억 하십시오.
- Cas9 단백질 및 400 pg/nL Cas9 단백질의 최종 농도를 Cas9:sgRNA의 2:1 비율에서 sgRNA 및 200 pg/nL sgRNA를 결합 하 여 5 µ L 주입 솔루션을 생성 합니다. 복잡 한 ribonucleoprotein를 형성 하는 Cas9 및 sgRNA 수 있도록 5 분 동안 실 온에서 Cas9/sgRNA 솔루션을 품 어. 2.5 %wt / 집 페 놀 레드 솔루션의 0.5 µ L 추가 ( 재료의 표참조), 및 5 µ L의 최종 볼륨을 물 RNase 무료.
참고: 솔루션의 이온 강도 Cas9/sgRNA 복잡 한, 따라서 KCl의 추가 낮은 indel 형성28sgRNAs의 절단 효율성을 증가 시킬 수 있습니다의 용 해도 영향을 보여왔다. - 모 세관 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 1.0 m m 유리를 당겨서 주사 바늘을 확인 합니다. Chorion 및 노른자위 sac 피어스 쉽게 것입니다 각된 개방을 얻기 위해 새로운 면도날 또는 집게를 사용 하 여 갓 만든 바늘의 끝을 잘라.
- 장소는 micromanipulator에 바늘 공기 소스와 microinjector에 연결 된 설정. 특정 장치에 대 한 결정은 보정에 대 한 적합 한 확대를 사용 하 여 가벼운 현미경, 바늘은 지속적으로 미네랄 오일으로 채워진 페 트리 접시에 1 nL 솔루션을 추출 될 때까지 주입 압력을 조정 합니다.
참고: 바늘의 품질이 중요 합니다. 바늘을 생산 하 고가 기술 될 때까지 태아의 노 른 자 낭으로 주입 실험45를 추가 하기 전에 마스터입니다. - 분할선을 제거 하 고 약 15 분 동안 사육 하기 물고기 허용.
그러나 참고: 더 이상 번 식 번 더 배아를 생산할 예정 이다, 배아는 기회를 극대화 하기 위해 1 셀 단계에서 Cas9 절단 그 동안 주입을 완료 해야 합니다 발생 초기에 따라서 감소 유전 mosaicism. 배아 (2-4 셀 단계), 나중 단계에서 주입 수 있습니다 하지만이 가능 하 게 수정 된 대립 유전자의 생식 전송 속도 줄일 수 있습니다. - 스 트레이너를 사용 하 여 계란을 수집 하 고 10 cm 배양 접시 0.0001% 메 틸 렌 블루 1 x E3 미디어를 사용 하 여로 그들을 씻어. 어떤 unfertilized 계란과 파편을 제거 하는 가벼운 현미경 아래 계란의 상태를 검사 합니다.
- 따로 별도, 레이블이 지정 된 페 트리 접시에 uninjected 제어로 10-15 태아를 설정 합니다.
- 실내 온도를 따뜻하게 주입 접시에 계란을 일렬로 전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게.
- 2.5 배 확대에서 해 부 현미경, 주사 1 Cas9 단백질의 400 pg와 sgRNA의 200 pg의 총 투입을 각 태아의 노 른 자 낭으로 nL.
참고: 원하는 또는 필요한 경우 절단 증가, 800 페이지/nL에 Cas9 단백질의과 주입 솔루션; 400 pg/nL에 sgRNA의 최종 농도 증가 그러나,이 또한 오프 대상 절단 증가 및 감소 태아 건강 있습니다. 절단 효율성 또한 셀46에 직접 주입 하 여 증가 수 있습니다. 그러나, 노 른 자 자루에 주입 기술적으로 덜 요구 이며 높은 생식 전송 물고기를 생산 하기 위해 충분 한 절단을 제공 (> 수정된 대립 유전자를 포함 하는 자손의 70%). - 올바르게 레이블이 지정 된 페 트리 접시에 주입 된 배아를 반환, 메 틸 렌 파랑, 1 x E3 미디어와 함께 그들을 커버와 28 ° c.로 설정 하는 배아 인큐베이터에 넣어
- 24 시간에 게시물 수정 (hpf) 하 고 죽 었 거 나 비정상적으로 개발 개인 제거 주입된 태아의 건강 검사 미디어 ( 그림 3참조)을 변경 합니다. Uninjected 컨트롤에 대 한 생존의 속도 확인 하십시오.
