Summary
Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.
Abstract
Modificazioni istoniche costituiscono una componente importante dell'epigenoma e svolgono un ruolo importante regolamentazione nella determinazione dello stato trascrizionale di loci associati. Inoltre, la presenza di modifiche specifiche è stata utilizzata per determinare la posizione e l'identità non codificanti elementi funzionali come rinforzatori. Negli ultimi anni, immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è diventato un potente strumento nel determinare i profili di genoma di modificazioni istoniche individuali. Tuttavia, è diventato sempre più chiaro che i modelli combinatoriali delle modificazioni della cromatina, denominati Stati della cromatina, determinano l'identità e la natura del locus genomico associato. Pertanto, i flussi di lavoro costituito da metodologie di (HT) robusti ad alta produttività per l'analisi di un numero di segni di modifiche dell'istone, nonché condotte analisi computazionali capaci di gestire miriadi di ChIP-Seq profilatura DataSet, sono necessari per completa determinazione degli Stati di epigenomic in gran numero di campioni. Il HT-ChIP-Seq flusso di lavoro qui presentato è costituito da due moduli: 1) un protocollo sperimentale per la profilatura diverse modificazioni istoniche da piccole quantità di campioni tumorali e linee cellulari in un formato a 96 pozzetti; e 2) una pipeline di analisi computazionale dati che combina gli strumenti esistenti per calcolare sia marchio individuale occupazione e modelli di stato della cromatina combinatoria. Insieme, questi due moduli facilitano facile elaborazione di centinaia di campioni di ChIP-Seq in maniera veloce ed efficiente. Il flusso di lavoro qui presentato è utilizzato per derivare modelli di stato della cromatina da 6 profili di contrassegno dell'istone in linee cellulari e tumori del melanoma. Nel complesso, vi presentiamo un flusso di lavoro completo di ChIP-seq che possa essere applicato a decine di campioni tumorali umani e linee cellulari di cancro per determinare aberrazioni epigenomic in varie malignità.
Introduction
La maggior parte del genoma di mammiferi (98-99%) è costituita di sequenza non codificante, e queste regioni nocoding contengono elementi regolatori noti per partecipare nel controllare l'espressione genica e della cromatina organizzazione1,2. In una cellula normale, l'assembly specifico del DNA genomico in struttura della cromatina compattato è critica per l'organizzazione spaziale, regolamento e tempi precisi di vari processi DNA-collegato3,4,5. In una cellula tumorale tuttavia, modificazioni della cromatina di meccanismi epigenetici aberranti possono portare alla errata organizzazione della struttura della cromatina, compreso l'accesso a elementi regolatori, sistemi di loop cromosomiche e gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Nonostante i recenti progressi, abbiamo limitato comprensione delle alterazioni epigenetiche che sono associati con la progressione del tumore o risposta terapeutica. L'epigenoma è costituito da una matrice di modifiche, tra cui marchi dell'istone e metilazione del DNA, che collettivamente formano uno stato dinamico (denominato stato di cromatina) che incide su reti di espressione genica e altri processi critici per il mantenimento identità cellulare. Recentemente, le alterazioni in esaltatori sono state indicate in malignità multiple studiando H3K27Ac profili11. Sebbene tali studi consentono di comprendere la correlazione dei marchi epigenetici isolati, più di 100 modificazioni epigenetiche sono stati identificati12,13 senza chiara comprensione dei loro ruoli biologici e interdipendenza. Inoltre, ci sono un numero ancora maggiore di modelli possibili combinatoriale di questi istoni e modificazioni del DNA, e non questi modelli combinatoriali - modifiche non individuali - che dettano epigenetici stati14. Quindi, c'è urgente bisogno di identificare le alterazioni in questi stati di cromatina durante la progressione del cancro o le risposte alla terapia. Conoscenza completa dell'epigenoma alterazioni nei cancri ha stato in ritardo in parte a causa di tecniche (ad esempio la generazione di dati su larga scala da piccole quantità di cliniche materiale/singole cellule) e analitiche (ad es. algoritmi per definire sfide di combinatoria Stati). Di conseguenza, c'è esigenza critica di metodi robusti ad alta produttività per la profilatura di gran numero di segni di modifiche dell'istone da materiale clinico e facile da implementare approcci computazionali per predire i modelli combinatoriale che faciliterà determinazione degli Stati epigenetici associato a diversi stadi di tumorigenesis e resistenza terapeutica. Ulteriori, dati disponibili dal recente epigenome profilatura studi15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in tessuti normali e linee cellulari può essere integrata con i profili di cromatina dei tumori per ulteriori approfondimenti su epigenome contributo alla biologia del tumore.
