Summary
Målrettet genomet redigering i modellen systemet Danio rerio (sebrafisk) har blitt mye lettere av fremveksten av CRISPR tilnærminger. Her beskriver vi en strømlinjeformet og robust protokoll for generasjon og identifisering av CRISPR-avledet tull alleler som inkorporerer heteroduplex mobilitet analysen og identifikasjon av mutasjoner med neste generasjons sekvensering.
Abstract
Karakterisering av de klynget, interspaced regelmessig, kort, palindromic gjenta (CRISPR) system for Streptococcus pyogenes har aktivert utviklingen av en tilpasses plattform å raskt generere genet endringer i en rekke organismer, inkludert sebrafisk. CRISPR-baserte genomet redigering bruker en enkelt hjelpelinje RNA (sgRNA) å målrette en CRISPR-assosiert (Cas) endonuclease for en genomisk DNA (gDNA) mål av interesse, der Cas-endonuclease genererer en dobbel-strand pause (DSB). Reparasjon av DSBs av feilutsatte mekanismer føre til innsettinger og/eller slettinger (indeler). Dette kan forårsake frameshift mutasjoner som ofte introduserer en tidlig stopp codon innen koding sekvensen, dermed skape en protein-null allelet. CRISPR-baserte genomet krever bare noen molekylær komponenter og er lett introdusert i sebrafisk embryo ved microinjection. Denne protokollen beskriver metodene som brukes til å generere CRISPR reagensene sebrafisk microinjection og identifisere fisk viser germline overføring av CRISPR endret gener. Disse metodene omfatter i vitro transkripsjon av sgRNAs, microinjection CRISPR reagenser, identifikasjon av indeler indusert på målområdet bruker PCR-basert metode kalt en heteroduplex mobilitet analysen (HMA) og karakterisering av indeler bruke både lav overføringshastighet og en kraftig neste generasjons sekvensering (NGS)-tilnærming som kan analysere flere PCR produkter fra heterozygote fisk. Denne protokollen er strømlinjeformet for å redusere både antall fisk kreves og typer utstyr som trengs for å utføre analysene. Videre er denne protokollen utformet for å være mottagelig for bruk av laboratoriet personlig på alle nivåer av erfaring inkluderer studenter, slik at dette kraftige verktøyet å økonomisk noen forskningsgruppe interessert i å utføre CRISPR-basert genomic endring i sebrafisk.
Introduction
Bevaring av molekylære maskiner over eukaryoter ligger under kraften i å bruke modellen organismer for forskning. Mange av disse modellsystemer rette for bruk av reverse-genetiske tilnærminger som målrettet genet fortrenging å karakterisere bidrag gene produktet til en biologisk eller sykdom prosess av interesse. Gene avbrudd teknikker i organismer som sebrafisk avhengig historisk målrettet innføring av frameshift mutasjoner som følge av upresise reparasjon av DSBs1,2. Når en DSB er introdusert i genomet, DNA lesjonen er reparert gjennom en av to baner som er universelt i nesten alle celletyper og organismer: ikke-homologe slutten med (NHEJ) og homologi-rettet reparasjon (HDR)3,4 . Upresise natur NHEJ maskiner produserer ofte indeler ulike lengder5,6,7,8,9. Innføring av frameshift mutasjoner i et gen koding spørsmålsrekken kan produsere en tidlig stopp codon, som ofte gjør genet fungerer ikke.
Tidlig genomet engineering strategier i sebrafisk å fremme indeler inkludert meganucleases, sink-finger nucleases og transkripsjon aktivator som effektor nucleases, som utnyttet DNA-protein interaksjoner å målrette en nuclease til en bestemt genomisk mål hvor det introdusert en DSB10,11,12,13,14,15. Disse teknologiene er imidlertid ofte vanskelig å bruke på grunn av arbeidskrevende og komplekse prosjektering kreves for å generere en nuclease mål DNA sekvensen av interesse. I motsetning til tidligere strategier stole CRISPR-baserte genet redigering ikke på protein-DNA samhandlinger for målretting. I stedet styres CRISPR-assosiert (Cas) endonuclease via en RNA guide som bruker nukleotid base sammenkobling interaksjoner for å målrette en genomisk området rundt16,17,18,19 ,20,21. På grunn av enkelheten med å utforme en RNA er guide med ønsket base sammenkobling samhandlinger for målretting det relativt enkelt å målrette Cas-endonuclease til ønsket locus. Type II CRISPR system er spesielt mye utviklet for genomet redigering programmer på grunn av flere fordelaktig funksjoner inkludert bruk av en enkelt replikasjonen Cas-nuclease (Cas9) som krever interaksjon med DNA å stimulere endonuclease aktivitet og bruk av en enkelt hjelpelinje (sgRNA) for å målet til beslektet DNA sekvens18. Sekvensen kravene nødvendig for målretting av beslektet sgRNA er godt forstått19, og den ønskede sgRNA genereres lett i vitro transkripsjon. Enkelhet og robusthet av CRISPR/Cas9 tilnærming forenkler sterkt målrettet genmodifisering i sebrafisk og en rekke andre organismer.
