Summary
本文介绍了小鼠胚胎发育过程中造血干细胞前体的克隆分析方法。我们结合内皮细胞共培养和移植对胚胎主动脉-性腺-中区单细胞的指标进行分类, 以表征单造血前体的表型性质和植入电位。
Abstract
在胚胎发育过程中, 研究造血干细胞 (hsc) 成因的能力受到了早期胚胎中 HSC 前体稀有性的限制, 缺乏检测功能, 可以识别长期的多向植入潜能。个人假定的 HSC 前体。在这里, 我们描述的方法, 使功能验证的 HSC 前体在单细胞水平的分离和鉴定。首先, 我们利用索引排序来编目每个单独排序的细胞的精确表型参数, 使用表型标记的组合, 以丰富的 HSC 前体和附加标记的实验分析。其次, 每个指数排序细胞都是由主动脉-性腺-中 (嫁接) 区的血管位质基质共同培养的, 它支持非 hsc 前体的成熟与多向的功能性 hsc, 长期植入电位在移植化验。这种方法使克隆 hemogenic 前体的表型性质与其功能植入电位或其他特性 (如转录剖面) 的相关性, 为 HSC 前驱物的详细分析提供了手段。在单个单元格级别上进行开发。
Introduction
克隆研究揭示了成人 HSCs 长期植入特性的异质性, 为 hsc 亚型和在老化的1中的 hsc 行为变化提供了新的见解。然而, 对胚胎 HSCs 及其前体的类似研究更具挑战性。在早期胚胎发育过程中, HSCs 产生于一种称为 hemogenic 内皮的前体, 在一个瞬态过程中称为内皮细胞到造血转换2。第一个 HSC, 定义的能力, 提供强健, 长期多向植入后移植到条件成年接受者, 直到胚胎天 10.5 (E10.5) 后, 在小鼠胚胎, 在非常低频率3.在它们的发展过程中, hemogenic 内皮引起的 hsc 前体 (hsc) 必须在获得成年 HSC 的特性之前进行成熟, 从而在移植化验中允许有效的植入4,5,6. 模糊了罕见的 HSC 起源的研究, 在从前 hsc7、8出现之前, 已经检测到大量具有红、髓系和淋巴电位的造血祖细胞。因此, 区分前 hsc 与其他造血祖细胞需要的方法, 以无性分离的干细胞, 并提供足够的信号, 他们成熟的 hsc, 以检测其植入的性质, 在移植化验。
已经描述了许多方法, 允许通过 " 体外" 或体内成熟度检测 hsc。"前体" 方法依赖于胚胎组织的区域性, 例如, 在开发9中检测到第一个 HSC 的 "年会" 区域。在这些方法的基础上, 结合了周年大会组织的分离、分类和再聚合的协议, 允许在 E9.5 到 E11.5 的准主动脉的发育过程中含有 HSC 前体的排序种群的特征。splanchnopleura (P Sp)/股东大会区域4,5,10;然而, 这些方法不适用于克隆分析所需的单细胞水平的前体高通量分析。同样,在体内通过移植进入新生小鼠, 在这种情况下, 假设微环境更适合于早期的 HSC 前体的支持, 也使从蛋黄囊中分类的种群的研究和周年大会/p sp (p sp 是年度股东大会的前体区域), 具有预 HSC 的特点, 但这些方法也未能为单个单元分析1112提供一个健壮的平台。
从 Rafii et . 的研究表明, Akt 活化内皮细胞 (EC) 基质可以提供一个利基基质支持成人 HSC 自我更新体外13,14,15。我们最近确定, 由年会 (Akt) 衍生的欧共体 (年会) 提供了一个适当的体外利基, 以成熟的 hemogenic 前体, 早在 E9 的发展, 对成年嫁接 HSC, 以及随后自更新生成的 HSC16。鉴于该系统采用了简单的2维共培养, 它很容易适应克隆分析的 hemogenic 前体独立的 HSC 潜力。
我们最近报告了一种方法来检测克隆 hemogenic 前体的 HSC 潜力, 结合 hemogenic 前体的小鼠胚胎的指数排序与年会-欧共体共培养和随后的功能分析移植化验17。索引排序是一种荧光活化细胞分选模式, 它记录 (索引) 所有表型参数 (即、正散射 (FSC a)、侧向散射 (SSC a)、荧光参数), 从而使这些特征可以追溯到后续功能分析后的排序。资产管制系统软件记录每个单元的表单信息, 以及放置在其中的96孔板的位置/井。这种技术以前很优雅地用于鉴定成人 hsc 中的异质性, 确定进一步丰富 hsc 长期嫁接子集的表型参数, 并将 hsc 的表形参数与转录相关联。单个单元格级别的属性18,19。在这里, 我们提供了这种方法的详细方法, 使识别独特的表型参数和谱系贡献的前 HSC 在胚胎发育的早期阶段。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了弗雷德哈钦森癌症研究中心机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 为共同文化准备年会-EC 膜