참고: 때 uninjected 컨트롤을 기준으로 예상 10% 치 사 율 보다는 더 적은 필요 하지 않은 유전자를 대상으로. 경우 치 사 율 높은 수준의 uninjected 컨트롤에 비해 가이드 주입 인구에서 관찰 된다, 그것은 타겟된 유전자 개발에 대 한 필수적입니다 또는 오프 대상 효과 실패 한 개발 선도 나타낼 수 있습니다. 주입된 CRISPR 시 약의 양을 감소 해야 하거나 감소에서 대상 효과 함께 새로운 sgRNA의 생성에 필요할 수 있습니다. - 인큐베이터에는 배아를 반환 하 고 72에 배아를 성장 계속 hpf, 태아 건강을 유지 하기 위해 매일 미디어를 변경.
4.는 HMA를 사용 하 여 Indel 형성의 효율성 분석
- 72에 성장 주사 플레이트에서 5 배아의 수집 두 세트 microcentrifuge 튜브와 수집으로 hpf 5 배아의 uninjected 컨트롤에서 설정 합니다.
- 0.004%를 추가 하 여 배아를 anesthetize MS-222 (tricaine) 2 분 기다립니다.
- gDNA를 추출, 부드럽게 플라스틱 각 배아 설정에서 미디어를 50 m m NaOH의 45 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 95 ° C에 태아를 품 어.
- 실내 온도에 열 소스와 멋진에서 배아를 제거 합니다. 추가 1 M Tris HCl pH의 5 µ L = 8, 소용돌이 샘플 적극적으로 (5-10 s). 최대 속도로 솔루션 원심 (> 16000 x g) 3 분에 대 한 실내 온도 microcentrifuge에 깨끗 하 고 레이블 튜브에는 상쾌한 전송 하 고 최대 6 개월 동안-20 ° C DNA에서 gDNA를 저장.
참고: DNA 파편 약 900 bp 및 작은 것의이 프로토콜의 사용을 통해 생성 됩니다. - 중 합 효소, 예측된 컷된 사이트 측면 이전에 디자인된 뇌관을 사용 하 여 포함 된 지침 당 50 µ L의 PCR 반응 각 샘플 (를 포함 하 여 uninjected 컨트롤)에서 준비 gDNA의 2 µ L를 사용 하 여 설정 합니다.
- 정화는 PCR는 PCR를 사용 하 여 청소 키트 ( 재료의 표참조), 물 또는 차입 버퍼의 30 µ L의 샘플을 elute 제품과 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA를 계량.
- (500 mL 비 커에 약 150 mL) 끓는 물 욕조에 뜰 선반에 튜브를 배치 하 여 각 순화 된 PCR 제품의 모든 30 µ L를 reanneal. 3 분 후 열 원을 끄고 약 1 시간, 실내 온도에 냉각 솔루션을 허용.
참고:이 단계 먼저 DNA를 변성 한 후 무작위로 생성 가능한 heteroduplex 악대, reanneal를 가닥 또는 일치 하지 않는 이중 가닥 DNA 동 질 다 상 있는 CRISPR mutagenesis에 의해 만들어진 있고 따라서는 변경 전기 이동 기동성 homoduplexes에 비해입니다. 제품47,48, reanneal를 PCR 또는 다운 프로그램에는 thermocycler의 마지막 주기를 사용하실 수 있습니다 하지만 끓는 목욕의 사용은 heteroduplex 제품의 향상 된 해상도 얻을 수 있습니다. - 추가 로드 x 6의 5 µ L reannealed PCR 솔루션 ( 재료의 표참조)를 염색.
