Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En integrert plattform for genomet hele kartlegging av Chromatin stater med høy gjennomstrømming ChIP-sekvensering Tumor vev

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Her beskriver vi en optimalisert høy gjennomstrømming ChIP-sekvensering protokollen og beregningsformelen analyser rørledning for fastsettelse av genomet hele chromatin staten mønstre fra frosne tumor vev og linjer.

Abstract

Histone endringene utgjør en viktig komponent i epigenome og spille viktige forskrifter rolle i å bestemme tilknyttet loci transcriptional status. I tillegg har tilstedeværelsen av endringer blitt brukt til å bestemme posisjonen og identitet ikke-koding funksjonelle elementer som enhancers. De siste årene, har chromatin immunoprecipitation etterfulgt av neste generasjons sekvensering (ChIP-seq) blitt et kraftig verktøy for å bestemme genomet hele profiler av personlige histone modifikasjoner. Det har imidlertid blitt stadig klarere at kombinasjon mønstre av chromatin modifikasjoner, referert til som Chromatin stater, fastslå identiteten og natur tilhørende genomisk locus. Derfor arbeidsflyter bestående av robust høy gjennomstrømming (HT) metoder for profilering flere histone endring merker, samt beregningsformelen analyser rørledninger i stand til å håndtere myriader av ChIP-Seq profilering datasett, er nødvendig for omfattende fastsettelse av epigenomic stater i mange eksempler. Den HT-ChIP-Seq arbeidsflyt presenteres her består av to moduler: 1) en eksperimentell protokoll for profilering flere histone endringer fra små mengder svulst prøver og cellelinjer i 96-brønnen format; og 2) en beregningsformelen data analyse rørledning som kombinerer eksisterende verktøy for å beregne både individuelle merke belegg og kombinasjon chromatin staten mønstre. Sammen lette disse to modulene enkel bearbeiding av hundrevis av ChIP-Seq eksempler på en rask og effektiv måte. Arbeidsflyten presenteres her brukes til å utlede chromatin staten mønstre fra 6 histone merke profiler i melanom svulster og linjer. Total, presenterer vi en omfattende ChIP-seq-arbeidsflyt som kan brukes til en rekke menneskelige svulst prøver og kreftcelle linjer å avgjøre epigenomic avvik i ulike malignancies.

Introduction

Fleste pattedyr genomer (98-99%) består av noncoding, og disse nocoding områdene inneholder regulatoriske elementer kjent å delta i å kontrollere genuttrykk og chromatin organisasjonen1,2. I en normal celle er bestemte forsamlingen genomisk DNA komprimerte chromatin strukturen avgjørende for romlig organisering, regulering og presis timing av ulike DNA-assosiert prosesser3,4,5. I en kreftcelle imidlertid kan chromatin modifikasjoner av avvikende epigenetic mekanismer føre til feil organisasjon av chromatin struktur, inkludert tilgang til regulatoriske elementer, chromosomal looping systemer og gene expression mønstre6, 7,8,9,10.

Til tross for nylige fremskritt, har vi begrenset forståelse av epigenetic endringer som er tilknyttet svulst progresjon eller terapeutisk svar. Epigenome består av en rekke endringer, inkludert histone merker og DNA metylering, som samlet utgjør en dynamisk tilstand (referert til som chromatin stat) som gjøre inngrep på genet uttrykk nettverk og andre prosesser som er avgjørende for å opprettholde mobilnettet identitet. Endringer i enhancers har nylig vist i flere malignitet ved å studere H3K27Ac profiler11. Selv om slike studier gir innsikt i sammenhengen isolert epigenetic merker, mer enn 100 epigenetic endringer har blitt identifisert12,13 uten klar forståelse av deres biologiske roller og avhengighet. Videre finnes det et enda større antall mulige kombinasjon mønstre av disse histone og DNA modifikasjoner, og det er disse kombinasjon mønstre - ikke endinger - dikterer epigenetic stater14. Derfor er det enormt behov å identifisere endringer i disse chromatin stater under kreft progresjon eller svar til terapi. Omfattende kunnskap om epigenome endringer i kreft er lagging delvis på grunn av tekniske (f.eks generasjon av store data fra liten mengde klinisk materiale/single celler) og analytisk (f.eks algoritmer til å definere kombinasjon stater) utfordringer. Derfor er det kritisk behov for robust høy gjennomstrømming metoder for profilering stort antall histone endring merker fra klinisk materiale og lett-å-implementere computational tilnærminger til å forutsi kombinasjon mønstre som vil lette fastsettelse av epigenetic knyttet til ulike stadier av tumorigenesis og terapeutiske motstand. Videre, data som er tilgjengelige fra siste epigenome profilering studier15,16,17,18,19,20,21, 22,23 i normalt vev og linjer kan integreres med chromatin profiler av svulster for ytterligere innsikt i epigenome bidrag til svulst biologi.

