Summary
Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.
Abstract
Karakterisering van de geclusterde, regelmatig interspaced, korte, palindromische herhalen (CRISPR) systeem van Streptococcus pyogenes heeft de ontwikkeling van een aanpasbaar platform om snel genereren gene wijzigingen in een breed scala van organismen, met inbegrip van de zebravis. CRISPR gebaseerde genoom bewerken maakt gebruik van een enkele gids RNA (sgRNA) te richten op een CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease aan een genomic DNA (gDNA) doel van belang, waar de Cas endonuclease genereert een dubbel-strand break (DSB). Reparatie van DSBs door foutgevoelige mechanismen tot invoegingen of verwijderingen (microdeleties). Hierdoor kan frameshift mutaties die vaak leiden tot een voortijdige stop codon binnen de codering volgorde, waardoor een eiwit-null-allel. CRISPR gebaseerde genoom engineering vereist alleen een paar onderdelen van de moleculaire en zebrafish embryo's gemakkelijk door microinjection is binnengebracht. Dit protocol beschrijft de methoden die worden gebruikt voor het genereren van CRISPR reagentia voor zebrafish microinjection en vis exposeren germline transmissie van CRISPR gemodificeerde genen te identificeren. Deze methoden omvatten in vitro transcriptie van sgRNAs, microinjection van CRISPR reagentia, identificatie van microdeleties veroorzaakte op de doelsite met behulp van een PCR-gebaseerde methode met de naam van een heteroduplex mobility assay (HMA) en karakterisering van de microdeleties met behulp van zowel een lage doorvoersnelheid en een krachtige volgende generatie sequencing (NGS)-gebaseerde aanpak die meerdere PCR producten verzameld uit heterozygoot vis analyseren kan. Dit protocol wordt gestroomlijnd om te minimaliseren van het aantal vissen nodig én de soorten apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van de analyses. Bovendien, dit protocol is ontworpen om te worden vatbaar voor gebruik door laboratorium persoonlijke van alle niveaus van ervaring met inbegrip van studenten, waardoor dit krachtige hulpmiddel kunnen economisch worden ingezet door alle geïnteresseerd in het uitvoeren van de CRISPR gebaseerde onderzoeksgroep genomic wijziging in zebrafish.
Introduction
De instandhouding van de moleculaire machines in eukaryoten ten grondslag ligt aan de kracht van het gebruik van modelorganismen voor onderzoek. Veel van deze modelsystemen vergemakkelijken het gebruik van omgekeerde-genetische benaderingen zoals gerichte gene uitsparingen te karakteriseren van de bijdrage van een gen-product met een biologische of ziekte proces van belang. Gene verstoring technieken in organismen zoals zebrafish hebben historisch vertrouwd op gerichte invoering van frameshift mutaties die uit de onnauwkeurige reparatie van DSBs1,2 voortvloeien. Wanneer een DSB is ingevoerd in het genoom, de DNA-laesie is gerepareerd door een van de twee trajecten die universeel aanwezig in bijna alle soorten cellen en organismen zijn: niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR)3,4 . De onnauwkeurige aard van de NHEJ machine produceert vaak microdeleties van verschillende lengtes5,6,7,8,9. Invoering van frameshift mutaties in de codering sequentie van een gen kan produceren een voortijdige stop codon, waardoor vaak de gene achterblijven.
Vroege genoom engineering strategieën in zebrafish ter bevordering van microdeleties opgenomen meganucleases, zink-vinger nucleasen en transcriptie activator-achtige effector nucleasen, die allemaal DNA-eiwit interactie gebruikt te richten op een nuclease aan een specifieke genomic doel waar het een DSB10,11,12,13,14,15ingevoerd. Deze technologieën zijn echter vaak moeilijk toe te passen als gevolg van de moeizame en ingewikkelde techniek nodig om te genereren een nuclease die zich richt op de opeenvolging van DNA van belang. In tegenstelling tot eerdere strategieën afhankelijk gene CRISPR gebaseerde bewerken niet is van eiwit-DNA interacties voor targeting. In plaats daarvan is de CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease gericht via een RNA-gids die gebruikmaakt van de nucleotide base paren interacties te richten een genomic site van belang16,17,18,19 2120, ,. Als gevolg van de eenvoud van het ontwerpen van een RNA is gids met de gewenste base interacties voor targeting het in paren rangschikken relatief eenvoudig om de Cas endonuclease naar de gewenste plaats. Het type II CRISPR systeem is in het bijzonder sterk ontwikkeld voor genoom uitgeven toepassingen als gevolg van verschillende voordelige eigenschappen met inbegrip van gebruik van een enkele met meerdere domeinen Cas nuclease (Cas9) die interactie met DNA te stimuleren endonuclease activiteit vereist en gebruik van een enkele gids RNA (sgRNA) om te richten het op de DNA sequentie van cognaat18. De reeks eisen die noodzakelijk zijn voor het targeten van de cognaat sgRNA zijn goed begrepen19, en de gewenste sgRNA gemakkelijk door in vitro transcriptie wordt gegenereerd. De eenvoud en robuustheid van de CRISPR/Cas9-aanpak vergemakkelijkt sterk gerichte genetische modificatie in de zebravis en een grote verscheidenheid van andere organismen.
De verbeterde mogelijkheid ertoe gerichte genoom bewerken in de zebravis als gevolg van de ontwikkeling van de CRISPR gebaseerde reagentia aanzienlijk heeft verhoogd de kans om processen karakteristieke van gewervelde organismen zoals ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel te bestuderen systeem. De zebravis genoom van Sinorhizobium orthologs van 70% van de eiwit-codeert genen gevonden in het menselijk genoom alsmede 84% van de genen die ziekten bij de mens22is gekoppeld. Zebravis ontwikkeling vertoont enkele key kwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren: de embryo's worden gelegd in grote klauwen, extern te ontwikkelen van de moeder, waardoor ze zich lenen voor genetische manipulatie door microinjection, en volwassen zebravis seksueel volwassen door 3 maanden oud, waardoor snelle teeltmateriaal voor gewenste lijnen23.