Profilatura di cromatina è diventato un potente strumento per identificare i modelli di associazione globale di vari cromatina modifiche15,24. Negli ultimi anni, ChIP-seq è diventato il "gold standard" per lo studio delle interazioni DNA-proteina su una scala globale25,26,27. Per ogni esperimento ChIP-seq, ci sono passaggi critici necessari per il suo successo, tra cui la dissociazione e la lavorazione del tessuto, determinare condizioni ottimale sonicazione, determinare la concentrazione di anticorpi ottimale per precipitazione, preparazione di biblioteca, Post-sequenziamento di elaborazione dei dati e dell'analisi a valle. Ognuno di questi passaggi contengono i punti di controllo chiave di controllo di qualità e quando presi insieme, sono cruciale per l'identificazione di potenziali bersagli per validazione funzionale correttamente. Attraverso l'innovazione in questi passaggi, parecchi studi precedenti hanno sviluppato metodologie per eseguire ChIP o ChIP-Seq da piccole quantità di tessuti28,29,30,31,32 . Inoltre, alcuni studi hanno suggerito protocolli per esperimenti di ChIP di alto-rendimento seguiti da PCR basati quantificazione33,34. Infine, alcune piattaforme di analisi disponibili pubblicamente per ChIP-Seq dati sono ora disponibili come Easeq35 e36di Galaxy. Tuttavia, è mancata una piattaforma integrata per l'esecuzione di ChIP-Seq in una moda di alto-rendimento in combinazione con una pipeline di calcolo per eseguire singolo marchio, come pure analisi dello stato della cromatina.
Questo protocollo descrive un workflow di ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in tessuti tumorali e linee cellulari, con facile seguire le linee guida che comprende tutti i passaggi necessari per un esperimento riuscito. Adottando un metodo di alto-rendimento precedentemente descritto da Blecher-Gonen et al. 37, questo protocollo può essere eseguito su decine di campioni in parallelo ed è stato applicato con successo su linee cellulari del cancro e tumori umani quali il melanoma, colon, prostata e glioblastoma multiforme. Dimostriamo la metodologia per sei modifiche dell'istone di nucleo che rappresentano componenti chiave del panorama normativo epigenetico in linee cellulari di melanoma umano e campioni di tumore. Queste modifiche includono H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione) e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Questi segni utilizzabile da solo o in combinazione per identificare stati di cromatina funzionalmente distinte che rappresentano i domini sia repressivi e attivi.
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Protocol
Tutti i campioni clinici sono stati ottenuti seguendo le linee guida di Institutional Review Board.
1. preparazione buffer
- Fare 200 mL di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido pH 8.0).
- Fare 200 mL di buffer di STE (10 mM Tris-HCl, 10mm EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
- Fare 200 mL di 2.0 M glicina (37,52 g di glicina in 200 mL di acqua) e riscaldare fino a 65 ° C.
- Fare 200 mL di soluzione di 5% sodio desossicolato (DOC) (10 g di DOC in 200 mL di acqua).
- Fare 500 mL di buffer di ChIP raccolto (12 mM Tris-Cl, 0,1 x tampone fosfato salino (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% sodio dodecil solfato (SDS)).
- Fare 500 mL di tampone di diluizione dei ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0.1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
- Fare 500 mL di tampone di lavaggio RIPA (STE, 1% Triton x-100, 0.1% SDS, 0,1% DOC).
- Fare 500 mL di tampone di lavaggio RIPA/500 (RIPA buffer + 360 mM NaCl).
- Fare 500 mL di tampone di lavaggio LiCL (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
- Fare 500 mL di tampone di eluizione diretta: 10 mM Tris-Cl a pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
- Portare a 50 mL di anticorpo associazione/Blocking buffer (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% privo di IgG BSA).
2. tessuti/cellule Line Processing e cross-linking
- Se il tessuto è flash congelati, si dethaw il ghiaccio prima della dissociazione.
- Dissociare 50 mg del tessuto (~ 8 mg / anticorpo modifiche dell'istone) manualmente in 2 mL di Hanks' bilanciato sale soluzione (HBSS) utilizzando una lama di rasoio sterile. Tritare il tessuto in pezzi di 3-4 mm per circa 5 min in un piatto di sterili per coltura.
- Trasferire la soluzione HBSS e tessuto in una provetta di dissociatore e aggiungere un altro 8 mL di HBSS. Ulteriori dissociare il tessuto utilizzando un dissociatore finché non omogeneizzato.
- Per i tumori del melanoma, posizionare i tubi in un dissociatore ed eseguire i seguenti cicli ciascuno una sola volta in questo ordine: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 e m_heart_02.01.
- Ruspe 21 × 106 cellule in 10 mL di terreno (~ 3 × 106 modifica dell'istone e ingresso; può essere abbassata a 100.000 cellule per marchio per popolazioni rare) in una coltura di tessuto standard piatto e raccoglierli in una provetta conica da 15 mL.