Forbedret evne til å gjennomføre målrettet genomet redigering i sebrafisk som følge av utviklingen av CRISPR-baserte reagenser har økt mulighet til å studere prosesser illustrerende for virveldyrenes organismer som utviklingen av sentralnervesystemet system. Sebrafisk genomet inneholder orthologs av 70% av protein-koding gener i det menneskelige genom samt 84% av gener som er knyttet til sykdommer i mennesker22. Sebrafisk utviklingen viser flere nøkkel egenskaper som forbedrer bruken i omvendt genetiske studier: embryoene legges i store klør, utvikle eksternt fra mor gjør dem mottakelig for genetisk manipulering av microinjection og voksen sebrafisk seksuelt moden med 3 måneder gammel, slik at for rask spredning ønskede linjene23.
Flere protokoller er tilgjengelige som beskriver en rekke tilnærminger til å generere og identifisere CRISPR-avledet indeler i sebrafisk24,25,26,27,28,29 ,30,31. Men mange av disse prosedyrene er intens, krever tilgang til dyrt utstyr, og kan være utfordrende for labs med begrenset ekspertise. Trinnene beskrevet her gir en enkel, robust og økonomisk CRISPR/Cas9-strategi til ingeniør sebrafisk knockout linjer. Denne protokollen beskriver bruken av en svært effektiv kit å syntetisere sgRNAs bruker DNA oligonucleotides (oligos), som ligner andre tilnærminger som er beskrevet tidligere32. Beskrevet protokollen omfatter to trinn spesielt som sterkt forenkler analyse av CRISPR-mutert linjer: step-by-step bruk PCR-baserte HMA33 til enkelt å se tilstedeværelsen av Genova endringer og sekvensering analyse av heterozygote sebrafisk til raskt og enkelt angi flere indeler på en økonomisk måte. I tillegg er instruksjoner inkludert for robust utvalg, pålitelig produksjon og injeksjon av guide RNAs. Trinnene her eksemplifiserer en robuste, relativt billig protokoll som laboratoriepersonell med en rekke kompetanse å bidra til identifisering av genet knockouts i sebrafisk.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Purdue Animal Care og bruk Committee (PACUC nummer 08-031-11).
1. tegning av mal-spesifikke Oligos for Guide RNA produksjon
- Velg målet området rundt endres i området koding genet. Dette bør være nær 5' slutten av genet å generere en avkortet protein, men ikke så nær slik at en etterfølgende i-ramme starten codon gjør produksjonen av et protein med en beskjeden N-terminal trunkering.
Merk: En måte å utelukke denne muligheten er å skanne nedstrøms koding regionen genet for en i-ramme starter codon. I tillegg kan bruker en guide RNA som er rettet mot midten av en stor ekson, bidra til å identifisere PCR primere for påfølgende scoring av den resulterende indel. - Identifisere potensielle guide områder i genomisk regionen rundt med en guide RNA valg program (se Tabell for materiale)34,35,36. Sette den nettleseren til Danio rerio og protospacer tilstøtende motiv (PAM) rekkefølgen til 5'-NGG-3 ".
Merk: Ideelle gRNA sekvenser inneholder en 5 '-G i første posisjon av gRNA for effektiv T7 i vitro transkripsjon. Hvis ingen godkjente guide med en G fra 5 ' posisjonen, 5 ' bunnen av en annen guide endres til en G eller en G kan legges på 5 ' slutten av veiledningen RNA, men dette kan redusere kutte effektivitet37. For å maksimere kutte effektiviteten, en optimal guide sekvens har 40-80% GC innhold (høyere er bedre), og inneholder en G på 20th posisjon, tilstøtende til PAM, men er ikke nødvendige38. Et eksempel på en ideell målretting sekvens: 5 ' - G (N)18 G-3 - NGG (NGG er PAM). I tillegg til å undersøke resultatene fra programmet guide RNA utvalg å identifisere optimal guide RNAs som beskrevet ovenfor, bør man være forsiktig å unngå guide RNAs med sterk off-målet forutsigelige som sterkt vanskeliggjør nedstrøms. Spesielt guide RNAs med off-målet forutsigelige som ligger innenfor koding områder bør utelukkes, og totalt off-målet nettstedene spådd bør minimaliseres. - Fra utdataene for utformingsverktøyet guide RNA, utelukke PAM sekvensen (5 '-NGG-3 '); det brukes ikke for målretting men omfatter anerkjennelse rekkefølgen for Cas9 cleavage.
- De resterende 20 nukleotider (nts), legge T7 promoter sekvensen og overlapping sekvensen (region komplementær til en stillaset oligo brukes å syntetisere full lengde sgRNAs følger med anbefalt i vitro transkripsjon settet) i angitt rekkefølge nedenfor for å hente en 54 nt oligo: T7 promoter sekvens: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-3; Guide RNA sekvens 5 ' - G (N)18 G-3; Overlappe sekvens: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3
- Identifisere PCR primere som flanken spådd kuttet nettstedet (Cas9 innstiftet 3 nt oppstrøms av PAM sekvensen) i en avstand på 50-150 base parene (bp) hver på klipp ved hjelp av web-basert programvare (se Tabell for materiale).