Er zijn talrijke protocollen beschikbaar die beschrijven een aantal verschillende benaderingen te genereren en te identificeren CRISPR afkomstige microdeleties in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Veel van deze procedures zijn echter tijd intensief, toegang tot dure apparatuur nodig, en kunnen lastig zijn voor labs met beperkte expertise. De hierin beschreven stappen bieden een eenvoudige, robuuste en economische CRISPR/Cas9-strategie voor de ingenieur zebrafish knock-out lijnen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een zeer efficiënte kit voor het synthetiseren van sgRNAs met behulp van DNA oligonucleotides (oligos), vergelijkbaar met andere benaderingen die al eerder beschreven32. Het beschreven protocol omvat twee stappen in het bijzonder die sterk analyse van CRISPR-gemuteerd lijnen vereenvoudigen: stapsgewijze gebruik van de PCR-gebaseerde HMA33 gemakkelijk bepalen de aanwezigheid van genoom wijzigingen en sequencing analyse van heterozygoot zebrafish snel en gemakkelijk bepalen de aard van meerdere microdeleties op een economische manier. Daarnaast zijn stapsgewijze instructies opgenomen voor selectie van de robuuste, betrouwbare productie en injectie van gids RNAs. De stappen hier illustreren een robuust, relatief goedkope protocol waarmee laboratoriumpersoneel met een scala aan expertise bij te dragen aan de identificatie van het gen uitsparingen in zebrafish.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health. Het protocol is goedgekeurd door de Purdue Animal Care en gebruik Comité (PACUC nummer 08-031-11).
1. ontwerp van een sjabloon-specifieke Oligos voor gids RNA productie
- Selecteer het doel regio van belang zijn voor de codering regio van het gen worden gewijzigd. Dit moet dicht bij het einde 5' van het gen te genereren een afgeknotte eiwit, maar niet zo dicht zodanig dat een latere in-frame start codon productie van een eiwit met een bescheiden N-terminale afkappen kunt.
Opmerking: Een manier om deze mogelijkheid uitsluiten is voor het scannen van de stroomafwaartse codering regio van het gen voor een in frame start codon. Bovendien, kan met behulp van een gids RNA dat zich richt op het midden van een grote exon, helpen om het identificeren van PCR inleidingen voor latere scoring van de resulterende indel. - Identificeren van potentiële locaties van de gids in de genomische regio van belang met behulp van een gids RNA selectie program (Zie Tabel van materialen)34,35,,36. Stel in de browser gegevens op Danio rerio en de volgorde van de aangrenzende motief (PAM) protospacer tot 5'-NGG-3 '.
Opmerking: De ideale gRNA sequenties bevatten een 5 '-G in de eerste positie van de gRNA voor efficiënte T7 in vitro transcriptie. Als er geen aanvaardbaar gids is gevonden met een G op de 5 '-positie, de basis van de 5 ' van een andere gids kan worden gewijzigd op een G of een G op de 5 ' einde van de geleider RNA kan worden toegevoegd, maar dit kan snijden efficiëntie37beperken. Maximaliseren van de efficiëntie van het snijden, een optimale gids-reeks heeft 40-80% GC gehalte (hoger is beter), en bevat een G op de 20th positie, grenzend aan de PAM, maar is niet vereist38. Een voorbeeld van een ideale targeting reeks: 5 ' - G (N)18 G-3 ' - NGG (NGG is de PAM). Naast de bestudering van de resultaten van de gids RNA selectie programma te identificeren van de optimale gids RNAs zoals hierboven beschreven, moet de zorg worden genomen om te voorkomen gids RNAs met voorspelde sterk af-target effecten die sterk downstream analyse bemoeilijken. In het bijzonder begeleiden RNAs met voorspelde af-target effecten vallen onder codering van de regio's moet worden uitgesloten, waardoor de totale uit-target sites voorspeld moeten worden geminimaliseerd. - De output van de gids RNA design tool, de volgorde van de PAM uitsluiten (5 '-NGG-3 '); het wordt niet gebruikt voor targeting maar omvat de volgorde van de erkenning voor Cas9 decollete.
- De resterende 20 nucleotiden (nts), toevoegt de T7 promotor volgorde en de volgorde van de overlapping (regio complementair aan een steiger oligo gebruikt voor het synthetiseren van volledige lengte sgRNAs bijgeleverde aanbevolen in vitro transcriptie) in de aangegeven volgorde hieronder om het verkrijgen van een 54 nt oligo: T7 promotor volgorde: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; Begeleiden van RNA volgorde 5 ' - G (N)18 G-3 '; Overlapping van reeks: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
- PCR de inleidingen die flank van de voorspelde gesneden site identificeren (Cas9 cleaves 3 nt stroomopwaarts van de PAM-reeks) op een afstand van 50 – 150 basenparen (bp) elk van de snede met behulp van web-gebaseerde software (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Deze zal worden gebruikt in een latere stap voor meting van snijden efficiëntie. Als geen geschikt inleidingen worden geïdentificeerd met behulp van deze beperkingen, kan een andere gids RNA site moet worden beschouwd. - Bestel 54 nt oligonucleotides voor de productie van de gids RNA en PCR inleidingen voor analyse van de sites van de doelgroep (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Als een optionele positieve controle, op mei zitten hulpvaardig voor de productie van een sgRNA gericht op een gen die nodig zijn voor de productie van pigment om te controleren of de prestaties van dit protocol, met behulp van een eenvoudig scoorde visuele fenotype (Zie Figuur 1 voor representatieve resultaten). Een gemeenschappelijke doelstelling is het gen tyrosinase, met behulp van de oligo (gids sequentie van het RNA is onderstreept)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-GGACTGGAGGACTTCTGGGG-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
2. voorbereiding van de CRISPR-reagentia voor Embryo Microinjection
-
Bestellen van verkrijgbare Cas9 eiwit (zie tabel van materialen).