Nota: Il supporto utilizzato per la linea cellulare di melanoma rappresentante WM115 è DMEM completati con 10% siero bovino fetale e 5% penicillina/streptomicina. - Crosslink del tessuto/cellule usando una concentrazione di 1% di formaldeide finale con l'aggiunta di 200 µ l di formaldeide del 16% per 3 mL HBBS per tessuto (o 3 mL di terreno per le cellule). Agitare la miscela a 10 giri utilizzando un mixer per esattamente 10 min a 37 ° C.
Attenzione: Formaldeide è tossica e deve essere gestita in un'appropriata cappa. - Aggiungere 200 µ l di 2.0 M glicina per 3 mL di campione e continuare ad agitare a 10 giri per un altro 5 min a 37 ° C.
Nota: Glicina agisce come un quencher. Fanno fresco glicina soluzione ogni mese come il pf di pH che la soluzione tende nel tempo. - Girare i campioni a 934 x g per 5 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da banco. Eliminare il surnatante, aggiungere 5 mL di PBS freddo ghiaccio, centrifugare i campioni nuovamente a 934 x g e rimuovere il surnatante.
- Flash il pellet di congelare e conservare a-80 ° C per un'ulteriore elaborazione.
3. tessuto Lisi, sonicazione e preparazione di anticorpo
- Sciogliere 1 compressa di inibitore della proteasi per 10 mL di buffer di raccolto di ChIP.
- Aggiungere 300 µ l di tampone di raccolta di ChIP con inibitori della proteasi per 50 mg di tessuto e 30 min di lisi su ghiaccio.
Nota: Aggiungere 300 µ l di tampone di raccolta ChIP con inibitori delle proteasi a 1 X 107 di linee cellulari di melanoma WM115. - Mentre le cellule sono Lisi, accendere l'il bagnomaria disruptor e relativo sistema di raffreddamento e consentire temperatura di 4 ° c. Posizionare i tubi sonicatore in bagnomaria disruptor e Sonicare i tessuti del melanoma per 60 cicli a 30 s s on e 30 off per ottenere frammenti di cromatina di ~ 200-600 paia di basi (bp).
Nota: Tempo di sonicazione può differire tra tipo di tessuto e deve essere regolata di conseguenza. Questo è un passaggio fondamentale e dovrebbe essere ottimizzato in esperimento pilota prima di procedere all'immunoprecipitazione. - Durante la sonicazione, lavare 20 µ l di biglie magnetiche di proteina G a anticorpo per campione tre volte utilizzando 1000 µ l di tampone di associazione/blocco (PBS + 0,1% di TWEEN-20 + 0.2% BSA).
- ~ 8 mg di tessuto del melanoma, Incubare 3 µ g di ogni anticorpo istone in 100 µ l di binding / blocking buffer per 2 ore a 4 ° C con rotazione utilizzando un revolver di tubo. 12 campioni per un anticorpo singolare contengono 240 µ l di perline, 36 µ g di anticorpo e 1200 µ l di tampone di associazione/blocco.
Nota: Per 3 × 106 celle, utilizzare 5 µ g di ogni anticorpo e 30 µ l di biglie magnetiche G di proteine per l'anticorpo. Dell'anticorpo e della proteina-G perle dovrebbero essere titolati se viene utilizzato diverse quantità di tessuto. Questo protocollo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per il descritto sei modifiche dell'istone (Tabella materiali), tuttavia, le concentrazioni nell'anticorpo deve essere ottimizzati per altre modifiche e fattori di trascrizione. - Per determinare la dimensione del frammento, rimuovere 20 µ l di soluzione di sonciated della cromatina e aggiungere un tampone di eluizione del buffer mix master (temperatura ambiente) contenente 44 µ l di eluizione diretta, 1 µ l di RNAsi (20mg/mL) e 5 µ l di proteinasi K (20mg/mL) per campione. Incubare i campioni in un termociclatore PCR per almeno 2 ore a 50 ° C. Purificare il campione utilizzando un kit di purificazione di PCR seguendo le istruzioni del produttore.
- Garantire la cromatina è sufficientemente tosata determinando la dimensione del frammento utilizzando uno strumento di elettroferogramma di DNA ad alta sensibilità prima di procedere al punto 3.6. Accendere lo strumento di elettroferogramma.
- Caricare 2 µ l di reagente tampone ad alta sensibilità in ciascun pozzetto di una striscia di tubo ottico 8 pozzetti. Caricare 2 µ l di alta sensibilità ladder nel primo bene e 2 µ l di campioni purificati in pozzetti rimanenti.
- Tappi tubo ottico su tubo stips e vortice i campioni a 2000 rpm per 1 min. Aprire il coperchio e inserire un nuovo nastro di schermo ad alta sensibilità e la scatola di punte di carico. Rimuovere i tappi di striscia e caricare i campioni in strumento di elettroferogramma.