- 30 %polyacrylamide (29: 1)를 사용 하 여 15 %polyacrylamide / TBE 젤 캐스팅. 젤은 설정 후 실행 버퍼 TBE와 전기 장치에 놓습니다. P1000 사용 하 여, 잔여 소금 같은 어떤 파편 든 지의 우물을 취소 또는 부드럽게 pipetting 버퍼 아래로 우물으로 여러 번 하 여 우물을 방해 수 있는 조각의 젤.
- Reannealed PCR 제품, 고 부하 제어 (uninjected 물고기에서 샘플) sgRNA 샘플의 각 집합 옆의 부하 500 ng. 150 V 2.5 h 또는 젤의 하단에는 염료 앞까지에 젤을 실행 합니다.
- 핵 산 얼룩을 사용 하 여 밴드를 시각화 (예를 들어, ethidium 평범한 사람 또는 SYBR 녹색 ( 재료의 표참조)).
- 각 제어 및 배아의 CRISPR 주입 풀 밴드 패턴을 검사 합니다.
참고: 다중의 모양 밴드는 주입에서 느리게 실행 하는 uninjected 차선 대 소설 heteroduplex 제품 (그림 4)의 형성을 나타냅니다. 소설 heteroduplex DNA의 존재 indels CRISPR 주입에 의해 생성 된 것을 나타냅니다. 약 50% 이상 주입 솔루션에서 homoduplex 밴드 강도 감소는 충분 한 생식 전송 결과를 일반적으로 충분 합니다. 또한, 추가 밴드 가끔 uninjected 물고기에서 확인 된 그리고 heteroduplex 밴드 주입된 물고기에서 관찰 될 때 고려해 서는 안됩니다. - 선택 대상; uninjected 컨트롤에 상대적인 높은 절단 효율성으로 주사 이러한 주사에서 배아 indels 조 정지 codons를 일으키는 대 한 보고 물고기를 성장 사용할 수 있습니다.
참고: 고효율 절단 (약 > 50% 강도 의해 homoduplex 밴드 감소), 20-30 성인 물고기 심사 충분 해야 한다 생식 전송 얻을.
더 적은 절단을 생성 하는 sgRNAs에 대 한 더 성인 물고기 조 숙한 정지 codon를 포함 하는 수정 된 대립 유전자의 생식 전송 하는 물고기를 식별의 가능성을 높이기 위해 필요할 수 있습니다. 경우 indel 형성은 하지 그것은 유전자의 다른 영역에 sgRNA를 다시 디자인 해야 할 수 있습니다. 없는 heteroduplex 밴드 형성 관찰 되는 경우는 sgRNA 성능이 저하 될 수 있습니다, 그리고 sgRNA 품질 요소/페이지 젤을 사용 하 여 확인 해야 합니다.
5. 식별 및 노크 아웃 라인의 전파
- 잠재적인 설립자 부모 물고기를 식별 하기 위해 (약 2.5-3 개월 성장) indels의 존재를 식별 하는 성인 F0 물고기의 꼬리 클립을 수행 합니다. 0.62 m m tricaine에서 물고기를 anesthetize ( 재료의 표참조) 다음 깨끗 하 고 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 약 1/2-3/4의 꼬리 지 느 러 미를 제거 하.
- 50 m NaOH, m 45 µ L에서 꼬리를 놓고 복구 탱크에 물고기를 반환 합니다. GDNA 추출 단계로 설명 (4.2-4.4)을 수행 합니다. 물고기는 정상적인 수영 동작을 다시 시작, 일단 흐르는에 다시 물고기를 놓습니다 시스템 물은 indel의 특성 확인 될 때까지.