Merk: Dette vil bli brukt i et senere trinn for måling av skjæring effektivitet. Hvis ingen passende primere identifiseres av disse begrensningene, må en annen guide RNA nettsted vurderes. - Bestille 54 nt oligonucleotides å produsere guiden RNA og PCR primere for analyse av målområdene (se Tabell for materiale).
Merk: Som en valgfri positiv kontroll, kan det være nyttig å produsere en sgRNA rettet mot et gen som er nødvendig for produksjon av pigment kontrollere ytelsen til denne protokollen ved hjelp av en enkelt scoret visuelle fenotypen (se figur 1 representant resultater). Felles mål, er det genet tyrosinase, bruke i oligo (guide RNA sekvens understrekes)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3
2. forberedelse av CRISPR-reagenser til fosteret Microinjection
-
Bestille kommersielt tilgjengelig Cas9 protein (se tabell for materiale).
Merk: Injeksjon av Cas9 mRNA kan også brukes til å generere indeler i sebrafisk40,41, men sebrafisk fosteret microinjection med Cas9 protein har vist seg å være mer effektiv32,42.- Avbryte Cas9 protein bufferen til å generere en 1 mg/mL løsning. Lagre løsningen i injeksjon-klar dele i PCR rør ved-80 ° C å fryse-Tin sykluser. For å generere en 5 µL injeksjon løsning, 2 µL av 1 mg/mL Cas9 løsningen brukes, kan derfor Cas9 være aliquoted i 2 µL dele bruker PCR strip-rør.
- Syntetisere sgRNA bruker sgRNA i vitro transkripsjon kit (se Tabell for materiale). Utføre i vitro transkripsjon henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Opprettholde RNase-fri teknikk under alle syntese, opprydding og injeksjon løsning forberedelsene. For eksempel bruke engangshansker og endre dem ofte, bruke rør og tips som er sertifisert RNase-fri, og rengjør flater og Pipetter kommersielt tilgjengelige løsninger for å rense labware (se Tabell for materiale). -
Rense den syntetiserte sgRNA bruker en ammonium/acetate nedbør ved hjelp RNase-fri teknikk.
Merk: Alternativt sgRNAs kan bli renset ved hjelp av en rekke kommersielt tilgjengelige kolonne-baserte RNA rydde opp kits for en relativt beskjeden kostnad.- Legg til 25 µL av 5 M ammonium acetate og vortex å bland godt.
Merk: Ammonium acetate løsning er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale), eller en 5 M løsning kan gjøres i huset ved å legge 385.4 mg av molekylære klasse ammonium acetate 1 mL av RNase-fritt vann og lagret på 20 ° C. - Legge til 150 µL av 200-bevis nuclease-fri etanol hvert utvalg. Plass reaksjonen i-80 ° C fryser i minst 20 min.
Merk: Prøvene kan lagres over natten ved-80 ° C, men vil ikke signifikant øke den totale RNA avkastningen. - Sentrifuge prøvene med maksimal hastighet (> 16.000 x g) i en 4 ° C microcentrifuge for 20 min.
- Fjerne nedbryting nøye ved sakte pipettering av væske, sikre RNA pellet ikke forstyrres.
- Legg 1 mL av 70% etanol (laget av fortynne nuclease-fri etanol i RNase-fritt vann) og bland forsiktig røret ved å snu det flere ganger å vaske gjenværende salt fra røret.
- Gjenta sentrifugering trinn for 7 min.
- Fjerne nedbryting av første pipettering av de fleste av løsningen ved å benytte en P1000 pipette, deretter bruke en P200 pipette fjerne løsningen så mye som mulig uten perturbing av pellets. Tørr RNA pellet i en ren plass, for eksempel laminær strømning hette eller en benk toppen, forsiktige for å unngå RNase forurensning, i 15 minutter eller til ingen mer flytende dråper er synlig i røret.
- Resuspend pellet i 30 µL RNase uten vann, kvantifisere produkt (for eksempel med et spektrofotometer) og aliquot løsningen for langvarig lagring i-80 ° C fryser.
Merk: Typisk konsentrasjonene varierer fra 800-2500 ng/µL.
- Legg til 25 µL av 5 M ammonium acetate og vortex å bland godt.
-
(VALGFRITT) Kontroller at full lengde RNA har blitt generert med urea/side. Alternativt, bruk en agarose gel for å bekrefte at RNA intakt.
Merk: Men hvis bruker en agarose gel en større mengde gRNA må kjøres for å visualisere RNA, og hvor nøyaktig kan ikke fastslås. Når du analyserer effektiviteten til målet kutte etter injeksjon av reagensene i fisken, hvis det er ingen eller liten kutte stede bør da sgRNA sjekkes for degradering.- Kastet en 8% polyakrylamid gel i TBE med 40% polyakrylamid (19:1) og 8 M urea ved hjelp RNAse-fri teknikk for løsninger og utstyr43.
Merk: Kommersielt tilgjengelige materialer kan brukes til å rense utstyr (se Tabell for materiale). - Etter gel har helt styrket (ca 30 min), equilibrate gel ved å plassere den i TBE kjører bufferen, og utfører geleelektroforese for 30 min på 5 V/cm.
