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Cancer Research

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Abstract

Histone modifications constituent une composante majeure de l’épigénome et jouent un rôle réglementaire important dans la détermination de l’État transcriptionnel de loci associés. En outre, la présence de modifications spécifiques a été utilisée pour déterminer la position et l’identité non codantes des éléments fonctionnels comme améliorateurs. Ces dernières années, immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage de la génération suivant (ChIP-seq) est devenu un outil puissant pour déterminer les profils de génome des modifications des histones individuelles. Cependant, il est devenu plus en plus évident que les modèles combinatoires de modifications de la chromatine, appelées États de chromatine, déterminent l’identité et la nature du locus génomique associé. Par conséquent, les workflows consistant en des méthodologies (HT) haut débit robustes pour le profilage d’un certain nombre de marques de modification des histones, mais aussi des pipelines d’analyses informatiques capables de manipulation des myriades de ChIP-Seq profilage datasets, sont nécessaires pour détermination complète des États épigénomique en grand nombre d’échantillons. Le HT-ChIP-Seq workflow présenté ici se compose de deux modules : 1) un protocole expérimental pour le profilage de plusieurs modifications d’histone de petites quantités d’échantillons de tumeurs et de lignées cellulaires dans un format 96 puits ; et 2) un pipeline d’analyse de données informatiques qui combine des outils existants pour calculer les modèles d’état de la chromatine combinatoires et les occupation marque individuelle. Ensemble, ces deux modules de facilitent le traitement facile des centaines d’échantillons de ChIP-Seq de manière rapide et efficace. Le flux de travail présentée ici est utilisée pour dériver des modèles d’état de la chromatine de 6 profils de marque histone dans les tumeurs de mélanome et de lignées cellulaires. Dans l’ensemble, nous présentons un workflow de ChIP-seq complète qui peut être appliqué à des dizaines d’échantillons de tumeurs humaines et des lignées de cellules cancéreuses pour déterminer épigénomique aberrations dans diverses tumeurs malignes.

Introduction

La majorité des génomes de mammifères (98-99 %) est constituée de séquences non codantes, et ces régions nocoding contiennent des éléments régulateurs connus pour participer au contrôle de l’expression des gènes et la chromatine organisation1,2. Dans une cellule normale, l’assembly spécifique de l’ADN génomique dans la structure de la chromatine compactée est critique pour l’organisation spatiale, le règlement et le calendrier précis de divers processus liés à l’ADN3,4,5. Dans une cellule cancéreuse Toutefois, des modifications de la chromatine par des mécanismes épigénétiques aberrants peuvent conduire à une mauvaise organisation de la structure de la chromatine, notamment l’accès aux éléments de régulation, systèmes de bouclage chromosomiques et gene expression patterns6, 7,8,9,10.

Malgré des progrès récents, nous avons limité la compréhension des altérations épigénétiques qui sont associés à la progression tumorale ou de la réponse thérapeutique. L’épigénome consiste en un tableau des modifications, y compris les marques histone et la méthylation de l’ADN, qui composent un état dynamique (dénommé État de la chromatine) qui empiète sur les réseaux de l’expression génique et autres processus essentiels pour le maintien identité cellulaire. Récemment, altérations de rehausseurs ont été présentées dans plusieurs tumeurs malignes en étudiant H3K27Ac profils11. Bien que ces études permettent de mieux comprendre la corrélation entre les marques épigénétiques isolés, plus de 100 modifications épigénétiques ont été identifiés12,,13 , sans une compréhension claire de leurs rôles biologiques et interdépendance. En outre, il y a un nombre encore plus grand des modèles combinatoires possibles de ces histones et les modifications de l’ADN, et c’est ces modèles combinatoires - modifications non individuels - qui dictent les États épigénétiques14. Par conséquent, il y a un besoin énorme d’identifier les altérations dans ces États de la chromatine au cours de la progression du cancer ou des réponses à la thérapie. Connaissance approfondie de l’épigénome altérations dans les cancers a été en retard en partie en raison de la technique (par exemple la génération de données à grande échelle de petite quantité de cellules cliniques de matériel/single) et analytique (par exemple des algorithmes pour définir défis de combinatoire d’États). Par conséquent, il est besoin critique de Méthodes robustes de haut-débit pour profiler le grand nombre de marques modification histone de matériel clinique et easy-to-implement approches informatiques pour prédire la combinatoire qui facilitera détermination des États épigénétiques associé à différentes étapes de la tumorigenèse et de résistance thérapeutique. Données supplémentaires, de récentes épigénome profilage études15,16,17,18,19,20,21, 22,23 dans les tissus normaux et les lignées cellulaires peuvent être intégrées aux profils de la chromatine des tumeurs pour plus amples aperçus épigénome contribution à la biologie de la tumeur.

