Summary
Здесь мы описываем, оптимизированный протокол чип последовательности высокой пропускной способностью и трубопровод Вычислительный анализ для определения генома общесистемной хроматина состояния моделей из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий.
Abstract
Изменения гистона являются одним из основных компонентов epigenome и играют важную роль регулирования в определении транскрипционный анализ статуса ассоциированных локусов. Кроме того наличие конкретных изменений был использован для определения позиции и личность-кодирования функциональных элементов, таких как усилители. В последние годы иммунопреципитации chromatin, следуют следующего поколения последовательности (чип seq) стал мощным инструментом определения генома общесистемной профилей отдельных гистона модификаций. Однако это становится все более очевидным, комбинаторные шаблоны изменений chromatin, называют Chromatin государствами, определить личность и характер связанных геномной Локус. Таким образом рабочие процессы, состоящие из надежной методологии (HT) высок объём для профилирования количество меток гистона модификации, а также Вычислительный анализ трубопроводов способна обработки мириады чип-Seq профилирование наборов данных, необходимых для всеобъемлющее определение государств epigenomic в большое количество проб. HT-чип-Seq рабочего процесса, представленные здесь состоит из двух модулей: 1) экспериментальный протокол для профилирования нескольких модификаций гистона от небольших количеств образцов опухоли и клеточных линий в 96-луночных формате; и 2) вычислительные данные анализа трубопровода, который объединяет существующие инструменты для вычисления отдельные Марк размещение и комбинаторные хроматина состояние модели. Вместе эти два модуля облегчить легкая Обработка сотни образцов чип-Seq быстрым и эффективным образом. Рабочий процесс, представленные здесь используется для получения структур хроматина государства от 6 гистона Марк профилей в меланома опухоли и клеточных линий. В целом мы представляем всеобъемлющий чип seq рабочий процесс, который может быть применен к десятков образцов человека опухоли и рак клеточных линий для определения epigenomic аберраций в различных злокачественных опухолей.
Introduction
Большинство млекопитающих геномов (98-99%) состоит из некодирующих последовательностей, и эти регионы nocoding содержат нормативных элементов, известных участвовать в контроле экспрессии генов и хроматина организации1,2. В нормальной клетке конкретные Ассамблея геномной ДНК в уплотненных хроматина структура имеет решающее значение для пространственной организации, регулирования и точные сроки различных процессов, связанных с ДНК3,4,5. В раковых клеток, однако, chromatin изменения по аномальным эпигенетические механизмы может привести к неправильной Организации структуры хроматина, включая доступ к регуляторных элементов, хромосомные циклической системы и ген выражение модели6, 7,8,9,10.
Несмотря на недавние успехи мы ограничили понимание эпигеномные изменения, которые связаны с опухолевой прогрессии или терапевтического ответа. Epigenome состоит из массива изменений, в том числе меток гистона и метилирование ДНК, которые вместе образуют динамического состояния (упоминаемый как состояние хроматина), которая посягает на выражение генных сетей и других процессов, решающее значение для поддержания Сотовый личность. Недавно изменения в усилители были показаны в множественные злокачественные опухоли, изучая профили H3K27Ac11. Хотя такие исследования дают представление о корреляции изолированных эпигенетических меток, более чем 100 эпигеномные изменения были определены12,13 без четкого понимания их биологических функций и взаимозависимость. Кроме того есть еще большее количество возможных комбинаторной моделей этих гистона и модификации ДНК, и это эти комбинаторной закономерности - не отдельные модификации - диктовать эпигеномные государств14. Таким образом существует огромный необходимость выявления изменений в этих государствах хроматина в прогрессии рака или ответы на терапии. Всесторонние знания о epigenome изменений в раках отставание в части из-за технического (например , поколения крупномасштабных данных из небольшого количества клинического материала/сингл клеток) и аналитический (например алгоритмы для определения комбинаторные государства) проблемы. Таким образом ощущается насущная необходимость для надежные методы высокой пропускной способностью для профилирования большое количество марок изменения гистона из клинического материала и вычислительной подходов в реализации предсказать комбинаторной шаблоны, которые будут способствовать определение эпигеномные государств, связанных с различными этапами tumorigenesis и терапевтической резистентности. Кроме того, данные, поступившие от недавних epigenome профилирования исследования15,16,,1718,19,20,21, 22,23 в нормальных тканей и клеточных линий может быть интегрирована с профилями хроматина опухоли для дальнейшего понимание epigenome вклад биология опухоли.