- 24小时前的年会解剖和排序, 使年会-欧共体文化媒体和过滤消毒。
- 在水中加入0.1% 明胶 (100 µL/井), 每井96井板, 并在室温下孵化15分钟. 吸入明胶, 将盘子放在组织培养罩中, 除去盖子, 直到水井干涸为止。
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将股东大会-EC 单分子膜和板材与96井板分离。
注: 在股东大会-欧共体文化媒体上, 保持前述16所准备的股东大会-ec。为了保持一致性, 应在获得足够数量 (一般为 1-3) 的情况下, 尽快冻结年会的细胞线, 并在定义的通道号 (一般通过 5-12) 中用于共培养实验。欧共体细胞系由 C57BL/6J (CD45.2) 股东大会获得。有关所有媒体组合的材料表, 请参见。- 从75厘米2烧瓶中的股东大会-EC 文化中吸取媒体, 并添加5毫升 PBS。吸入 PBS, 并添加3毫升胰蛋白酶溶液 (见材料表)。
- 孵育37°c 2-4 分钟, 直到大多数细胞从盘子上抬起。添加7毫升的年会-EC 培养基和吸管8-10 倍, 10 毫升吸管, 以准备单细胞悬浮, 并转移到15毫升管。
- 旋转 300 x g 5 分钟, 移除上清, 在10毫升的年会-EC 培养基中重新悬浮, 并用 hemocytometer 估计细胞数。将细胞稀释成浓度为 1 x 105细胞/毫升的年会-欧共体文化媒体。
- 增加100µL 年会-欧共体细胞悬浮 (1 x 104细胞) 到每个井糊96井板材。在一夜之间放置37°c, 5% CO2组织培养孵化器, 让年会-欧共体附上和形成一个汇合的单层。
注意: 均匀分布的年会-EC 基质细胞, 所以有有限的过度生长或细胞聚集, 以最佳的共同培养。 -
为股东大会共同文化准备年会-EC 单层。
- 第二天早上, 准备年会无血清的媒体。
- 使用12井多通道吸管, 从股东大会上删除欧盟联盟的文化媒体, 并添加200µL/井的年会无细胞因子的无血清介质, 以冲洗掉任何残留的含血清介质。
- 删除媒体, 并添加200µL/良好的年会无血清培养基与细胞因子。在移除和添加介质时快速工作, 使内皮层不致受损;例如, 一次移除和重新添加媒体一行。将96井板放在组织培养孵化器中37摄氏度, 直到胚胎细胞准备好进行排序。
2. 小鼠胚胎组织单细胞悬浮液的制备
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从定时的交配中剖析股东大会。
- 设置定时交配, 以生成所需年龄的胚胎组织。
- 在9.5 至11.5 天后 coitum (dpc), 根据预 HSC 的阶段进行分析, 从孕妇中收获胚胎。
注意: 胚胎组织是从 C57BL/6J (CD45.2) 小鼠身上收获的, 如先前所描述的, 并基于 somite 计数16精确分期。我们专注于从 somite 分期的 E9.5 到 E11.5 的胚胎周年大会区及其前驱体的种群分析。 - 从胚胎20中解剖周年大会。
注: 其他20公布了从小鼠胚胎中剥离周年大会的详细协议。另外, 也可以用这种方法分析卵黄囊或其他组织的可能具有预抗性活性的细胞。
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分离解剖的胚胎组织。
- 收集15毫升圆锥管中的解剖组织, 其中含有10毫升 PBS, 冰上有10% 个血清。重力沉降组织, 吸入 PBS/血清, 然后立即添加1毫升0.25% 胶原酶和放置在37°c 水浴25分钟。
- 添加1毫升的 PBS/10%fbs 和吸管约20-30 倍1毫升吸管提示, 以获得单个细胞悬浮。增加8毫升的 PBS/10%fbs 和离心细胞在 300 x g 5 分钟。
3. 小鼠胚胎细胞的抗体染色
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准备用于抗体染色的阻塞缓冲器。
- 添加10µg/毫升抗小鼠 CD16/CD32 (Fc 受体 (FcR) 块) 和1µg/毫升 DAPI (1 毫克/毫升股票在 H2O) 到1毫升 PBS 与10% 血清。
- 在3毫升注射器中绘制, 通过一个0.22 µm 注射器过滤器进行杀菌。将细胞颗粒从分离的小鼠胚胎组织 (从步 2.2.2) 中重新悬浮在500µL 阻塞缓冲液中, 在冰上孵育5分钟。