Chromatin profilering har blitt et kraftig verktøy for å identifisere globale bindende mønstre av ulike chromatin modifikasjoner15,24. De siste årene blitt ChIP-seq "gull standard" for å studere DNA-protein interaksjoner på en global skala25,26,27. For noen ChIP-seq eksperiment er det avgjørende skritt nødvendig for sin suksess, inkludert vev behandling og tilknytningene, finne optimale sonication forhold, finne optimale antistoff konsentrasjon for nedbør, bibliotek forberedelse, etter sekvensering databehandling, og nedstrøms. Hvert av disse trinnene inneholder viktige kvalitetskontroll sjekkpunkter, og samlet, er avgjørende for riktig identifisere potensielle mål for funksjonell validering. Gjennom innovasjon i disse trinnene, har flere tidligere studier utviklet metoder for å utføre ChIP eller ChIP-Seq fra liten mengde vev28,29,30,31,32 . Videre, noen studier har antydet protokoller for høy gjennomstrømming ChIP eksperimenter etterfulgt av PCR basert kvantifisering33,34. Endelig er noen offentlig tilgjengelig analyse plattformer for ChIP-Seq-data nå tilgjengelig som Easeq35 og Galaxy36. Imidlertid har en integrert plattform for å utføre ChIP-Seq i en høy gjennomstrømming mote i kombinasjon med en beregningsorientert rørledning utføre enkelt merke samt chromatin staten analyser manglet.

Denne protokollen beskriver en komplett og omfattende ChIP-seq arbeidsflyt for genomet hele kartlegging av chromatin stater i tumor vev og cellelinjer, med lett for å følge retningslinjene omfatter alle trinnene nødvendig for en vellykket eksperiment. Ved å vedta en høy gjennomstrømming metode tidligere beskrevet av Blecher-Gonen et al. 37, denne protokollen kan utføres på dusinvis av eksempler parallelt og har blitt aktivert på kreftcelle linjer og menneskelige svulster melanom, colon, prostata og glioblastom multiforme. Viser vi metodikken for seks kjerne histone modifikasjoner som representerer nøkkelkomponenter i epigenetic regulatoriske landskapet i menneskelig melanom linjer og svulst prøver. Disse endringene inkluderer H3K27ac (forsterker), H3K4me1 (aktiv og klar enhancers), H3K4me3 (arrangører), H3K79me2 (transkribert regioner), H3K27me3 (polycomb undertrykkelse), og H3K9me3 (heterochromatic undertrykkelse). Disse merkene kan brukes enten alene eller i kombinasjon for å identifisere funksjonelt forskjellige chromatin stater som representerer både undertrykkende og aktive domener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle kliniske prøvene ble innhentet etter retningslinjene for institusjonelle Review Board.

1. buffer forberedelse

  1. Gjøre 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) pH 8.0).
  2. Gjøre 200 mL STE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
  3. Gjøre 200 mL 2.0 M glysin (37.52 g av glysin i 200 mL vann) og varme den til 65 ° C.
  4. Gjøre 200 mL 5% natrium deoxycholate (DOC) løsning (10 g av DOC i 200 mL vann).
  5. Gjøre 500 mL ChIP harvest buffer (12 mM Tris-Cl, 0.1 x fosfat bufret saltvann (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% natrium dodecyl sulfate (SDS)).
  6. Gjøre 500 mL ChIP fortynning buffer (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Gjøre 500 mL RIPA vaskebuffer (STE 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Gjøre 500 mL RIPA/500 vaskebuffer (RIPA buffer + 360 mM NaCl).
  9. Gjøre 500 mL LiCL vaskebuffer (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Gjøre 500 mL direkte elueringsbufferen: 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Gjøre 50 mL av antistoff bindende/blokkerer buffer (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% IgG-fri BSA).