Nota: Injectie van Cas9 mRNA kan ook worden gebruikt voor het genereren van microdeleties in zebrafish40,41, maar zebrafish embryo microinjection met Cas9 eiwit heeft aangetoond dat meer efficiënte32,42.- Opschorten van de Cas9 eiwitten in de meegeleverde buffer voor het genereren van een oplossing van 1 mg/mL. Bewaar de oplossing in injectie gebruiksklare porties in PCR buizen bij-80 ° C tot een minimum beperken van het aantal cycli bevriezen-ontdooien. Voor het genereren van een 5 µL injectie oplossing, 2 µL van 1 mg/mL Cas9 oplossing wordt gebruikt, kunnen de Cas9 dus aliquoted in 2 µL aliquots met behulp van PCR strip-buizen.
- De sgRNA met behulp van de sgRNA in vitro transcriptie synthetiseren kit (Zie Tabel van materialen). Het uitvoeren van de transcriptie in vitro volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Handhaven RNase-vrije techniek tijdens alle synthese, sanering en injectie voorbereiding stappen oplossing. Bijvoorbeeld, gebruik van wegwerphandschoenen en ze vaak veranderen, buizen en tips die zijn gecertificeerd RNase-vrij, en schone oppervlakken en pipetten met verkrijgbare oplossingen voor decontaminatie labware gebruiken (Zie Tabel van materialen). -
De kunstmatige sgRNA met behulp van een ammoniumacetaat/neerslag met behulp van RNase-vrije techniek zuiveren.
Opmerking: U kunt ook sgRNAs gezuiverd kan worden met behulp van een verscheidenheid van commercieel beschikbare kolom gebaseerde RNA opruimen kits voor een bescheiden prijs.- Voeg 25 µL van 5 M ammoniumacetaat en vortex aan meng.
Opmerking: Ammonium acetaat oplossing is commercieel beschikbaar (Zie Tabel of Materials), of een oplossing van 5 M kan worden gemaakt in huis door 385.4 mg ammoniumacetaat op moleculaire rang toe te voegen tot 1 mL RNase-gratis water en opgeslagen bij-20 ° C. - 150 µL van 200-proof nuclease-vrije ethanol toevoegen aan elk monster. Plaats de reactie in een vriezer-80 ° C voor een minimum van 20 min.
Opmerking: De monsters 's nachts kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C, maar de totale opbrengst van RNA niet aanzienlijk zal toenemen. - De monsters op maximale snelheid te centrifugeren (> 16.000 x g) in een microcentrifuge van 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig door langzaam pipetteren uit de vloeistof, ervoor te zorgen dat de RNA-pellet wordt niet verstoord.
- Voeg 1 mL 70% ethanol (gemaakt door verdunning van de nuclease-vrije ethanol in RNase-gratis water) en meng voorzichtig de buis door het omkeren van het meerdere malen te wassen resterende zout uit de buis.
- Herhaal de stap van centrifugeren voor 7 min.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen door het eerste pipetteren uit allermeest naar de oplossing met behulp van een precisiepipet P1000, gebruik dan een P200 pipet om zoveel oplossing verwijderen als mogelijk is zonder storing veroorzaakt de pellet. Droog de RNA-pellet in een schone ruimte, zoals een laminaire flow-kap of een bankje top, voorzichtig om RNase verontreiniging te vermijden, gedurende 15 minuten of tot geen meer vloeistof druppels zijn zichtbaar in de buis.
- Resuspendeer de pellet in 30 µL van RNase-gratis water, kwantificeren van het product (bijvoorbeeld met een spectrofotometer) en aliquot de oplossing voor langdurige opslag in een vriezer-80 ° C.
Opmerking: Typische concentraties variëren van 800-2500 ng/µL.
- Voeg 25 µL van 5 M ammoniumacetaat en vortex aan meng.
-
(OPTIONEEL) Controleer of dat full-length RNA is gegenereerd met behulp van ureum/pagina. Ook een agarose gel te gebruiken om te verifiëren dat de RNA intact is.
Opmerking: Echter als met behulp van een agarose gel een groter bedrag aan gRNA moet worden uitgevoerd om te visualiseren van RNA, en de lengte niet nauwkeurig kan worden bepaald. Bij het analyseren van de efficiëntie van het doel snijden na injectie van de reagentia in de vis, als er geen of weinig snijden aanwezig moet dan de sgRNA worden gecontroleerd voor afbraak.- Gegoten een polyacrylamidegel van 8% in de TBE met 40% polyacrylamide (19:1) en 8 M ureumstikstof met behulp van RNAse-vrije techniek voor de oplossingen en de apparatuur43.
Opmerking: Commercieel beschikbare materialen kunnen worden gebruikt voor het reinigen van apparatuur (Zie Tabel van materialen). - Nadat de gel is volledig verhard (ongeveer 30 min), de gel equilibreer door deze te plaatsen in de TBE buffer uitvoeren en uitvoeren van elektroforese voor 30 min 5 V/cm.
- Mix 300 – 500 ng van sgRNA met een gelijk volume 2 x RNA gel laden kleurstof (Zie Tabel van materialen). Met behulp van een P1000, schakelt u de putten van een puin door pipetteren buffer in elke goed meerdere malen uitgevoerd. De oplossing(en) laden en de gel bij 10 V/cm gedurende 2,5 uur lopen.