- Blanding 300-500 ng av sgRNA med en lik mengde 2 x RNA gel lasting fargestoff (se Tabell for materiale). Bruker en P1000, Fjern brønnene av alle partikler av pipettering kjører buffer i hver også flere ganger. Laste løsning og kjøre gel på 10 V/cm for 2,5 t.
Merk: En markør lane her er nyttig å visualisere lengden av den, men er ikke nødvendig; Generelt er det åpenbart hvis full lengde RNA har blitt syntetisert (figur 2). - Visualisere band med en nukleinsyre flekker (se Tabell for materiale).
Merk: sgRNA band skal vises som et enkelt band, mens smøre angir RNA degradering (figur 2).
- Kastet en 8% polyakrylamid gel i TBE med 40% polyakrylamid (19:1) og 8 M urea ved hjelp RNAse-fri teknikk for løsninger og utstyr43.
3. microinjection CRISPR-komponenter i sebrafisk embryo
- Definere avl tanker natten før injisere ved å plassere ønsket menn og kvinner (vanligvis 2 kvinner og 1 eller 2 menn) i en avl tank med en skillelinje i sted44.
- Klargjør en microinjection plate med 1,5% agarose i 1 x E3 media (se Tabell for materiale) med 0,01% methylene Blåfarge (en soppdreper) ved å helle 35 mL av smeltet agarose i en 10 cm Petriskål og forsiktig lå en plast mold å opprette kileformet daler i den løsning, trykke mold å fjerne luftbobler.
- Tillate agarose å angi og lagre parabolen med en liten mengde media og pakket i parafin film å hindre platen tørker ut på 4 ° C.
Merk: Injeksjon platene er gjenbrukbare i flere uker, til brønnene blir deformert eller tørr eller platen begynner å vokse mugg. - På morgenen sprøytebruk tine renset sgRNA og Cas9 protein på is. Husk å håndtere alle materialer med hansker å hindre RNase forurensning og bruke RNase gratis tips og rør.
- Generere en 5 µL injeksjon løsning ved å kombinere Cas9 protein og sgRNA i forholdet 2:1 Cas9:sgRNA å få siste konsentrasjoner av 400 pg/nL Cas9 protein og 200 pg/nL-sgRNA. Inkuber Cas9/sgRNA løsningen ved romtemperatur for 5 min til La Cas9 og sgRNA danner en ribonucleoprotein kompleks. Legge til 0,5 µL av 2,5% wt/vol fenol rød løsning (se Tabell for materiale), og RNase-gratis vann til et endelig antall 5 µL.
Merk: Ioniske styrken av løsningen har blitt vist å påvirke Løseligheten av Cas9/sgRNA komplekse, derfor tillegg av KCl kan effektivisere kutte sgRNAs som viser lav indel formasjon28. - Gjøre en injeksjon p ved å trekke et 1.0 mm glass kapillær bruker en brønnene avtrekker. Kutte spissen av nylaget nålen bruker en ny barberblad eller tang for å få en vinklet åpning som vil lett pierce plasmocitara og plommesekken.
- Plass nålen i et micromanipulator festet til en microinjector med luft-kilde aktivert. Under en lys mikroskop med forstørrelsen egnet for kalibreringen bestemt for bestemt apparatet, justere injeksjon press til nålen konsekvent mates ut en 1 nL-løsning i en Petriskål fylt med mineralolje.
Merk: Kvaliteten på nålen er avgjørende. Produsere en nål og injisere i plommesekken av embryo før dette er ferdigheter er mestret før videre eksperimenter45. - Fjerne skillet og la fisken å rase i ca 15 min.
Merk: Lengre avl ganger vil produsere mer embryo, men injeksjon bør fullføres mens embryoene er på 1-celle scenen å maksimere sjansen som Cas9 kutte vil skje tidlig og dermed redusere genetisk mosaicism. Embryo kan injiseres i senere stadier (2-4 celle etapper), men dette kan muligens redusere overføringshastigheten germline av det endrede allelet. - Samle egg med en sil og skyll i en 10 cm Petriskål 1 x E3 media med 0,0001% methylene blåfarge. Undersøke helse egg under lys mikroskopet, fjerne alle 5mas egg og rusk.
- Sette av 10-15 embryo som en uninjected-kontroll i en egen, merket Petriskål.
- Bruker en overføring pipette, forsiktig linje opp egg på injeksjon platen varmet til romtemperatur.
- Under disseksjon mikroskop på 2,5 X forstørrelse, injisere 1 nL løsningen til plommesekken på hver fosteret å injisere totalt 400 pg Cas9 protein og 200 pg av sgRNA.
Merk: For å øke kutte webdelers, øke siste konsentrasjonen Cas9 protein 800 pg/nL og sgRNA til 400 pg/nL i injeksjon løsningen; men dette kan også øke off-målet skjæring og/eller redusere embryoet helse. Kutte effektivitet kan også økes ved å injisere direkte inn celle46. Men injeksjon i eggeplomme sekken er teknisk mindre krevende og gir tilstrekkelig kutte å produsere fisk med høy germline overføring (> 70% av avkom som inneholder en modifisert allelet). - Returnere de injiserte embryoene til en riktig merket Petriskål dekke dem med 1 x E3 media med methylene blåfarge og sette dem i en embryoet inkubator satt til 28 ° C.