2. vev/mobiltelefon linje behandling og Cross-linking

  1. Hvis vev er flash frossen, dethaw det på is før dissosiasjon.
  2. Fjerne 50 mg vev (~ 8 mg per histone endring antistoff) manuelt i 2 mL av Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) bruker et sterilt barberblad. Hakke vevet i 3 til 4 mm biter for ca 5 min i sterilt vev kultur parabol.
  3. Overføre vev og HBSS løsning i et dissociator rør og legge en annen 8 mL av HBSS. Videre fjerne vev ved hjelp av en dissociator til homogenisert.
  4. Melanom svulster, plassere rør i en dissociator og Kjør følgende sykluser hver en gang i denne rekkefølgen: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 og m_heart_02.01.
  5. Skrape 21 × 106 celler i 10 mL av medium (~ 3 × 106 per histone endring og inngang; det kan senkes til 100.000 celler per merke for sjeldne populasjoner) dyrket i en standard vev kultur parabol og samle dem i et 15 mL konisk rør.
    Merk: Medier som brukes til representative melanom celle linje WM115 er DMEM med 10% fosterets Bovine Serum og 5% penicillin/streptomycin.
  6. Krysskobling vev/celler ved hjelp av en 1% siste formaldehyd konsentrasjon av tilføyer 200 µL av 16% formaldehyd per 3 mL HBBS vev (eller 3 mL medium for celler). Riste blandingen på 10 rpm bruker en mikser for nøyaktig 10 min på 37 ° C.
    Forsiktig: Formaldehyd er giftig og skal håndteres på en passende avtrekksvifte.
  7. Legg 200 µL av 2,0 M glysin per 3 mL utvalg og fortsette rister på 10 rpm for en annen 5 min på 37 ° C.
    Merk: Glysin fungerer som en avsluttes. Gjør frisk glysin løsning hver måned som pH pf løsningen har en tendens til over tid.
  8. Spinne prøvene 934 x g i 5 min på 4 ° C ved hjelp av en Borstemmaskin sentrifuge. Fjern nedbryting, legge til 5 mL av is kaldt PBS, sentrifuge prøvene igjen på 934 x g og fjerne nedbryting.
  9. Flash fryse pellet og lagre den på-80 ° C for videre behandling.

3. vev Lysis, Sonication og antistoff forberedelse

  1. Oppløse 1 protease hemmer tablett per 10 mL av ChIP harvest buffer.
  2. Legger 300 µL av ChIP harvest buffer med proteasehemmere per 50 mg vev og tillate 30 min av lyse på is.
    Merk: Legg 300 µL av ChIP harvest buffer med proteasehemmere per 1 X 107 av WM115 melanom linjer.
  3. Mens cellene er lysing, slå på den waterbath disruptor og tilknyttede kjølesystemet og temperaturen å nå 4 ° C. Plasser sonicator rør i waterbath disruptor og sonicate melanom vev for 60 sykluser på 30 s på og 30 av å få chromatin fragmenter av ~ 200-600 base parene (bp).
    Merk: Sonication gang kan variere mellom vev type og bør justeres tilsvarende. Dette er et kritisk punkt skal være optimalisert i pilotprosjekt før du går videre til immunoprecipitation.
  4. Under sonication, vask 20 µL av protein G magnetiske perler per antistoff per prøve tre ganger med 1000 µL bindende/blokkerer bufferen (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Etter ~ 8 mg av melanom vev, ruge 3 µg hver histone antistoff i 100 µL av bindende / blokkerer bufferen for 2t 4 ° c med rotering bruker en tube revolver. 12 prøver for et entall antistoff inneholder 240 µL av perler, 36 µg antistoff og 1200 µL bindende/blokkerer bufferen.
    NOTE For 3 × 106 celler, bruk 5 µg hver antistoff og 30 µL av Protein-G magnetiske perler per antistoff. Antistoff og Protein-G perler bør være titreres hvis forskjellige mengden vev brukes. Denne protokollen illustrerer immunoprecipitation betingelser for beskrevet seks histone endringene (Tabell for materiale), men antistoff konsentrasjoner skal være optimalisert for andre endringer og transkripsjonsfaktorer.
  6. Bestemme fragment størrelse, fjerne 20 µL sonciated chromatin løsning og legge til en elueringsbufferen master mix (romtemperatur) som inneholder 44 µL av direkte elueringsrør bufferen, 1 µL av RNase (20mg/mL) og 5 µL proteinasen K (20mg/mL) per prøve. Inkuber eksemplene i et PCR termisk cycler minst 2 h på 50 ° C. Rense prøven ved hjelp av en PCR rensing kit følger produsentens instruksjoner.
  7. Sikre chromatin er tilstrekkelig skåret ved å bestemme fragment størrelse ved hjelp av en høy følsomhet DNA electropherogram instrument før du fortsetter til trinn 3.6. Slå på apparatet electropherogram.
  8. Legg 2 µL av høy følsomhet buffer reagensen i hver brønn av en 8-og optisk rør. Legg 2 µL av høy følsomhet stige i den første godt og 2 µL av renset prøver i gjenværende brønnene.
  9. Plasser optisk tube caps på rør stips og vortex prøvene på 2000 rpm i 1 Åpne lokket og sett nye høy følsomhet skjermen tape for lasting tips. Fjerne dekslene stripe og laste prøvene til electropherogram instrument.
  10. Åpne analyseprogramvare, markere første tretten områder på skjermen tape og trykk Start nederst i høyre hjørne. Chromatin fragmenter varierer mellom ~ 200-1000 bp er egnet for ChIP.
  11. Overføre sonicated løsningen til sterilt rør og spinne rør 21,130 x g ved hjelp av en bordplaten sentrifuge i 15 min på 4 ° C. Overføre nedbryting til nye rør.
  12. Bestemme det totale volumet av nedbryting og fjerne 10% av den totale løsningen for kontrollen og lagre den på 4 ° C.