Profilage de la chromatine est devenu un puissant outil pour identifier les profils de liaison globale des divers chromatine modifications15,24. Ces dernières années, ChIP-seq est devenu le « gold standard » pour l’étude des interactions ADN-protéines sur une échelle mondiale25,26,27. Pour toute expérience de ChIP-seq, il y a des étapes critiques nécessaires à son succès, y compris la dissociation et le traitement de tissus, de constatation dans des conditions optimales sonication, déterminer la concentration en anticorps optimal pour les précipitations, préparation de la bibliothèque, traitement des données après séquençage et analyse en aval. Chacune de ces étapes contiennent des points de contrôle clés contrôle de la qualité et ensemble, sont indispensable pour bien identifier les cibles potentielles pour la validation fonctionnelle. Grâce à l’innovation dans ces étapes, plusieurs études antérieures ont élaboré des méthodes pour effectuer une puce ou un ChIP-Seq de petite quantité de tissus28,29,30,31,32 . De plus, certaines études ont suggéré des protocoles pour les expériences de puce haut débit suivies par PCR basée quantification33,34. Enfin, certaines plates-formes d’analyse disponibles publiquement pour ChIP-Seq données sont maintenant disponibles comme Easeq35 et36de la galaxie. Cependant, une plate-forme intégrée pour effectuer des ChIP-Seq dans un mode haut-débit en combinaison avec un pipeline calcul pour effectuer la marque unique ainsi que des analyses d’état de la chromatine a fait défaut.

Ce protocole décrit un workflow de ChIP-seq complète et global pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les tissus de la tumeur et de lignées cellulaires, avec facile à suivre les lignes directrices qui englobe toutes les étapes nécessaires pour une expérience réussie. En adoptant une méthode de haut débit, déjà décrite par Blecher-Gonen et al. 37, ce protocole peut être effectué sur des dizaines d’échantillons en parallèle et a été appliqué avec succès sur des lignées de cellules cancéreuses et tumeurs humaines telles que le mélanome, côlon, prostate et glioblastome multiforme. Nous démontrons la méthodologie pour six modifications d’histone de base qui représentent des composantes clés du paysage réglementaire épigénétique dans les lignées de cellules de mélanome humain et des échantillons de tumeur. Ces modifications incluent H3K27ac (exhausteurs), H3K4me1 (exhausteurs actives et posés), H3K4me3 (promoteurs), H3K79me2 (transcrit les régions), H3K27me3 (polycomb répression) et H3K9me3 (hétérochromatique répression). Ces marques utilisable seul ou en combinaison pour identifier des États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives.

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Protocol

Tous les échantillons cliniques ont été obtenues en suivant les directives de l’Institutional Review Board.

1. préparation de la mémoire tampon

  1. Faire 200 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM tétraacétique (EDTA) l’acide pH 8.0).
  2. Faire 200 mL de tampon STE (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
  3. Faire 200 mL de 2,0 M glycine (g 37,52 de glycine dans 200 mL d’eau) et chauffer à 65 ° C.
  4. Faire 200 mL de solution à 5 % sodium Désoxycholate (DOC) (10 g de DOC dans 200 mL d’eau).
  5. Faire 500 mL de tampon de récolte de puce (12 mM Tris-Cl, 0,1 x saline tamponnée au phosphate (PBS), 6 mM EDTA, 0,5 % dodécylsulfate de sodium (SDS)).
  6. Faire 500 mL de tampon de dilution de puce (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1 % DOC, 1 % Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Faire 500 mL de tampon de lavage RIPA (STE, 1 % Triton x-100, SDS 0,1 %, 0,1 % DOC).
  8. Faire 500 mL de tampon de lavage RIPA/500 (RIPA tampon + 360 mM NaCl).
  9. Faire 500 mL de tampon de lavage LiCL (TE, LiCl, 0,5 % de 250 mM NP-40, 0,5 % DOC).
  10. Faire 500 mL de tampon d’élution directe : pH 10 mM Tris-Cl 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, SDS de 0,5 %.
  11. Faire 50 mL de tampon de liaison/blocage des anticorps (PBS + 0,1 % de TWEEN-20 + 0,2 %, exempte d’IgG BSA).