- 准备抗体组合17。
- 添加10µg/毫升 FcR 块到1毫升 PBS 与10% 的血清和10µL 的每 fluorochrome 共轭抗 VE 钙粘蛋白抗体 (CD144, 见材料表) 和 fluorochrome 共轭抗 EPCR 抗体 (CD201, 见材料表)。使用1:100 的最终稀释抗体, 除非另有说明根据制造商的建议或根据滴定。
注: 此抗体组合用于定义用于排序的门, 如下所述 (步骤 4.2)。基于 VE 钙黏蛋白和 EPCR 的共表达式排序, 可以显著地丰富包含 HSC 前体活动的股东大会派生细胞的一部分, 如前面所描述的17。 - 添加额外的 fluorochrome 共轭抗体, 进一步表型分析的个别指数排序前体。
注意: 这些抗体不一定用于定义用于排序的门。在这个样本协议中, 我们包括了 PE 共轭 anti-CD41 抗体和 FITC 共轭 anti-CD45 抗体, 以分析这些造血标记物的相对表达, 这些基因在从 hemogenic 内皮细胞出现前 HSC 的发生过程中演化为4 ,5,16,17。其他感兴趣的标记可以按需要包括在内。用 fluorochrome 共轭同种抗体控制染色的样品用于定义阴性和阳性门进行分析。 - 在3毫升注射器中绘制抗体组合, 通过一个0.22 µm 注射器过滤器进行杀菌。添加500µL 的抗体混合到细胞悬浮在阻塞缓冲, 吸管混合, 并在冰上孵化至少15-20 分钟。
- 添加10µg/毫升 FcR 块到1毫升 PBS 与10% 的血清和10µL 的每 fluorochrome 共轭抗 VE 钙粘蛋白抗体 (CD144, 见材料表) 和 fluorochrome 共轭抗 EPCR 抗体 (CD201, 见材料表)。使用1:100 的最终稀释抗体, 除非另有说明根据制造商的建议或根据滴定。
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清洗染色的细胞。
- 加入8毫升 PBS/10%fbs。离心细胞在 300 x g 5 分钟, 吸入, 并重新悬浮细胞颗粒与1毫升 PBS/10%fbs。
- 通过在5毫升管上通过35微米细胞过滤器盖吹打细胞悬浮液来去除细胞团簇。用另外的3毫升 PBS/10%fbs 清洗细胞过滤器。离心细胞在 300 x g 5 分钟, 吸入, 重新悬浮在500µL PBS/10%fbs, 并放置在冰上, 直到外地资产管制。
4. 对96井的单 Hemogenic 前体进行指数排序, 并与年会-EC 基质共培养
- 根据制造商的指示, 准备用于板模式的流式机, 并对齐96井板。在软件中选择 "单个单元格模式" 和 "索引排序" 模式, 以实现最大纯度掩码设置, 并为每个已排序的单元格获取索引参数。
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从抗体染色样品中获取细胞样本, 以设置门进行排序。
- 将染色的细胞样本加载到该机器上, 并以最低的流速获取细胞。情节 FSC-一节, 并选择一个门, 其中包括不同大小的细胞 (图 1B) (这是基于观察, 预 HSC 活动是在股东大会17的不同大小配置文件的单元格中标识)。剧情 fsc-一节 fsc-w 和 ssc-一节的经文-w, 并选择门排除双峰。然后绘制 FSC-一节 DAPI 到门活单元格 (DAPI 的负数) (图 1B)。
- 绘制 PECy7 (或相关 fluorochrome 的 VE 钙黏蛋白染色) 与 PerCP (或 EPCR 染色相关 fluorochrome)。对 VE 钙黏蛋白 (包括内皮细胞混合种群以及造血祖和预 HSC) 具有高 EPCR 表达 (从 P Sp/周年大会中丰富的前 hsc) 的门细胞 (由 p--17) 组成。这是将用于在步骤4.3 中对单个单元格进行索引的最后一个门 (图 1B)。
- 绘制用于染色的附加荧光。
注意: 根据要分析的亚群, 可以根据检测到的其他标记对染色细胞进行设置。但是, 索引排序可以记录每个已排序单元的荧光参数, 以便对这些参数进行回顾性分析。因此, 在这一点上不需要额外的浇口。对于所有的外地管理装置, 使用单一抗体染色的样本应用于调整补偿, 以说明重叠荧光的排放溢出, 以及同种控制抗体, 以说明背景染色并确定负/正门。
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索引对年会单元进行排序。