4. chromatin Immunoprecipitation

  1. Oppløse 2 protease hemmer tabletter per 20 mL ChIP fortynning buffer.
  2. Etter sonication fortynne gjenværende prøven 5 ganger bruker ChIP fortynning buffer for å bringe SDS nivåer ned 0,1%. Fortynne 270 µL av gjenværende nedbryting med 1080 µL av ChIP fortynning buffer for å få et endelig totalvolum på 1350 µL.
  3. Når inkubasjonstiden for antistoffer og protein G magnetiske perler er ferdig, sett røret på en magnet og fjerne nedbryting.
  4. Med røret fortsatt sitter på magnet, vask perlene en gang ved å legge til 750 µL av ChIP fortynning buffer med proteasehemmere.
    Merk: Det er viktig ikke å forstyrre perler eller rotere rør i dette trinnet.
  5. Fjerne ChIP fortynning buffer vask og resuspend perler i 240 µL på samme ChIP fortynning bufferen. Aliquot 20 µL av perler i 12 separate rør, hver brukes for en separat Vevsprøve.
  6. Aliquot sonicated materialet jevnt på protein G perler med spesifikt antistoff og tørketrommel bruker en tube revolver natten på 4 ° C.

5. vask og omvendt Crosslinking av Immunoprecipitated DNA-protein komplekser

  1. Morgenen etter omvendt crosslinking, overføre antistoff-protein løsningen til en 96-brønns plate og plassere den på magnetiske stand. Tillate perler å overholde for minst 30 s og fjern nedbryting.
  2. Vask perlene 5 ganger med 150 µL av iskalde RIPA vaskebuffer bruker en flerkanals pipetter. Under vask trinnene, gjør ikke Pipetter perler, men Flytt magneten kontinuerlig fra høyre til venstre for 30 s per vask.
  3. Vask prøvene to ganger med 150 µL av iskalde RIPA-500 vaskebuffer.
  4. Vask prøvene to ganger med 150 µL av iskalde LiCl vaskebuffer.
  5. Vask prøvene gang med 150 µL av iskalde TE vaskebuffer og fjern TE buffer umiddelbart. Dette trinnet kan utelates for lav input programmer.
  6. Legge til kontrollen fra trinn 3.7 i frisk brønner i 96-brønnen platen inneholder ChIP DNA-prøvene.
  7. Etter vask trinnene, legge til et elueringsrør buffer master mix (romtemperatur) som inneholder 44 µL av direkte elueringsbufferen, 1 µL av RNase (20mg/mL) og 5 µL proteinasen K (20mg/mL) per brikke og inngang for omvendt crosslinking utvalg.
  8. Inkuber eksemplene bruker en PCR termisk cycler 4 h ved 37 ° C, 4 h 50 ° C og 8-16 h på 65 ° C.

6. rensing og kvantifisering av utfelt DNA

  1. Neste morgen, sted prøvene tilbake på magnet og overføre supernatant til en ny 96-brønns PCR plate som inneholder immunoprecipitated DNA.
  2. Legge til 2,3 ganger spinn perler løsning (115 µL for 50 µL av løsning) og nøye Pipetter opp og ned 25 ganger med en flerkanals pipetter. Løsningen blir homogen Hvis riktig blandet.
  3. Inkuber løsningen ved romtemperatur av magneten i 4 min. prøvene tilbake på magneten og ruge ved romtemperatur for en annen 4 min. Forkast nedbryting.
  4. Mens eksemplene på magnet, legge til 150 µL av 70% etanol (vol/vol) og ruge ved romtemperatur for 30 s uten å forstyrre perler.
  5. Gjenta vask fjerne etanol. Tillate spinn perler til luft tørr på magneten i 5 min.
    Merk: Fjern alle etanol etter andre vask som gjenværende etanol vil forstyrre rensing.
  6. Fjern prøvene fra magneten og legge 30 µL av 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Blande av pipettering 25 ganger og ruge prøvene ved romtemperatur av magneten i 4 min.
  7. Sett prøvene tilbake på magneten og ruge ved romtemperatur for en annen 4 min. overføre 20 µL av hvert utvalg til en ny 96-brønns plate for biblioteket forberedelse. Lagre de resterende 10 µL av ChIP DNA ved potensielle problemer med generering av bibliotekene.
  8. På dette stadiet, kvantifisere ChIP DNA før biblioteket forberedelse. DNA konsentrasjonen er målt med høy følsomhet DNA reagenser. Fordelingen størrelse utfelt DNA ved hjelp av en høy følsomhet DNA electropherogram instrument fortsetter til trinn 7.1.

