Summary
Riktade gen editering i systemet modell Danio rerio (Sebrafisken) har underlättats avsevärt genom uppkomsten av CRISPR-baserade metoder. Häri, beskriver vi ett strömlinjeformat, robust protokoll för generering och identifiering av CRISPR-derived nonsens alleler som innefattar heteroduplex rörlighet analysen och identifiering av mutationer med nästa generations sekvensering.
Abstract
Karakterisering av den klustrade, mellanliggande regelbundet, kort, palindromic upprepa (CRISPR) systemet med Streptococcus pyogenes har möjliggjort utvecklingen av en anpassningsbar plattform för att snabbt generera genen ändringar i en mängd olika organismer, inklusive zebrafiskar. CRISPR-baserade gen editering använder en enda guide RNA (sgRNA) att rikta en CRISPR-associerade (Cas) Amiiiiin ett genomisk DNA (gDNA) mål av intresse, där de Cas Amiiiiin genererar en dubbel-strand paus (DSB). Reparation av DSBs av felbenägna mekanismer leder till infogningar och borttagningar (indels). Detta kan orsaka frameshift mutationer som ofta presentera en tidig stop kodon inom kodning sekvensen, vilket skapar ett protein är null-allelen. CRISPR-baserade genomet teknik kräver endast några molekylära komponenter och införs enkelt i zebrafiskar embryon genom Mikroskop. Det här protokollet beskriver de metoder som används för att generera CRISPR reagenser för zebrafiskar Mikroskop och identifiera fisk som uppvisar könsceller överföring av CRISPR-modifierade gener. Dessa metoder inkluderar in vitro transkription av sgRNAs, Mikroskop av CRISPR reagenser, identifiering av indels inducerad på målwebbplatsen använder en PCR-baserad metod som kallas en heteroduplex rörlighet assay (HMA) och karakterisering av indels med både en låg genomströmning och en kraftfull nästa generations sekvensering (NGS)-baserat tillvägagångssätt som kan analysera flera PCR-produkter som samlas in från heterozygot fisk. Detta protokoll är strömlinjeformad för att minimera både antalet fiskar som krävs och vilka typer av utrustning som behövs för att utföra analyser. Dessutom är detta protokoll utformad för att vara mottagliga för användning av laboratoriet personliga av alla nivåer av erfarenhet inklusive grundutbildningsstudenter, möjliggör detta kraftfulla verktyg att vara ekonomiskt anställd av någon forskargrupp som är intresserade av att utföra CRISPR-baserade genomisk ändring i zebrafiskar.
Introduction
Bevarande av molekylära maskineri över eukaryotes ligger bakom har befogenhet att använda modellorganismer för forskning. Många av dessa modellsystem underlätta användningen av omvänd-genetiska metoder såsom riktade gene knockouts att karakterisera bidrag av en gen produkt till en biologisk eller sjukdom process av intresse. Gen störningar tekniker i organismer såsom zebrafisk har historiskt åberopat riktade införandet av frameshift mutationer som resulterar från oprecisa reparation av DSBs1,2. När en DSB införs i arvsmassan, DNA lesionen repareras genom en av två vägar som finns allmänt i nästan alla typer av celler och organismer: icke-homolog slutet att gå (NHEJ) och homologi-regisserad reparation (HDR)3,4 . Den oprecisa naturen av NHEJ maskiner producerar ofta indels olika längder5,6,7,8,9. Införandet av frameshift mutationer i den kodande sekvensen av en gen kan producera en förtida stop kodon, som ofta återger genen inte fungerar.
Tidiga genomet engineering strategier i zebrafiskar att främja indels ingår meganucleases, zink finger nukleotider och transkription aktivator-liknande effektor nukleaser, varav alla utnyttjas DNA-protein interaktioner för att rikta en nuclease till en specifik genomisk målet var det introducerade en DSB10,11,12,13,14,15. Dessa tekniker är dock ofta svåra att tillämpa på grund av mödosamma och komplex teknik behövs för att generera en nukleotid som mål den DNA-sekvensen av intresse. Till skillnad från tidigare strategier förlitar CRISPR-baserade gen redigering sig inte på protein-DNA interaktioner för inriktning. I stället riktas den CRISPR-associerade (Cas) Amiiiiin via en RNA-guide som använder nukleotid bas ihopkoppling interaktioner för att rikta en genomisk webbplats intresse16,17,18,19 ,20,21. På grund av enkelheten i utforma en RNA är guide med önskad bas ihopkoppling interaktioner för att rikta det relativt lätt att rikta de Cas Amiiiiin till det önska locus. Typ II CRISPR system utvecklats särskilt allmänt för genomet redigeringsprogram på grund av flera fördelaktiga funktioner, inklusive användning av en enda flera domäner-Cas-nuclease (Cas9) som kräver interaktion med DNA för att stimulera Amiiiiin aktivitet och användning av en enda guide RNA (sgRNA) för att rikta den till den cognate DNA sekvens18. Sekvens kraven nödvändiga för inriktning av den cognate sgRNA är förstådda19och den önskade sgRNA genereras enkelt genom in vitro- transkription. Enkelheten och robusthet av metoden CRISPR/Cas9 underlättar avsevärt riktad genmodifiering i zebrafiskar och ett brett utbud av andra organismer.