- 放置一个96井板与年会-EC 基质在年会上与细胞因子 (从步骤 1.5.3) 在板块块的流媒体分拣机。加载示例并开始采样获取。选择索引排序/单细胞模式, 并开始 sortingsingle 单元格到单个96井。使用最低流速最小化胚胎细胞的剪切应力。
- 确保在索引排序过程中记录所有事件。这将使在排序门中分析的单元格总数相对于与单个96井排序的实际数字进行计数, 因为并非所有记录的事件都将被分类为水井。
- 一旦细胞被整理成一个完整的96井板, 把盘子放在一个组织培养孵化器, 在37摄氏度设置在 5% CO2。重复每个实验所需的额外板材。
- 共培养96口水井中的个体分类细胞 (从步骤 4.3) 到7天 (从 E11-11.5 胚胎排列的细胞5天, 从 E10-10.5 胚胎的6天, 7 天 E9-9. 5 个胚胎)。在共培养期之后, 在100X 放大倍数 (图 2B) 上, 可视化各种大小和形态的造血菌落。
注意: 在共用文化期间不需要更改媒体。排序的 hemogenic 前体最初可能会与 ec 类似的形态结合到股东大会-ec 层, 并且最初不能与股东大会-ec 基质 (图 2A) 区分开来。然而, 在共培养24-48 小时后, 可以检测到小的、圆形的造血细胞或细胞簇。在共培养 (5-7 天) 结束时, 可以在96井的子集中可视化造血细胞的个体菌落, 该群接收到具有克隆造血电位的有序细胞。如果目视检查的水井包含多个不同的菌落, 则此样本被排除在下游分析之外, 以排除可能接收了多个单元格的样本。
5. 共培养后克隆造血后代的分析
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从每 96-井中收获克隆, 以进行资产管制分析。
- 大力吸管用200µL 吸管贴士的多通道吸管将造血细胞从内皮层中分离出来。尽量不要分离内皮层。去除100µL (约50% 的样本), 用于表型分析的造血后代通过外地资产管制署。
- 转移到一个96井 V 底板和离心机在 300 x g 2 分钟, 以颗粒细胞。当板块反转时, 用单片快速运动将介质从板上弹出来, 将介质移开 (轻拍板)。
- 将剩余的100µL 细胞放在原来的96井板中, incubatorfor 在随后的植入化验中使用37°c (步骤 6)。
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用适当的抗体对细胞进行造血分析。
- 在96井 V 底的每个井中重新悬浮细胞小球, 50 µL PBS/2%fbs, 其中10µg/毫升 FcR 块和1µg/毫升 DAPI。在4摄氏度孵化出5分钟的盘子。
- 添加50µL PBS/2%fbs 含有10µg/毫升 FcR 块和一个抗体组合, 包括 PE-Cyanine7-conjugated 抗 VE 钙黏素, PerCP 共轭 anti-CD45, PE 共轭抗 EPCR, APC 共轭 anti-Sca1, 和 FITC 共轭 anti-Gr1 和anti-F4/80 (每个抗体在1:100 最终稀释, 除非另有说明根据制造商的建议或根据滴定)。在4摄氏度孵化出至少20分钟的板材。
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用顺序稀释去除未绑定抗体, 并对细胞进行分析。
- 添加200µL/井 PBS/2%fbs 和离心机在 300 x g 2 分钟, 以颗粒细胞。然后, 轻拍板丢弃上清, 并添加200µL PBS/2%fbs 到每个细胞颗粒和离心机在 300 x g 2 分钟的颗粒细胞。
- 轻拍板丢弃上清, 并添加50µL/井 PBS/2%fbs 进行分析。使用装有平板阅读器的流式细胞仪, 进行单元格的分析。
注: 获取固定体积的细胞 (例如, 35 µL 50 µL 用于重新悬浮), 以列举造血后代的子集。
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分析每个含有造血后代的井的数据, 以筛选包含 HSC 电位的菌落 (图 3)。
- 门首先 CD45 阳性的人群是阴性的髓系标记 Gr1 和 F480。不要门外的细胞仍然表达低浓度的 VE 钙黏蛋白。在造血菌落的收获过程中被打乱的股东大会-欧共体层细胞是 VE 钙黏素阳性和 CD45 阴性。
- 门 CD45+VE-Cad-/低Gr1 F4/80-单元格, 该子集表示高级别的 EPCR 和 Sca1 (图 3A -C).