2. tissus/cellules ligne traitement et réticulation

  1. Si le tissu est flash gelée, il dethaw sur la glace avant la dissociation.
  2. Dissocier les 50 mg de tissu (environ 8 mg par anticorps modification histone) manuellement dans 2 mL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Découper le tissu en morceaux de 3 à 4 mm pendant environ 5 min dans une boîte de Petri stérile tissu.
  3. Transférer le tissu et la HBSS solution dans un tube de dissociator et ajouter un autre 8 mL de HBSS. Plus dissocier le tissu à l’aide d’un dissociator jusqu'à homogénéisé.
  4. Pour les tumeurs de mélanome, placer les tubes dans un dissociator et exécuter ce qui suit des cycles chacun une fois dans cet ordre : h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 et m_heart_02.01.
  5. Gratter 21 × 106 cellules dans 10 mL de milieu (~ 3 × 106 par modification des histones et entrée ; il peut être abaissé à 100 000 cellules par marque pour les populations rares) cultivés dans un tissu standard plat et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL.
    Note : Le support utilisé pour la lignée de cellules de mélanome représentant WM115 est DMEM additionné de 10 % de sérum de veau fœtal et de 5 % la pénicilline/streptomycine.
  6. Crosslink les tissus/cellules en utilisant une concentration de 1 % de formaldéhyde final en ajoutant 200 µL de 16 % de formaldéhyde par 3 mL HBBS pour tissu (ou 3 mL de milieu pour les cellules). Agiter le mélange à 10 tr/min en utilisant un mélangeur pendant exactement 10 minutes à 37 ° C.
    ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé dans une hotte de laboratoire appropriées.
  7. Ajouter 200 µL de glycine de 2,0 M / 3 mL d’échantillon et continuer à trembler à 10 tr/min pendant 5 min à 37 ° C.
    NOTE : Glycine agit comme un piège. Font la solution de glycine frais chaque mois comme le pf pH que la solution tend au fil du temps.
  8. Faites tourner les échantillons à 934 x g pendant 5 min à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant, ajouter 5 mL de PBS froid glace, centrifuger les échantillons à nouveau à 934 x g et éliminer le surnageant.
  9. Flash gel le culot et conserver à-80 ° C pour un traitement ultérieur.

3. tissu lyse, Sonication et préparation d’anticorps

  1. Dissoudre 1 comprimé d’inhibiteur de protéase pour 10 mL de tampon de récolte de puce.
  2. Ajouter 300 µL de tampon de récolte de puce avec les inhibiteurs de la protéase par 50 mg de tissu et laisser 30 min de lyse sur la glace.
    NOTE : Ajouter 300 µL de tampon de récolte de puce avec les inhibiteurs de la protéase par 1 X 107 de lignées de cellules de mélanome WM115.
  3. Alors que les cellules sont ensuite, allumez le le bain d’eau disruptor et système de refroidissement associé et laisser la température atteindre 4 ° C. Placer les tubes de sonicateur dans le bain d’eau disruptor et ultrasons les tissus mélanome pendant des cycles de 60 à 30 s sur et 30 s pour obtenir des fragments de la chromatine de ~ 200-600 paires de bases (PB).
    NOTE : Temps de Sonication peut différer entre le type de tissu et doit être ajustée en conséquence. C’est une étape cruciale et doit être optimisée dans une expérience pilote avant de passer à l’immunoprécipitation.
  4. Au cours de la sonication, laver 20 µL de billes magnétiques de protéine G par anticorps par exemple trois fois avec 1000 µL de tampon de liaison/blocage (PBS + 0,1 % de TWEEN-20 + 0,2 % de BSA).
  5. Pour environ 8 mg de tissu de mélanome, incuber 3 µg de chaque anticorps histone dans 100 µL de liaison / bloquant un tampon pendant 2 h à 4 ° C avec rotation à l’aide d’un revolver de tube. 12 échantillons pour un anticorps du singulier contenant 240 µL de perles, 36 µg d’anticorps et 1200 µL de tampon de liaison/blocage.
    Remarque : Pour 3 × 106 cellules, utilisez 5 µg de chaque anticorps et 30 µL de billes magnétiques G de protéine par anticorps. Anticorps et perles de protéines-G devraient être réglées si différente quantité de tissu est utilisée. Ce protocole illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les modifications d’histone six décrit (Table des matières), cependant, les concentrations d’anticorps doivent être optimisées pour les autres modifications et les facteurs de transcription.
  6. Pour déterminer la taille du fragment, retirer 20 µL de solution de chromatine sonciated et ajouter un tampon d’élution, mélange principal (température ambiante) contenant 44 µL d’élution directe tampon, de 1 µL de RNase (20mg/mL) et 5 µL de protéinase K (20mg/mL) par échantillon. Incuber les échantillons dans un thermocycleur PCR pendant au moins 2 h à 50 ° C. Purifier l’échantillon à l’aide d’un kit de purification de PCR suivant les instructions du fabricant.
  7. S’assurer que la chromatine est suffisamment cisaillée en déterminant la taille de fragment à l’aide d’un instrument d’électrophorèse ADN haute sensibilité avant de passer à l’étape 3.6. Allumez l’appareil d’électrophorèse.
  8. Charger 2 µL de réactif de tampon haute sensibilité dans chaque puits d’une bande de tube optique 8 puits. Charger 2 µL de l’échelle de sensibilité élevée dans le premier bien et 2 µL d’échantillons purifiés dans les puits restants.
  9. Placer des bouchons de tube optique sur tube stips et vortex les échantillons à 2000 tr/mn pendant 1 min. ouvrir le couvercle et insérer une nouvelle bande d’écran de haute sensibilité et la boîte de chargement conseils. Retirer les couvercles de barrette et charger les échantillons en électrophorèse instrument.
  10. Ouvrez le logiciel d’analyse, mettre en évidence les treize premiers espaces sur le ruban de l’écran et appuyez sur l’onglet démarrer dans le coin inférieur droit. Des fragments de chromatine allant de ~ 200-1000 bp ne conviennent pas pour la puce.
  11. Transférer la solution aux ultrasons dans des tubes stériles et faire tourner les tubes à x 21 130 g à l’aide d’une centrifugeuse de table pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes.
  12. Déterminer le volume total du liquide surnageant et supprimer 10 % de la solution totale pour le contrôle des entrées et conserver à 4 ° C.