Хроматин профилирования стала мощным инструментом для выявления глобальных привязки моделей различных chromatin изменения15,-24. В последние годы чип seq стал «золотым стандартом» для изучения ДНК белковых взаимодействий на глобальном масштабе25,,2627. Для любого эксперимента чип seq критические шаги необходимые для его успеха, включая обработку ткани и диссоциации, determing условий оптимального sonication, determing оптимального антитела концентрации для осадков, Библиотека подготовки, После последовательность обработки данных и анализа, ниже по течению. Каждый из этих шагов содержат ключевые качества контрольно-пропускных пунктах и когда вместе взятые, имеют решающее значение для надлежащего выявления потенциальных целей для функциональной проверки. Через инновации в эти шаги несколько предварительного исследования были разработаны методологии для выполнения чип или чип-Seq от небольшого количества ткани28,29,,3031,32 . Кроме того некоторые исследования показали, что протоколы для экспериментов чип высокой пропускной способности, следуют ПЦР на основе количественный33,34. Наконец некоторые публично доступна анализ платформы для чип-Seq данных теперь доступны как Easeq35 и36галактики. Однако хватало интегрированную платформу для выполнения чип-Seq в духе высокой пропускной способности в сочетании с вычислительной трубопровода для выполнения одной марки, а также анализы состояние хроматина.
Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий процесс чип seq для картирования генома общесистемной государств хроматина в опухоль тканей и клеточных линий, с легко следовать руководящим принципам, охватывающий все шаги, необходимые для успешного эксперимента. Приняв метод высок объём ранее описанных Blecher Гонен et al. 37, этот протокол может быть выполнена на десятки образцов параллельно и успешно применяется на линии клеток рака и человеческих опухолей, таких как меланома, толстой кишки, простаты и глиобластомы мультиформной. Мы демонстрируем методологии для шести основных гистона модификаций, которые представляют собой основные компоненты эпигеномный нормативные ландшафт в человека меланомы клеточных линий и образцов опухоли. Эти изменения включают в себя H3K27ac (усилители), H3K4me1 (активных и готова усилители), H3K4me3 (промоутеры), H3K79me2 (транскрибируется регионов), H3K27me3 (polycomb репрессии) и H3K9me3 (гетерохроматиновые репрессии). Эти метки может использоваться отдельно или в сочетании для выявления государств функционально различных хроматина, представляющих репрессивных и активных доменов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все клинические образцы были получены следующие руководящие принципы институциональных Наблюдательный Совет.
1. буфер подготовка
- Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0).
- Сделайте 200 мл STE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм ЭДТА рН 8,0, 140 мм NaCl).
- Сделать 200 мл 2,0 М глицин (37.52 г глицина в 200 мл воды) и тепло его на 65 ° C.
- Сделайте 200 мл 5% раствора натрия Дезоксихолат (DOC) (10 g DOC в 200 мл воды).
- Сделайте 500 мл чип урожай буфера (12 мм трис-Cl, 0.1 x фосфатный буфер (PBS), 6 мм ЭДТА, 0,5% лаурилсульфат натрия (SDS)).
- Сделать 500 мл буфера для разведения чип (140 мм NaCl, 0.1% 10 мм трис-Cl, DOC, 1% тритон-X, 1 мм ЭДТА).
- Сделать 500 мл Буфер RIPA мыть (STE, 1% тритон x-100, 0.1% SDS, 0.1% DOC).
- Сделайте 500 мл буфера мытья РИПА/500 (Буфер RIPA + 360 мм NaCl).
- Сделать 500 мл LiCL мыть буфера (TE, 250 мм LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
- Сделать 500 мл прямого Элюирующий буфер: 10 мм трис-Cl рН 8,0, 5 мм ЭДТА, 300 мм NaCl, 0,5% SDS.
- Сделайте 50 мл антитела Binding/блокирование буфера (PBS + 0.1% BSA TWEEN-20 + 0.2% IgG бесплатно).
2. ткани/мобильные линии обработки и Cross-linking
- Если ткань флэш замороженных, dethaw его на льду до диссоциации.
- Отделить 50 мг ткани (~ 8 мг на антитела изменения гистона) вручную в 2 мл из Hanks сбалансированный соли раствора (HBSS) с помощью стерильные лезвия бритвы. Фарш ткани на 3-4 мм куски приблизительно 5 минут в стерильных тканевой культуры блюдо.
- Ткани и HBSS решение перенести в диссоциатором трубу и добавьте еще 8 мл HBSS. Далее, отделить ткани, с помощью диссоциатором до гомогенизированный.