注意: 在以前的研究中, 缺乏单元格的 CD45+VE-Cad-/低Gr1 F4/80 Sca1hiEPCRhi表型 (图 3D) 重现性未能提供可检测的多向外周血植入在辐照受体小鼠中的作用17 (未显示数据);因此, 在步骤6中不需要将这些菌落包括在后续的移植分析中。
6. 单个无性系的植入特性分析及其与表型性质的关系通过指数排序阐明
- (如果可能的话) 或早晨在步骤5中的表型分析后, 重新暂停其余100µL 细胞从每个96井包含造血菌落后, 共培养 (从步骤 5.1) 的积极吹打使用200µL 吸管提示。
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从同类系菌株 B6 的全骨髓中制备并添加抢救细胞。SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) 成年小鼠16,17。
- 在 hemocytometer 下对土耳其人溶液中有核的骨髓细胞进行计数。稀释到 5 x 105有核细胞/毫升的浓度, 在 PBS 与2% 的血清。
- 将100µL 的骨髓细胞 (5 x 104) 添加到每个含有造血子代的井中, 用于移植分析和吹打混合。
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移植后代的个体克隆成一个单一的致命辐照接受同类系菌株 B6。SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) 成体鼠标。
- 致命照射相同数量的 B6 CD45.1 小鼠作为克隆的数量, 以单独注入一个单一克隆的后裔 (使用 1000 cGy 从铯源)。
- 绘制200µL 总细胞悬浮 (这包括从克隆的细胞以及 5 x 104 B6 CD45.1 抢救骨髓细胞) 成½毫升胰岛素注射器与29G ½英寸针。
- 致命照射 B6 CD45.1 成人接受者在注射前2-24 小时。
- 使用一个塑料鼠标抑制剂, 允许尾部访问, 注射通过尾静脉200µL 卷包含两个细胞从每个克隆和 5 x 104 B6 CD45.1 成人骨髓救援细胞, 以帮助接受者生存。
- 耳朵标记和体重的受体小鼠, 并检查他们的体重/健康定期 (例如, 3-4 次/周后照射/移植, 或每一个机构标准操作程序), 以确保良好的健康。
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在移植后定期对外周血植入进行分析 (例如、2、16、24周)。
- 清除50-100 µL 的血液通过复古轨道出血或另一种道德上批准的血液允许方法。
- 添加3毫升裂解缓冲液 (16.6 克 NH4Cl, 2 克 NaHCO3和74.4 毫克 EDTA 到2升 H2O) 对血液和孵育在室温下为5分钟离心机在 300 x g 为5分钟抽吸和再暂停球团与2毫升 PBS/2%fbs。离心机在 300 x g 5 分钟。
- 重新悬浮颗粒与150µL PBS/2%fbs 含有10µg/毫升 FcR 块和1µg/毫升 DAPI, 并分配1/3 的体积为一个包含50µL 同种控制的捐助者和血统, 1/3 到一个含有50µL 抗体的供方和同种控制的血统, 1/3 到含有50µL 抗体的油井, 以检测捐献者和血统。
注: 检测多向植入的抗体: APCeFluor780-conjugated 抗 CD45.2、Pe-Cyanine7-conjugated 抗 CD45.1、FITC 共轭 anti-CD3、Pe 共轭 anti-F4/80、PerCP 共轭 anti-Gr1 和 APC 共轭 anti-CD19, 或相关的同种控制。 - 通过对 CD45.2 (供体) 衍生造血细胞与髓系 (Gr1 和/或 F4/80 阳性)、B 细胞 (CD19 阳性) 和 T 细胞 (CD3 阳性) 的时间进行评估外周血贡献来确定长期植入的克隆 (图4A -b)。
注: 造血植入也可以通过 CD45.2 (供体) 对从骨髓、脾脏、胸腺和腹膜获得的组织中的造血细胞的贡献, 或继骨髓干细胞的二次移植来分析。到 B6 CD45.1 鼠标来分析串行植入属性17。