4. immunoprécipitation de la chromatine

  1. Dissoudre 2 comprimés d’inhibiteur de protéase par 20 mL de tampon de dilution de puce.
  2. Après sonication diluer l’échantillon restant 5 fois à l’aide de tampon de dilution de puce pour apporter les niveaux SDS à 0,1 %. Diluer 270 µL de liquide surnageant restant avec 1080 µL de tampon de dilution de puce pour obtenir un volume total de 1350 µL.
  3. Fin de l’incubation des billes magnétiques de l’anticorps et la protéine G, placer le tube sur un aimant et éliminer le surnageant.
  4. Avec le tube, toujours assis sur l’aimant, laver les billes une fois en ajoutant 750 µL de tampon de dilution de puce avec des inhibiteurs de protéase.
    Remarque : Il est important de ne pas déranger les perles ou faire pivoter les tubes au cours de cette étape.
  5. Retirer la puce tampon de dilution laver et remettre en suspension les perles dans 240 µL la même puce de tampon de dilution. Aliquote 20 µL de billes dans 12 tubes distincts, dont chacun est utilisé pour un échantillon de tissu distinct.
  6. Aliquote le matériau traité aux ultrasons uniformément aux billes de protéine G avec des anticorps spécifiques et linge en utilisant un revolver tube pendant la nuit à 4 ° C.

5. lavage et inverse de réticulation des Complexes de protéines et l’ADN immunoprécipitée

  1. Le lendemain matin après réticulation inverse, transvaser la solution de protéine-anticorps dans une plaque à 96 puits et placer sur le support magnétique. Permettre les perles d’adhérer au moins 30 s et enlever le surnageant.
  2. Laver les billes 5 fois avec 150 µL de tampon de lavage RIPA glacé à l’aide d’une pipette multi-canaux. Au cours des étapes de lavage, ne pas pipeter les perles, mais déplacer l’aimant sans cesse de droite à gauche pour 30 s / cycle de lavage.
  3. Laver les échantillons deux fois avec 150 µL de tampon de lavage glacé RIPA-500.
  4. Laver les échantillons deux fois avec 150 µL de tampon de lavage glacé LiCl.
  5. Laver les échantillons une fois avec 150 µL de tampon de lavage TE glacé et enlever tampon TE immédiatement. Cette étape peut être omise pour les applications d’entrée faibles.
  6. Ajouter contrôle des entrées de l’étape 3,7 dans frais puits de la plaque à 96 puits contenant les échantillons d’ADN de la puce.
  7. Après les étapes de lavage, ajouter un élution tampon mélange principal (température ambiante) contenant 44 µL de tampon d’élution directe, 1 µL de RNase (20mg/mL) et 5 µL de protéinase K (20mg/mL) par échantillon ChIP et entrée de réticulation inverse.
  8. Incuber les échantillons à l’aide d’un thermocycleur PCR pendant 4 h à 37 ° C, 4 h à 50 ° C et 8-16 h à 65 ° C.

6. la purification et la Quantification de l’ADN précipité

  1. Le lendemain matin, place les échantillons retour sur l’aimant et le surnageant de transfert à une nouvelle plaque PCR 96 puits qui contient l’immunoprécipitée ADN.
  2. Ajouter 2,3 x perles paramagnétiques à solution (115 µL pour 50 µL de solution) et soigneusement la pipette et descendre 25 fois en utilisant une pipette multicanaux. La solution va devenir homogène si bien mélangé.
  3. Incuber la solution à température ambiante au large de l’aimant pour min. 4 Place les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant encore 4 min. jeter le surnageant.
  4. Tout en laissant les échantillons sur l’aimant, ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % (vol/vol) et incuber à température ambiante pendant 30 s sans déranger les perles.
  5. Enlever l’éthanol et répéter le lavage. Permettre les billes paramagnétiques à l’air sec sur l’aimant pendant 5 min.
    Remarque : Retirez tout l’éthanol après le deuxième lavage comme l’éthanol restant n’interférera avec purification.
  6. Enlever les échantillons de l’aimant et ajouter 30 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mélanger en pipettant également 25 fois et incuber les échantillons à la température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  7. Replacez les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant un autre 4 min. transférer 20 µL de chaque échantillon d’une nouvelle plaque 96 puits, pour la préparation de la bibliothèque. Stocker le reste 10 µL de puce ADN en cas de problèmes potentiels avec la génération des bibliothèques.
  8. À ce stade, quantifier la puce ADN avant la préparation de la bibliothèque. La concentration d’ADN est mesurée avec les réactifs de l’ADN de haute sensibilité. Déterminer la granulométrie de l’ADN précipité à l’aide d’une procédure d’instrument haute sensibilité ADN électrophorégramme à étape 7.1.