- På 24 h legge befruktning (hpf), inspisere helsen til de injiserte embryoene, fjerne død eller unormal utvikling individer og endre media (se Figur 3). Se på overlevelse mot kontrollen uninjected.
Merk: Når målretting en unødvendige genet, mindre enn 10% dødelighet forventes i forhold til kontrollen uninjected. Hvis forhøyede nivåer av dødelighet er observert i guide-injisert befolkningene i forhold til kontrollen uninjected, kan det tyde at målrettet genet er viktig for utvikling, eller off-målet effekter fører til mislykket utvikling. Reduserer injisert CRISPR-reagenser kan være nødvendig eller generering av en ny sgRNA med reduserte off-målet effekter kan være nødvendig. - Returnerer embryoene til inkubatoren og fortsette å vokse embryoene til 72 hpf, endre media daglig for å opprettholde embryoet helse.
4. analyse av effektiviteten til Indel dannelse bruker en HMA
- Samle to sett med fem embryoer fra innsatt plater vokst til 72 hpf microcentrifuge rør og samle ett sett med fem embryoer fra en uninjected kontroll.
- Bedøve embryoene ved å legge 0.004% MS-222 (tricaine) og vente 2 min.
- For å ekstra gDNA, forsiktig Pipetter media av hvert embryoet sett og legge 45 µL 50 mm NaOH. Inkuber embryoer på 95 ° C i 10 min.
- Fjerne embryoer fra varmekilde og kjølig til romtemperatur. Legge til 5 µL av 1 M Tris-HCl pH = 8 og vortex prøvene kraftig (5-10 s). Sentrifuge løsningen på maks fart (> 16.000 x g) i en romtemperatur microcentrifuge for 3 min. overføre nedbryting slik rent, merket og lagre gDNA på 20 ° C DNA for inntil 6 måneder.
Merk: DNA fragmenter av ca 900 bp og mindre vil bli generert gjennom bruk av denne protokollen. - Definere en 50 µL PCR reaksjon med 2 µL av de forberedt gDNA fra hver prøve (inkludert en uninjected kontroll) per instruksjonene som fulgte med polymerase, bruker tidligere designet primerne flankert spådd kuttet området.
- Rense PCR produkter med en PCR rydde opp kit (se Tabell for materiale), elute eksemplene i 30 µL av vann eller elueringsrør buffer og kvantifisere DNA bruker et spektrofotometer.
- Reanneal alle 30 µL av hvert renset PCR-produkt ved å plassere rør i en floatable rack i kokende vann badekar (ca 150 mL i et 500 mL beaker). Etter 3 min, slå av varmekilden og tillate løsningene avkjøles til romtemperatur, ca 1 time.
Merk: Dette trinnet først denatures DNA og så lar tråder for å reanneal tilfeldig for å generere mulig heteroduplex band eller dobbel-strand DNA som inneholder polymorfismer skapt av CRISPR-mutagenese og har derfor en forandret electrophoretic mobilitet sammenlignet med homoduplexes. De siste syklus av PCR eller rampe ned-program i thermocycler kan også brukes til å reanneal produkter47,48, men bruk av kokende badekaret kan gi bedre oppløsning av heteroduplex produkter. - Legge til 5 µL av 6 x lasting fargestoff (se Tabell of Materials) til den reannealed PCR-løsninger.
- Kastet en 15% polyakrylamid/TBE gel med 30% polyakrylamid (29:1). Når gel har satt, Legg den i et geleelektroforese apparat med TBE kjører buffer. Bruker en P1000, Fjern brønnene av alle partikler som gjenværende salter eller gel fragmenter som kan hindre brønnene ved forsiktig pipettering buffer opp og ned i brønnene flere ganger.
- Last 500 ng reannealed PCR produkter og belaste en kontroll (eksempel fra uninjected fisk) ved siden av hvert sett av sgRNA prøver. Kjør gel på 150 V i 2,5 t eller til fargestoff fronten er på bunnen av gel.
- Visualisere band med en nukleinsyre flekk (f.eks, ethidium bromide eller SYBR grønne (se Tabell for materiale)).
- Undersøke bandet mønsteret for hver kontroll og CRISPR-injisert pool av embryo.
Merk: Utseendet på flere band som kjører saktere i det injiserte versus uninjected baner angir dannelsen av romanen heteroduplex produkter (Figur 4). Tilstedeværelse av Roman heteroduplex DNA angir at indeler ble generert av CRISPR-injeksjon. Reduksjon i homoduplex band intensiteten i de injiserte løsningene på ca 50% eller høyere er vanligvis tilstrekkelig til å gi tilstrekkelig germline overføring. I tillegg ekstra band identifiseres noen ganger i uninjected fisk, og bør ikke anses heteroduplex band når observert i injisert fisk. - Velg injeksjoner med høyeste klippe effektivitet i forhold til kontrollen uninjected for hvert mål; embryoer fra disse injeksjoner kan brukes til å vokse opp fisk å se etter indeler forårsaker tidlig stopp kodon.
Merk: For svært effektiv kutte (reduksjon i homoduplex band av ca > 50% intensitet), screening 20-30 voksne fisk bør være tilstrekkelig for å oppnå germline overføring.