참고: 개별 물고기 식별 하 고 적절 하 게 꼬리 클립의 결과 일치 될 수 있습니다 중요입니다. - 설명 된 대로 (단계 4.5-4.9), 물고기 CRISPR 주입 (그림 5)에 의해 수정 된 경우 확인 하려면 꼬리 클립 gDNA를 HMA 수행. 설립자의 물고기를 식별 하려면 성인 야생-타입 물고기 꼬리 gDNA에서 heteroduplex 밴드 하는 사육 한다. 배아를 수집 하 고 72 성장 hpf.
- 72에서 hpf, 10 배아를 수집 하 고 각 배아는 개별 튜브에 배치. 11.25 µ L 50 m NaOH m 및 1 M Tris pH의 1.25 µ L를 사용 하 여 (단계 4.2-4.4) 위에서 설명한 대로 gDNA 추출 = 8.
- 반복은 PCR 및 전기 이동 법 heteroduplex 밴드 (단계 4.7-4.13) 위에서 설명한 대로 식별 하 indel 대립이 세대 (그림 6) 통과 되었습니다 경우 확인 하.
- 단일 배아는 HMA를 사용 하 여 관찰 백분율 전송에 따라 달라 집니다, 성인 기의 각 CRISPR-라인에 대 한 십자가 의해 얻은 20-30 배아의 평균 성장.
참고:이 숫자 증가 또는 생식 전송의 주파수에 따라 감소 될 수 있습니다. - 설명된 (5.1-5.2 단계)으로 indels의 존재를 식별 하는 성인 F1 물고기의 꼬리 클립을 수행 합니다. 설명 된 대로 (단계 4.5 – 4.11), 꼬리 클립 gDNA 물고기 indel (그림 7) 수행 결정에 HMA를 수행.
-
Heteroduplex 밴드를 포함 하는 물고기에 대 한 DNA 시퀀싱 분석에 대 한 준비.
- PCR 증폭 300-600 bp PCR 제품 컷된 사이트를 중심으로 새로운 뇌관을 사용 하 여 수행 합니다.
- 정리 하는 DNA 고 30 µ L. elute PCR 정화 키트를 사용 하 여 단일 밴드 존재 인지는 agarose 젤에 DNA를 검사 합니다.
참고: 일부 heteroduplex 밴딩 작은 얼룩 또는 더블 밴드 보다 큰 예상된 크기에 PCR 제품으로 나타나고 agarose 젤에 존재할 수 있습니다.
- 1 ~ 3 indels를 분석 하는 경우 생어를 사용 하 여 PCR 제품을 시퀀싱 시퀀싱 및 indel49생물 정보학 도구 사용 하 여 순서를 결정. 그렇지 않으면, NGS 분석을 사용 하 여 다중 PCR 제품의 시퀀스의 결정 (참조 테이블의 재료)은 더 경제적 이다.
- 조 숙한 정지 codon 생물 정보학 도구를 사용 하 여 시퀀스를 분석 하 여 얻은 되었습니다 경우 결정 ( 재료의 표참조).
- 적절 한 레이블 가진 새로운 탱크에 원하는 돌연변이 체 대립 유전자를 포함 하는 물고기를 놓습니다.
- 미래 유전형 요구에 대 한 특정 indel 대립 유전자에 대 한 PCR 뇌관 디자인. 이 뇌관 돌연변이 시퀀스를 확장 하 고 야생-타입 시퀀스를 증폭 하지 해야 합니다.
- -크로스 heterozygous zebrafish 분리 인구 25% 노크 아웃 라인을 포함 하는 생성 하.