Opmerking: Een marker lane hier is nuttig voor het visualiseren van de lengte van het RNA maar is niet verplicht; over het algemeen is het gemakkelijk herkenbaar als volledige lengte RNA al gesynthetiseerd (Figuur 2). - Visualiseer de bands met behulp van een nucleïnezuur vlek (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: sgRNA banden moeten worden weergegeven als een enkele band, overwegende dat smeren de aantasting van het RNA (Figuur 2 blijkt).
- Gegoten een polyacrylamidegel van 8% in de TBE met 40% polyacrylamide (19:1) en 8 M ureumstikstof met behulp van RNAse-vrije techniek voor de oplossingen en de apparatuur43.
3. microinjection van CRISPR-componenten in Zebrafish embryo 's
- Instellen van het fokken van tanks de nacht vóór het injecteren van door het plaatsen van het aantal gewenste mannetjes en vrouwtjes (meestal 2 vrouwtjes en 1 of 2 mannen) plaats in een tank fokken met een divider in44.
- Bereid een microinjection plaat met 1,5% agarose in 1 x E3 media (Zie Tabel van materialen) met 0,01% methyleenblauw (een fungicide) door gieten 35 mL van de gesmolten agarose in een 10 cm petrischaal en zachtjes lag een plastic mal maken wig-vormige troggen in de oplossing, te tikken van de mal te elimineren luchtbellen.
- Toestaan dat de agarose instellen en opslaan van de schotel met een kleine hoeveelheid media en verpakt in paraffine film om te verhinderen dat de plaat uitdrogen bij 4 ° C.
Opmerking: Injectie platen zijn herbruikbare wekenlang, totdat de putten vervormd of droog worden, of de plaat begint te schimmel groeien. - Op de ochtend van injecteren, ontdooi gezuiverde sgRNA en Cas9 eiwit op ijs. Vergeet niet om alle materialen met handschoenen RNase verontreiniging te voorkomen en te gebruiken RNase-gratis tips en buizen.
- Genereer een 5 µL injectie oplossing door het combineren van Cas9 eiwit en de sgRNA in een 2:1 ratio van Cas9:sgRNA om de eindconcentraties van 400 pg/nL Cas9 eiwit en 200 pg/nL-sgRNA. Incubeer de Cas9/sgRNA-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om de Cas9 en de sgRNA om te vormen van een complexe ribonucleoprotein. Voeg 0,5 µL van 2.5% wt/vol fenol rood-oplossing (Zie Tabel of Materials), en RNase-gratis water tot een eindvolume van 5 µL.
Opmerking: De Ionische sterkte van de oplossing is aangetoond dat invloed hebben op de oplosbaarheid van het complex, dat dus de toevoeging van KCl kan de verhoging van de efficiëntie van de snijden van sgRNAs die lage indel vorming28 vertonenCas9/sgRNA. - Maak een injectie naald door te trekken een 1,0 mm glas capillaire met behulp van een trekker van de micropipet. Snijd het puntje van de vers-en-klare naald met behulp van een nieuwe scheermesje of pincet te verkrijgen van een schuine opening die gemakkelijk de chorion en de dooierzak doorboren zal.
- Plaats de naald in een micromanipulator gekoppeld aan een microinjector met de bron van de lucht ingeschakeld. Pas onder een lichte Microscoop met behulp van de vergroting is geschikt voor de calibratie bepaald voor het specifieke apparaat, de druk van de injectie naar de naald ejects consequent een 1 nL-oplossing in een petrischaal gevuld met minerale olie.
Opmerking: De kwaliteit van de naald is van cruciaal belang. Praktijk produceren een naald en het injecteren in de dooierzak van embryo's, totdat dit vaardigheid is is gemasterd voordat verdere experimenten45. - Verwijderen van de scheidingslijn en laat de vis te kweken voor ongeveer 15 min.
Opmerking: Langere fokken tijden zal produceren meer embryo's, maar de injectie moet worden voltooid terwijl de embryo's stadium de 1-cel de kans maximaliseren dat Cas9 snijden treedt vroeg en derhalve afname genetische mozaïcisme. Embryo's kunnen worden geïnjecteerd in latere stadia (2 – 4 cel stadia), maar dit kan eventueel de germline overdrachtssnelheid van de gemodificeerde allel afnemen. - Verzamelen van de eieren met behulp van een zeef en spoel ze af in een 10 cm 1 x E3 media met 0,0001% methyleenblauw petrischaal. Onderzoeken van de gezondheid van de eieren onder de lichte Microscoop, eventuele onbevruchte eieren en puin te verwijderen.
- 10 – 15 embryo's als uninjected-besturingselement in een petrischaal aparte, gelabelde gereserveerd.
- Zachtjes de eieren op de plaat van de injectie opgewarmd tot kamertemperatuur met behulp van een pipet overdracht, line-up.
- Onder een Microscoop dissectie bij 2.5 X vergroting, injecteren 1 nL van de oplossing in de dooierzak van elk embryo te injecteren een totaal van 400 pg Cas9 eiwit en 200 pg van sgRNA.
Opmerking: Het vergroten van snijden als gewenste of noodzakelijk is, verhogen de uiteindelijke concentratie van Cas9 eiwit aan 800 pg/nL en sgRNA aan 400 pg/nL in de injectie-oplossing; echter, dit kan ook verhogen af-target snijden en/of embryo gezondheid verlagen. Snijden-efficiëntie kan ook worden verhoogd door het injecteren rechtstreeks in de cel-46. Injectie in de dooier zak is echter technisch minder veeleisend en geeft voldoende snijden voor de productie van vis met hoog germline transmissie (> 70% van de nakomelingen met een gewijzigde allel). - De geïnjecteerde embryo's terug te keren naar een goed label petrischaal, bestrijk ze met 1 x E3 media met methyleenblauw, en leg ze in een embryo incubator ingesteld op 28 ° C.