7. biblioteket generasjon ved hjelp av NEBNext Ultra II DNA biblioteket forberedelse Kit

  1. Generere biblioteker for NGS sekvensering med DNA biblioteket forberedelse følger anbefalte protokollen fra produsenten. Alle reaksjonene utføres i 96-brønnen plater og incubations utføres i et PCR termisk cycler med lokk temperatur satt > 100 ° C og volumet satt til 50 µL.
  2. Multiplex Oligos for NGS plattformen brukes for indekser. Utføre totalt 10 x sykluser for PCR forsterkning med følgende innstillinger: første rødsprit 98 ° c for 30 s, rødsprit 98 ° c for 10 s, annealing/forlengelse på 65 ° C for 30 s (10 x sykluser), endelig utvidelse 65 ° C i 5 min og hold på 4° C.
    Merk: Tabell 1 inneholder primerne brukes for PCR forsterkning.
  3. Etter PCR forsterkning, fjerne prøvene og tar totale volumet til 100 µL bruker nuclease-fritt vann. Utfør dobbelsidig spinn størrelse utvalg (0.55x/0.8x) ved første legge 55 µL av perler og blande av pipettering 25 ganger. Inkuber prøvene ved romtemperatur av magneten i 4 min.
  4. Sett prøvene tilbake på en magnet og ruge ved romtemperatur for en annen 4 min. Dette trinnet brukes til å beholde store fragmenter til perler som er uegnet for sekvenser.
  5. Overføre nedbryting til en ny 96-brønns PCR plate. Ikke kast nedbryting som inneholder delvis renset DNA.
  6. Legge til en annen 25 µL av spinn perler og blande av pipettering 25 ganger og ruge ved romtemperatur av magneten i 4 min.
  7. Sett prøvene tilbake på magneten og ruge ved romtemperatur for en annen 4 min og forkaste nedbryting. Dette trinnet brukes til å beholde fragmenter av ~ 200 til 600 bp som skal brukes for sluttført biblioteker.
  8. Mens eksemplene på magnet, legge til 150 µL av 70% etanol (v/v) og tillate rugende for 30 s uten å forstyrre perler (ikke flytte på magneten). Fjerne etanol gjenta vask en gang.
  9. Tillate spinn perler å lufttørke på magneten i 5 min. fjerne alle etanol etter andre vask som gjenværende etanol vil forstyrre rensing.
  10. Fjern prøvene fra magneten og legge 25 µL av 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Blande av pipettering 25 ganger og ruge ved romtemperatur av magneten i 4 min. prøvene tilbake på magneten og ruge ved romtemperatur for en annen 4 min.
  11. Kvantifisere biblioteker med en høy følsomhet DNA electropherogram instrument før multipleksing for å sikre størrelser egner seg for sekvenser. Fullført bibliotekene varierer mellom 200-600 bp og er blottet for alle primer dimers.
    Merk: Hvis det er nødvendig, en 0.7 x spinn perle rensing er utført for å fjerne uønsket primer dimers som finnes på ~ 130 bp.
  12. Basseng kvantifisert DNA basert på unik indeks primere ifølge konsentrasjon. Fordelingen er et basseng som inneholder seks prøver med konsentrasjoner mellom 1 ng/µL og 6ng/µL, 15 µL av laveste utvalget og 2,5 µL av høyeste utvalget. Dette gjøres for å sikre lese teller vil være jevnt fordelt på hver bane i flyt-cellen.