Förbättrad förmåga att genomföra riktade gen editering i zebrafiskar till följd av utveckla CRISPR-baserade reagenser har betydligt ökad möjlighet att studera processer emblematiska av vertebrate organismer som utvecklingen av centralen nervsystemet systemet. Zebrafiskar genomet innehåller orthologs 70% av de protein-kodande gener i det mänskliga genomet samt 84% av gener associerade med sjukdomar i människor22. Zebrafiskar utveckling uppvisar flera viktiga egenskaper som förbättrar dess användning i omvänd genetiska studier: embryona läggs i stora klorna, utveckla externt från mamman att göra dem mottagliga för genetisk manipulation av Mikroskop och vuxen zebrafiskar könsmogna vid 3 månaders ålder, vilket möjliggör Forförökningen av önskad rader23.
Många protokoll finns tillgängliga som beskriver en mängd metoder att generera och identifiera CRISPR-derived indels i zebrafiskar24,25,26,27,28,29 ,30,31. Dock många av dessa förfaranden är tid intensivt, kräver tillgång till dyr utrustning, och kan vara en utmaning för labs med begränsad expertis. Stegen som beskrivs häri ger en enkel, robust och ekonomisk CRISPR/Cas9-strategi till ingenjör zebrafiskar knockout linjer. Det här protokollet beskriver användningen av en högeffektiv kit att syntetisera sgRNAs använder DNA oligonukleotider (oligos), liknar andra metoder som varit tidigare beskrivits32. Protokollet beskrivs omfattar två steg i synnerhet som underlättar analys av CRISPR-muterade linjer: steg för steg användningen av de PCR-baserade HMA33 att enkelt avgöra förekomsten av genomet ändringar och sekvensering analys av heterozygot zebrafiskar till snabbt och enkelt avgöra vilken typ av flera indels på ett ekonomiskt sätt. Dessutom ingår stegvisa instruktioner för robust urval, tillförlitlig produktion och injektion av guide RNAs. Stegen här exemplifiera ett robust, relativt billig protokoll som möjliggör laboratoriepersonal med ett utbud av expertis att bidra till identifiering av genen knockouts i zebrafiskar.
Protocol
Denna studie utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Purdue djur vård och användning kommittén (PACUC nummer 08-031-11).
1. design av mall-specifika Oligos för Guide RNA produktion
- Välj regionen target sevärdheter ska ändras i den kodande regionen av genen. Detta bör vara nära 5' slutet av genen att generera ett trunkerat protein, men inte så nära så att en efterföljande i-frame start-kodon möjliggör produktion av ett protein med en blygsam N-terminala trunkering.
Obs: Ett sätt att utesluta denna möjlighet är att skanna nedströms kodande regionen av genen för en i ram starta kodon. Dessutom kan använder en guide RNA som mål i mitten av en stor exon, bidra till att identifiera PCR primers för efterföljande poängsättning av den resulterande ditsatta. - Identifiera potentiella guide platserna i regionen genomisk av intresse med hjälp av en guide RNA urval program (se Tabell för material)34,35,36. Ange webbläsarinformation Danio rerio och sekvensen protospacer angränsande motiv (PAM) till 5'-NGG-3 '.
Obs: Idealisk gärna sekvenser innehåller en 5′-G i första positionen i gärna för effektiv T7 i vitro transkription. Om ingen godtagbar guide finns med ett G på 5′ position, 5′ basen av en annan guide kan ändras till ett G eller ett G kan läggas på 5′ slutet av guiden RNA, men detta kan minska skära effektivitet37. För att maximera skära effektivitet, en optimal guide sekvens har 40-80% GC innehåll (högre är bättre), och innehåller ett G på 20: e positionen, intill PAM, men är inte obligatoriska38. Ett exempel på en perfekt inriktning sekvens: 5′ - G (N)18 G-3′ - NGG (NGG är PAM). Förutom att granska resultaten från guide RNA urval programmet att identifiera optimala guide RNAs enligt ovan bör vara försiktig att undvika guide RNAs med förväntade starka off-target effekter som avsevärt försvårar efterföljande analys. I synnerhet guide RNAs med förutspådda off-target effekter som faller inom kodande regioner bör undantas, och de totala off-target platser förutspådde bör minimeras. - Från produktionen av verktyget guide RNA design, utesluta sekvensen PAM (5′-NGG-3′); Det används inte för inriktning men består av sekvensen erkännande för Cas9 klyvning.
- Till de återstående 20 nukleotiderna (nts), lägga till T7 promotorn sekvensen och sekvensen överlappning (region komplement till en byggnadsställning oligo används för att syntetisera full längd sgRNAs medföljer i transkription rekommenderade in vitro- satsen) i angiven ordning nedan för att erhålla en 54 nt oligo: T7 promotorn sekvens: 5′-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; Vägleda RNA-sekvens 5′ - G (N)18 G-3′; Överlappa sekvens: 5′-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
- Identifiera PCR primers som flankerar den förutsedda skär webbplatsen (Cas9 klyver 3 nt uppströms av PAM sekvensen) på ett avstånd av 50 – 150 baspar (bp) varje från snittet med hjälp av webbaserad programvara (se Tabell för material).