7. Bibliothèque génération à l’aide de la trousse de préparation du bibliothèque d’ADN II Ultra NEBNext

  1. Générer des bibliothèques pour l’ordonnancement de la NGS en utilisant l’ADN bibliothèque préparation suivant le protocole recommandé par le fabricant. Toutes les réactions sont effectuées dans les plaques à 96 puits et des incubations sont effectuées dans un thermocycleur PCR avec la couvercle température réglée > 100 ° C et le volume réglé à 50 µL.
  2. Pour les index, Oligos Multiplex pour la plate-forme NGS sont utilisés. Effectuer un total de 10 x cycles d’amplification par PCR en utilisant les paramètres suivants : une dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, dénaturation à 98 ° C pendant 10 s, recuit/extension à 65 ° C pendant 30 s (10 x cycles), la dernière extension de 65 ° C pendant 5 min et maintenez à 4° C.
    NOTE : Le tableau 1 contient les amorces utilisées pour l’amplification par PCR.
  3. Après amplification par PCR, supprimer les échantillons et porter le volume total à 100 µL avec de l’eau exempte de nucléase. Effectuez sélection taille paramagnétique recto-verso (0.55x/0.8x) en premier ajout 55 µL de perles et de la composition de pipetage 25 fois. Incuber les échantillons à la température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  4. Replacez les échantillons sur un aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min. Cette étape permet de conserver les grands fragments sur les perles qui ne conviennent pas pour le séquençage.
  5. Transférer le liquide surnageant dans une nouvelle plaque PCR 96 puits. Ne pas jeter le surnageant car il contient l’ADN partiellement purifié.
  6. Ajouter un autre 25 µL de billes paramagnétiques et mélanger en pipettant également 25 fois et incuber à température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  7. Replacez les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min et éliminer le surnageant. Cette étape permet de conserver des fragments de ~ 200 à 600 bp qui sera utilisé pour finalisé des bibliothèques.
  8. Tout en laissant les échantillons sur l’aimant, ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % (v/v) et laisser incuber pendant 30 s sans déranger les perles (ne bouge pas alors que sur l’aimant). Enlever l’éthanol et répéter le lavage une seconde fois.
  9. Laisser que les billes paramagnétiques à air sec sur l’aimant pendant 5 min. Retirez éthanol tous après le deuxième lavage comme éthanol restant n’interférera avec purification.
  10. Enlever les échantillons de l’aimant et ajouter 25 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mélanger en pipettant également 25 fois et incuber à température ambiante au large de l’aimant pour min. 4 Place les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min.
  11. Bibliothèques à l’aide d’un instrument d’électrophorèse ADN haute sensibilité avant multiplexage pour assurer les tailles ne conviennent pas pour le séquençage de l’optométriste. Rempli de bibliothèques varient entre 200-600 bp et sont dépourvues de tous les dimères d’amorce.
    Remarque : Si nécessaire, un autre 0,7 x purification perle paramagnétique est exécutée pour supprimer les dimères d’amorce indésirables qui se trouvent à environ 130 bp.
  12. Piscine l’ADN quantifié issu des amorces d’index unique selon la concentration. Pour un bassin contenant six échantillons avec des concentrations comprises entre 1 ng/µL et 6ng/µL, la distribution est 15 µL de l’échantillon le plus bas et 2,5 µL de l’échantillon plus élevé. Ceci est fait pour assurer la lecture chefs d’accusation seront distribués uniformément sur chaque voie de la cellule de flux.