8. innlegget ChIP-seq databehandling

  1. En rørledning basert på snakemake38,39 brukes til prosessen med følgende trinn i en enkelt kommando. Viktigere er hver av disse trinnene omtalt individuelt med tilhørende kommandoer.
  2. Bestemme kvaliteten av rå fastq sekvensering leser bruker FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): åpne unix terminal og endre adresseliste (cd) til mappen som inneholder rå fastq filene for hver av seks histone modifikasjoner. I unix terminaltype, fastqc *fastq.gz og trykk [Enter]. Dette vil kjøre kvalitetskontroll beregninger på alle fastq filer i mappen.
  3. Juster kvalitet lyder å referanse genomet og Fjern duplikater før komprimering bam filer. Dette utføres bowtie versjon 1.1.239, SAMBLASTER versjon 0.1.2140og SAMTOOLS versjon 1.3.141: I unix terminaltype, bowtie -m 1 - n 1 - beste - lag -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Vis -Sb - > histone1.bam og trykk [Enter].
    Merk: path_to angir mappen som inneholder samlingen hg19 menneskelige genom. Dette vil endres avhengig av organismen rundt.
  4. Sortere bam filer ved hjelp av SAMTOOLS med følgende kommando: I unix terminaltype, samtools sortere histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted og trykk [Enter].
  5. Indeksfiler bam SAMTOOLS med følgende kommando: unix terminaltype, samtools indeks histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai og trykk på [Enter].
  6. Fastslå entydig tilordnet og unaligned leser SAMTOOLS flagstat med følgende kommando: I unix terminaltype, samtools flagstat histone1.sorted.bam og trykk [Enter].
  7. Normalisere bam filer per Les teller ved å utføre stikkprøvekontroll med følgende kommando: unix terminaltype, sambamba vise -f bam-subsampling-frø = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools sortere -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam og trykk [Enter].
  8. Indeksere bam filene igjen med SAMTOOLS med følgende kommando: unix terminaltype, samtools indeks histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai og trykk på [Enter].
  9. Visualisere ChIP-seq biblioteker på en genomet nettleser (dvs. UCSC eller IGV), generere bigwig filer med deepTools versjon 2.4.040 ved skalering bam filene leser per kilobase per million (RPKM). Dette kan utføres ved hjelp av følgende kommandoer:
    1. For standard bigwig filer: I unix terminaltype, bamCoverage -b histone1. downsample.sorted.Bam - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw og trykk {ENTER].
    2. For inndata trukket bigwig filer: I unix terminaltype, bamCompare - bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam - bamfile2 input1.downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - forholdet trekke - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW og trykk [Enter].
  10. Identifisere ChIP-seq signal berikelse over "Input" bakgrunnen basert analyse av ChIP-seq (Mac) versjon 1.4.225,26 og versjon 2.1.0. Bruk macs1 for "punkt kilde" faktorer H3K4me3, H3K4me1 og H3K27ac og macs2 for "bred kilde" faktorer H3K79me2, H3K27me3 og H3K9me3. Dette utføres ved hjelp av følgende kommandoer:
    1. For punkt kilde: I unix terminaltype, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 - nomodel - Hold-dup alle - n histone1.file og trykk [Enter].
    2. For bred kilde: I unix terminaltype, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6 - bred - bred-cutoff 1e-6-holde-dup alle--nomodel - n histone1.file og trykk [Enter].
  11. Bruk ChromHMM24 å identifisere kombinasjon chromatin staten mønstre basert på histone modifikasjoner studerte ved hjelp av følgende kommandoer:
    1. I unix terminalen skriver, cd/path_to/ChromHMM_folder og trykk på [Enter].
    2. I den ChromHMM katalogtypen, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output og trykk på [Enter].
    3. Type, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 og trykk på [Enter].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen tillater immunoprecipitation fra frosne tumor vev og linjer som kan utføres på dusinvis av eksempler parallelt med en høy gjennomstrømming metode (figur 1A). Chromatin fragmenter burde omfang imellom ~ 200-1000 bps for optimal immunoprecipitation. Vi har bemerket at tiden det tar å oppnå samme klippe lengden varierer for ulike vev og celletyper. Chip fra små mengder vev avhenger holder lysate kulden alltid særlig under sonication. Renset ChIP-DN skulle kvantifiseres før du fortsetter til biblioteket forberedelse (figur 2A). Fullført biblioteker for multiplexing og NGS bør mellom ~ 200-600 bp og være blottet for enhver primer dimers (figur 2B). På post sekvensering, finnes det mange kvalitetskontroll beregninger som skal oppfylles før du fortsetter å fremme skritt av rørledningen, for eksempel Mac topp-ringer eller ChromHMM analyse (Figur 3). Mange av disse beregningene kan bestemmes ved hjelp av programmer som FastQC og MultiQC. Kvalitet fastq leser justeres til det menneskelige genomet med en hastighet på ~ 50-80% med maksimalt én feil. En anbefalt sekvensering dybden er ~ 10-15 millioner entydig tilordnet leser for "punkt kilde" faktorer og ~ 20-30 millioner entydig tilordnet leser for "bred kilde" faktorer27,41,42,43. Sorterte og indeksert BAM filer brukes til å generere bigwig filer som kan visualiseres ved hjelp av et genom nettleser som IGV eller UCSC. ChIP prøver skal bli beriket over input DNA og hver histone endring skal vise en tydelig profil som representerer en bestemt komponent av epigenetic landskapet (figur 4A). Det er mulig at i noen vev blir høyere nivåer av bakgrunnsstøy som kan skjule ChIP-seq signalet. Hvis dette skjer, anbefales det å generere input trukket fra bigwig filer og re visualisere på et genom nettleser. For å fastslå chromatin staten profiler, bruker vi ChromHMM algoritme24. ChromHMM bruker en multivariabel Hidden Markov Model for å identifisere de mest fremtredende å dukke kombinasjon og romlige chromatin mønstre basert på histone modifikasjoner studerte (figur 5). Bruke endringene seks ChromHMM identifiserer funksjonelt forskjellige chromatin stater som representerer både undertrykkende og aktive domener, for eksempel polycomb undertrykkelse (State 1), heterochromatic undertrykkelse (staten 5), aktiv transkripsjon (State 8 og 9) og aktive enhancers (State 13 og 14). Utdataene fra ChromHMM omfatter segmentert seng filer for hver delstat som kan videre brukes til nedstrøms.