- Меланома опухоли, место трубы в диссоциатором и запустите следующие циклы каждый один раз в следующем порядке: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 и m_heart_02.01.
- Скрип 21 × 106 клеток в 10 мл среды (~ 3 × 106 процентов изменения гистона и ввода; он может быть снижен до 100 000 ячеек на знак для популяций редких) вырос в стандартной тканевой культуры блюдо и собирать их в 15 мл Конические трубки.
Примечание: Средства массовой информации используются для представителя меланома клеток линии WM115-DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина. - Crosslink клетки/ткани с помощью окончательный формальдегида 1% концентрации, добавив 200 мкл 16% формальдегида на 3 мл HBBS для ткани (или 3 мл среды для клеток). Встряхните смесь 10 об/мин, используя миксер для ровно 10 минут при 37 ° C.
Предупреждение: Формальдегид токсичных и должны рассматриваться в соответствующих зонта. - Добавить 200 мкл 2,0 М глицин 3 мл образца и продолжать пожимая 10 об/мин для еще 5 минут при 37 ° C.
Примечание: Глицин действует как утоления. Сделайте свежий глицин раствора каждый месяц как pf рН, решение, как правило, с течением времени. - Спиновые образцов 934 x g 5 мин при 4 ° C, с помощью настольная центрифуга. Удалить супернатант, добавить 5 мл холодного льда PBS, Центрифугуйте образцы снова в 934 x g и удалить супернатант.
- Вспышки заморозить гранулы и хранить его на-80 ° C для дальнейшей обработки.
3. ткань Lysis, Sonication и подготовка антител
- Растворите 1 таблетка ингибитор протеазы на 10 мл чип урожай буфера.
- Добавить 300 мкл буфера урожай чип с ингибиторами протеазы на 50 мг ткани и позволяют 30 мин лизиса на льду.
Примечание: 300 мкл буфера урожай чип с ингибиторами протеазы за 1 X 10-7 линий клеток меланомы WM115. - В то время как лизировать клетки, включите капилляре disruptor и связанные системы охлаждения и дайте температуре возможность добраться до 4 ° C. Sonicator трубы в капилляре disruptor и sonicate меланома тканей для 60 циклов в 30 s на и 30 s off, чтобы получить фрагменты хроматина ~ 200-600 пар оснований (ВР).
Примечание: Время Sonication могут отличаться между ткани типа и должны быть скорректированы соответствующим образом. Это является важным шагом и должны быть оптимизированы в эксперимент, прежде чем приступать к иммунопреципитации. - Во время sonication мыть 20 мкл белок G магнитные бусы на антитела на сэмпл, три раза с использованием 1000 мкл привязки/блокирование буфера (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
- Для ~ 8 мг меланомы ткани Инкубируйте 3 мкг каждого гистона антитела в 100 мкл привязки / блокирование буфера втечение 2 ч при температуре 4 ° C с вращения с помощью трубки револьвер. 12 образцов для сингулярных антитела содержат 240 мкл бусы, 36 мкг антител и 1200 мкл привязки/блокировки буфера.
Примечание: Для 3 × 106 клеток, используйте 5 мкг каждого антитела и 30 мкл белок G магнитные бусы на антитела. Антитела и протеина G бусы следует титруют если используется различное количество ткани. Этот протокол иллюстрирует иммунопреципитации условия описаны шесть изменения гистона (Таблица материалов), однако, концентрации антитела должны быть оптимизированы для других модификаций и транскрипционных факторов. - Определить размер фрагментов, удалить 20 мкл раствора sonciated хроматина и добавить Элюирующий буфер Мастер микс (комнатной температуры), содержащий 44 мкл прямой Элюирующий буфер, 1 мкл РНКазы (20 мг/мл) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) на сэмпл. Проинкубируйте образцы в PCR тепловой cycler для по крайней мере 2 ч при 50 ° C. Очищение образца с помощью ПЦР очистки комплект инструкций производителей.
- Убедитесь, что хроматина достаточно стриженый, определяя размер фрагмента с помощью инструмента electropherogram ДНК высокая чувствительность до перехода к этапу 3.6. Включите инструмент electropherogram.
- Загрузка 2 мкл Реагента высокой чувствительности буфера в каждой скважине 8-Ну оптические трубки газа. Загрузка 2 мкл лестница высокая чувствительность в первый хорошо и 2 мкл очищенный образцов в оставшихся скважинах.