- Aprire il software di analisi, evidenziare i primi tredici spazi sul nastro schermo e premere la linguetta di Start in basso a destra. Frammenti di cromatina che variano tra ~ 200-1000 bp sono adatti per il ChIP.
- Trasferire la soluzione lisati mediante in provette sterili e girare i tubi a 21.130 x g usando una centrifuga di piano d'appoggio per 15 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in nuove provette.
- Determinare il volume complessivo del surnatante e rimuovere il 10% della soluzione totale per il controllo di Input e conservare a 4 ° C.
4. immunoprecipitazione della cromatina
- Sciogliere 2 compresse di inibitore della proteasi per 20 mL di tampone di diluizione dei ChIP.
- Dopo sonicazione diluire il campione rimanente 5 volte con tampone di diluizione dei ChIP per portare i livelli di SDS fino a 0,1%. Diluire 270 µ l del surnatante rimanenti con 1080 µ l di tampone di diluizione dei ChIP per ottenere un volume finale totale di 1350 µ l.
- Al termine l'incubazione dell'anticorpo e della proteina G perle magnetiche, posizionare il tubo su un magnete e rimuovere il surnatante.
- Con il tubo ancora seduto sul magnete, lavare le perle di una volta con l'aggiunta di 750 µ l di tampone di diluizione di ChIP con inibitori delle proteasi.
Nota: È importante non disturbare i branelli o ruotare i tubi durante questo passaggio. - Rimuovere il ChIP tampone di diluizione lavare e risospendere le sfere in 240 µ l del tampone di diluizione ChIP stesso. Aliquota 20 µ l di perline in 12 tubi separati, ciascuno dei quali è utilizzato per un campione di tessuto separato.
- Aliquota del lisati mediante materiale uniformemente ai branelli di proteine G con anticorpo specifico e asciugatrice usando un revolver del tubo durante la notte a 4 ° C.
5. lavaggio e inversa reticolazione dei complessi della DNA-proteina di Immunoprecipitated
- La mattina successiva dopo reticolazione inversa, trasferire la soluzione di anticorpo-proteina in una piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul supporto magnetico. Consentire le perline di aderire per almeno 30 s e rimuovere il surnatante.
- Lavare le perle 5 volte con 150 µ l di tampone di lavaggio RIPA ghiacciato usando una pipetta multicanale. Durante le fasi di lavaggio, non pipettare le perline, ma spostare il magnete continuamente da destra a sinistra per 30 s a lavaggio.
- Lavare i campioni due volte con 150 µ l di tampone di lavaggio di RIPA-500 ghiacciato.
- Lavare i campioni due volte con 150 µ l di tampone di lavaggio LiCl ghiacciato.
- Lavare i campioni una volta con 150 µ l di tampone di lavaggio TE ghiacciato e rimuovere immediatamente il buffer di TE. Questo passaggio può essere omesso per applicazioni a bassa inpue.
- Aggiungere il controllo di Input dal passaggio 3,7 in freschi pozzetti della piastra 96 pozzetti contenenti i campioni di DNA ChIP.
- Dopo i passaggi di lavaggio, aggiungere un mix master buffer eluizione (temperatura ambiente) contenente 44 µ l di tampone di eluizione diretta, 1 µ l di RNAsi (20mg/mL) e 5 µ l di proteinasi K (20mg/mL) per campione di ChIP e Input per reticolazione inversa.
- Incubare i campioni utilizzando un termociclatore PCR per 4 h a 37 ° C, 4 h a 50 ° C e 8-16 h a 65 ° C.
6. purificazione e quantificazione del DNA precipitato
- La mattina successiva, posto i campioni indietro sul magnete e il surnatante di trasferimento ad una nuova piastra PCR a 96 pozzetti che contiene il DNA immunoprecipitato.
- Aggiungere 2.3 x perline paramagnetici soluzione (115 µ l 50 µ l di soluzione) e attentamente dispensare su e giù per 25 volte usando una pipetta multicanale. La soluzione diventerà omogenea se mescolato correttamente.
- Incubare la soluzione a temperatura ambiente fuori il magnete per un minimo di 4 posto i campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min scartare il surnatante.
- Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% (vol/vol) e incubare a temperatura ambiente per 30 s senza disturbare le perline.
- Rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio. Lasciare asciugare le perline paramagnetiche per aria sul magnete per 5 min.
Nota: Rimuovere tutti l'etanolo dopo il secondo lavaggio in etanolo rimanente interferirà con la purificazione. - Rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 30 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare i campioni a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
- Riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min di trasferimento di 20 µ l di ogni campione una nuova piastra 96 pozzetti per la preparazione di biblioteca. Conservare il restante 10 µ l di DNA ChIP in caso di eventuali problemi con generazione delle librerie.