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyt for ChIP modul. Biopsied tumor vev er først koble og krysskoblet for å fange protein-DNA interaksjoner. Vev er deretter sonicated for å få chromatin fragmenter egnet for immunoprecipitation og histone-DNA komplekser er utløst med seks angitt antistoffer. Eksempler er vasket, cross-links tilbakeføres og ChIP-DNA er renset og kvantifisert. Biblioteker er generert fra renset DNA og multiplekset etter unike indekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Electropherogram analyse av renset ChIP-DNA og fullførte biblioteket forberedelse. (A) representant electropherogram fra renset ChIP-DNA som inneholder chromatin fragmenter ~ 200-600 bp som passer for biblioteket forberedelse. (B) representant electropherogram fra et fullført bibliotek etter forsterkning og tosidige spinn størrelse utvalg som er egnet for multiplexing og NGS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Arbeidsflyt for ChIP-seq databehandling modul. Arbeid-flyt avgjørende skritt for ChIP-seq databehandling og forberedelse til nedstrøms. Rørledningen brukes i denne protokollen ble generert ved hjelp snakemake, men hver av disse trinnene kan også utføres individuelt som beskrevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Genomet leservisningen av histone modifikasjon ChIP-seq spor. A) ChIP-seq spor generert av deeptools viser aktive og undertrykte regioner rundt NRAS locus i et representativt melanom svulst utvalg. Gener som NRAS, CSDE1 er SIKE1 er forbundet med alle aktive histone endringer (H3K27ac, H3K4me3 og H3K4me1) og aktiv transkripsjon (H3K79me2), mens flankert gener AMPD1, DENND2C og SYCP1 inneholder polycomb undertrykkende merke H3K27me3 og ikke inneholde aktive transkripsjon. B) chIP-seq spor generert av deeptools viser klar heterochromatin over ZNF gener i representant melanom svulst prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : ChromHMM modell basert på melanom svulst samples. Utslipp profilen fra en 15-State LearnModel basert på seks histone modifikasjoner studerte. ChromHMM identifiserer funksjonelt forskjellige chromatin stater som representerer både undertrykkende og aktive domener, for eksempel polycomb undertrykkelse (State 1), heterochromatic undertrykkelse (staten 5), aktiv transkripsjon (State 8 og 9) og aktiv enhancers (State13 og 14 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en komplett og omfattende høy gjennomstrømming ChIP-seq modul for genomet hele kartlegging av chromatin statene i menneske tumor vev og linjer. I noen ChIP-seq-protokollen er en av de viktigste trinnene antistoff spesifisitet. Her viser denne metoden immunoprecipitation betingelser for beskrevet seks histone modifikasjoner, alle er ChIP-klasse og tidligere har validert i våre og andre laboratorier42,44,45 . Mens samme antistoff konsentrasjonen har vært anvendt på forskjellige andre svulst typer, er det viktig å fastslå antistoff spesifisitet hvis studerer ulike faktorer rundt27.

En annen viktig aspekt for en vellykket eksperiment inkluderer optimalisering av sonication forhold. Sonication gang kan variere både mellom utvalg og vev og justeres tilsvarende. For riktig optimalisering utføres en prøvetur for hver prøve av gradvis økende sonication tiden og kontinuerlig sjekke fragment størrelse. For første ChIP-eksperimentet chromatin fragmenter burde omfang imellom ~ 200-1000 bp for optimal immunoprecipitation, og renset ChIP-DNA bør kvantifiseres før du fortsetter til biblioteket forberedelse. Denne fragment størrelsen sikrer optimal generasjon og oppbevaring av forsterket DNA (~ 200 til 600 bp) som skal brukes for multiplexing og NGS. Hvis utfører disse eksperimentene på en høy gjennomstrømming måte, er et godt utgangspunkt for multiplexing å samle ~ 8 samplinger kjørefelt for sekvenser. Mens denne mengden prøver kan produsere en grunne sekvensering dybde, er det nyttig for testing av antistoff kvalitet før du fortsetter. En av flaskehalser ved å samle flere eksempler er ulik dekning innlegg sekvensering. En fluoremetric metode basert kvantifisering brukes imidlertid mange-en-timene det er vanligvis ikke tilsvarende sekvensering-klar molekyler i hvert bibliotek. Den beste metoden for kvantifisering av biblioteket DNA er å benytte qPCR bruke standarder laget av forhåndsbestemt sekvensering-klar DNA molekyler.