- 将每个克隆的表单属性与初始单个单元格索引排序所确定的植入属性关联起来。使用流分析软件, 上载每个索引排序的单元格的排序参数 (相关的 96-好, 它被排序)。将功能数据映射到流图, 以评估单个单元格的表单属性 (例如, 长期、多向植入) (图 4C)。
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Representative Results
图 1A显示了实验设计的示意图。一旦在胶原酶中解剖、汇集和分离了 p-Sp/年会组织, 就会对 VE 钙黏蛋白和 EPCR 的抗体染色, 以进行指数排序。在 VE 钙黏蛋白+EPCR高(图 1B) 中排序的单元格中, 预 HSC 被丰富。其他 fluorochrome 共轭抗体可包括在回顾性分析其他表型参数, 这是记录的每个细胞在索引排序。在 E11 年会的这一典型实验中, 细胞也被 FITC 共轭 anti-CD45 和 PE 共轭 anti-CD41 抗体染色。在本阶段5的造血发育的已知异步性方面, 观察到了用于这些造血特定标记的 VE 钙黏蛋白+EPCR高填充物中的异质性 (图 1C)。
对单 VE-钙黏蛋白+EPCR高年会细胞进行索引排序后, 将在年会上包含了无血清培养基和细胞因子的单个96井, 并发生菌落形成。最初, 已排序的 VE 钙黏蛋白+EPCR高股东大会在它们开始四舍五入和形成造血簇之前, 将其整合到年会-欧共体层 (图 2A, 这里显示从基因组中的细胞从表达 GFP 的转基因小鼠胚胎在Ly6a启动子21下, 将它们与股东大会-EC 基质区分开来)。经过5-7 天的共同文化, 各种大小和形态的殖民地可以通过检查与倒置显微镜 (图 2B), 显示在这里从一个代表性的实验, 6 天后, 从 E11 年会排序。
接下来, 将在每个 VE 钙黏蛋白+EPCR高细胞的一半的子代上进行表型分析, 并形成造血菌落。包含 HSC 表型细胞的菌落被识别为 VE 钙黏蛋白-/低Gr1-F4/80-CD45 Sca1hiEPCR喜(图 3).在这里, 我们展示了四个不同的殖民地获得了以下共同文化的索引排序 E11 周年大会 VE 钙黏蛋白+EPCR高细胞, 三包含不同比例的表型 HSC 与其他更有区别的细胞类型 (图3A -C), 第四缺乏具有 HSC 表型的单元格 (图 3D)。每个被镀细胞数的菌落数和导致 engraftable 干细胞菌落数量的百分比因胚胎年龄和进行排序而异。VE 粘附素-/低Gr1-F4/80 CD45 Sca1hiEPCR喜E11 周年大会克隆产生了 53 15 个殖民地192个细胞镀与 5% @ 1.3% 细胞镀生成克隆, 嫁接长术语 (平均为3实验)。
为了使表型与植入电位相关联, 每个 VE 钙黏蛋白+EPCR高单元的后代的其余一半, 它已经形成了一个包含有 HSC 表型细胞的造血菌落 (例如,图 3AC中所代表的菌落被移植到辐照 (1000 cGy) 成体同类系菌株 (B6 CD45.1) 小鼠身上, 同时还有一大群 B6 CD45.1 骨髓的抢救细胞。长期多向植入是确认每个克隆通过以下捐助者 (CD45.2) 贡献的髓体 (Gr1 和 F4/80), B 细胞 (CD19) 和 T 细胞 (CD3) 间隔时间的外周血 (图 4A)。虽然大多数含有 HSC 表型细胞的菌落都提供长期植入, 但移植是确认功能多向植入的必要条件, 因为某些克隆会随着时间的推移而失去植入 (图 4B), 或者显示独特的植入属性, 如淋巴偏向植入 (未显示数据)。确定了每个 VE 钙黏蛋白+EPCR高克隆的功能 HSC 潜能后, 这与该克隆的索引排序参数相关联, 以确定其精确的表型特征。在本例中, 我们看到功能确认的 HSC 前克隆 (红点) 在其 CD41 和 CD45 表达式中是异质的, 与这些标记在预 hsc 成熟到 hsc (图 4C) 中的既定动态表达式一致。克隆形成造血菌落, 但缺乏 HSC 潜能的表型筛选或缺乏长期, 多向植入后移植 (非 HSC hemogenic 克隆, 蓝点) 也异质的 CD41 和 CD45,虽然子集表示较高级别的 CD41 与前 HSC 克隆相比, 后者主要 CD41低。未形成造血菌落 (非 hemogenic 克隆、浅绿色点) 的克隆主要 CD41-/低CD45, 这可能反映非 hemogenic VE 钙黏蛋白+EPCR高内皮细胞。