- In questa fase, è necessario quantificare ChIP DNA prima della preparazione di biblioteca. La concentrazione di DNA viene misurata con i reagenti di DNA ad alta sensibilità. Determinare la distribuzione delle dimensioni del precipitato DNA mediante un procedimento di strumento ad alta sensibilità del DNA elettroferogramma al punto 7.1.
7. Biblioteca generazione utilizzando il Kit di preparazione NEBNext libreria di DNA II Ultra
- Generazione di librerie per il sequenziamento NGS utilizzando DNA libreria preparazione seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Tutte le reazioni avvengono in piastre da 96 pozzetti e le incubazioni vengono eseguite in un termociclatore PCR con il set di temperatura coperchio > 100 ° C e il volume impostato a 50 µ l.
- Per gli indici, vengono utilizzati i Oligos Multiplex per piattaforma NGS. Eseguire un totale di 10 cicli di x per l'amplificazione di PCR utilizzando le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s, denaturazione a 98 ° C per 10 s, ricottura/estensione a 65 ° C per 30 s (10 x cicli), estensione finale 65 ° C per 5 min e permanenza a 4° C.
Nota: La tabella 1 contiene i primers utilizzati per l'amplificazione di PCR. - Dopo l'amplificazione di PCR, rimuovere i campioni e portare il volume totale a 100 µ l utilizzando acqua priva di nucleasi. Selezione dimensione paramagnetico bifacciale (0.55x/0.8x) per eseguire primo 55 µ l aggiunta di perline e Miscelare pipettando 25 volte. Incubare i campioni a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
- Posizionare i campioni indietro su un magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min. Questo passaggio è utilizzato per mantenere grandi frammenti sulle perle che non sono adatti per il sequenziamento.
- Trasferire il surnatante in una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Non gettare il surnatante come questo contiene DNA parzialmente purificato.
- Aggiungere un altro 25 µ l di perline paramagnetici e Miscelare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente fuori il magnete per 4 min.
- I campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min e scartare il surnatante. Questo passaggio consente di conservare frammenti di ~ 200 a 600 finalizzato bp che verrà utilizzato per le librerie.
- Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% (v/v) e lasciare Incubare per 30 s senza disturbare le perle (non si muovono mentre sul magnete). Rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio una seconda volta.
- Consentire che le perline paramagnetiche per aria secca sul magnete per 5 min, eliminare l'etanolo tutti dopo il secondo lavaggio come etanolo rimanente interferirà con la purificazione.
- Rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 25 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente fuori il magnete per un minimo di 4 posto i campioni indietro sul magnete e incubare a temperatura ambiente per un altro 4 min.
- Quantificare le librerie utilizzando uno strumento di elettroferogramma di DNA ad alta sensibilità prima multiplexing per garantire dimensioni sono adatti per il sequenziamento. Completate le librerie variano fra 200-600 bp e sono privi di tutti i dimeri dell'iniettore.
Nota: Se necessario, un altro 0,7 x purificazione perlina paramagnetico viene eseguito per rimuovere indesiderati dimeri presenti a ~ 130 bp. - Piscina il DNA quantificato basato su primer indice univoco secondo la concentrazione. Per una piscina contenente sei campioni con concentrazioni tra 1 ng / µ l e 6ng / µ l, la distribuzione è 15 µ l del campione più basso e 2,5 µ l del campione più alto. Questo viene fatto per garantire la lettura conteggi verranno distribuiti uniformemente su ogni corsia di cella di flusso.
8. elaborazione dati ChIP-seq
- Una pipeline sulla base di38, snakemake39 viene utilizzata per processo di tutti i seguenti passaggi in un unico comando. Cosa importante, ognuno di questi passaggi sono discussi singolarmente con comandi associati.
- Determinare la qualità di fastq crudo sequenziamento letture utilizzando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): aprire terminale unix e cambiare directory (cd) nella cartella contenente i file fastq crudo per ognuna delle sei modifiche dell'istone. Il tipo di terminale unix, fastqc *fastq.gz e premere [Invio]. Questo verrà eseguito il controllo qualità metriche su tutti i file fastq nella cartella.
- Allineare le letture di qualità per il genoma di riferimento e rimuovere i duplicati prima della compressione per i file bam. Questa operazione è eseguita utilizzando bowtie versione 1.1.239, SAMBLASTER versione 0.1.2140e SAMTOOLS versione 1.3.141: In unix tipo di terminale, bowtie -m 1 - n 1--migliori - strata -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | Vedi samtools -Sb - > histone1.bam e premete [Invio].
Nota: path_to indica la cartella contenente l'assembly di genoma umano hg19. Questo cambierà a seconda del microrganismo di interesse. - Ordinare i file bam utilizzando SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools ordinare histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted e premete [Invio].
- Indicizzare i file bam utilizzando SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai di indice e premete [Invio].