- Bij 24 h post bevruchting (hpf), inspecteren van de gezondheid van de geïnjecteerde embryo's, het verwijderen van dode of abnormaal ontwikkelen individuen en wijzigen van de media (Zie Figuur 3). Controleer het tarief van overleven tegen de uninjected controle.
Opmerking: Wanneer gericht op een niet-essentiële gen, op minder dan 10% letaliteit verwachting ten opzichte van de uninjected controle. Als verhoogde niveaus van letaliteit worden waargenomen in de gids-geïnjecteerd populaties in vergelijking met de controle van de uninjected, kan het aangeven dat het beoogde gen essentieel voor de ontwikkeling is, of off-target effecten tot mislukte ontwikkeling leiden. De hoeveelheid ingespoten CRISPR-reagentia te verminderen kan het nodig zijn of generatie voor een nieuwe sgRNA met verlaagde off-target effecten kan verplicht worden. - De embryo's terug te keren naar de incubator en blijven groeien de embryo's tot en met 72 hpf, veranderen de media dagelijks om embryo gezondheid te behouden.
4. analyse van de efficiëntie van Indel formatie met behulp van een HMA
- Verzamel twee sets van vijf embryo's uit de ingespoten platen uitgegroeid tot 72 hpf in microcentrifuge buizen en verzamelen een set van vijf embryo's uit een uninjected controle.
- Anesthetize van de embryo's door toevoeging van 0.004% MS-222 (tricaïne) en 2 min wachten.
- Wilt uitpakken van de gDNA, zachtjes Pipetteer de media uit elke set embryo en 45 µL van 50 mM NaOH toe te voegen. Incubeer de embryo's bij 95 ° C gedurende 10 min.
- Verwijder embryo's uit de warmtebron en koel aan kamertemperatuur. Voeg 5 µL van 1 M Tris-HCl pH = 8, en vortex de monsters krachtig (5 – 10 s). Centrifugeer de oplossing bij max snelheid (> 16.000 x g) in een microcentrifuge van de kamertemperatuur voor 3 min. overbrengen in het supernatant een schone, gelabelde buis en opslaan van de gDNA bij-20 ° C DNA voor maximaal 6 maanden.
Opmerking: DNA-fragmenten van ongeveer 900 bp en kleiner zal worden gegenereerd door het gebruik van dit protocol. - Een 50 µL PCR reactie met behulp van 2 µL van de voorbereide gDNA van elk monster (met inbegrip van een uninjected controle) instellen per de instructies die bij de polymerase, met behulp van de eerder ontworpen inleidingen flankerend de voorspelde gesneden site geleverd.
- Zuiveren van de PCR producten met behulp van een PCR opruimen kit (Zie Tabel of Materials), elueer de monsters in 30 µL van water of elutie buffer en kwantificeren van het DNA met een spectrofotometer.
- Reanneal alle 30 µL van elk gezuiverde PCR-product door het plaatsen van de buizen in een floatable rek in een bad met kokend water (ongeveer 150 mL in een bekerglas van 500 mL). Na 3 min, uitschakelen van de warmtebron en laat de oplossingen afkoelen tot kamertemperatuur, ongeveer 1 uur.
Opmerking: Deze stap eerst het DNA gedenatureerd en laat dan de strengen om willekeurig reanneal voor het genereren van mogelijke heteroduplex banden, of niet-overeenkomende dubbel-streng DNA waarin polymorfismen gemaakt door CRISPR-mutagenese en daarom hebben een veranderde elektroforetische mobiliteit ten opzichte van homoduplexes. De laatste cyclus van PCR of helling-down programma in de thermocycler kan ook worden gebruikt om reanneal producten47,48, maar gebruik van de bad met kokend verbeterde resolutie van heteroduplex producten kan opleveren. - Voeg 5 µL van 6 x laden kleurstof (Zie Tabel van materialen) aan de reannealed PCR-oplossingen.
- Gegoten een 15% polyacrylamide/TBE gel met 30% polyacrylamide (29:1). Nadat de gel heeft ingesteld, plaats u het in een elektroforese apparaat met FSME buffer uitgevoerd. Met behulp van een P1000, schakelt u de putten van een puin zoals residuele zouten of gel fragmenten die de putten door zachtjes pipetteren buffer op en neer in de putjes meermaals kunnen belemmeren.
- Belasting 500 ng van de reannealed PCR producten, en de belasting een besturingselement (voorbeeld van uninjected vis) naast elke set van sgRNA monsters. Stel de gel bij 150 V gedurende 2,5 uur of totdat de kleurstof voorzijde aan de onderkant van de gel is.
- Visualiseren van de bands met een vlek van nucleic zuur (bijvoorbeeld, ethidiumbromide of SYBR groene (Zie Tabel van materialen)).
- Het patroon van de band voor elke controle- en CRISPR-geïnjecteerd pool van embryo's te onderzoeken.
Opmerking: De weergave van meerdere bands die trager in de ingespoten versus uninjected rijstroken geeft aan vorming van roman heteroduplex producten (Figuur 4). De aanwezigheid van roman heteroduplex DNA aangeeft dat microdeleties werden gegenereerd door het CRISPR-injectie. Vermindering van de intensiteit van de band homoduplex in de ingespoten oplossingen van ongeveer 50% of meer is in het algemeen voldoende om te resulteren in voldoende germline transmissie. Bovendien extra bands worden soms aangeduid in de uninjected vis, en moeten niet worden beschouwd als heteroduplex bands als waargenomen in de ingespoten vis. - Kies de injecties met hoogste snijden efficiëntie ten opzichte van de uninjected controle voor elk doel; embryo's uit deze injecties kunnen opgroeien vis zoekt microdeleties veroorzaakt vroegtijdige stop codonen worden gebruikt.