8. système de données du ChIP-seq de post-traitement

  1. Un pipeline basé sur snakemake38,39 est utilisé pour les étapes de processus de toutes les caractéristiques suivantes en une seule commande. Ce qui est important, chacune de ces étapes sont discutés individuellement avec les commandes associées.
  2. Déterminer la qualité des lectures de séquençage fastq brut à l’aide de FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) : Ouvrez terminal unix et changez de répertoire (cd) dans le dossier contenant les fichiers raw fastq pour chacune des six modifications histone. Dans le type de terminal unix, fastqc *fastq.gz et appuyez sur [retour]. Cela se déroulera les mesures de contrôle de qualité sur tous les fichiers fastq dans le dossier.
  3. Aligner les lectures de qualité contre le génome de référence et supprimer les doublons avant compression de fichiers de bam. Cette opération est effectuée à l’aide de noeud papillon version 1.1.239, SAMBLASTER version 0.1.2140et SAMTOOLS version 1.3.141: dans l’unix type de terminal, noeud papillon -m 1 - n 1--meilleur--strates -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Découvre -Sb - > histone1.bam, puis appuyez sur [retour].
    Remarque : path_to indique le dossier qui contient l’assembly de génome humain hg19. Cela changera selon l’organisme d’intérêt.
  4. Trier les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools Trier 2G histone1.bam -m-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted et appuyez sur [retour].
  5. Indexer les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai de l’index et appuyez sur [entrée].
  6. Déterminer les lectures unique mappés et non alignés à l’aide de SAMTOOLS flagstat avec la commande suivante : type de terminal unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam et appuyez sur [retour].
  7. Normaliser les fichiers bam par les chefs d’accusation lus en procédant à un échantillonnage aléatoire avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, sambamba Découvre bam -f-sous-échantillonnage-graine = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools Trier -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam et appuyez sur [retour].
  8. Indexer les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai de l’index et appuyez sur [entrée].
  9. Pour visualiser la ChIP-seq bibliothèques sur un navigateur de génome (i.e. UCSC ou IGV), générer des fichiers de bigwig utilisant deepTools version 2.4.040 en redimensionnant les fichiers bam de lectures par kilobases par million (RPKM). Cela peut être effectuée en utilisant les commandes suivantes :
    1. Pour les fichiers de bigwig standard : dans le type de terminal unix, bamCoverage -b histone1. downsample.Sorted.BAM--normalizeUsingRPKM binSize--30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw, puis appuyez sur RETURN].
    2. Pour l’entrée soustraite fichiers bigwig : dans le type de terminal unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--ratio soustraire binSize--30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW, puis appuyez sur [retour].
  10. Identifier l’enrichissement ChIP-seq signal sur fond de « Input » en utilisant l’analyse de modèle basé de ChIP-seq (Mac) version 1.4.225,26 et version 2.1.0. Utilisez macs1 pour facteurs de « point source » H3K4me3, H3K4me1 et H3K27ac et macs2 de facteurs « large source » H3K79me2, H3K27me3 et H3K9me3. Cette opération est effectuée en utilisant les commandes suivantes :
    1. Pour une Source ponctuelle : Dans le type terminal unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--keep-dup tous histone1.file - n et appuyez sur [retour].
    2. Pour large Source : Dans le type de terminal unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f 6-BAM -p 1e--large--large coupure 1e-6--keep-dup tous--nomodel histone1.file - n et appuyez sur [retour].
  11. Utilisation ChromHMM24 à identifier des profils de chromatine combinatoire État basé sur les modifications d’histone étudiées en utilisant les commandes suivantes :
    1. Dans le terminal unix, tapez cd/path_to/ChromHMM_folder et appuyez sur [entrée].
    2. Une fois dans le type de répertoire ChromHMM, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output et appuyez sur [entrée].
    3. Type, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 et appuyez sur [entrée].

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Representative Results

Ce protocole permet l’immunoprécipitation de tissus tumoraux congelés et des lignées de cellules qui peuvent être effectuées sur des dizaines d’échantillons en parallèle à l’aide d’une méthode de haut-débit (Figure 1 a). Des fragments de chromatine devraient se situer entre ~ 200-1000 bits/s pour l’immunoprécipitation optimale. Nous avons noté que le temps nécessaire pour atteindre la même longueur de cisaillement est différent pour différents tissus et types de cellules. Le succès d’une puce de petites quantités de tissu dépend gardant le lysat froid en permanence, en particulier au cours de la sonication. Purifiée ChIP-DN abattissent doser avant de procéder à la préparation (Figure 2 a) de la bibliothèque. Dûment remplis bibliothèques convenant au multiplexage et NGS devraient comprise entre ~ 200-600 bp et dépourvu de toute dimères d’amorce (Figure 2 b). Dès après le séquençage, il y a plusieurs mesures de contrôle de la qualité qui doivent être remplies avant de passer aux autres étapes du pipeline, comme les MACS pic-convocation ou analyse ChromHMM (Figure 3). Bon nombre de ces mesures peuvent être déterminées à l’aide de programmes tels que FastQC et MultiQC. Qualité fastq lectures sont alignés sur le génome humain à un taux d’environ 50 à 80 % avec un maximum d’une incompatibilité. Une profondeur de séquençage recommandée est 10 millions mappée unique lectures pour « ponctuels » facteurs et 20 millions uniquement mappées lectures pour « large source » facteurs27,41,42,43. Fichiers BAM classés et indexés sont utilisés pour générer les fichiers de gros bonnet qui peuvent être visualisées à l’aide d’un navigateur de génome comme IGV ou UCSC. Puce échantillons doivent être enrichis au fil de l’ADN d’entrée et chaque modification d’histone doit afficher un profil distinct, ce qui représente un composant spécifique du paysage épigénétique (Figure 4 a). Il est possible que dans certains tissus, il y aura des niveaux plus élevés de bruit de fond qui peut obscurcir le signal de ChIP-seq. Dans ce cas, il est recommandé de générer des fichiers d’entrée bigwig soustraites et re-visualiser sur un navigateur de génome. Pour déterminer les profils d’état de la chromatine, nous utilisons un algorithme de ChromHMM24. ChromHMM utilise un modèle de Markov caché multivarié pour identifier les plus éminents reproduisent combinatoires et les patrons de la chromatine spatiale basées sur des modifications d’histone étudiés (Figure 5). À l’aide de ces six modifications ChromHMM identifie des États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives, comme la répression polycomb (État 1), la répression hétérochromatique (État 5), transcription active (État 8 et 9) et exhausteurs de l’actifs (État 13 et 14). La sortie de ChromHMM inclut des fichiers segmentés lit pour chaque État qui de plus peut être utilisé pour l’analyse en aval.