- Determinare in modo univoco mappate e non allineate letture utilizzando SAMTOOLS flagstat con il seguente comando: il tipo di terminale unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam e premere [Invio].
- Normalizzare file bam per lettura conta eseguendo il campionamento casuale con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, sambamba Mostra -f bam-sottocampionamento-seme = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools ordinare -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam e premete [Invio].
- Indicizzare i file bam utilizzando nuovamente SAMTOOLS con il seguente comando: nel tipo di terminale unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai di indice e premete [Invio].
- Per visualizzare le librerie di ChIP-seq su un browser del genoma (cioè. UCSC o IGV), generare i file Parruccone utilizzando deepTools versione 2.4.040 ridimensionando i file bam per letture al kilobase per milione (RPKM). Questa operazione può essere eseguita utilizzando i seguenti comandi:
- Per i file standard Parruccone: nel tipo di terminale unix, bamCoverage -b histone1. Downsample.Sorted.BAM - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw e premere {RETURN].
- Per ingresso sottratto file Parruccone: nel tipo di terminale unix, bamCompare - bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam - bamfile2 input1.downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - rapporto sottrarre - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW e premete [Invio].
- Identificare arricchimento segnale ChIP-seq sopra priorità bassa di "Input" usando l'analisi del modello basata del ChIP-seq (MACS) versione 1.4.225,26 e versione 2.1.0. Utilizzare macs1 per i fattori di "punto sorgente" H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac e macs2 per i fattori di "vasta sorgente" H3K79me2, H3K27me3 e H3K9me3. Questa operazione è eseguita utilizzando i seguenti comandi:
- Per punto di origine: Nel tipo di terminale unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 - nomodel - tenere-dup tutti - n histone1.file e premete [Invio].
- Per vasta sorgente: Nel tipo di terminale unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6-- vasto - broad-cutoff 1e-6--tenere-dup tutte le histone1.file - n - nomodel e premete [Invio].
- Uso ChromHMM24 per identificare i modelli di stato della cromatina combinatoria basato sulle modificazioni istoniche studiate utilizzando i seguenti comandi:
- Nel terminale unix digitare cd/path_to/ChromHMM_folder e premete [Invio].
- Una volta nel tipo di directory ChromHMM, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output e premete [Invio].
- Tipo, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 e premete [Invio].
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Representative Results
Questo protocollo permette l'immunoprecipitazione da tessuti tumorali congelati e linee cellulari che possono essere eseguite su decine di campioni in parallelo utilizzando un metodo di alto-rendimento (Figura 1A). Frammenti di cromatina deve essere compreso tra ~ 200-1000 bps per immunoprecipitazione ottimale. Abbiamo notato che il tempo necessario per raggiungere la stessa lunghezza di taglio differisce per diversi tessuti e tipi di cellule. Il successo del ChIP da piccole quantità di tessuto dipende dal mantenere il freddo lisato in ogni momento soprattutto durante la sonicazione. Purificata ChIP-DN eliminate quantificati prima di procedere alla preparazione della biblioteca (Figura 2A). Completato librerie adatte per multiplexing e NGS dovrebbero variano fra ~ 200-600 bp e privo di qualsiasi dimeri di primer (Figura 2B). Al momento successivo al sequenziamento, ci sono numerosi parametri di controllo di qualità che devono essere soddisfatti prima di procedere con ulteriori fasi della pipeline, ad esempio Mac chiamata a picco o analisi ChromHMM (Figura 3). Molti di questi parametri può essere determinati utilizzando programmi come FastQC e MultiQC. Qualità fastq letture sono allineate al genoma umano ad un tasso di ~ 50-80% con un massimo di una mancata corrispondenza. Una profondità di sequenziamento consigliato è 10 milioni in modo univoco mappato letture per "puntiforme" fattori e 20 milioni in modo univoco mappato letture per "vasta sorgente" fattori27,41,42,43. Ordinata e indicizzati file BAM vengono utilizzati per generare file di Parruccone che possono essere visualizzati utilizzando un browser del genoma come IGV o UCSC. Campioni di chIP dovrebbero essere arricchiti sopra DNA ingresso e ogni modifica dell'istone deve visualizzare un profilo distinto che rappresenta uno specifico componente del paesaggio epigenetico (Figura 4A). È possibile che in alcuni tessuti non ci sarà più elevati livelli di rumore di fondo che possono oscurare il segnale di ChIP-seq. In questo caso, è consigliabile per generare file di input Parruccone sottratto e ri-visualizzare in un browser del genoma. Per determinare i profili di stato della cromatina, utilizziamo ChromHMM algoritmo24. ChromHMM utilizza un modello di Markov nascosto a più variabili per identificare il più prominente che si verifichi nuovamente combinatoria e studiato modelli di cromatina spaziale basati sulle modificazioni degli istoni (Figura 5). Utilizzando questi sei modifiche ChromHMM identifica funzionalmente distinte della cromatina Stati che rappresentano sia repressivi che attivi domini, ad esempio polycomb repressione (stato 1), repressione eterocromatiche (stato 5), trascrizione attivo (stato 8 e 9) e esaltatori di attivi (stato 13 e 14). L'output da ChromHMM include file letto segmentato per ciascuno stato che può essere ulteriormente utilizzato per analisi a valle.