图 1: 单个单元格索引排序的协议概述和代表性流式细胞分析.(A) 协议的示意图表示形式。(B) 分离 E11 的流式细胞术分析显示了用于 VE 钙黏蛋白+EPCR高单元的索引排序的门策略 (使用资产管制系统分析软件分析)。每个栅极中的数字表示单元格的百分比。(C) 流式细胞仪分析显示 CD41 和 CD45 在 VE 钙黏蛋白+EPCR高人群中的染色。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在年会-欧共体联合文化期间形成造血殖民地.(A) VE 钙黏蛋白+EPCR高GFP+从Ly6a-GFP转基因胚胎21在周年大会上共同培养的序列化细胞的时间推移成像。µm 中的刻度条显示在每个图像的左下角。(B) 由 VE 钙黏蛋白+EPCR高索引排列的单个单元格组成的具有代表性的殖民地, 在6天的年会上共文化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 流式细胞仪分析单 E11 的后代在股东大会上共同培养的 EPCR高单元格中, 由一个单一的、由周年大会衍生的 VE 钙黏蛋白+.对于具有 HSC 电位的单元格的浇口显示为-/低Gr1F4/80- (左面板)、CD45+ (中间面板) 和 Sca1hiEPCRhi (右面板) 的子集。(A) 代表群体, 由具有 HSC 表型的细胞同质种群组成。(B-C)有代表性的菌落, 含有混合的细胞与 HSC 表型和更分化的细胞类型。(D) 代表群体, 由缺乏 HSC 表型的细胞组成。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 植入与指数排序参数的相关性, 对个体无性系后代的外周血进行分析.(A) 捐赠者 (CD45.2) 衍生的外周血植入髓系 (Gr1 和 F4/80)、B 细胞 (CD19) 和 T 细胞 (CD3) 亚群, 从代表受体 (B6 CD45.1) 中移植到单个 E11 VE 钙黏蛋白+EPCR高按照股东大会-欧共体联合文化进行克隆。(B) 捐赠者 (CD45.2) 衍生的外周血植入随着时间的推移, 个体 E11 VE 钙黏蛋白+EPCR高无性系继欧盟联盟的共同文化之后。(C) 对每个索引排序的 VE 钙黏蛋白+EPCR高克隆的 CD41 和 CD45 表达式之间的相关性, 其 HSC 潜力是基于长期的多向植入在移植试验中的联合培养。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
研究胚胎发育过程中的 hsc 成因, 需要检测 hemogenic 前体中的 hsc 电位, 但在移植成人接受者中缺乏提供长期多向造血重建的能力。在本议定书中, 我们提出了一种克隆方法的胚胎 hemogenic 前体之间的基质共培养的血管位, 从大会, 支持成熟的前体对 HSC, 并随后功能分析的移植化验。纳入索引排序允许回顾性分析的表型参数, 以表征前 HSC 的性质, 由表面标记的定义包括在化验。因此, 这种方法比其他依赖于基于重新聚合的 HSC 检测的前体群排序的方法具有优势:4,5,10, 为潜在标记提供有效的筛选, 同时提供有关每个单元格表面标记的相对表达式级别的信息。例如, 使用这一方法, 我们以前报告说, 除了使用 EPCR 在不同发育阶段对前 HSC 种群进行丰富, 凹槽配体的中间表达 Dll4 进一步定义了克隆的亚群VE 钙黏蛋白+EPCR+前体具有 HSC 电位, 而 Dll4 负 VE 粘附素+EPCR+ hemogenic 前体大多缺乏 HSC 潜在的17。