- Место оптическая труба шапки на трубки НТИП и вихревой образцы на 2000 об/мин на 1 мин открыть крышку и вставьте новые ленты высокой чувствительности экрана и окно загрузки советы. Снимите крышки газа и загрузить образцы в инструмент electropherogram.
- Откройте программное обеспечение для анализа, выделите первые тринадцать запрещено на ленте экрана и нажмите на вкладку Пуск в нижнем правом углу. Фрагменты хроматина, колебаясь между ~ 200-1000 bp подходят для чипа.
- Передача sonicated решение в стерильные пробирки и спин трубы на 21,130 x g с помощью центрифуги столешницы для 15 мин при 4 ° C. Супернатант передавать новые трубы.
- Определите суммарный объем супернатант и удалить 10% общего решения для управления вводом и хранить при 4 ° C.
4. chromatin иммунопреципитации
- Растворите 2 таблетки ингибитор протеазы в 20 мл буфера для разведения чип.
- После sonication разбавленной оставшиеся выборки 5 раз, используя чип буфером для разбавления проб довести SDS уровнях вплоть до 0,1%. Разбавьте 270 мкл оставшихся супернатант с 1080 мкл буфера для разведения чип для получения окончательного суммарный объем 1350 мкл.
- Когда заканчивается инкубации антитела и протеина G магнитные бусы, поместите трубку на магнит и удалить супернатант.
- С трубки, по-прежнему сидел на магните мыть бисер один раз путем добавления 750 мкл буфера для разведения чип с ингибиторов протеазы.
Примечание: Важно, чтобы не нарушить бусы или поворот трубы во время этого шага. - Фишки буфером для разбавления проб мыть и Ресуспензируйте бисер в 240 мкл буфера для разведения же чип. Аликвота 20 мкл бисера в 12 отдельных труб, каждая из которых используется для выборки отдельных тканей.
- Алиготе sonicated материал равномерно белок G бусы с специфическим антителом и сушилка с помощью трубки револьвер на ночь при 4 ° C.
5. мытье и обратного сшивания Immunoprecipitated ДНК белковых комплексов
- На следующее утро после обратного сшивания, передачи антител белка решение 96-луночных тарелку и поместите его на магнитную подставку. Разрешить бусины присоединиться для по крайней мере 30 s и удалить супернатант.
- Вымойте бусины 5 раз с 150 мкл ледяной Буфер RIPA мыть с помощью многоканальные пипетки. Во время стирки шаги, сделать не накапайте бисер, но перемещать магнит непрерывно справа налево для 30 s за мыть.
- Стирайте образцы дважды с 150 мкл ледяной буфера мытья RIPA-500.
- Стирайте образцы дважды с 150 мкл ледяной LiCl мыть буфера.
- Вымойте образцы с 150 мкл ледяной TE мыть буфера и немедленно удалить буфер TE. Этот шаг может быть опущен для низкого входного приложений.
- Добавьте управления вводом от шага 3.7 в свежих добра 96-луночных пластины, содержащие образцы ДНК чип.
- После стирки шаги добавить Элюирующий буфер мастер смесь (комнатной температуры) содержащий 44 мкл прямого Элюирующий буфер, 1 мкл РНКазы (20 мг/мл) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) за образец чипа и ввода для обратного сшивания.
- Проинкубируйте образцы с помощью ПЦР тепловой cycler для 4 ч при 37 ° C, 4 h при 50 ° C и h 8-16 на 65 ° C.
6. Очистка и количественная оценка осажденный ДНК
- На следующее утро, место образцы обратно на магнит и передачу супернатанта новой 96-луночных ПЦР-планшете, который содержит immunoprecipitated ДНК.
- Добавьте 2.3 x парамагнитных бусины решение (115 мкл для 50 мкл раствора) и тщательно накапайте вверх и вниз 25 раз с использованием многоканальные пипетки. Решение станет однородной, если правильно смешать.
- Инкубируйте решение при комнатной температуре от магнита на 4 мин место образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин удалить супернатант.
- Оставляя образцы на магните, 150 мкл 70% этанола (vol/vol) и инкубации при комнатной температуре за 30 s не нарушая бисер.
- Удаление этанола и повторите мыть. Разрешить парамагнитных бусины воздуха сухой на магните для 5 мин.
Примечание: Удалите все этанола после второй мыть как остальные этанола будет вмешиваться с очисткой. - Удаление образцов из магнита и 30 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Смешать, закупорить 25 раз и Проинкубируйте образцы при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
- Поместите образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин передачи 20 мкл каждого образца для новой 96-луночных пластины для приготовления библиотеки. Сохраните оставшиеся 10 мкл чип ДНК в случае любых возможных проблем с поколением библиотек.