Figura 1: flusso di lavoro per modulo ChIP. Tessuto biopsiato del tumore in primo luogo è dissociato e reticolato per l'acquisizione di interazioni proteina-DNA. Tessuto è quindi sonicato per ottenere frammenti di cromatina adatti per immunoprecipitazione e complessi DNA-istone sono precipitati usando gli sei anticorpi indicati. I campioni vengono lavati, legami incrociati sono invertiti e ChIP-DNA è purificato e quantificato. Le librerie vengono generate da DNA purificato e multiplexed secondo indici univoci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi elettroferogramma di ChIP-DNA purificato e Biblioteca completato preparazione. (A) rappresentante elettroferogramma da purificato cromatina contenente DNA ChIP frammenti bp ~ 200-600 che è adatto per la preparazione di biblioteca. (B) rappresentante elettroferogramma da una libreria completata dopo amplificazione e selezione bifacciale paramagnetico dimensione che è adatto per funzionamento in multiplex e NGS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Il flusso di lavoro per modulo di elaborazione dati di ChIP-seq. Flusso di lavoro visualizzazione passaggi critici per l'elaborazione di dati di ChIP-seq e preparazione per l'analisi a valle. La pipeline utilizzata in questo protocollo è stata generata utilizzando snakemake, tuttavia, ciascuna di queste operazioni possa essere eseguita anche singolarmente come descritto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Visualizzazione del browser del genoma di modifica dell'istone canzoni di ChIP-seq. A) ChIP-seq brani generati da deeptools visualizzati da regioni attive e represse che circondano il locus ANR in un campione di tumore rappresentativo del melanoma. Geni come ANR, CSDE1 sono SIKE1 sono associati con tutte le modifiche dell'istone attivo (H3K27ac, H3K4me3 e H3K4me1) e trascrizione attivo (H3K79me2), mentre fiancheggianti i geni AMPD1, DENND2C e SYCP1 contengono polycomb repressive mark H3K27me3 e non contenere trascrizione attivo. B) chIP-seq brani generati da deeptools visualizzazione dell'eterocromatina bilico attraverso geni ZNF in rappresentante campione del tumore del melanoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : ChromHMM modello basato su campioni tumorali del melanoma. Profilo di emissione da un LearnModel di 15-stato basato sulle modificazioni istoniche sei studiato. ChromHMM identifica funzionalmente distinte della cromatina Stati che rappresentano domini sia repressivi e attivi, come la repressione polycomb (stato 1), heterochromatic repressione (stato 5), attivo trascrizione (stato 8 e 9) e rinforzatori attivi (State13 e 14 ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un modulo di ChIP-seq di alto-rendimento completo ed esaustivo per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in linee cellulari e tessuti del tumore umano. In qualsiasi protocollo di ChIP-seq, uno dei passi più importanti è la specificità dell'anticorpo. Qui, questo metodo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per le modifiche dell'istone sei descritta, i quali sono ChIP-grado e sono stati già convalidati nel nostro ed altri laboratori42,44,45 . Mentre le stesse concentrazioni di anticorpi sono state applicate con successo a vari altri tipi di tumore, è fondamentale per determinare la specificità dell'anticorpo se studiando diversi fattori di interesse27.
Un altro aspetto fondamentale per un esperimento riuscito comprende l'ottimizzazione delle condizioni di sonicazione. Tempo di sonicazione può variare sia tra campione e tessuto tipo e deve essere regolata. Per la corretta ottimizzazione, una corsa di prova viene eseguita per ciascun campione in modo incrementale aumentando il tempo di sonicazione e continuamente controllando la dimensione del frammento. Per il ChIP-esperimento iniziale frammenti di cromatina deve essere compreso tra ~ 200-1000 bp per immunoprecipitazione ottimale, e ChIP-DNA purificato deve essere quantificato prima di procedere alla preparazione di biblioteca. Questa dimensione del frammento assicura ottimale generazione e conservazione del DNA amplificato (~ 200 a 600 bp) che verrà utilizzato per multiplexing e NGS. Se eseguendo questi esperimenti in un modo ad alta velocità, un buon punto di partenza per multiplexing è di ~ 8 campioni per corsia per la sequenza della piscina. Mentre questa quantità di campioni può produrre una profondità poco profonda sequenziamento, è utile per testare la qualità di anticorpo prima di procedere. Uno dei colli di bottiglia del pool di campioni multipli è disuguale copertura post sequenziamento. Di solito un metodo di fluoremetric base quantificazione è usata, tuttavia, molti-a-volte non è equivalente a molecole di sequenziamento-pronto in ogni libreria. Il miglior metodo per la quantificazione del DNA di biblioteca è utilizzare qPCR utilizzando standard di fatto pre-determinati pronto per sequenziamento DNA molecole.