Obs: Dessa kommer att användas i ett senare steg för mätning av bearbetningens effektivitet. Om inga lämpliga grundfärger identifieras med hjälp av dessa begränsningar, kan en annan guide RNA webbplats behöva övervägas. - Beställa 54 nt oligonukleotider att producera guiden RNA och PCR primers för analys av mål platser (se Tabell för material).
Obs: Som en extra positiv kontroll, kan det vara bra att producera en sgRNA inriktning en gen som är nödvändigt för produktionen av pigment att kontrollera utförandet av detta protokoll som använder en lätt skårade visuella fenotyp (se figur 1 för representativa resultat). Ett gemensamt mål är den genen tyrosinase, använder oligo (guide RNA-sekvens är understruket)39: 5′-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 '
2. förberedelse av CRISPR-reagenser för Embryo Mikroskop
-
Beställa kommersiellt tillgängliga Cas9 protein (se tabell för material).
Obs: Injektion av Cas9 mRNA kan också användas att generera indels i zebrafiskar40,41, emellertid zebrafiskar embryo Mikroskop med Cas9 protein har visat sig vara effektivare32,42.- Avbryta Cas9 proteinet i medföljande bufferten att generera en 1 mg/mL lösning. Förvara lösningen i injektion-klar alikvoter i PCR-rören vid-80 ° C att minimera antalet frysning-tining cykler. För att generera en 5 µL injektionslösningen, 2 µL av 1 mg/mL Cas9 lösning används, kan därför Cas9 vara aliquoted i 2 µL portioner med hjälp av PCR-strip-rören.
- Syntetisera de sgRNA med sgRNA in vitro- transkriptionen kit (se Tabell för material). Utför in vitro- transkriptionen enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Upprätthålla RNase-fri teknik under alla syntes, sanering och injektion lösningen förberedelsesteg. Till exempel, använda engångshandskar och ändra dem ofta, använder rör och tips som är certifierad RNase-fri, och rena ytor och pipetter med kommersiellt tillgängliga lösningar att sanera labware (se Tabell för material). -
Rena den synthesized sgRNA använder en ammoniumacetat/nederbörd med RNase-fri teknik.
Obs: Alternativt sgRNAs kan renas med hjälp av olika kommersiellt tillgängliga kolumnbaserade RNA städa upp kit för en relativt blygsam kostnad.- Tillsätt 25 µL 5 M ammoniumacetat och vortex att blanda.
Obs: Ammonium Acetat lösning är kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material), eller en 5 M lösning kan göras i huset genom att lägga till 385.4 mg molekylärbiologisk kvalitet ammoniumacetat 1 mL RNase-gratis vatten och förvaras vid-20 ° C. - Tillsätt 150 µL 200-bevis nuclease-gratis etanol i varje prov. Placera reaktionen i-80 ° C frys i minst 20 min.
Obs: Proverna kan lagras över natten vid-80 ° C, men inte kommer att avsevärt öka den totala RNA avkastningen. - Centrifugera proverna med maximal hastighet (> 16 000 x g) i en mikrocentrifug 4 ° C i 20 min.
- Ta bort supernatanten noggrant genom långsamt pipettering av vätskan, att säkerställa RNA pelleten inte störs.
- Tillsätt 1 mL 70% etanol (skapad av späda nuclease-gratis etanol i RNase-fritt vatten) och blanda försiktigt röret genom att invertera det flera gånger att tvätta kvarvarande salt från röret.
- Upprepa centrifugeringssteget för 7 min.
- Ta bort supernatanten genom första pipettering av de flesta av lösningen med P1000 pipett och sedan använda P200 pipett att ta bort så mycket lösning som möjligt utan störande pelleten. Torka den RNA pelleten i ett rent utrymme som en LAF eller en arbetsbänk, vara noga med att undvika RNase kontaminering, 15 min eller tills inget mer flytande droppar syns i röret.
- Återsuspendera pelleten i 30 µL RNase-gratis vatten, kvantifiera på produkten (till exempel med en spektrofotometer) och alikvot lösningen för långsiktig lagring i-80 ° C frys.
Obs: Typiska koncentrationerna varierar mellan 800 – 2 500 ng/µL.
- Tillsätt 25 µL 5 M ammoniumacetat och vortex att blanda.
-
(VALFRITT) Verifiera att fullängds RNA har genererats med hjälp av urea/sida. Alternativt använda en agarosgel Kontrollera att RNA är intakt.
Obs: Men om du använder en agarosgel en större mängd gärna måste köras för att visualisera RNA och längden kan inte fastställas exakt. När analysera effektiviteten i målet skära efter injektion av reagenserna i fisken, om det finns ingen eller liten kapning närvarande sedan kontrolleras sgRNA för nedbrytning.- Kasta en 8% Polyakrylamidgelen i TBE med 40% polyakrylamid (19:1) och 8 M urea med RNAse-fri teknik för lösningar och utrustning43.
Obs: Kommersiellt tillgängliga material kan användas för att rengöra utrustning (se Tabell för material). - När gelen stelnat helt (ca 30 min), temperera gelen genom att placera den i TBE kör buffert och utför elektrofores för 30 min vid 5 V/cm.
- Blanda 300 – 500 ng av sgRNA med en lika stor volym 2 x RNA gel lastning färga (se Tabell för material). Använder en P1000, rensa brunnarna av eventuellt skräp genom pipettering kör buffert i varje väl flera gånger. Ladda lösningar och kör gelen vid 10 V/cm för 2,5 h.