For sgRNAs som genererer mindre skjæring, kan mer voksen fisk være nødvendig å øke sannsynligheten for at identifisere fisken som viser germline overføring av endrede alleler inneholder en tidlig stopp codon. Hvis indel formasjon ikke er observert kan det være nødvendig å omstrukturere sgRNA til et annet område av genet. Hvis ingen heteroduplex band formasjon er observert, sgRNA kan ha forringet og sgRNA kvaliteten skal verifiseres ved hjelp av en urea/side gel.
5. identifikasjon og overføring av Knock-out linjer
- For å identifisere en potensiell grunnlegger overordnede fisk, utføre hale klipp av voksen F0 fisken (vokst til ca 2,5-3 måneder) å identifisere tilstedeværelsen av indeler. Bedøve fisken i 0.62 mM tricaine (se Tabell for materiale), deretter bruke en rene, skarpe razor blad for å fjerne ca 1/2-3/4 av halefinnen.
- Plasser halen i 45 µL 50 mm NaOH, og returnere fisken til en utvinning tank. Utføre gDNA utvinning som beskrevet (trinn 4.2-4.4). Når fisken gjenopptas normal svømming atferd, legg fisken på flytende system vann til innholdet i indel er funnet.
Merk: Det er viktig å sikre at fisk er identifiserbare, og kan være riktig tilpasset resultatene av halen klippene. - Som beskrevet (skritt 4,5-4,9), utføres en HMA på halen klippet gDNA å finne ut hvis fisken ble endret ved CRISPR injeksjon (figur 5). For å identifisere en grunnlegger fisk, rase voksne som viser heteroduplex band fra hale gDNA vill-type fisk. Samle embryoene og vokse dem til 72 hpf.
- På 72 hpf, samle 10 embryoer og plassere hver embryoet i en enkelt rør. Utføre en gDNA utvinning som beskrevet ovenfor (trinn 4.2-4,4) bruker: 11.25 µL 50 mm NaOH og 1,25 µL av 1 M Tris pH = 8.
- Gjenta PCR og geleelektroforese for å identifisere heteroduplex band som beskrevet ovenfor (trinn 4,7-4.13) for å fastslå Hvis indel alleler har blitt gitt videre til denne generasjon (figur 6).
- Basert på prosent overføring observert i enkelt embryoer bruker HMA, vokse et gjennomsnitt på 20-30 embryo innhentet av korset for hver CRISPR-linjer rundt til voksen.
Merk: Dette nummeret kan økes eller senkes avhengig av hyppigheten av germline overføring. - Utføre hale klipp av voksen F1 fisken å identifisere tilstedeværelsen av indeler som beskrevet (trinn 5.1-5.2). Som beskrevet (skritt 4,5-4.11), utføre en HMA på halen klippet gDNA å finne ut hvis fisken bærer en indel (figur 7).
-
For fisk som inneholder et heteroduplex band, forberede DNA sekvensering analyse.
- Utføre PCR bruker nye primere for å forsterke et 300-600 bp PCR produkt sentrert rundt kuttet området.
- Bruk en PCR rensing kit å rydde opp i DNA, og elute i 30 µL. Undersøk DNA på en agarose gel å sikre et enkelt band finnes.
Merk: Noen heteroduplex striper kan finnes på agarose gel og vises som en liten smøre eller dobbel bandet like over PCR produktet på den forventede størrelsen.
- Hvis en til tre indeler er analysert, sekvens PCR-produkter som bruker Sanger sekvensering og bestemme rekkefølgen indel bruker en Bioinformatikk verktøy49. Ellers fastsettelse av sekvensen av flere PCR produkter NGS analyse (se Tabell for materiale) er mer økonomisk.
- Fastslå om en tidlig stopp codon er innhentet ved å analysere sekvensen med et Bioinformatikk verktøy (se Tabell for materiale).
- Legg fisken som inneholder ønsket mutant allelet i en ny tank med riktig etiketter.
- Utforme PCR primere for bestemte indel alleler for fremtidige genotyperingteknologi behov. Disse veiledningene bør omfatte mutert sekvensen og ikke forsterke vill-type sekvensen.
- I tvers heterozygote sebrafisk generere segregerende innbyggere som inneholder 25% bank-out linjer.
Representative Results
Eksperimentell tilnærminger beskrevet i denne protokollen tillate kostnadseffektiv produksjon av sebrafisk knock-out linjer med CRISPR/Cas9-teknologi. Følgende figurer er inkludert i denne artikkelen for å lette tolkning og feilsøking av resultatene oppnådd bruker denne protokollen. Etter vellykket produksjon og microinjection CRISPR-reagenser, sebrafisk embryo kan bli analysert for utilslørt fenotyper og indel formasjon bruker HMA. En nyttig kontroll å visualisere suksessen til CRISPR-eksperimentet er bruk av sgRNA som beskrevet i trinn 1.5 å målrette pigment-produserende genet tyrosinase. Cas9-indusert indel formasjon på tyrosinase resulterer i tap av pigment og lett scores av 48 hpf (figur 1). En annen nyttig kontroll for å sikre at utarbeidelsen av CRISPR-reagenser for injeksjon er vellykket, er å bekrefte det fulle (120 nt) sgRNA har blitt syntetisert bruker en denaturing polyakrylamid gel (figur 2, Lane 1 og 2). Hvis RNA har blitt degradert kan den vises som en smear, for eksempel Lane 3 (figur 2) viser dårligere RNA som ikke er egnet for injeksjon.