- На данном этапе количественно чип ДНК до подготовки библиотеки. Концентрации ДНК измеряется с высок чувствительности ДНК реагенты. Определите размер распределение осажденный ДНК с помощью высокочувствительного ДНК electropherogram инструмент перейти к шагу 7.1.
7. Библиотека поколение с помощью комплекта библиотека подготовки ДНК Ultra II NEBNext
- Создайте библиотеки для секвенирования NGS, с помощью подготовки библиотеки ДНК после рекомендуемый протокол от производителя. Все реакции выполняются в 96-луночных пластины и инкубаций выполняются в PCR тепловая велосипедист с крышкой температуры > 100 ° C и объем на 50 мкл.
- Для индексов используются мультиплекс Oligos NGS платформы. Выполнение в общей сложности 10 x циклов для амплификации PCR, используя следующие параметры: первоначальный Денатурация при 98 ° C за 30 s, денатурации на 98 ° C 10 s, отжиг/расширение при 65 ° C для 30 s (10 x циклов), окончательное расширение 65 ° C за 5 мин и удерживайте при 4° C.
Примечание: Таблица 1 содержит Праймеры для амплификации PCR. - После амплификации PCR удалить образцы и довести объем до 100 мкл, с использованием воды, свободной от нуклеиназы. Выполнить выбор двухсторонний парамагнитных размера (0.55x/0.8x), Первый Добавление 55 мкл бисера и смешивать, закупорить 25 раз. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
- Поместите образцы обратно на магнит и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин. Этот шаг используется для сохранения больших фрагментов на бусы, которые подходят для виртуализации.
- Передать новой пластинкой ПЦР 96-луночных супернатант. Не выбрасывайте супернатанта как это содержит частично очищенная ДНК.
- Еще 25 мкл парамагнитных бусины и смешивать, закупорить 25 раз и инкубации при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
- Поместите образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин и удалить супернатант. Этот шаг используется для сохранения фрагменты ~ 200 до 600 ВР, который будет использоваться для завершения библиотек.
- Оставляя образцы на магните, 150 мкл этанол 70% (v/v) и позволяют инкубировать 30 s не нарушая бусины (не двигаться на магните). Удаление этанола и повторите мыть во второй раз.
- Разрешить парамагнитных бусины воздух сухой на магните для 5 минут удалить все этанола после второй мыть, как остальные этанола будет вмешиваться с очисткой.
- Удаление образцов из магнита и 25 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Смешать, закупорить 25 раз и инкубации при комнатной температуре от магнита на 4 мин место образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин.
- Количественно библиотек с помощью инструмента electropherogram ДНК высокая чувствительность до мультиплексирования чтобы убедиться, что размеры подходят для виртуализации. Завершенные библиотеки в диапазоне между 200-600 ВР и лишены всех Димеры праймера.
Примечание: В случае необходимости, другой 0,7 x парамагнитных шарик очистки производится для удаления нежелательных грунтовка димеры, которые присутствуют в ~ 130 bp. - Бассейн количественных ДНК, на основе уникального индекса грунты по концентрации. Для пула, содержащие шесть образцов с концентрацией 1 нг/мкл и 6ng/мкл распределение является 15 мкл низкие образца и 2,5 мкл высшей пробы. Это делается для обеспечения чтения, которые счетчики будут равномерно распределены на каждый Лейн потока ячейки.
8. Последующая обработка данных чип seq
- Трубопровод, основанные на snakemake,3839 используется для процесса все следующие шаги в одной команде. Важно отметить, что каждый из этих шагов обсуждаются индивидуально с связанные команды.
- Определить качество сырья fastq последовательности чтения с помощью FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Откройте терминал unix и измените каталог (cd) на папку, содержащую файлы raw fastq для каждого из шести модификаций гистонов. Тип терминала unix, fastqc *fastq.gz и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ]. Это будет работать метрики контроля качества на всех fastq файлов в папке.
- Совместите качества читает генома ссылку и удалить дубликаты перед сжатием файлов bam. Это выполняется с помощью Боути версия 1.1.239, SAMBLASTER версии 0.1.2140и SAMTOOLS версия 1.3.141: В unix типа терминала, bowtie -m 1 - n 1--Лучший--слоев -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | SAMtools Просмотр -Sb - > histone1.bam и нажмите кнопку [Возврат].