Obs: En markör-lane här är användbar för att visualisera längden på RNA men krävs inte; Generellt är det uppenbart om full längd RNA har varit syntetiseras (figur 2). - Visualisera de band som använder en nukleinsyra fläcken (se Tabell för material).
Obs: sgRNA band ska visas som ett enda band, smetar visar RNA nedbrytning (figur 2).
- Kasta en 8% Polyakrylamidgelen i TBE med 40% polyakrylamid (19:1) och 8 M urea med RNAse-fri teknik för lösningar och utrustning43.
3. Mikroskop av CRISPR-komponenter till zebrafiskar embryon
- Ställa in avel tankar i natten före injicering genom att placera antalet önskad hanar och honor (vanligtvis 2 honor och 1 eller 2 hanar) i en avel tank med en avdelare i placera44.
- Förbereda en Mikroskop tallrik med 1,5% agaros i 1 x E3 media (se Tabell för material) med 0,01% metylenblått (fungicid) genom att hälla 35 mL smält Agarens i en 10 cm petriskål och försiktigt lägga en plast mögel för att skapa kilformade rännor i den lösning, knacka formen för att eliminera luftbubblor.
- Tillåta Agarens att ange och lagra skålen med en liten mängd av media och insvept i paraffin film till att plattan torkar ut vid 4 ° C.
Obs: Injektion plattorna kan återanvändas i flera veckor, tills brunnarna blir deformerade eller torr eller plattan börjar växa mögel. - På morgonen den injicera, Tina renat sgRNA och Cas9 protein på is. Kom ihåg att hantera alla material med handskar att förhindra RNase kontaminering och använda RNase-gratis tips och rör.
- Generera en 5 µL injektionslösning genom att kombinera Cas9 protein och sgRNA i förhållandet 2:1 av Cas9:sgRNA att få slutliga koncentrationer av 400 pg nL Cas9 protein och 200 pg/nL sgRNA. Inkubera Cas9/sgRNA lösningen i rumstemperatur 5 minuter så att Cas9 och sgRNA att bilda en ribonukleoprotein komplexa. Tillsätt 0,5 µL av 2,5% wt/vol fenolrött lösning (se Tabell för material), och RNase-fria vattnet till en slutlig volym av 5 µL.
Obs: Joniska styrkan i lösningen har visat sig påverka den Cas9/sgRNA komplexa, därför tillägg av KCl kan effektivisera skärande sgRNAs som uppvisar låg ditsatta bildande28löslighet. - Göra en injektionsnål genom att dra ett 1,0 mm glas kapillär med hjälp av en mikropipett avdragare. Skär den nygjorda nålspetsen använda en nya rakblad eller pincett för att få en vinklad öppning som lätt tränger den chorion och gulesäcken.
- Placera nålen i en micromanipulator kopplad till en microinjector med luft källa påslagen. Under ett ljusmikroskop med förstoringen passar kalibreringen bestämmas för viss apparatur, justera Injekteringstryck tills nålen konsekvent matar ut en 1 nL-lösning i en petriskål fylld med mineralolja.
Obs: Kvaliteten på nålen är kritisk. Bruket producerar en nål och injicera i gulesäcken av embryon tills detta är färdighet är behärskar innan ytterligare experiment45. - Avlägsna avdelare och låt fisken att häcka i ca 15 min.
Obs: Längre avel gånger kommer att producera fler embryon, men injektionen bör slutföras medan embryona är i 1-cellstadie att maximera chansen att Cas9 klippa sker tidigt och därför minska genetisk mosaicism. Embryon kan injiceras vid senare stadier (2 – 4 cell stadier), men detta kan möjligen minska överföringshastigheten könsceller av modifierade allelen. - Samla ägg med hjälp av en sil och skölj dem i ett 10 cm petriskål med 1 x E3 media med 0,0001% metylenblått. Undersöka hälsan hos äggen under mikroskopet ljus, ta bort alla Obefruktade ägg och skräp.
- Avsätt 10 – 15 embryon som en uninjected kontroll i en separat, märkt petriskål.
- Med överföring pipett försiktigt radas upp äggen på injektion plattan värms till rumstemperatur.
- I dissektion Mikroskop på 2,5 X förstoring, injicera 1 nL av lösningen i gulesäcken av varje embryo att injicera totalt 400 pg Cas9 protein och 200 pg av sgRNA.
Obs: För att öka skärdata om önskad eller nödvändigt, öka den slutliga koncentrationen av Cas9 protein till 800 pg nL och sgRNA till 400 pg/nL i injektionslösningen; dock kan detta också öka skärdata med off-target eller minska embryo hälsa. Bearbetningens effektivitet kan också ökas genom att injicera direkt i den cell46. Men injektion i äggula säcken är tekniskt mindre krävande och ger tillräcklig skärande att producera fisk med hög könsceller transmission (> 70% av avkomman som innehåller en modifierad allel). - Tillbaka de injicerade embryona till en korrekt märkta petriskål, täcka dem med 1 x E3 media med metylenblått och sätta dem i en embryo inkubator inställd på 28 ° C.