Representative Results
이 프로토콜에서 설명 하는 실험 방법의 제 브라 노크 아웃 라인 CRISPR/Cas9 기술을 사용 하 여 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 수 있습니다. 다음 수치 해석 및이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 문제 해결이 문서에 포함 되었습니다. 다음 성공적인 생산 그리고 CRISPR 시 약의 microinjection, zebrafish 태아 명백한 고기 및 indel 형성 HMA를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. CRISPR 실험의 성공을 시각화 하는 유용한 컨트롤은 안료 생산 유전자를 대상으로 1.5 단계에서 설명 하는 sgRNA 사용 하 여 tyrosinase. Cas9 유도 indel tyrosinase 에서 염색의 손실에 결과 형성과 48에 의해 쉽게 득점 hpf (그림 1). 주입에 성공 했다에 대 한 CRISPR 시 약의 그 준비를 위해 또 다른 유용한 제어는 전체 길이 확인 하는 것입니다 (120 nt) sgRNA 변성 polyacrylamide 젤 (그림 2, 레인 1와 2)를 사용 하 여 합성 되어 있다. RNA를 타락 하는 경우 그것은 나타날 수 있습니다 얼룩, 예를 들어 레인 3 (그림 2)은 저하 RNA 사출에 적합 하지 않습니다.
Tyrosinase, 같은 명백한 고기 초래 하지 않는 CRISPR Cas9 대상 유전자의 indel 형성 주파수 분석을 HMA 분석은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. sgRNA/Cas9 heteroduplex 밴드의 형성 및 homoduplex 밴드 (그림 4)의 강렬의 감소에서 HMA 결과 사용 하 여 분석 하는 배아를 주입. Heteroduplex 밴드의 존재는 더 잠재적인 설립자 물고기 (그림 4 및 그림 5), 성인 설립자 ( 의 생식 전송 효율을 분석 하 고 microinjected 배아에서 식별 하기 위해이 프로토콜에 활용 그림 6), 그리고는 indel heterozygous F1 물고기 (그림 7)의 존재를 확인 하. Heterozygous 물고기는 indel을 포함 하는 후보로 NGS는 indel의 성격을 파악 하 고 조 숙한 정지 codon 대상 유전자의 코딩 지구에 존재 여부를 확인 하는.
그림 1 : Zebrafish 태아 전시 tyrosinase 1 셀 단계에서 대상으로 하는 sgRNA와 함께 주입 했을 때 안료 결함. (A) 야생-타입, uninjected 48에 배아 hpf와 (B) 주입 48에서 배아 hpf. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 합성 키트를 사용 하 여 sgRNA의 녹음 방송 생체 외에서 . Oligos는 sgRNA 종합 키트 지침에 따르면 녹음 방송 생체 외에서 를 사용 하 여 합성 했다. 500 ng RNA의 설명 된 대로 요소/페이지 젤에 실행 했다. sgRNA 레인 1과 2에 로드 밴드 전체 길이 그대로 120 nt RNA에 해당 표시 됩니다. 레인 3에 sgRNA 사출에 적합 하지 않습니다 저하 RNA 샘플을 보여 줍니다.
그림 3 : 24 hpf 주입 태아의 건강의 비교. 24 생활 배아 (A) 개발 hpf, (B) 개발 중단은 배아에서 쉽게 구별 된다. (B)를 닮은 나 크게 있는 태아 척추 곡률 등 (a) 기능을 변경 또는 머리를 변경 및 눈 개발 접시에서 제거 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : SgRNA Cas9의 Heteroduplex 이동성 분석 결과 zebrafish 태아 microinjected. 샘플 당 5 배아의 풀 72에서 수집 된 hpf 및 gDNA 추출 되었다. Heteroduplex 분석 수행, 설명 된 대로 샘플 500 동등 하 게 로드 된 DNA의 ng. 레인: M = 100 bp 마커; 1 = uninjected 제어; 2 사출 샘플 1; = 3 = 사출 샘플 2. 예상 밴드 크기 98 = 혈압.