Figure 1
Figure 1 : flux de travail pour module puce. Tissu tumoral biopsié est tout d’abord dissocié et réticulé pour capturer les interactions protéine-ADN. Le tissu est ensuite sonication pour obtenir des fragments de chromatine convenable pour l’immunoprécipitation et complexes ADN-histones sont précipités à l’aide de l’anticorps indiqués six. Échantillons sont lavés, liaisons transversales sont inversées et puce ADN est purifiée et quantifiée. Les bibliothèques sont générés à partir de l’ADN purifié et multiplexés selon index uniques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse électrophorégramme de ChIP-ADN purifié et préparation de bibliothèque remplie. (A) représentant électrophorégramme de purifiée chromatine contenant de l’ADN-ChIP des fragments bp ~ 200-600 qui convient à la préparation de la bibliothèque. (B) représentant électrophorégramme auprès d’une bibliothèque remplie après amplification et sélection de recto-verso paramagnétique taille qui convient pour le multiplexage et NGS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Flux de travail pour module informatique ChIP-seq. Flux de travail affichant les étapes essentielles pour le traitement des données ChIP-seq et préparation pour l’analyse en aval. Le pipeline utilisé dans le présent protocole a été généré à l’aide de snakemake, cependant, chacune de ces étapes peut également être effectuée individuellement comme décrit. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Affichage du génome de modification d’histone ChIP-seq titres. A) ChIP-seq pistes générées par deeptools affichant des régions actives et refoulées entourant le locus d’ARN dans un échantillon de tumeur représentatif de mélanome. Gènes tels que les ARN, CSDE1 sont SIKE1 sont associés à toutes les modifications d’histone actif (H3K27ac, H3K4me3 et H3K4me1) et de transcription active (H3K79me2), tandis que les gènes AMPD1, DENND2C et SYCP1 contiennent polycomb répressif marque H3K27me3 et pas d’accompagnement contenir de transcription active. B) chIP-seq pistes générées par deeptools affichant hétérochromatine prêt dans l’ensemble de gènes ZNF représentant échantillon de tumeur de mélanome. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : ChromHMM modèle basé sur des échantillons de tumeur mélanome. Profil d’émission d’une LearnModel de 15 États basé sur les six modifications d’histone étudié. ChromHMM identifie les États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives, comme répression polycomb (État 1), répression hétérochromatique (État 5), transcription active (État 8 et 9) et exhausteurs de l’actifs (religion13 et 14 ). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit un module complet et détaillé de ChIP-seq haut débit pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les lignées de cellules et tissus tumoraux humains. Dans n’importe quel protocole de ChIP-seq, une des étapes plus importantes est la spécificité de l’anticorps. Ici, cette méthode illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les décrit six modifications d’histone, qui sont de qualité ChIP et ont été déjà validés dans notre et d’autres laboratoires42,44,45 . Alors que les mêmes concentrations d’anticorps ont été appliquées avec succès à divers autres types de tumeurs, il est essentiel de déterminer la spécificité de l’anticorps si étudie différents facteurs d’intérêt27.

Un autre aspect clé pour une expérience réussie inclut l’optimisation des conditions de la sonication. Temps de sonication peut varier tant entre l’échantillon et tissu type et doit être adaptée en conséquence. Pour une optimisation adéquate, un essai est effectué pour chaque échantillon en augmentant progressivement le temps de sonication et en vérifiant en permanence taille du fragment. Pour la première puce-expérience des fragments de chromatine devraient se situer entre bp ~ 200-1000 pour l’immunoprécipitation optimale, et ChIP-ADN purifié doit être quantifiée avant de procéder à la préparation de la bibliothèque. Cette taille de fragment assure la génération optimale et la conservation de l’ADN amplifié (~ 200 à 600 bp) qui seront utilisés pour le multiplexage et NGS. Si vous effectuez ces expériences d’une manière de haut-débit, un bon point de départ pour le multiplexage est de mutualiser ~ 8 échantillons par voie pour le séquençage. Tandis que cette quantité d’échantillons peut produire une profondeur peu profond séquencement, il est utile pour tester la qualité des anticorps avant de procéder. D'entre les goulets d’étranglement du regroupement de plusieurs échantillons est inégale couverture post séquençage. Généralement une méthode de fluoremetric base quantification est utilisée, cependant, beaucoup-a-temps il n’est pas équivalent à des molécules de séquençage-prêt dans chaque bibliothèque. La meilleure méthode pour le dosage de l’ADN de la bibliothèque est d’utiliser qPCR utilisant des normes fait-de pré-déterminé séquençage prête des molécules d’ADN.