- På 24 h efter befruktning (hpf), inspektera hälsan hos de injicerade embryon, ta bort döda eller onormalt utveckla individer och ändra media (se figur 3). Kontrollera graden av överlevnad mot uninjected kontroll.
Obs: När inriktning en onödiga genen, mindre än 10% dödlighet beräknas i förhållande till uninjected kontroll. Om förhöjda nivåer av dödlighet observeras i guide-injiceras populationer jämfört med uninjected kontrollen, kan det innebära att den rikta genen är avgörande för utvecklingen eller off-target effekter leder till misslyckade utveckling. Att minska mängden injicerad CRISPR-reagens kan vara nödvändigt eller generering av en ny sgRNA med minskad off-target effekter kan krävas. - Tillbaka embryon till inkubatorn och fortsätta växa embryon till 72 hpf, ändra media dagligen för att bibehålla embryo hälsa.
4. analys av effektiviteten i ditsatta bildandet använder en HMA
- Samla in två uppsättningar av fem embryon från injicerade plattorna vuxit till 72 hpf in mikrocentrifugrör och samla en uppsättning av fem embryon från en uninjected kontroll.
- Söva embryon genom att lägga till 0,004% MS-222 (tricaine) och vänta 2 min.
- För att extrahera gDNA, försiktigt Pipettera media utanför varje embryo set och tillsätt 45 µL av 50 mM NaOH. Inkubera embryon vid 95 ° C i 10 min.
- Ta bort embryon från värmekällan och svalna till rumstemperatur. Tillsätt 5 µL av 1 M Tris-HCl pH = 8 och vortex proverna kraftigt (5 – 10 s). Centrifugera lösningen vid max varvtal (> 16 000 x g) i en rumstemperatur mikrocentrifug för 3 min. överför supernatanten till en ren, märkt tube och lagra gDNA vid-20 ° C DNA för upp till 6 månader.
Obs: DNA-fragment av cirka 900 bp och mindre kommer att genereras genom användning av detta protokoll. - Ställa in en 50 µL PCR-reaktion med 2 µL av den beredda gDNA från varje prov (inklusive en uninjected kontroll) per instruktionerna som medföljer med den polymeras, använder tidigare designat primers flankerar den förutsedda skär webbplatsen.
- Rena PCR produkter med en PCR städa upp kit (se Tabell för material), eluera proverna i 30 µL av vatten eller eluering buffert och kvantifiera DNA med en spektrofotometer.
- Reanneal alla 30 µL av varje renat PCR-produkt genom att placera rören i en flytbar rack i kokande vattenbad (cirka 150 mL i en 500 mL-glasbägare). Efter 3 min, Stäng av värmekällan och tillåta lösningarna svalna till rumstemperatur, ca 1 h.
Obs: Detta steg först denaturerar DNA och sedan gör delarna till reanneal slumpmässigt generera möjligt heteroduplex band eller inkompatibla dubbel-strand DNA som innehåller polymorfismer skapad av CRISPR-mutagenes och därför har en förändrad elektroforetiska mobilitet jämfört med homoduplexer. Sista cykeln av PCR eller ramp ner programmet i termocyklern kan också användas för att reanneal produkter47,48, men användning av kokande badet kan ge förbättrad upplösning av heteroduplex produkter. - Tillsätt 5 µL 6 x lastning färga (se Tabell för material) till de reannealed PCR-lösningarna.
- Kasta en 15% polyakrylamid/TBE gel med 30% polyakrylamid (29: 1). När gelen har ställt, placera den i en elektrofores-apparat med TBE kör buffert. Använder en P1000, rensa brunnarna av eventuellt skräp såsom kvarvarande salter eller gel fragment, som kan hindra brunnarna av försiktigt pipettering buffert upp och ner i brunnar flera gånger.
- Last 500 ng reannealed PCR-produkter och belastning en kontroll (prov från uninjected fisk) bredvid varje uppsättning sgRNA prover. Kör gelen vid 150 V för 2,5 h eller tills dye framsidan är på botten av gelen.
- Visualisera de band som använder en nukleinsyra fläck (t exetidiumbromid eller SYBR green (se Tabell för material)).
- Granska mönstret för band för varje kontroll och CRISPR-injiceras pool av embryon.
Obs: Uppkomsten av flera band som kör långsammare i den injicerade jämfört med uninjected körfält visar bildandet av romanen heteroduplex produkter (figur 4). Förekomsten av romanen heteroduplex DNA indikerar att indels genererades av CRISPR-injektionen. Homoduplex bandet intensiteten i de injicerade lösningarna minskning på cirka 50% eller mer är i allmänhet tillräckligt för att resultera i tillräcklig könsceller överföring. Dessutom extra band identifieras ibland i uninjected fisken, och bör inte betraktas som heteroduplex band när observerats i injiceras fisken. - Välja injektionerna med högsta skära effektivitet jämfört med uninjected kontroll för varje mål; embryon från dessa injektioner kan användas att växa upp fisk för att leta efter indels orsakar för tidig stop kodon.
Obs: För mycket effektiv skärning (reduktion i homoduplex bandet av ungefärligt > 50% intensitet), screening 20 – 30 vuxna fiskar bör räcka att få könsceller överföring.