Opmerking: Voor hoogefficiënte snijden (vermindering van de homoduplex band door ongeveer > 50% intensiteit), screening van 20-30 volwassen vis moet voldoende te verkrijgen germline transmissie.
Voor sgRNAs die minder snijden genereren, kunnen meer volwassen vis te verhogen de kans op identificatie van vis die vertonen germline transmissie van gemodificeerde allelen met een voortijdige stop codon nodig zijn. Indien indel vorming niet waargenomen kan het nodig zijn wordt om herontwerp van de sgRNA naar een andere regio van het gen zijn. Indien geen heteroduplex band vorming wordt waargenomen, de sgRNA kan hebben aangetast en de kwaliteit van de sgRNA dient te worden geverifieerd met behulp van een ureum/pagina gel.
5. identificatie en verspreiding van Knock-out lijnen
- Voer ter identificatie van een potentiële oprichter bovenliggende vis, staart clips van de volwassen F0 vis (uitgegroeid tot ongeveer 2,5-3 maanden) tot het identificeren van de aanwezigheid van microdeleties. Anesthetize van de vis in 0.62 mM tricaïne (Zie Tabel of Materials), dan gebruik een schone, scherpe scheermesje te verwijderen ongeveer 1/2-3/4 van de staartvin.
- Plaats de staart in 45 µL van 50 mM NaOH en de vis terug te keren naar de tank van een herstel. Het uitvoeren van de winning van gDNA als beschreven (stappen 4.2 – 4.4). Zodra de vis weer normale zwemmen gedrag, plaats de vis terug op stromende systeem water totdat de aard van de indel is vastgesteld.
Opmerking: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat afzonderlijke vissen geïdentificeerd worden, en op de juiste wijze kunnen worden afgestemd op de resultaten van de staart clips. - Zoals beschreven (stappen 4.5-4.9), voeren een HMA op de staart clip gDNA om te bepalen als de vis werd gewijzigd door de CRISPR-injectie (Figuur 5). Fokken om te identificeren een vis van de oprichter, de volwassenen die heteroduplex bands uit staart gDNA wild-type vissen vertonen. Verzamelen van de embryo's en ze groeien tot en met 72 hpf.
- Op 72 hpf, verzamelen van 10 embryo's en plaatst u elk embryo in een individuele buis. Uitvoeren van een extractie van de gDNA zoals hierboven (stappen 4.2 – 4.4) beschreven met behulp van 11.25 µL van 50 mM NaOH en 1,25 µL van 1 M Tris pH = 8.
- Herhaal de PCR en de elektroforese om te identificeren heteroduplex bands zoals hierboven (stappen 4.7 – 4.13) beschreven om te bepalen als indel allelen doorgevoerd op deze generatie (Figuur 6).
- Op basis van het percentage transmissie waargenomen in één embryo's het HMA, groeien gemiddeld 20 tot 30 embryo's verkregen door het Kruis voor elk CRISPR-lijnen van belang naar volwassenheid.
Opmerking: Dit nummer kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de frequentie van germline transmissie. - Staart clips van de volwassen vis van de F1 te identificeren van de aanwezigheid van microdeleties als beschreven (stappen 5.1-5.2) uit te voeren. Zoals beschreven (stappen 4.5 – 4.11), voeren een HMA op de staart clip gDNA om te bepalen als de vis een indel (Figuur 7 draagt).
-
Voor vis die een heteroduplex band bevatten, voorbereiden op de DNA sequentie-analyse.
- PCR met behulp van nieuwe inleidingen tot het versterken van een 300-600 bp PCR product gecentreerd rond de gesneden site uitvoeren
- Gebruik een PCR zuivering kit om opruimen van het DNA, en elueer in 30 µL. onderzoeken het DNA op een agarose gel om ervoor te zorgen dat een enkele band aanwezig is.
Opmerking: Sommige heteroduplex "banding" mag aanwezig zijn op de agarose gel en wordt weergegeven als een kleine uitstrijkje of dubbele band net boven het PCR-product op de verwachte grootte.
- Als één tot drie microdeleties worden geanalyseerd, volgorde van de PCR-producten met behulp van Sanger sequencing en bepalen van de volgorde van de indel met behulp van een hulpprogramma bioinformatics49. Anders, de bepaling van de volgorde van meerdere PCR producten met behulp van NGS analyse (Zie Tabel of Materials) is bovendien voordeliger.
- Bepalen als een voortijdige stop codon is verkregen door het analyseren van de reeks bioinformatics gereedschap (Zie Tabel van materialen).
- Plaats de vis met gewenste mutant allel in een nieuwe tank met passende etiketten.
- PCR inleidingen voor specifieke indel allelen voor toekomstige genotypering behoeften ontwerpen. Deze inleidingen moeten omvatten de gemuteerde volgorde en niet versterken de wild-typen volgorde.
- In-cross heterozygoot zebrafish voor het genereren van een laagniveau bevolking die 25% knock-out regels zal bevatten.
Representative Results
De experimentele benaderingen in dit protocol omschreven zorgen voor efficiënte, rendabele productie van zebravis knock-out lijnen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie. De volgende cijfers zijn opgenomen in dit artikel om de interpretatie en probleemoplossing van de resultaten verkregen met behulp van dit protocol. Na succesvolle productie en microinjection van CRISPR-reagentia, de zebravis embryo's kunnen worden geanalyseerd voor openlijke fenotypes en indel vorming met behulp van HMA. Een nuttige controle te visualiseren van het succes van de CRISPR-experiment is het gebruik van de sgRNA die is beschreven in stap 1.5 te richten op het produceren van pigment gen tyrosinase. Cas9-geïnduceerde indel vorming op tyrosinase resulteert in verlies van pigmentatie en gemakkelijk gescoord wordt door 48 hpf (Figuur 1). Een ander nuttig besturingselement om ervoor te zorgen dat de bereiding van de CRISPR-reagentia voor injectie is geslaagd, is om te verifiëren dat full-length (120 nt) sgRNA heeft zijn gesynthetiseerd met behulp van een denatureren polyacrylamide-gel (Figuur 2, Lane 1 en 2). RNA is afgebroken het mogelijk weergegeven als een uitstrijkje, bijvoorbeeld Lane 3 (Figuur 2) toont aangetaste RNA dat is niet geschikt voor injectie.