Analysere indel formasjon frekvensen av gener målrettet av CRISPR-Cas9 som ikke vil føre utilslørt fenotyper som tyrosinase, er HMA analyse en enkel og pålitelig måte. sgRNA/Cas9 injisert embryo analysert bruker HMA resultater i dannelsen av heteroduplex band, og reduksjon av intensiteten av homoduplex bandet (Figur 4). Tilstedeværelsen av heteroduplex band benyttes videre i denne protokollen til å identifisere potensielle grunnlegger fisk fra de microinjected embryoene og som voksne (Figur 4 og figur 5), til å analysere germline overføring effektivitet grunnlegger ( Figur 6), og for å bekrefte tilstedeværelse av en indel i en heterozygote F1 fisk (figur 7). Heterozygote fisk som inneholder en indel er kandidater for NGS identifisere innholdet i indel og avgjøre om en tidlig stopp codon er tilstede i regionen koding av målet genet.
Figur 1 : Sebrafisk embryo viser feil pigment når injisert med en sgRNA rettet mot tyrosinase på en celle scenen. (A) vill-type, uninjected embryo på 48 hpf og (B) injisert embryo på 48 hpf. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : In vitro transkripsjon av sgRNA bruker syntese kit. Oligos ble syntetisert bruker i vitro transkripsjon instruerte sgRNA syntese kit. 500 ng av RNA ble kjørt på en urea/side gel som beskrevet. sgRNA lastet inn i baner 1 og 2 viser et band tilsvarer full lengde, intakt 120 nt RNA. SgRNA i lane 3 viser en dårligere RNA prøve som ikke er egnet for injeksjon.
Figur 3 : Sammenligning av helsen til 24 hpf injisert embryoer. En levende embryo (A) utviklet til 24 hpf, er lett skilles fra et embryo som er avbrutt utvikling (B). Embryo som ligner (B) eller har drastisk endret funksjoner til (A), som spinal kurvatur eller endret hodet og øye utvikling bør fjernes fra parabolen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Heteroduplex mobilitet analysen av sgRNA-Cas9 microinjected sebrafisk embryoer. Bassenger med 5 embryo per prøve var samlet på 72 hpf og gDNA ble trukket ut. Heteroduplex-analyse ble gjennomført som beskrevet, prøver var lastet like med 500 ng DNA. Baner: M = 100 bp penn; 1 = uninjected kontroll; 2 = injeksjon prøve 1; 3 = injeksjon eksempel 2. Forventet bandet størrelse = 98 bp.
Figur 5 : Heteroduplex mobilitet analysen av gDNA Hentet fra halen av en voksen CRISPR-injisert sebrafisk. Embryo som ble injisert med sgRNA og Cas9 protein var vokst til voksen (3 måneder). Fisk B og C utstilling heteroduplex band og senere ble avlet for å identifisere germline overført indeler; fisk A ble ikke brukt i påfølgende analyse fordi den ikke viser et positivt heteroduplex band. Baner: 1 = vill-type kontroll. 2 = fisk A; 3 = fisk B; 4 = fisk C. forventet bandet størrelse = 98 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Heteroduplex mobilitet analysen av enkelt embryo generert av avl en F0 CRISPR-injisert sebrafisk en vill-type fisk å identifisere germline overført indeler. Sebrafisk ble paret, og F1 embryo vokst for 72 h. enkelt embryo var samlet og heteroduplex analyse utført som beskrevet. Baner: 1 = vill-type kontroll. 2-10 = en enkelt F1 embryoet per kjørefelt. Denne gel viser at 7 ute av 10 embryo viser en positiv heteroduplex band, som indikerer en germline overføringshastighet på 70% av indel. Forventet bandet størrelse = 98 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Heteroduplex mobilitet analysen voksen F1 sebrafisk hale utklipp. Voksen F1 fisk ble scoret av HMA å identifisere indeler. Fisk som viste en positiv heteroduplex band var PCR forsterket og presentert for bredt sekvensering analyse å bestemme hva slags mutasjon. (A) baner: 1 = vill-type kontroll. 2 = fisk (4 bp slettingen, 1 bp feil). (B) disse F1 fisk ble identifisert fra samme grunnlegger og likevel vise forskjellige heteroduplex mønstre, indikerer germline overføring av flere endret alleler fra en enkelt grunnlegger. Baner: 1 = vill-type kontroll. 2 = fisk B (4 bp innsetting, 7 bp feil), 3 = fisk C (4 bp sletting, 4 bp feil). Hver av disse indeler opprettet en tidlig stopp codon i koding sekvensen av målet genet, som bestemmes av NGS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver produksjon av genet knockouts i sebrafisk virveldyr modell systemet bruker CRISPR-Cas9-teknologi. Flere protokoller har tidligere blitt beskrevet for å gjennomføre CRISPR-mediert genomet engineering i sebrafisk15,25,26,50,51,52. Denne protokollen bygger på tidligere innsats ved å kombinere en rekke enkle men reproduserbar konsekvent eksperimentelle teknikker, spesielt HMA og NGS av flere heterozygote fisk, lage en enkel, økonomisk, og eksperimentelt robust protokollen for CRISPR-mediert mutagenese i sebrafisk som passer for labs bemannet med personell med et utvalg av opplæring og erfaring, samt undervisning labs.