För sgRNAs som genererar mindre skärande, kan mer vuxen fisk behövas att öka sannolikheten för att identifiera fisk som uppvisar könsceller överföring av modifierade alleler som innehåller en för tidig stop kodon. Om ditsatta bildandet inte beaktas kan det krävas att omforma sgRNA till en annan region av genen. Om ingen heteroduplex bandet bildning observeras, sgRNA kan har degraderat och sgRNA kvalitet bör verifieras med en urea/sida gel.
5. identifiering och spridning av Knock-out Lines
- För att identifiera en potentiell grundare överordnade fisk, utföra svans klipp av vuxen F0 fisken (vuxit till cirka 2,5 – 3 månader) att identifiera närvaron av indels. Söva fisken i 0,62 mM tricaine (se Tabell för material), sedan använda en rena, skarpa rakblad för att ta bort cirka 1/2-3/4 av stjärtfenan.
- Placera svansen i 45 µL av 50 mM NaOH och tillbaka fisken en återhämtning tank. Utföra gDNA utvinning som beskrivs (steg 4.2 – 4.4). När fisken återupptar normal simning beteende, placera fisken tillbaka på flödande system vatten tills arten av ditsatta identifieras.
Obs: Det är viktigt att säkerställa att enskilda fiskar kan identifieras, och på lämpligt sätt kan anpassas till resultaten av svans klippen. - Som beskrivs (steg 4,5 – 4.9), utföra en HMA på svans klipp gDNA att avgöra om fisken ändrades genom CRISPR injektion (figur 5). För att identifiera en grundare fisk, rasen de vuxna uppvisar heteroduplex band från svans gDNA till vildtyp fisk. Samla in embryon och odla dem till 72 hpf.
- Vid 72 hpf, samla 10 embryon och placera varje embryo i en individuell röret. Utföra en gDNA utvinning som beskrivits ovan (steg 4.2 – 4.4) använder 11,25 µL av 50 mM NaOH och 1,25 µL 1 M Tris pH = 8.
- Upprepa PCR och elektrofores för att identifiera heteroduplex band som beskrivs ovan (steg 4,7 – 4.13) för att avgöra om ditsatta alleler har övervältrats på denna generation (figur 6).
- Baserat på procent överföringen observerats i enstaka embryon använder HMA, växa i genomsnitt 20 – 30 embryon erhållits genom korset för varje CRISPR-rader av intresse för vuxenlivet.
Obs: Detta antal kan ökas eller minskas beroende på frekvensen av könsceller överföring. - Utföra svans klipp av vuxen F1 fisken att identifiera förekomst av indels som beskrivs (steg 5.1 – 5.2). Som beskrivs (steg 4.5 – 4.11), utföra en HMA på svans klipp gDNA att avgöra om fisken bär en ditsatta (figur 7).
-
För fisk som innehåller ett heteroduplex band, förbereda DNA sekvensering analys.
- Utför PCR använder nya grundfärger för att förstärka en 300 – 600 bp PCR-produkten centrerad kring snittet webbplatsen.
- Använd ett PCR-rening kit att rensa upp DNA, och eluera i 30 µL. undersöka DNA på en agarosgel att säkerställa ett enda band är närvarande.
Obs: Vissa heteroduplex ränder kan vara närvarande på agarosgel och visas som en liten utstryk eller dubbla band precis ovanför PCR-produkten på den förväntade storleken.
- Om en till tre indels analyseras, sekvens PCR-produkterna använder Sanger sekvensering och bestämmer vilken sekvens av den ditsatta använder en bioinformatik verktyg49. Annars, bestämning av sekvensen av flera PCR-produkter använder NGS analys (se Tabell för material) är mer ekonomiskt.
- Avgöra om en förtida stop kodon har erhållits genom att analysera sekvensen med hjälp av ett verktyg för bioinformatik (se Tabell för material).
- Placera fisken som innehåller önskad mutant allel i en ny tank med lämpliga etiketter.
- Design PCR primers för specifika ditsatta alleles för framtida genotypning behov. Dessa primers bör span muterad sekvens och inte förstärka den wild-type-sekvensen.
- I-cross heterozygot zebrafiskar att generera en segregerande befolkning som innehåller 25% knock-out linjer.
Representative Results
De experimentella metoder som beskrivs i detta protokoll möjliggör effektiv, kostnadseffektiv produktion av zebrafisk knock-out linjer med CRISPR/Cas9-teknik. Följande siffror har inkluderats i denna artikel för att underlätta tolkningen och felsökning av de resultat som erhålls med hjälp av detta protokoll. Efter framgångsrik produktion och Mikroskop av CRISPR-reagenser, zebrafiskar embryon kan analyseras för uppenbara fenotyper och ditsatta bildandet använder HMA. En bra kontroll att visualisera framgången för CRISPR-experimentet är användningen av de sgRNA som beskrivs i steg 1,5 att rikta pigment-producerande genen tyrosinase. Cas9-inducerad ditsatta bildande på tyrosinase resulterar i förlust av pigmentering och görs enkelt genom 48 hpf (figur 1). En annan bra kontroll för att säkerställa att utarbetandet av CRISPR-reagenser för injektion har varit framgångsrik, är att verifiera att fullängds (120 nt) sgRNA har syntetiserats använder en denatureringen polyakrylamidgel (figur 2, Lane 1 och 2). Om RNA har försämrats kan det visas som ett utstryk, till exempel Lane 3 (figur 2) visar försämrad RNA som inte lämpar sig för injektion.