Voor het analyseren van de indel vorming frequentie van genen gericht door CRISPR-Cas9 die niet leiden openlijke fenotypen zoals tyrosinase tot, is HMA analyse een eenvoudige en betrouwbare methode. sgRNA/Cas9 geïnjecteerd embryo's geanalyseerd gebruik HMA resulteert in de vorming van heteroduplex bands en vermindering van de intensiteit van de homoduplex band (Figuur 4). De aanwezigheid van heteroduplex bands wordt verder gebruikt in dit protocol bij het identificeren van potentiële oprichter vis uit de microinjected van de embryo's en als volwassenen (Figuur 4 en Figuur 5), voor het analyseren van de efficiëntie van de transmissie germline van een oprichter ( Figuur 6), en om te controleren of de aanwezigheid van een indel in een heterozygote F1 vis (Figuur 7). De heterozygoot vis die een indel bevatten zijn kandidaten voor NGS de aard van de indel vast te stellen en te bepalen of een voortijdige stop codon in de codering regio van het target-gen aanwezig is.
Figuur 1 : Zebravis embryo's vertonen een pigment defect wanneer ingespoten met een sgRNA dat targeting tyrosinase stadium van de één-cel. (A) Wild-type, uninjected embryo op 48 hpf en (B) geïnjecteerd embryo op 48 hpf. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : In vitro transcriptie van sgRNA met behulp van synthese kit. Oligos werden gesynthetiseerd met behulp van in vitro transcriptie volgens de sgRNA synthese kit instructies. 500 ng van RNA werd uitgevoerd op een gel ureum/pagina zoals beschreven. sgRNA geladen in rijstroken 1en 2 toont een band die overeenkomt met de volledige lengte, intact 120 nt RNA. De sgRNA in baan 3 toont een aangetaste RNA-monster dat is niet geschikt voor injectie.
Figuur 3 : Vergelijking van de gezondheid van de embryo's 24 hpf geïnjecteerd. Een levende embryo (A) ontwikkeld om 24 hpf, wordt gemakkelijk onderscheiden van een embryo dat ontwikkeling (B) is afgebroken. Embryo's die lijken op (B) of drastisch veranderd functies met (A), zoals spinal kromming of gewijzigd van hoofd en ogen ontwikkeling moet worden verwijderd uit de schotel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Heteroduplex mobility assay voor sgRNA-Cas9 microinjected embryo's de zebravis. Zwembaden van de 5 embryo's per monster werden verzameld op 72 hpf en gDNA werd gewonnen. Heteroduplex analyse werd uitgevoerd zoals beschreven, monsters even vol met 500 ng van DNA. Rijstroken: M = 100 bp marker; 1 = uninjected controle; 2 = injectie monster 1; 3 = injectie monster 2. Verwacht band maat 98 = bp.
Figuur 5 : Heteroduplex mobiliteit kwantitatieve analyse van gDNA gewonnen uit de staart van een volwassen CRISPR-geïnjecteerd zebrafish. Embryo's die werden geïnjecteerd met een sgRNA en een Cas9 eiwit waren uitgegroeid tot volwassenheid (3 maanden). Vissen B en C heteroduplex banden vertonen en vervolgens werden gefokt om te identificeren germline verzonden microdeleties; vis A werd niet gebruikt in daaropvolgende analyse omdat het niet een positieve heteroduplex-band vertonen doet. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis A; 3 = vis B; 4 = vis C. verwacht band maat 98 = bp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Heteroduplex mobility assay van één embryo's die zijn gegenereerd door het fokken van een zebravis F0 CRISPR-geïnjecteerd om een wild-type vis te identificeren germline verzonden microdeleties. Zebravis werden gekruist, en de F1-embryo's geteeld voor 72 h. één embryo's werden verzameld en heteroduplex analyse uitgevoerd zoals beschreven. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2-10 = een enkele F1 embryo per rijstrook. Deze gel bevat dat 7 van de 10 embryo's een positieve heteroduplex-band tonen, die een doorvoersnelheid van kiemcellen van 70% van de indel aangeeft. Verwacht van de band grootte = 98 bp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Heteroduplex mobility assay voor volwassen F1 zebrafish staart clips. Volwassen F1 vis werden gescoord door HMA microdeleties identificeren. Vis die tentoongesteld van een positieve heteroduplex band waren PCR versterkt en ingediend voor brede sequencing analyse om te bepalen van de aard van de mutatie. (A) rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis een (4 bp schrapping, 1 bp mismatch). (B) deze F1 vis van de dezelfde oprichter werden geïdentificeerd, en nog verschillende heteroduplex patronen, die aangeeft germline transmissie van meerdere gemodificeerde allelen van een enkele oprichter Toon. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis B (4 bp inbrengen, 7 bp mismatch), 3 = vis C (4 bp schrapping, 4 bp mismatch). Elk van deze microdeleties gemaakt een voortijdige stop codon in de codering sequentie van het gen van de doelgroep, zoals bepaald door NGS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol beschrijft de productie van gene uitsparingen in de zebravis gewervelde modelsysteem met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een aantal protocollen zijn eerder beschreven om uit te voeren CRISPR-gemedieerde genoom engineering in zebrafish15,25,,26,50,51,,52. Dit protocol bouwt voort op eerdere pogingen door het combineren van een aantal eenvoudige maar reproducibly consistent experimentele technieken, met name HMA en NGS van meerdere heterozygoot vis, maken van een eenvoudig, economisch, en experimenteel robuust protocol voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in zebrafish die geschikt is voor labs bemand met personeel met een bereik van opleiding en ervaring, evenals het onderwijzen van de labs.