此方法的另一个优点是能够在基于表型 (VE-粘附素-/低Gr1 F4/80-CD45+Sca1) 检测到的造血后代的联合区域性下立即筛选 HSC 潜能.您好EPCRhi), 它与长期的、多向的植入相关。这消除了移植缺乏造血后代的群体与此 HSC 表型的需要, 因为这些殖民地不提供长期植入的移植化验。此外, 初步信息区分潜在的前 hsc 从 hemogenic 前体缺乏 hsc 的潜力立即跟随共同文化, 不需要等待的结果从长期植入化验, 是有用的, 例如, 在迅速筛选 HSC 前体的候选标记。然而, 与移植后长期植入的表型数据的相关性, 提供了额外的宝贵的洞察力的变化, 精确植入性质的前 HSC 克隆。例如, 我们发现, 在 E9.5 和 E11.5 之间的 P Sp/周年大会区域, 克隆前 HSC 具有独特的潜力, 可以产生 B1a 和 B2-lymphocytes, 而 B1a-lymphocyte 潜能在成人 HSC17中是缺乏的。此外, 我们发现在 E9.5 和 E11.5 之间的植入性质的进化, 早期的前 hsc 表明相对倾斜的腹膜 B1a 节 B2-lymphocyte 植入和不太健壮的自我更新潜力基于在二次移植化验中17。
虽然本议定书提供了一种有价值的方法来阐明克隆 HSC 前体的独特性质, 但必须承认一些限制。虽然与长期的多向植入, 但与此表型相关的一些菌落在一个或多个方面只提供短期植入或植入不足造血血统 (图 4B; 未显示的数据)。因此, 移植仍然是验证功能性 HSC 的金标准。此外, 不能排除的是, 植入性质的一些差异, 而不是反映细胞内在差异的 hemogenic 前体电位, 可能是由于随机变异期间, 欧共体联合文化在自我更新的诗句分化决定, 因为前 hsc 是同时成熟到 hsc 和正在进行细胞分裂。事实上, 这可能在某种程度上考虑到不同的前 hsc 克隆 (例如、图 3A-C) 所产生的菌落形态和表型的异质性, 并可能导致对预 hsc 的低估。这项检测, 如果不是所有潜在的前 hsc 克隆是发现的功能 hsc 的世代后, 欧共体联合文化。但是, 通过此方法启用的独特表型标记 (如 Dll417) 的差异表达式区分功能不同的 hemogenic 克隆的能力提供了一种方法, 用以确定 hemogenic 前体的亚群, 并内在的细胞-内在的差异。
在这个基本协议的基础上, 可以包括一些扩展的应用, 以进一步研究克隆 hemogenic 前体在发育过程中的造血潜能。除了使用抗体检测表面标记, 转基因胚胎中荧光标记的表达 (e. g, Ly6a-gfp21或Runx1-GFP22在 hemogenic 内皮/预 HSC 中表达) 可以hemogenic 前体指数分类的合并。除了经年会-欧共体联合培养检测假定的前 HSC 的移植化验外, 还可以根据次级体外检测 (如 OP9 或 OP9-Dl1 上的培养) 来评估造血谱系电位, 以发现 B 和 T 细胞潜在的23或克隆在纤维素中形成检测 erythromyeloid 电位的菌落。实际上, 某些非 HSC hemogenic 克隆 (例如、图 3D) 可能代表了以前描述的多能祖、erythromyeloid 祖细胞或 T 和 B 单元格祖先, 并且独立于 hsc 开发8,24,25,26,27,28, 此检测可进一步促进对这些明显的造血前体波的克隆研究。最后, 前 hsc 的索引排序可以结合其他下游分析, 如单细胞 RNA 排序, 以关联表型性质与全球转录剖面的发展 HSC 前体。总之, 本协议提供了一种从胚胎 hemogenic 前体中对克隆造血进行健壮分析的方法, 为 HSC 的发展提供了新的见解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢安德鲁. 伯格, 史黛西 Dozono, 和布莱恩 Raden 在弗雷德. 哈钦森流式细胞术核心协助与外地资产管制。这项工作得到了国家卫生研究院 NHLBI UO1 赠款 #HL100395、辅助合作赠款 #HL099997 和 NIDDK 赠款 #RC2DK114777 的支持。布兰登上 Hadland 是支持的亚历克斯的柠檬水站基础和现代希望在车轮基础上。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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