Un altro passo fondamentale nell'analisi dataset ChIP-Seq è post-sequenziamento elaborazione dei dati. Importante, prima di procedere a qualsiasi aspetto dell'analisi a valle ci sono diverse metriche di controllo di qualità che devono essere soddisfatti prima. Programmi come FastQC fornirà informazioni per quanto riguarda la qualità delle letture di sequenziamento fastq crudo sotto forma di pass o fallire il test. Mentre le letture fastq dovrebbero passare la maggior parte delle metriche, sono alcuni dei test più importanti statistiche di base, Per qualità base di sequenza, Per punteggi di qualità di sequenza e la contaminazione di adattatore. Letture FastQC-trattati sono allineate al genoma umano e necessario eseguire il mapping a un tasso di ~ 50-80% con un massimo di una mancata corrispondenza. Tariffe inferiori a 50% potrebbe indicare problemi nel ChIP, preparazione libreria o sequenziamento e possono includere contaminazione, bassa qualità ChIP-DNA o amplificazione eccessiva durante la PCR. Durante la conversione di SAM i BAM, letture duplicate in primo luogo devono essere contrassegnate e poi successivamente rimosso utilizzando SAMBLASTER prima di procedere al campionamento di giù. Mentre un certo livello di duplicazione è normale durante la PCR, alti livelli di duplicazione sono solitamente indicativi di bassa qualità ChIP-DNA, o forse un problema con preparazione di biblioteca. Le uscite da FastQC, Papillon e samblaster (combinati in flagstat) possono essere reindirizzate nel MultiQC che fornisce un completo riepilogo interattivo di tutti i risultati del controllo di qualità. MultiQC vengono visualizzate metriche di controllo di qualità dai file di output di fastqc, Papillon e samblaster fornendo informazioni sulle statistiche di base, le percentuali di allineamento e PCR duplicazione tassi rispettivamente.
Dopo la normalizzazione di down-sampling, il passo successivo e probabilmente più importante, è visualizzazione dei dati utilizzando un browser del genoma come IGV o UCSC. Ogni modifica dell'istone rappresenta una componente chiave del panorama normativo epigenetico, tra cui H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione), e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Tramite questi segni da solo o in combinazione, questi istoni possono identificare rinforzatori attivi, sospesi o repressi e promotori, come pure lo stato trascrizionale di regioni codificanti. Questo è stato dimostrato utilizzando ChromHMM, in cui sono stati identificati funzionalmente distinte della cromatina Stati che rappresentano i domini sia repressivi e attivi. Questi Stati sono stati definiti dai marchi singolare, come repressione polycomb (H3K27me3), repressione di hetrochromatic (H3K9me3) e trascrizione attivo (H3K79me2), così come segni di combinatoriali, quali attivi rinforzatori (H3K4me1 e H3K27ac) e trascritto rinforzatori (H3K4me1, H3K27ac e H3K79me2).
La piattaforma integrata presentata è adatta per la determinazione della capienza di istoni o fattori di trascrizione da campioni di tessuti. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per la determinazione di occupazione dei suddetti sei marchi dai campioni di biopsia-dimensioni del melanoma. Tuttavia, abbiamo ancora non determinato la minima quantità di tessuto necessaria per applicazioni di ChIP-Seq successo perché è depenedent il tipo di tessuto, nonché di anticorpo disponibile. Inoltre, anche se utilizziamo abitualmente questo protocollo flash, freschi congelati e OCT congelati campioni, non abbiamo ottimizzato questo protocollo per tessuti FFPE. Alcuni studi recenti hanno segnalato protocolli per tali tessuti46,47 e le modifiche proposte non ci possono essere incorporate nel quadro di questa piattaforma per verificare se la piattaforma presentata sarà utile dai tessuti FFPE. Crediamo che questo sarà molto utile nella determinazione dei modelli di stato della cromatina da materiale clinico ottenuti da pazienti in studi clinici. Nel complesso, questo protocollo descrive un modulo ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina nei tessuti del tumore umano, con facile seguire le istruzioni che comprende tutti i componenti necessari per un esperimento riuscito.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti.
Acknowledgments
Ringraziamo Marcus Coyle, Curtis Gumbs, core SMF a MDACC per il supporto di sequenziamento. Il lavoro descritto in questo articolo è stato sostenuto da sovvenzioni dalla concessione NIH (CA016672) al nucleo di SMF e NCI awards (1K99CA160578 e R00CA160578) a K. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - IgG-free | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag - 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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