Aanbevelingen voor ontwerp en de synthese van gids die RNAS zijn opgenomen in dit protocol. Een belangrijke overweging in handleiding RNA ontwerp is de minimalisering van off-target effecten. Verschillende voorspelling algoritmen hebben ontwikkeld waarmee CRISPR-gebruikers toegang hebben tot berekening tools met gebruiksvriendelijke grafische interfaces die de activiteit van de gids op doelsoort zijn zowel de kans op uit-target effecten34, voorspellen 35,,36. Een specifieke voordeel van de zebravis systeem is verlaagde tarieven van off-target effecten, omdat de Cas9 wordt ingespoten in de embryo's en daarom expressie voorbijgaande aard is, dat is aangetoond in muizen leiden tot verminderde af-target effecten53. Af-target effecten zijn echter aangetoond optreden in zebrafish54. Een manier om controle voor off-target effecten is naar fenotype oprichter zebrafish die zijn gegenereerd door twee onafhankelijke gids RNAs die gericht zijn op het zelfde gen, aangezien deze gidsen zou zeer waarschijnlijk van invloed zijn op verschillende uit-target sites. Een alternatieve methode om te minimaliseren off-target effecten die niet wordt beschreven in dit protocol is het gebruik van een gemuteerde Cas9 die enkele streng einden op doelDNA, die gerepareerd worden met een hoog rendement genereert. Koppeling van DNA nicks in nabijheid van elkaar dat zijn een aanvulling op het tegenovergestelde strengen resulteert in effectieve indel vorming op de gewenste locus en af-target effecten55,56minimaliseert.
Naast het hebben van verschillende tarieven van off-target effecten, kan verschillende sgRNAs hebben verschillende tarieven voor de mutagenese van de gewenste doelgroep57,58,59. Dit protocol maakt gebruik van HMA voor het analyseren van de efficiëntie van de mutagenese van een bepaalde sgRNA met heteroduplex band vorming33,40. Heteroduplex banden zijn gemaakt door kruising van PCR gegenereerde DNA-strengen die incongruenties bevatten, en kan gemakkelijk worden opgelost met behulp van de Elektroforese van het gel. In tegenstelling tot andere methoden die gewoonlijk worden gebruikt voor het meten van indel vorming, zoals de T7 endonuclease assay of hoge resolutie smelten analyse25,26, HMA hoeft niet een dure enzym te snijden niet-overeenkomende DNA, en vereist geen ingewikkelde analyse van PCR smelten curven. Nog belangrijker is, controleren van de hoge tarieven van indel vorming in de ingespoten bevolking met HMA maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te minimaliseren van de hoeveelheid vis die nodig zijn voor de productie van knock-out lijnen, waardoor de kosten van de identificatie van een mutatie met de gewenste kenmerken.
Het relatieve gemak van het genereren van de CRISPR gebaseerde microdeleties kunt creëren van multiple allelen van meerdere genen tegelijk. Web-gebaseerde software is beschikbaar voor analyse van enkele mutaties van heterozygoot vis met behulp van Sanger rangschikken van PCR producten49. In het geval waar drie of meer CRISPR-gemuteerd allelen worden geanalyseerd, is NGS te karakteriseren van de aard van de indel waarschijnlijk mogelijk te zijn rendabeler te karakteriseren van de aard van de indel als deze aanpak maakt een pool van maximaal 50 verschillende allelen te worden gekenmerkt op o nvu (Zie Tabel van materialen)60,61,62. Dergelijke schaalvoordelen zou waarschijnlijk vooral handig in een omgeving van undergraduate laboratorium.
Kortom, dit protocol biedt stapsgewijze aanwijzingen voor het reproducibly het genereren van hoge kwaliteit CRISPR-reagentia (in met name sgRNA) zodanig dat minder volwassen vis moeten worden gemaakt en geanalyseerd om te achterhalen met succes de mutant allelen van belang, die ook vermindert de tijd en de kosten van het genereren van de gewenste lijnen. Nog belangrijker is, is dit protocol zodanig is ontworpen dat het kan worden toegepast door laboratoria met beperkte middelen te produceren van mutant zebravis op een betaalbare manier. Bovendien, we hebben gevonden dat deze aanpak geschikt voor studenten is en dus de mogelijkheden voor onderwijs en opleiding van studenten geïnteresseerd in hands-on ervaring in het genoom van de CRISPR gebaseerde bewerken breidt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R21CA182197 naar J.O.), de Ralph W. en Grace M. Showalter Research Trust, en door de Purdue landbouwkunde en de uitbreiding voor de economischeontwikkeling (AgSEED) programma. Sanger sequencing gegevens werden verworven door de faciliteit van de Purdue Genomics Core ondersteund door P30 CA023168. Mary Witucki werd gesteund door de Purdue University Center for Cancer Research zomer Undergraduate Research Program ondersteund door de Carroll County kanker vereniging. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. Wij danken Benjamin Carter, Ellen Denning en Taylor Sabato voor kritische terugkoppeling geven over het manuscript. Wij danken het departement van biochemie voor ondersteuning van dit werk, en het Center for Zebrafish Research bij Purdue University voor hun inzet in de zorg en het welzijn van onze zebrafish kolonie. Tot slot, wij danken de Purdue faciliteit voor de kern van de genomica, en bijdragen van Phillip San Miguel met betrekking tot de diensten van het NGS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
- Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
- Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
- Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
- Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
- Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
- Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
- Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
- Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
- Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
- Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
- Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
- Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
- Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
- Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).