Примечание: path_to указывает папку, содержащую Ассамблеи генома человека hg19. Это будет меняться в зависимости от организма интерес. - Сортировка файлов bam, SAMTOOLS с помощью следующей команды: В тип терминала unix, samtools вроде histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Индекс файлов bam, SAMTOOLS с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools индекса histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai и нажмите [Enter].
- Определить однозначно сопоставленных и невыровненных читает, SAMTOOLS flagstat с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Нормализовать bam файлов каждого чтения графов, выполняя случайной выборки с помощью следующей команды: В тип терминала unix, Самбамба Просмотр bam -f-подвыборка-семя = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | SAMtools сортировка -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Индексировать файлы bam, снова SAMTOOLS с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools индекс histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai и нажмите [Enter].
- Чтобы визуализировать чип seq библиотек на генома браузер (т.е. UCSC или IGV), создавать файлы воротила помощью масштабирования bam файлы читает за kilobase за deepTools версия 2.4.040 млн (RPKM). Это можно выполнить, используя следующие команды:
- Для стандартных воротила файлов: В тип терминала unix, bamCoverage -b histone1. Downsample.Sorted.BAM--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw и нажмите клавишу {RETURN].
- Для ввода вычитается воротила файлов: В тип терминала unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--коэффициент вычесть--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Определение чип seq сигнал обогащения на фоне «Input», используя модель на основе анализа чип seq (ПДК) версии 1.4.225,26 и версии 2.1.0. Используйте macs1 для «точечный источник» факторов H3K4me3, H3K4me1 и H3K27ac и macs2 для «широкой источник» факторов, H3K79me2, H3K27me3 и H3K9me3. Это выполняется с помощью следующих команд:
- Для точечного источника: В тип терминала unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--держать dup все - n histone1.file и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Для широкого источника: В тип терминала unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM 1e - p-6--широкий--широкой среза 1e-6--держать dup все--nomodel - n histone1.file и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
- Использование ChromHMM24 для определения моделей комбинаторной хроматина государства на основе изменения гистона, учился, используя следующие команды:
- В терминале unix типа cd/path_to/ChromHMM_folder и нажмите [Enter].
- Однажды в ChromHMM тип каталога java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output и нажмите [Enter].
- Тип, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/каталог с выходными данными 15 hg19 и нажмите [Enter].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет иммунопреципитации из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий, которые могут быть выполнены на десятки образцов параллельно с использованием метода высок объём (рис. 1A). Хроматина фрагменты должны варьироваться от ~ 200-1000 bps для оптимального иммунопреципитации. Мы отметили, что время, необходимое для достижения такой же стрижка длиной отличается для разных тканей и типов клеток. Успех чип от небольшого количества ткани зависит от сохранения lysate холода во все времена, особенно во время sonication. Очищенный чип-DN Ashould быть количественно прежде чем приступить к подготовке библиотека (рисунок 2A). Завершенных библиотек для мультиплексирования и NGS следует диапазон между ~ 200-600 ВР и быть свободным от любых Димеры праймера (рис. 2B). После после последовательности, существует много контроля качества метрик, которые должны быть выполнены, прежде чем продолжить дальнейшие шаги трубопровода, например Мак Пик вызова или ChromHMM анализ (рис. 3). Многие из этих показателей могут быть определены с помощью программ, таких как FastQC и MultiQC. Качество fastq читает выравниваются в геноме человека со скоростью ~ 50-80% с максимум одного несоответствия. Рекомендуемая последовательность глубина составляет ~ 10-15 миллионов однозначно сопоставлены гласит «точечный источник» факторов и ~ 20-30 миллионов однозначно сопоставлены читает для «широкой источник» факторы27,,4142,43. Сортировки и индексированные BAM файлы используются для создания файлов воротила, которые могут быть визуализированы с помощью браузера генома как IGV или UCSC. Чип образцы должны пополняться над входной ДНК и каждого изменения гистона должен отображать собственный профиль, представляющий конкретный компонент эпигеномные ландшафта (рис. 4A). Вполне возможно, что в некоторых тканях будет более высокий уровень фонового шума, который может скрывать чип seq сигнала. В этом случае рекомендуется создавать файлы ввода вычитается воротила и повторно визуализировать на генома браузер. Чтобы определить состояние хроматина профили, мы используем алгоритм ChromHMM24. ChromHMM использует многомерный скрытой марковской модели для выявления наиболее известных повторного возникновения комбинаторная и пространственной хроматина моделей, основанных на изменения гистона учился (рис. 5). Используя эти шести модификаций ChromHMM идентифицирует хроматина функционально различных государств, представляющих репрессивных и активных доменов, например polycomb репрессий (состояние 1), гетерохроматиновые репрессий (статья 5), активные транскрипции (состояние 8 и 9) и Активные расширители (штат 13 и 14). Выход из ChromHMM включает в себя файлы сегментирована кровать для каждого государства, которое может далее использоваться для вниз по течению анализа.