Une autre étape critique dans l’analyse de dataset ChIP-Seq est séquençage après traitement des données. Ce qui est important, avant de passer à n’importe quel aspect de l’analyse en aval, il y a diverses métriques de contrôle de la qualité qu’il semble tout d’abord. Des programmes tels que FastQC seront fournissent des informations concernant la qualité des lectures de séquençage fastq brut sous forme de pass ou échouer le test. Tandis que les lectures de fastq doivent passer la plupart des mesures, essais les plus importants parmi les statistiques de base, par la qualité de base de séquence, par des scores de qualité de séquence et de la Contamination de l’adaptateur. FastQC-traité de lectures sont alignés sur le génome humain et doivent être mappé à un taux d’environ 50 à 80 % avec un maximum d’une incompatibilité. Taux inférieur à 50 % peut indiquer des problèmes dans la puce, préparation de la bibliothèque ou le séquençage et peut inclure la contamination, basse qualité puce ADN ou amplification excessive pendant l’ACP. Lors de la conversion de SAM aux fichiers BAM, lectures en double doivent d’abord être signalés et puis ensuite enlevés à l’aide de SAMBLASTER avant d’aller en bas d’échantillonnage. Certain degré de duplication est normale pendant l’ACP, des niveaux élevés de duplication sont généralement indicatifs de faible qualité puce ADN, ou peut-être un problème avec la préparation de la bibliothèque. Les sorties de FastQC, noeud papillon et samblaster (réunis en flagstat) peuvent être canalisés dans MultiQC qui fournit un résumé complet et interactif de tous les résultats du contrôle de la qualité. MultiQC affiche les mesures de contrôle de la qualité dans les fichiers de sortie de fastqc, noeud papillon et samblaster fournissant des informations concernant les statistiques de base, des pourcentages de l’alignement et taux de duplication de PCR respectivement.

Après normalisation de sous-échantillonnage, l’étape suivante et probablement la plus importante, visualisation de données utilise un navigateur génome comme IGV ou UCSC. Chaque modification d’histone représente une composante clé du paysage réglementaire épigénétique, y compris H3K27ac (exhausteurs), H3K4me1 (exhausteurs actives et posés), H3K4me3 (promoteurs), H3K79me2 (transcrit les régions), H3K27me3 (polycomb répression), et H3K9me3 (hétérochromatique répression). En utilisant ces marques seul ou en combinaison, ces histones peuvent identifier exhausteurs actives, prêts ou refoulés et promoteurs, ainsi que l’État transcriptionnel de régions codantes. Cela a été démontré à l’aide de ChromHMM, dans lequel les États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives ont été identifiés. Ces États ont été définis par les marques du singulier, comme la répression polycomb (H3K27me3), la répression de l’hetrochromatic (H3K9me3) et transcription active (H3K79me2), ainsi que des marques combinatoires, comme exhausteurs actives (H3K4me1 et H3K27ac) et transcrit rehausseurs (H3K4me1, H3K27ac et H3K79me2).

La plate-forme intégrée présentée est bien adaptée pour la détermination de l’occupation des histones ou de facteurs de transcription des échantillons de tissus. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour la détermination de l’occupation des six points susmentionnés des échantillons de biopsie-taille mélanome. Cependant, nous n’avons pas encore déterminé le montant le plus bas des tissus requis pour des applications de ChIP-Seq réussies parce que c’est depenedent sur le type de tissu, mais aussi les anticorps disponibles. En outre, bien que nous utilisons couramment ce protocole sur fresh, flash congelés et les OCT congelés échantillons, nous n’avons pas optimisé ce protocole pour tissus FFIP. Des études récentes ont rapporté des protocoles pour ces tissus46,47 et les changements proposés peuvent être incorporés dans le cadre de cette plateforme pour tester si la plate-forme présentée sera utile de tissus FFIP. Nous croyons que ce sera très utile dans la détermination des motifs d’État la chromatine du matériel clinique provenant de patients dans des essais cliniques. Dans l’ensemble, ce protocole décrit un module de ChIP-seq complète et global pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les tissus de tumeurs humaines, avec facile de suivre les instructions qui englobe tous les composants nécessaires pour une expérience réussie.

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Disclosures

Auteurs ne déclarent aucun conflit.

Acknowledgments

Nous remercions Marcus Coyle, Curtis Gumbs, noyau SMF au MDACC pour le soutien de séquençage. Le travail décrit dans cet article a été soutenu par des subventions de la subvention du NIH (CA016672) à base de SMF et NCI récompenses (1K99CA160578 et R00CA160578) K. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

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Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur
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