För att analysera ditsatta bildandet frekvensen av gener riktade av CRISPR-Cas9 som inte resulterar i uppenbara fenotyper såsom tyrosinase, är HMA analys en enkel och pålitlig metod. sgRNA/Cas9 injiceras embryon analyseras med HMA resultat i bildandet av heteroduplex band och minskning av intensiteten i homoduplex bandet (figur 4). Förekomsten av heteroduplex band utnyttjas ytterligare i detta protokoll för att identifiera potentiella grundare fisk från microinjected embryon och som vuxna (figur 4 och figur 5), att analysera en grundare ( könsceller överföring effektivitet Figur 6), och för att kontrollera förekomsten av en ditsatta i en heterozygota F1 fisk (figur 7). Den heterozygota fisk som innehåller en ditsatta är kandidater för NGS att identifiera vilken typ av ditsatta och avgöra om en förtida stop kodon är närvarande i regionen kodning av målgenen.
Figur 1 : Zebrafiskar embryon uppvisar en pigment defekt när injiceras med en sgRNA inriktning tyrosinase i en-cellstadie. (A) Wild-type, uninjected embryo på 48 hpf och (B) injiceras embryo på 48 hpf. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : In vitro transkription av sgRNA med syntes kit. Oligos var syntetiseras med in vitro- transkription enligt instruktionerna sgRNA syntes kit. 500 ng av RNA kördes på en urea/sida gel som beskrivs. sgRNA lastas i körfält 1 och 2 visar ett band som motsvarar den fulla längden, intakt 120 nt RNA. SgRNA i lane 3 visar en försämrad RNA-prov som inte är lämpligt för injektion.
Figur 3 : Jämförelse av 24 hpf injiceras embryon hälsa. Ett levande embryo (A) utvecklats till 24 hpf, är lätt skiljas från ett embryo som har avbrutits utveckling (B). Embryon som likna (B) eller har drastiskt förändrat funktioner till (A), såsom spinal krökning eller förändrat huvud och ögon utveckling bör tas bort från skålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Heteroduplex rörlighet haltbestämning av sgRNA-Cas9 microinjected zebrafiskar embryon. Pooler av 5 embryon per prov samlades vid 72 hpf och gDNA extraherades. Heteroduplex analysen utfördes enligt beskrivningen, prover lästes in lika med 500 ng DNA. Körfält: M = 100 bp markör; 1 = uninjected kontroll; 2 = injektion prov 1; 3 = injektion prov 2. Förväntat bandstorlek = 98 bp.
Figur 5 : Heteroduplex rörlighet haltbestämning av gDNA utvinns från svansen på en vuxen CRISPR-injiceras zebrafiskar. Embryon som injicerades med en sgRNA och Cas9 protein odlades till vuxen ålder (3 månader). Fisk B och C uppvisar heteroduplex band och var därefter föds upp för att identifiera könsceller överförs indels; fisken A användes inte i efterföljande analys eftersom det inte uppvisar ett positivt heteroduplex band. Körfält: 1 = vildtyp kontroll; 2 = fisk A; 3 = fisk B; 4 = fisk C. väntat bandstorlek = 98 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 : Heteroduplex rörlighet haltbestämning av enda embryon genereras genom avel en F0 CRISPR-injiceras zebrafiskar till en vildtyp fisk att identifiera könsceller överförs indels. Zebrafiskar parades, och F1 embryon odlas för 72 h. enda embryon insamlades och heteroduplex analys utförs enligt beskrivningen. Körfält: 1 = vildtyp kontroll; 2-10 = en enda F1 embryo per körfält. Denna gel visar att 7 av 10 embryon ett positivt heteroduplex band, som anger en könsceller överföringshastighet på 70% av ditsatta. Förväntat bandstorlek = 98 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : Heteroduplex rörlighet haltbestämning av vuxen F1 zebrafiskar svans klipp. Vuxen F1 fisk var gjorde av HMA att identifiera indels. Fisk som uppvisade en positiv heteroduplex bandet var PCR förstärks och inskickad för brett sekvensering analys att avgöra vilken typ av mutation. (A) körfält: 1 = vildtyp kontroll; 2 = fisk (4 bp borttagning, 1 bp mismatch). (B) dessa F1 fisk identifierades från samma grundare och ändå visa olika heteroduplex mönstring, vilket indikerar könsceller överföring av flera modifierade alleler från en enda grundare. Körfält: 1 = vildtyp kontroll; 2 = fisk B (4 bp införande, 7 bp mismatch), 3 = fisk C (4 bp radering, 4 bp mismatch). Var och en av dessa indels skapade en tidig stop kodon i kodande sekvens av målgenen, som bestäms av NGS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver produktionen av genen knockouts i systemet zebrafiskar ryggradsdjur modell med CRISPR-Cas9-teknik. Ett antal protokoll har tidigare beskrivits för att genomföra CRISPR-medierad genomet engineering i zebrafiskar15,25,26,50,51,52. Detta protokoll bygger på tidigare ansträngningar genom att kombinera ett antal enkla men reproducibly konsekvent experimentella tekniker, i synnerhet HMA och NGS av flera heterozygot fisk, att skapa ett enkelt, ekonomiskt, och experimentellt robust protokoll för CRISPR-medierad mutagenes i zebrafiskar som är lämplig för labs bemannas med personal med ett utbud av utbildning och erfarenhet, samt undervisning labs.