Рисунок 1: работа поток для модуля чип. Биопсию опухолевой ткани сначала связь разорвана и сшитого захватить взаимодействий протеин дна. Ткани затем sonicated для получения подходит для иммунопреципитации chromatin фрагменты и ускорили гистон ДНК комплексы с использованием шести указанных антител. Пробы промываются, поменяны перекрестные ссылки и чип-ДНК очищается и количественно. Библиотеки создаются из очищенного ДНК и мультиплексированных согласно уникальные индексы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Electropherogram анализ очищенного чип-ДНК и подготовка завершена библиотеки. (A) представитель electropherogram из очищенного чип-ДНК содержащие хроматина фрагменты ~ 200-600 bp, которая подходит для подготовки библиотеки. (B) представитель electropherogram из библиотеки завершена после усиления и выбор двухсторонний парамагнитных размера, который подходит для мультиплексирования и NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Работа поток для модуля обработки данных чип seq. Работа потока отображение критических шагов для чип seq обработки данных и подготовки к течению анализа. Трубопровод, используемые в настоящем протоколе был создан с помощью snakemake, однако, каждый из этих шагов могут также быть выполнены индивидуально, как описано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представление браузера генома изменения гистона чип seq треков. A) чип seq треков, порожденных deeptools отображение активных и репрессированных регионов, окружающих locus Регулирующим в образце представитель меланома опухоли. Гены как НКО, CSDE1, SIKE1 связаны с все изменения активных гистонов (H3K27ac, H3K4me3 и H3K4me1) и активные транскрипции (H3K79me2), тогда как фланкируя гены, AMPD1, DENND2C и SYCP1 содержат polycomb репрессивных Марк H3K27me3 и не содержат активные транскрипции. B) чип seq треков, порожденных deeptools отображение готовой гетерохроматин через ZNF генов в представитель меланома опухоли образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : ChromHMM модель на основе образцов опухоль меланому. Профиль выбросов от 15-государство LearnModel, основанный на шести изменения гистона учился. ChromHMM определяет хроматина функционально различных государств, представляющих репрессивных и активных доменов, например polycomb репрессий (состояние 1), гетерохроматиновые репрессий (статья 5), активные транскрипции (состояние 8 и 9) и Активные расширители (State13 и 14 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий высок объём чип seq модуль для картирования генома общесистемной государств хроматина в человека опухоли тканей и клеточных линий. В любом протоколе чип seq одним из наиболее важных шагов является специфичность антитела. Здесь этот метод иллюстрирует иммунопреципитации условия описанные шесть изменения гистона, все из которых являются чип класс и были ранее утверждены в нашей и других лабораторий42,,4445 . Пока же концентрации антитела были успешно применены к различных других типов опухолей, важно определить специфичность антитела, если изучать различные факторы интерес27.
Еще одним ключевым аспектом для успешный эксперимент включает оптимизации условий sonication. Sonication время может меняться как между образца и ткани типа и должен быть соответствующим образом скорректированы. Для правильной оптимизации постепенно увеличивая время sonication и постоянно проверять размер фрагмента для каждого образца осуществляется пробный запуск. Для первоначального чип эксперимент хроматина фрагментов должен варьироваться между ~ 200-1000 bp для оптимального иммунопреципитации и очищенного чип-ДНК должны быть количественно прежде чем приступить к подготовке библиотеки. Этот фрагмент размер обеспечивает оптимальное поколения и удержания амплифицированного ДНК (~ 200 до 600 bp) которые будут использоваться для мультиплексирования и NGS. Если эти эксперименты в духе высокой пропускной способности, хорошей отправной точкой для мультиплексирования заключается в объединении ~ 8 проб в Лейн для виртуализации. Хотя это количество образцов может производить поверхностное последовательности глубины, это полезно для тестирования качества антитела прежде. Одним из узких мест объединения нескольких образцов является неравное покрытия после виртуализации. Обычно метод fluoremetric, основанный количественный используется, однако, многие раз это не эквивалент последовательности готовые молекул в каждой библиотеке. Лучший метод для количественный библиотеки ДНК состоит в использовании ПЦР с использованием стандартов сделал из заранее определенной последовательности готовые молекул ДНК.