그림 5 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 gDNA 성인 CRISPR 주입 zebrafish의 꼬리에서 추출의. 배아는 sgRNA와 Cas9 단백질 주입 했다 성인 (3 개월)로 성장 했다. 물고기 B와 C heteroduplex 악대를 전시 하 고 이후에 생식 전송 indels;을 식별 하기 위해 사육 했다 긍정적인 heteroduplex 밴드를 전시 하지 않습니다 때문에 물고기 A는 이후 분석에 사용 되지 않습니다. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기; 3 = 물고기 B; 4 물고기 C. 예상 밴드 크기 = 98 = bp. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 단일 배아 전송 생식 indels를 식별 하는 야생-타입 물고기 F0 CRISPR 주입 제 브라를 번 식에 의해 생성 된의. Zebrafish 성관계 했다 F1 배아 72 h. 단일 배아에 대 한 성장 수집 그리고 heteroduplex 분석 수행 설명 된 대로. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2-10 차선 당 하나의 F1 배아를 =. 이 젤 10 중 7 배아는 indel의 70%의 생식 전송 속도 나타내는 긍정적인 heteroduplex 밴드 표시 보여줍니다. 밴드 크기 예상 = 98 bp. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 성인 F1 zebrafish 꼬리 클립의. 성인 F1 물고기 HMA indels를 식별 하 여 득점 했다. 긍정적인 heteroduplex 밴드 전시 물고기가 했다 PCR 증폭 및 넓은 시퀀싱 분석에 대 한 돌연변이의 특성을 확인 하. (A) 차선: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기 (4 혈압 삭제, 1 bp 불일치). (B)이이 F1 생선과 같은 설립자에서 확인 되었다 아직 다른 heteroduplex 패턴화, 하나의 설립자에서 여러 수정 된 대립 유전자의 생식 전송을 나타내는 표시. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 물고기 (4 bp 삽입, 7 bp 불일치), B = 3 = 물고기 C (4 혈압 삭제, 4 혈압 불일치). 각 이러한 indels NGS 정한 대상 유전자의 코딩 순서에서 조 숙한 정지 codon를 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜 CRISPR Cas9 기술을 사용 하 여 zebrafish 척추 동물 모델 시스템에서 유전자 녹아웃의 생산을 설명 합니다. 프로토콜의 수는 이전 zebrafish15,25,26,50,,5152CRISPR 중재 게놈 엔지니어링 수행을 설명 되었습니다. HMA와 여러 heterozygous 생선, 만들려고 간단, 경제적, 그리고 실험적으로 강력한 프로토콜의 NGS이이 프로토콜 수 간단 하 고 그러나 reproducibly 일관 된 실험 기법, 특히에서 결합 하 여 노력 이전에 빌드 CRISPR 중재 mutagenesis zebrafish에서 실험실 다양 한 훈련 및 경험, 뿐만 아니라 교육 연구소 직원과 직원에 대 한 적절 한입니다.
RNAs는이 프로토콜에 포함 된 설명서의 설계 및 합성에 대 한 권장 사항. 가이드 RNA 설계에에서 주요 고려 대상에서 효과의 최소화입니다. CRISPR-사용자가 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스 모두 대상에 가이드의 활동 및 오프 대상 효과34, 의 기회를 예측 하는 계산 도구를 액세스할 수 있도록 여러 가지 예측 알고리즘 개발 되었습니다 35,36. 특정 zebrafish 시스템의 장점은 오프 대상 효과의 저하 속도 Cas9 배아에 주입 되며 따라서 식 과도, 있는 감소에서 대상 효과53을 마우스에 표시 되었습니다 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 오프 대상 효과 zebrafish54에 입증 되었습니다. 한 오프 대상 효과 대 한 제어 방법은이 가이드는 매우 다른 오프 대상 사이트에 영향을 미칠 가능성이 있을 것 이라고 동일한 유전자를 대상으로 하는 두 개의 독립적인 가이드 RNAs에 의해 생성 된 표현 형 설립자 zebrafish에. 이 프로토콜에서 설명 되지 않은 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 다른 방법을 높은 효율으로 수리 대상 DNA 단일 가닥 휴식을 생성 하는 돌연변이 Cas9의 사용 이다. 반대로 보완 서로 근접 내의 DNA 닉스 페어링 원하는 장소에서 효과적인 indel 형성에 결과 긴 고 오프 대상 효과55,56를 최소화 합니다.