Anbefalinger for design og syntese av guide RNAs er inkludert i denne protokollen. En viktig faktor i guide RNA design er minimering av off-målet effekter. Flere prediksjon algoritmer er utviklet for å tillate CRISPR-brukere tilgang til beregning verktøy med brukervennlige grafiske grensesnitt som spår både aktiviteten på målet guide og sjansen for off-målet effekter34, 35,36. En bestemt fordel av sebrafisk er reduserte priser off-målet effekter fordi Cas9 injiseres i embryoene og derfor uttrykket er forbigående, som har vært vist i mus resulterer i redusert off-målet effekter53. Off-målet effekter har likevel vist seg for å oppstå i sebrafisk54. En måte å kontrollere for off-målet effekter er å fenotypen grunnlegger sebrafisk som er generert av to uavhengig guide RNAs som er rettet mot det samme genet, som disse guidene vil være svært sannsynlig til å påvirke forskjellige off-målet områder. En annen metode å minimere off-målet effekter ikke er beskrevet i denne protokollen er bruken av et mutert Cas9 som genererer enkelt strand bryter på målet DNA, som er reparert med høy effektivitet. Sammenkobling DNA kutt i nærheten av hverandre som er komplementære til motsatt tråder gir effektiv indel formasjon på ønsket locus og minimerer off-målet effekter55,56.
I tillegg til ulike priser off-målet effekter, kan forskjellige sgRNAs ha ulike priser over mutagenese ønskede mål57,58,59. Denne protokollen bruker HMA for å analysere effektiviteten av mutagenese av en gitt sgRNA bruker heteroduplex band formasjon33,40. Heteroduplex band opprettes ved blanding av PCR-generert DNA tilnærmingene som inneholder uoverensstemmelser, og kan lett løses med gel geleelektroforese. I motsetning til andre metoder som vanligvis brukes til å måle indel formasjon, som T7 endonuclease analysen eller høy oppløsning smelte analyse25,26, HMA krever ikke et dyrt enzym å kutte DNA, og krever ikke komplisert analyse av PCR smelte kurver. Viktigere, bruker HMA kontrollere høy forekomst av indel formasjon i befolkningen injisert kan også etterforskeren å minimere antallet av fisk nødvendig for etterfølgende produksjon av banke-ut linjer, noe som reduserer kostnadene ved å identifisere en mutasjon med den ønsket kjennetegnene.
Det er relative enkelt å generere CRISPR-baserte indeler gjør etablering av flere alleler av flere gener samtidig. Web-basert programvare er tilgjengelig for analyse av enkelt mutasjoner fra heterozygote fisker med Sanger sekvensering av PCR produkter49. I tilfelle der tre eller flere CRISPR-mutert alleler analyseres er NGS å karakterisere indel natur sannsynlig å være mer kostnadseffektivt å karakterisere natur indel som denne tilnærmingen lar en pool av opptil 50 forskjellige alleler å være preget på o NCE (se Tabell for materiale)60,61,62. Slike økonomien i skala ville trolig være spesielt nyttig i et lavere laboratorium.
I sammendraget, denne protokollen gir trinnvise instruksjoner om reproduserbar genererer høy kvalitet CRISPR-reagenser (spesielt sgRNA) slik at færre voksne fisk må opprettes og analysert for å kunne identifisere de muterte alleler interessepunkter, som også reduserer tid og kostnader å generere ønskede linjene. Viktigere, er denne protokollen utformet slik at det kan brukes av laboratorier med begrensede ressurser til å produsere mutant sebrafisk på en rimelig måte. Videre har vi funnet at denne tilnærmingen er egnet for studenter og dermed utvider mulighetene for utdanning og opplæring av studentene interessert i praktisk erfaring innen CRISPR-baserte genomet redigering.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R21CA182197 til J.O.), Ralph W. og Grace M. Showalter forskning tillit, og ved Purdue landbruksvitenskap og utvidelse for økonomisk utvikling (AgSEED) programmet. Sanger sekvensering data ble kjøpt opp av funksjonen Purdue Genomics Core støttes av P30 CA023168. Mary Witucki ble støttet av Purdue University Center for Cancer Research sommer Undergraduate Research Program støttes av Carroll County Cancer Association. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Benjamin Carter, Ellen Denning og Taylor Sabato for å gi tilbakemelding på manuskriptet. Vi takker Institutt for biokjemi for støtte av dette arbeidet, og Center for sebrafisk forskning ved Purdue University for deres engasjement i pleie og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt, vi takker Purdue Genomics Core anlegget, og bidrag av Phillip San Miguel angående NGS tjenestene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
- Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
- Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
- Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
- Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
- Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
- Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
- Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
- Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
- Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
- Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
- Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
- Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
- Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
- Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).