Еще один важный шаг в чип-Seq анализ набора данных после последовательность обработки данных. Важно отметить, что прежде чем приступить к любому аспекту течению анализа существуют различные метрики контроля качества, которые должны быть выполнены прежде. Такие программы, как FastQC будет предоставлять информацию относительно качества сырья fastq последовательности чтения в виде передачи или не тестирование. В то время как fastq читает должен пройти большинство метрик, некоторые из более важных тестов включают базовые статистические данные, за базовый качества последовательности, последовательность показателей качества и адаптер загрязнения. FastQC обработано читает выравниваются по геному человека и следует сопоставить со скоростью ~ 50-80% с максимум одного несоответствия. Цены ниже, чем 50% может указывать на проблемы в чип, Библиотека подготовка или последовательности и может включать загрязнения, низкое качество чип-ДНК или чрезмерного усиления во время ПЦР. Во время преобразования Сэм BAM файлов дубликаты считывает сначала должно быть помечено и затем впоследствии удаляется с помощью SAMBLASTER прежде чем вниз выборки. В то время как некоторый уровень дублирования является нормальным во время ПЦР, высокий уровень дублирования обычно свидетельствует о низкого качества чип-ДНК, или, возможно, проблемы с подготовкой библиотеки. Выходы из FastQC, bowtie и samblaster (Объединенные в flagstat) может быть передан в MultiQC, который обеспечивает полный интерактивный резюме результатов контроля качества. MultiQC отображаются метрики контроля качества от выходных файлов fastqc, bowtie и samblaster, предоставляя информацию о базовой статистики, выравнивание проценты и ПЦР дублирования ставки соответственно.
После нормализации вниз выборки, следующий и вероятно самый важный шаг, является визуализация данных с помощью браузера генома как IGV или UCSC. Каждое изменение гистона представляет собой ключевой компонент эпигеномный нормативные ландшафта, включая H3K27ac (усилители), H3K4me1 (активных и готова усилители), H3K4me3 (промоутеры), H3K79me2 (транскрибируется регионов), H3K27me3 (polycomb репрессии), и H3K9me3 (гетерохроматиновые репрессии). С помощью этих знаков, самостоятельно или в комбинации, эти гистонами может определить активные, готовы или репрессированных усилители и промоутеров, а также транскрипционный анализ состояния кодирования регионов. Это было продемонстрировано с помощью ChromHMM, в котором были определены хроматина функционально различных государств, представляющих репрессивных и активных доменов. Эти государства были определены особых знаков, таких как polycomb репрессий (H3K27me3), hetrochromatic репрессий (H3K9me3) и активных транскрипции (H3K79me2), а также комбинаторные знаки, такие как Активные расширители (H3K4me1 и H3K27ac) и транскрипции усилители (H3K4me1, H3K27ac и H3K79me2).
Представлена интегрированная платформа хорошо подходит для определения заполненности гистонами или факторы транскрипции от образцов тканей. Мы успешно использовали этот протокол для определения заполненности вышеупомянутых шести марок от меланомы биопсия размер образцов. Однако мы еще не определили наименьшее количество ткани, необходимых для успешного чип-Seq приложений, потому что это depenedent на ткани, а также доступные антитела. Кроме того хотя мы регулярно использовать этот протокол на свежий, флэш-замороженных и замороженных образцов OCT, мы не оптимизированы этот протокол для FFPE тканей. Некоторые недавние исследования сообщили протоколы для таких тканей46,47 , и предлагаемые изменения могут быть включены в рамках этой платформы, чтобы проверить ли представленные платформа будет полезным из FFPE тканей. Мы считаем, что это будет весьма полезным при определении структур хроматина государства из клинического материала, полученных от пациентов под клинических испытаний. В целом этот протокол описывает полный и всеобъемлющий чип seq модуль для картирования генома общесистемной государств хроматина в тканях человека опухоли, с легко следовать инструкциям, охватывающий все необходимые компоненты для успешного эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, никаких конфликтов.
Acknowledgments
Мы благодарим Маркуса Койл, Кертис Гамбс, ядро SMF в MDACC для поддержки виртуализации. Работа, описанная в этой статье была поддержана грантов от гранта NIH (CA016672) для SMF ядро и NCI награды (1K99CA160578 и R00CA160578) к. р.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - IgG-free | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag - 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