-대상 효과의 다른 요금 이외, 다른 sgRNAs mutagenesis 원하는 대상57,,5859의 다른 비율을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 heteroduplex 밴드 형성33,40을 사용 하 여 주어진된 sgRNA mutagenesis의 효율성을 분석 하 HMA를 사용 합니다. Heteroduplex 밴드와 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 쉽게 해결할 수 있습니다 불일치를 포함 하는 PCR에서 생성 된 DNA 가닥의 교 잡에 의해 만들어집니다. 일반적으로 indel 형성을 측정 하는 데 사용 하는 다른 메서드와 달리 T7 endonuclease 등 분석 결과 또는 높은 해상도 분석25,26, HMA 잘라 일치 하지 않는 DNA, 비싼 효소를 필요 하지 않습니다.를 녹여 필요 하지 않습니다. PCR의 복잡 한 분석 곡선 녹아 있습니다. 중요 한 것은, 물고기와 함께 돌연변이 식별 하는 비용을 줄일 수 있는 노크 아웃 라인의 다음 생산에 필요한 수를 최소화 하기 위해 수 사관 수 또한 HMA를 사용 하 여 주입 된 인구에서 indel 형성의 높은 속도 확인 하는 원하는 특성.
CRISPR 기반 indels 생성의 비교적 쉽게 한 번에 여러 여러 유전자의 대립 유전자의 생성을 수 있습니다. 웹 기반 소프트웨어는 생어를 사용 하 여 heterozygous 물고기에서 단일 돌연변이의 분석에 사용할 수 있는 PCR 제품49의 연속. 경우 3 개 이상의 CRISPR 돌연변이 대립 유전자 분석은 NGS는 indel의 자연 하는 가능성이 더 비용 효과적이 접근으로 indel의 자연 하 수 오에 특징을 최대 50 다른 대립 유전자의 풀 후부 터 (참조 테이블의 재료)60,,6162. 이러한 경제 규모의 가능성이 학부 실험실 환경에서 특히 유용 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 reproducibly 필요가 적은 성인 생선을 만들어 분석 성공적으로 관심의 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하는 (특히, sgRNA)에서 높은 품질 CRISPR 시 약을 생성 하기 위한 단계별 지침을 제공 하 또한 원하는 라인 생성의 비용과 시간을 줄일 수 있습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜을 저렴 한 방식으로 돌연변이 제 브라를 생산 하는 한정 된 자원 가진 실험실에 의해 적용할 수 있는 설계 되었습니다. 또한, 우리는이 이렇게 학부생에 적합 하 고 따라서 교육 및 CRISPR 기반 게놈 편집 실습에 관심 있는 학부 학생 들의 교육 기회를 확장 발견 했다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (R21CA182197 J.O.), 랄 프 W.와 그레이스 M. Showalter 연구 신뢰, 그리고 퍼듀 농업 과학 경제 개발 (AgSEED) 프로그램에 대 한 확장에 의해. 생어 시퀀싱 데이터 P30 CA023168에서 지 원하는 퍼듀 유전체학 핵심 시설에 의해 인수 되었다. 메리 Witucki 퍼듀 대학 센터에서 암 연구 여름 학부 연구 프로그램 캐롤 카운티 암 협회 지원 지원 한다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 감사 벤자민 카터, 런 닝, 그리고 테일러 Sabato 원고에 중요 한 피드백을 제공. 우리는이 작품의 생화학의 부 그리고 Zebrafish 관심과 우리의 zebrafish 식민지의 복지에 그들의 헌신에 대 한 퍼듀 대학에서 연구를 위한 센터 감사합니다. 마지막으로, 우리는 퍼듀 유전체학 핵심 시설, 감사 하 고 필립 산 미 구 엘의 기여에 대해서 NGS 서비스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
References
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