Rekommendationer för design och syntes av guide RNAs ingår i detta protokoll. En viktig hänsyn vid guide RNA design är minimering av off-target effekter. Flera prognos algoritmer har utvecklats för att ge CRISPR-användare åtkomst till uträkning verktyg med användarvänliga grafiska gränssnitt som förutspår både aktiviteten av guiden på målet och chansen att off-target effekter34, 35,36. En särskild fördel med zebrafiskar systemet är sänkta priser off-target effekter eftersom Cas9 injiceras i embryon och därför uttrycket är övergående, som i möss har visat sig resultera i minskad off-target effekter53. Off-target effekter har dock visats förekomma hos zebrafiskar54. Ett sätt att kontrollera för off-target effekter är att fenotyp grundare zebrafiskar som har genererats av två oberoende guide RNAs som riktar samma gen, som dessa guider skulle vara mycket sannolikt att påverka olika off-target platser. En alternativ metod att minimera off-target effekter som inte beskrivs i detta protokoll är användningen av en muterad Cas9 som genererar enda strand raster på mål-DNA, som repareras med hög verkningsgrad. Para ihop DNA nicks i närheten av varandra som kompletterar motsatsen strandar resulterar i effektiv ditsatta bildande på det önska locus och minimerar off-target effekter55,56.
Förutom att ha olika priser för off-target effekter, kan olika sgRNAs ha olika priser för mutagenicitet av önskat mål57,58,59. Detta protokoll använder HMA för att analysera effektiviteten av mutagenicitet av en viss sgRNA med hjälp av heteroduplex band bildande33,40. Heteroduplex band skapas av hybridisering av PCR-genererade DNA-strängar som innehåller avvikelser och kan lösas enkelt med gelelektrofores. Till skillnad från andra metoder som vanligen används för att mäta ditsatta bildande, såsom den T7 Amiiiiin assay eller högupplöst smält analys25,26, HMA kräver inte ett dyrt enzym att skära avvikande DNA, och kräver inte komplicerade analys av PCR smälta kurvor. Ännu viktigare, med HMA för att kontrollera höga andelen ditsatta formation i den injicerade befolkningen kan också utredaren att minimera antalet fiskar som behövs för tillverkning av knock-out linjer, vilket minskar kostnaden för att identifiera en mutation med den önskade egenskaper.
Den relativa lätthet generera CRISPR-baserade indels möjliggör skapandet av flera alleler av flera gener på en gång. Webbaserad programvara är tillgänglig för analys av enstaka mutationer från heterozygot fisk med Sanger sekvensering av PCR-produkter49. I fall där tre eller fler CRISPR-muterade alleler analyseras, är NGS att karakterisera arten av ditsatta sannolikt att vara mer kostnadseffektivt att karakterisera arten av ditsatta eftersom denna strategi tillåter en pool av upp till 50 olika alleler att präglas på o NCE (se Tabell för material)60,61,62. Sådana stordriftsfördelar skulle sannolikt vara särskilt användbart i en grundutbildningsprogram laboratoriemiljö.
Sammanfattningsvis, det här protokollet ger detaljerade anvisningar om reproducibly genererar hög kvalitet CRISPR-reagens (i synnerhet sgRNA) så att färre vuxna fiskar behöver skapas och analyseras för att framgångsrikt identifiera de muterade allelerna av intresse, som minskar också den tid och kostnad för att generera de önska linjerna. Allt har detta protokoll utformats så att den kan användas av laboratorier som har begränsade resurser att producera mutant zebrafiskar på ett prisvärt sätt. Dessutom har vi funnit att denna metod är lämplig för studenter och därmed utökar möjligheterna för utbildning av studenter som är intresserade av praktisk erfarenhet i CRISPR-baserade gen editering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R21CA182197 att J.O.), den Ralph W. och Grace M. Showalter forskning förtroende, och av Purdue jordbruksvetenskap och förlängning för ekonomisk utveckling (AgSEED) program. Sanger sekvensering data förvärvades av den Purdue Genomics Core facility stöds av P30 CA023168. Mary Witucki stöddes av Purdue University Center för Cancer forskning sommaren Undergraduate Research Program stöds av Carroll County Cancer Association. Finansiärerna hade ingen roll i den studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. Vi tackar Benjamin Carter, Ellen Denning och Taylor Sabato för kritiska återrapportering av manuskriptet. Vi tackar den institutionen för biokemi för stöd för detta arbete, och centrum för zebrafiskar forskning vid Purdue University för deras engagemang i den vård och omsorg av vår zebrafisk kolonin. Slutligen, vi tackar den Purdue Genomics Core Facility, och bidrag av Phillip San Miguel om NGS tjänsterna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
| Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
| ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
| Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
| Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
| Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
| Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
| Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
| 10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
| 6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
| 5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
| Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
| RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
| DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
| RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
| 40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
| SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
| MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
| Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
| Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| 30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
| MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
| 1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
| Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
| Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
- Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
- Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
- Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
- Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
- Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
- Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
- Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
- Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
- Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
- Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
- Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
- Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
- Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
- Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).