En annen avgjørende skritt i ChIP-Seq dataset analyse er etter sekvensering databehandling. Viktigere, før du fortsetter til alle aspekter av nedstrøms er det ulike kvalitetskontroll beregninger som skal oppfylles først. Programmer som FastQC vil gi informasjon om kvaliteten på rå fastq sekvensering leser i form av pass eller mislykkes testing. Mens den fastq lest skal passere de fleste av beregningene, inkluderer noen viktigere testene grunnleggende statistikk, Per sekvens base kvalitet, Per sekvens kvalitetspoeng og adapter forurensning. FastQC-behandlet leser justeres til det menneskelige genomet og bør tilordne med en hastighet på ~ 50-80% med maksimalt én feil. Priser lavere enn 50% kan indikere problemer i ChIP, bibliotek forberedelse eller sekvensering og kan omfatte forurensning, lav kvalitet ChIP-DNA eller over forsterkning under PCR. Under konvertering av SAM BAM filer, like lesing bør først bli flagget og deretter fjernet senere bruke SAMBLASTER før du fortsetter ned prøvetaking. Mens noen grad av duplisering er normalt under PCR, er høye nivåer av duplisering vanligvis indikativ av lav kvalitet ChIP-DNA eller et problem med biblioteket forberedelse. Resultatene fra FastQC, bowtie og samblaster (kombinert i flagstat) kan alle ledes ut MultiQC som gir en fullstendig interaktiv Sammendrag av alle kvalitetskontroll resultatene. MultiQC viser kvalitetskontroll beregninger fra utdatafiler fastqc, bowtie og samblaster å gi informasjon om grunnleggende statistikk, justering prosenter og PCR duplisering priser henholdsvis.

Etter ned-prøvetaking normalisering, det neste og trolig viktigste trinnet datavisualisering bruker et genom nettleser som IGV eller UCSC. Hver histone endring representerer en nøkkel komponenten av epigenetic regulatoriske landskapet, inkludert H3K27ac (forsterker), H3K4me1 (aktiv og klar enhancers), H3K4me3 (arrangører), H3K79me2 (transkribert regioner), H3K27me3 (polycomb undertrykkelse), og H3K9me3 (heterochromatic undertrykkelse). Ved å bruke merkene enten alene eller i kombinasjon, kan disse histones identifisere aktive, klar eller undertrykt enhancers og arrangører, samt transcriptional status koding regioner. Dette ble demonstrert med ChromHMM, der funksjonelt forskjellige chromatin stater som representerer både undertrykkende og aktive domener ble identifisert. Disse landene ble definert av entall merker, for eksempel polycomb undertrykkelse (H3K27me3), hetrochromatic undertrykkelse (H3K9me3) og aktiv transkripsjon (H3K79me2), samt kombinasjon merker, for eksempel aktive enhancers (H3K4me1 og H3K27ac) og transkribert enhancers (H3K4me1, H3K27ac og H3K79me2).

Presentert integrert plattformen er velegnet for fastsettelse av bruk av histones eller transkripsjonsfaktorer fra vev prøver. Vi har vellykket benyttet denne protokollen for fastsettelse av bruk av de nevnte seks karakterer fra biopsi størrelse melanom prøver. Men har vi fortsatt ikke bestemt laveste mengden vev kreves for vellykket ChIP-Seq applikasjoner fordi det er depenedent på vev type samt tilgjengelig antistoff. Videre, selv om vi rutinemessig bruke denne protokollen på ferske, flash frossen og OCT frosset eksempler, har vi ikke optimalisert denne protokollen for FFPE vev. Noen studier har rapportert protokoller for slike vev46,47 og de foreslåtte endringene det kan innlemmes i rammen av denne plattformen til å teste om presentert plattformen vil være nyttig fra FFPE vev. Vi tror dette vil være svært nyttig i vilje til chromatin state mønstre av klinisk materiale fra pasienter under kliniske studier. Samlet beskriver denne protokollen en komplett og omfattende ChIP-seq modul for genomet hele kartlegging av chromatin statene i menneske tumor vev, med lett for å følge instruksjonene omfatter alle nødvendige komponenter for en vellykket eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konflikter.

Acknowledgments

Vi takker Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kjernen for MDACC for sekvensering støtte. Arbeidet som er beskrevet i denne artikkelen ble støttet av tilskudd fra NIH tilskudd (CA016672) til SMF kjerne og NCI priser (1K99CA160578 og R00CA160578) til K. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Tags

Kreftforskning problemet 134 ChIP-Seq chromatin immunoprecipitation neste generasjons sekvensering histone modifisering menneskelige tumor vev metastatisk melanom chromatin staten profiler
En integrert plattform for genomet hele kartlegging av Chromatin stater med høy gjennomstrømming ChIP-sekvensering Tumor vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., … More

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., Maitituoheti, M., Raman, A., Amin, S., Liu, Z., Rai, K. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. J. Vis. Exp. (134), e56972, doi:10.3791/56972 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter