Summary
Her præsenterer vi metode til klonede analyse af hæmatopoietisk stamcelle prækursorer under murine embryonale udvikling. Vi kombinere indeks sortering af enkelt celler fra embryonale aorta-gonade-mesonephros regionen med endotel Co cellekultur og transplantation til at karakterisere fænotypiske egenskaber og engraftment potentiale af enkelt hæmatopoietisk prækursorer.
Abstract
Evnen til at studere hæmatopoietisk stamcelle (HSC) genesis under fosterudviklingen har været begrænset af sjældenhed af HSC prækursorer i tidlig embryo og manglen på assays, der funktionelt identificerer den langsigtede multilineage engraftment potentiale enkelte formodede HSC prækursorer. Her, beskriver vi metoder, som gør det muligt for isolering og karakterisering af funktionelt validerede HSC prækursorer på enkelt celle-niveau. Først, vi udnytter indeks sortering for at katalogisere den præcise fænotypiske parameter for hvert individuelt sorteret celle, ved hjælp af en kombination af fænotypiske markører til at berige for HSC prækursorer med yderligere markører for eksperimentel analyse. Andet, hvert indeks-sorteret celle er co kulturperler med vaskulære niche stroma fra regionen aorta-gonade-mesonephros (AGM), som understøtter modning af ikke-engrafting HSC prækursorer til funktionelle HSC med multilineage, langsigtet engraftment potentiale i transplantation assays. Denne metode giver mulighed for korrelation af fænotypiske egenskaber af klonede hemogenic prækursorer med deres funktionelle engraftment potentiale eller andre egenskaber såsom transcriptional profil, giver dig mulighed for en detaljeret analyse af HSC forløber udvikling på enkelt celle-niveau.
Introduction
Klonede undersøgelser har afsløret heterogenitet i de langsigtede engraftment egenskaber af voksen HSCs, giver ny indsigt i HSC undertyper og ændringer i HSC adfærd under aldring1. Lignende undersøgelser af embryonale HSCs og deres prækursorer har dog været mere udfordrende. I den tidlige embryonale udvikling, HSCs opstår fra en population af prækursorer kendt som hemogenic endotel i en forbigående proces omhandlet som i endothelial hæmatopoietisk overgang2. Den første HSC, defineret ved deres evne til at yde robust, langsigtede multilineage engraftment efter transplantation i konditioneret voksen modtagere, registreres ikke før efter embryonale dag 10.5 (E10.5) i murine embryo, på meget lav frekvens3 . I løbet af deres udvikling, skal forstadier til HSC (pre-HSC) som følge af hemogenic endotelet underkastes modning forud erhverve voksen HSC egenskaber, som giver mulighed for effektiv engraftment i transplantation assays4,5 , 6. tilsløre studiet af sjældne HSC oprindelse, et væld af hæmatopoietisk stamfaderen med erythroid, myeloid, og lymfoide potentiale er allerede opdaget før fremkomsten af HSC fra pre-HSC7,8. Således kræver skelne pre-HSC fra andre hæmatopoietisk stamfaderen metoder til alsidighed isolere cellerne og forsyne dem med tilstrækkeligt for deres modning signaler til HSC, at opdage deres engraftment egenskaber i transplantation assays.
En række tilgange er blevet beskrevet som giver mulighed for påvisning af pre-HSC af ex vivo eller i vivo modning til HSC. Ex vivo metoder har afhang kultur af embryonale væv, såsom AGM-regionen, hvor den første HSC registreres i udvikling af9. Med udgangspunkt i disse metoder, protokoller, der inkorporerer dissociation, har sortering og re sammenlægning af AGM væv tilladt karakterisering af sorterede befolkninger der indeholder HSC prækursorer under udvikling fra E9.5 til E11.5 i para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioner4,5,10; men disse tilgange er ikke indstillet til høj overførselshastighed analyse af prækursorer på det enkelte celle niveau kræves for klonede analyse. Ligeledes, i vivo modning af transplantation til nyfødte mus, hvor mikromiljø formodes at være mere egnet til støtte for tidligere stadier af HSC prækursorer, har også aktiveret undersøgelser af sorterede befolkninger fra blommesækken og AGM / P-Sp (P-Sp er regionen forløber til generalforsamlingen) med Karakteristik af pre-HSC, men disse metoder også undlader at skabe en robust platform for enkelt celle analyse11,12.
Undersøgelser fra Rafii et al. demonstreret, at Akt-aktiveret endotel celle (EF) stroma kan give et niche substrat til støtte af voksen HSC selvfornyelse in vitro-13,14,15. Vi har for nylig besluttet, at Akt-aktiveret EF stammer fra regionen AGM (AGM-EF) giver en passende in vitro- niche for modning af hemogenic prækursorer, isoleret så tidligt som E9 i udvikling til voksen-engrafting HSC, samt den efterfølgende Self-fornyelse af genererede HSC16. Da dette system benytter en simpel 2-dimensionelle fælles kultur, er det let kan tilpasses for klonede analyse af HSC potentiale af individuelt isolerede hemogenic prækursorer.
Vi har for nylig rapporteret en tilgang til analysen af klonede hemogenic prækursorer HSC potentiale ved at kombinere indeks sortering af individuelle hemogenic prækursorer fra murine embryoner med AGM-EF Co kultur og efterfølgende funktionalanalyse i transplantation -undersøgelser,17. Indeks sortering er en tilstand af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) der optager (indekser) alle fænotypiske parametre (dvs., forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescens parametre) for hvert individuelt sorteret celle, sådan at disse funktioner kan være med tilbagevirkende kraft korreleret til efterfølgende funktionel analyse efter sortering. FACS software registrerer både fænotypiske oplysninger for hver celle og position/brønd af 96-brønd plade, hvor det var placeret. Denne teknik er tidligere blevet elegant brugt til at identificere heterogenitet i voksen HSC, bestemme fænotypiske parametre, der yderligere berige for den langsigtede engrafting delmængde af HSC, og korrelere fænotypiske parametre af HSC med transcriptional egenskaber på indre celle niveau18,19. Her, leverer vi detaljeret metode for denne tilgang, der muliggør identifikation af unikke fænotypiske parametre og afstamning bidrag af pre-HSC i tidlige stadier af embryoets udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. forberedelse af generalforsamlingen-EF encellelag for fælles kultur
- 24 timer forud for generalforsamlingen dissektion og sortering, gøre AGM-EF dyrkningsmedier og filter sterilisere.
- Tilføje 0,1% gelatine i vand (100 µL/brønd) til hvert hul i en 96-brønd plade og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. aspirat gelatine og lad pladen i vævskultur hætte med låget fjernes indtil brøndene er tørre.
-
Adskille AGM-EF monolag og plade til 96-brønd plader.
Bemærk: Fastholde AGM-EF, forberedt som tidligere beskrevet16, i AGM-EF kultur medier. For konsistens, AGM-EF cellelinjer frosset så snart tilstrækkelig numre er opnået (generelt passage 1-3) og anvendes på en defineret passage nummer (generelt passage 5-12) til fælles kultur eksperimenter. AGM-EF cellelinjer er afledt fra C57BL/6J (CD45.2) generalforsamlingen. Se Tabel af materialer til alle medier kompositioner.- Opsug medier fra AGM-EF kultur i en 75 cm2 kolbe og tilsættes 5 mL PBS. Opsug PBS, og tilsættes 3 mL trypsin løsning (Se Tabel af materialer).
- Der inkuberes ved 37 ° C i 2-4 min, indtil de fleste celler løfte fra pladen. Tilføje 7 mL AGM-EF dyrkningsmedier og afpipetteres 8 - 10 gange med 10 mL pipette til at forberede enkelt celler suspension, og overføre til en 15 mL tube.
- Spin på 300 x g i 5 min, Fjern supernatanten, genopslæmmes i 10 mL AGM-EF dyrkningsmedier og anslå celle nummer med en hemocytometer. Fortynd celler til en koncentration på 1 x 105 celler/mL i AGM-EF kultur medier.
- Tilsæt 100 µL AGM-EF cellesuspension (1 x 104 celler) til hver brønd af et gelatinized 96 brønde plade. Sted i et 37 ° C, 5% CO2 vævskultur inkubator natten for at tillade AGM-EF at vedhæfte og danne en sammenflydende éncellelag.
Bemærk: Jævnt AGM-EF stromale celler så der er begrænset overvækst eller celle sammenklumpning for optimal Co kultur. -
Forberede AGM Co kultur AGM-EF-éncellelag.
- Den følgende morgen, forberede AGM serumfrit medier.
- Ved hjælp af en 12-godt multikanalpipette, fjerne AGM-EF Kulturmedier fra AGM-EF og tilføje 200 µL/brønd af AGM serumfrit medier uden cytokiner udviske alle resterende serum-holdige medier.
- Fjern mediet og tilsæt 200 µL/brønd af AGM serumfrit medier med cytokiner. Arbejde hurtigt når at fjerne og tilføje medierne, så i endothelial lag ikke bringes i fare; fx, fjerne og re-sammenlægge Medier én række ad gangen. Placere 96-brønd plader i vævskultur inkubator ved 37 ° C, indtil de embryonale celler er klar til sortering.
2. forberedelse af enkelt cellesuspension fra Murine embryonale væv
-
Dissekere AGM fra timet parringer.
- Oprette timet parringer til generering af embryonale væv i den ønskede alder.
- Høst embryoner fra drægtige hundyr på 9.5 til 11,5 dage post coitum (dpc), afhængigt af fase af præ-HSC skal analyseres.
Bemærk: Embryonale væv er høstet fra C57BL/6J (CD45.2) mus som tidligere beskrevet og præcist iscenesatte baseret på somite tæller16. Vi har fokuseret på analyse af befolkninger fra embryonale AGM-regionen og dens forløber, P-Sp, mellem E9.5 til E11.5, baseret på somite iscenesættelse. - Dissekere AGM fra embryoner20.
Bemærk: Detaljerede protokoller for dissektion af generalforsamlingen fra murine embryoner har været udgivet af andre20. Alternativt kunne blommesækken eller andre væv, foregav at have pre-HSC aktivitet også analyseres ved denne metode.
-
Adskille de dissekerede embryonale væv.
- Indsamle de dissekerede væv i en 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL PBS med 10% FBS på is. Tyngdekraften bilægge væv, Aspirér PBS/FBS, og derefter tilsættes straks 1 mL 0,25% collagenase og sted i et 37 ° C vandbad i 25 min.
- Tilsættes 1 mL PBS/10% FBS og afpipetteres omkring 20 - 30 gange med en 1 mL pipette tip til at få en enkelt cellesuspension. Tilføje en ekstra 8 mL af PBS/10% FBS og centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. supernatanten.
3. antistoffarvning Murine embryonale celler
-
Forberede den blokerende buffer antistoffarvning.
- Tilføje 10 µg/mL anti-mus CD16/CD32 (Fc receptor (FK) blok) og 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL lager i H2O) til 1 mL PBS med 10% FBS.
- Udarbejder i en 3 mL sprøjte og passere gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at sterilisere. Genopslæmmes celle toerstoffet fra de dissocierede murine embryonale væv (fra trin 2.2.2) i 500 µL blokerende buffer og inkuberes i isbad i 5 min.
- Forberede antistof mix17.
- Tilføje 10 µg/mL FcR blok til 1 mL PBS med 10% FBS og 10 µL af hver fluorokrom-konjugerede anti-VE-Cadherin antistof (CD144, se Tabel af materialer) og fluorokrom-konjugerede anti-EPCR antistof (CD201, se Tabel af materialer). Bruge en 1: 100 endelige fortynding af antistoffer, medmindre andet er angivet baseret på producentens anbefalinger eller ifølge titreringer.
Bemærk: Denne antistof kombination bruges til at definere gates for sortering, som beskrevet nedenfor (trin 4.2). Sortering baseret på fælles udtryk for VE-Cadherin og EPCR giver mulighed for betydelig berigelse for del af AGM-afledte celler, der indeholder HSC forløber aktivitet, som tidligere beskrevet17. - Tilføj yderligere fluorokrom-konjugerede antistoffer for yderligere fænotypiske analyser af enkelte indeks-sorteret prækursorer.
Bemærk: Disse antistoffer er ikke nødvendigvis anvendes til at definere gates til sortering. I denne prøve protokol, har vi medtaget PE-konjugerede anti-CD41 antistoffer og FITC-konjugeret anti-CD45 antistof til at analysere den relative udtryk for disse hæmatopoietisk markører, som udvikler sig under fremkomsten af pre-HSC fra hemogenic endotelet4 ,5,16,17. Andre markører af interesse kan medtages som ønsket. Prøver farves med fluorokrom-konjugeret isotype antistof kontrolelementer bruges til at definere negative og positive gates til analyse. - Udarbejde antistof mix i en 3 mL sprøjte og passere gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at sterilisere. Tilføje 500 µL antistof-mix til cellesuspension i blokerende buffer, pipette til mix, og der inkuberes i isbad i mindst 15-20 min.
- Tilføje 10 µg/mL FcR blok til 1 mL PBS med 10% FBS og 10 µL af hver fluorokrom-konjugerede anti-VE-Cadherin antistof (CD144, se Tabel af materialer) og fluorokrom-konjugerede anti-EPCR antistof (CD201, se Tabel af materialer). Bruge en 1: 100 endelige fortynding af antistoffer, medmindre andet er angivet baseret på producentens anbefalinger eller ifølge titreringer.
-
Vask de farvede celler.
- Tilsæt 8 mL PBS/10% FBS. Der centrifugeres celler på 300 x g for 5 min, aspirat og genopslæmmes cellen pellet med 1 mL PBS/10% FBS.
- Fjerne celle klumper af pipettering cellesuspension gennem en 35 μm celle si cap på en 5 mL tube. Vask celle si med en yderligere 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min, Aspirér, genopslæmmes i 500 µL PBS/10% FBS, og Anbring på is indtil FACS.
4. indeks sortering af enkelt Hemogenic prækursorer til 96-brønde med AGM-EF Stroma for fælles kultur
- Forberede FACS maskinen til plade mode og justere for sortering til 96-brønd plader ifølge producentens anvisninger. Vælg enkelt celle tilstand og indeks sortering tilstand i software for maksimal renhed mask indstillingerne og aktivere erhvervelse af indeks parametre for hver sorteret celle.
-
Erhverve en stikprøve af celler fra antistof farves prøver for at indstille porte til sortering.
- Indlæse farves celle prøven på FACS maskine og erhverve celler til den laveste sats, flow. Plot FSC-A vers SSC-A og vælge en port, der omfatter celler af forskellig størrelse (figur 1B) (som er baseret på den iagttagelse, at pre-HSC aktivitet er identificeret i celler af forskellig størrelse profiler i AGM17). Plot FSC-A vers FSC-W og SSC-A vers SSC-W, og vælg gates til at udelukke dubletter. Derefter plot FSC-A vers DAPI til gate levende celler (negativ for DAPI) (figur 1B).
- Plot PECy7 (eller den relevante fluorokrom for VE-Cadherin pletten) versus PerCP (eller den relevante fluorokrom for EPCR plet). Gate celler der er positive for VE-Cadherin, (som omfatter en blandet befolkning i endothelial celler samt hæmatopoietisk ophav og pre-HSC fra generalforsamlingen), og som har høj EPCR udtryk (som beriger for pre-HSC fra P-Sp/AGM17). Dette er den endelige gate, der vil blive brugt til at indeksere form enkelt celler i trin 4.3 (figur 1B).
- Plot yderligere fluorokromer bruges til farvning.
Bemærk: Afhængigt af delpopulation skal analyseres yderligere gates kan indstilles baseret på påvisning af andre markører inkluderet for farvning celler. Dog muliggør indeks sortering optagelse af de fluorescerende parametre for hver celle, sorteret sådan, at disse parametre kan analyseres med tilbagevirkende kraft. Således er ingen yderligere gating nødvendige på dette punkt. For alle FACS opsætninger, bør prøver farves med enkelt antistoffer anvendes til at justere kompensation, for at tage højde for spillover i emission af overlappende fluorokromer og med isotype kontrol antistoffer, at redegøre for baggrunden farvning og bestemme negativ/positiv gates.
-
Indeks sortere AGM celler.
- Anbring 96-brønds plade tilberedt med AGM-EF stroma AGM serumfrit medier med cytokiner (fra trin 1.5.3) i plade blok af FACs sortering maskine. Læg prøven og begynde prøven erhvervelse. Vælg indeks sortering/enkelt celle mode og begynder sortingsingle celler til individuelle 96-brønde. Brug den laveste flow til at minimere shear stress på embryonale celler.
- Sikre, at alle begivenheder er indspillet under indeks sortering. Dette vil aktivere optælling af det samlede antal celler analyseres i sortering porten i forhold til de faktiske antal sorteret til individuelle 96-brønde, som ikke alle hændelser registreres bliver sorteret fra brønde.
- Når cellerne er blevet sorteret til en hele 96-brønd plade, pladen anbringes i en vævskultur inkubator ved 37 ° C på 5% CO2. Gentag for ekstra plader kræves pr. eksperiment.
- Fælles kultur individuelt sorteret celler i 96-brønde med AGM-EF (fra trin 4.3) for op til 7 dage (5 dage for celler sorteret fra E11-11,5 embryoner, 6 dage fra E10-10.5 embryoner, 7 dage fra E9-9,5 embryoner). Visualisere hæmatopoietisk kolonier i forskellige størrelser og morfologier med en inverteret mikroskop på 100 X forstørrelse (figur 2B) efter perioden Co kultur.
Bemærk: Medierne behøver ikke at blive ændret i fælles kultur periode. Sorteret hemogenic prækursorer i første omgang kan integrere AGM-EF lag med en EF-lignende morfologi og i første omgang kan skelnes fra AGM-EF stroma (figur 2A). Men, følgende 24-48 h i fælles kultur, lille, afrundet hæmatopoietisk celler eller klynger af celler kan påvises. For enden af fælles kultur (5-7 dage), kan enkelte kolonier af hæmatopoietisk celler visualiseres i delmængden af 96-brønde, der modtog en sorteret celle med klonede hæmatopoietisk potentiale. Hvis visuelt inspiceret wells indeholder mere end én særskilt koloni, så denne prøve er udelukket fra downstream analyse at udelukke prøver, der kan have modtaget mere end én celle sorteret pr. brønd.
5. analyse af klonede hæmatopoietisk afkom efter fælles kultur
-
Høst kloner fra hver 96-brønd til FACS analyse.
- Energisk afpipetteres at adskille hæmatopoietisk celler fra endotel lag ved hjælp af en multikanalpipette med 200 µL pipette tips. Prøv ikke at adskille i endothelial lag. Fjerne 100 µL (~ 50% af stikprøven) for fænotypiske analyser af hæmatopoietisk afkom af FACS.
- Overførsel til en 96-brønd V-bundplade og centrifugeres ved 300 x g i 2 min. at sammenpresse cellerne. Fjerne medier ved at bladre medier fra pladen med en enkelt hurtig bevægelse, mens pladen er spejlvendt (svip plade).
- Placer de resterende 100 µL celler i den originale 96-brønd plade i et 37 ° C incubatorfor brug i efterfølgende engraftment assay (trin 6).
-
Inkuber celler med de passende antistoffer for hæmatopoietisk analyse.
- Genopslæmmes celle pellets i hver brønd med en 96-brønd V-bund med 50 µL af PBS/2% FBS indeholdende 10 µg/mL FcR blok og 1 µg/mL DAPI. Inkuber plade ved 4 ° C i 5 min.
- Tilsæt 50 µL af PBS/2% FBS indeholdende 10 µg/mL FcR blok og en antistof mix til HSC analyse der indeholder PE-Cyanine7-konjugerede anti-VE-Cadherin, PerCP-konjugerede anti-CD45, PE-konjugerede anti-EPCR, APC-konjugerede anti-Sca1 og FITC-konjugeret anti-Gr1 og anti-F4/80 (hver antistof på 1: 100 endelige fortynding medmindre andet er angivet baseret på producentens anbefalinger eller ifølge titreringer). Inkuber plade ved 4 ° C i mindst 20 min.
-
Fjerne ubundne antistof med sekventiel fortyndinger og analysere cellerne.
- Tilføje 200 µL/brønd PBS/2% FBS og centrifugeres ved 300 x g i 2 min at sammenpresse cellerne. Derefter, svirp plade supernatanten og tilføje 200 µL PBS/2% FBS til hver celle pellet og centrifugeres ved 300 x g i 2 min. at sammenpresse cellerne.
- Svirp plade til supernatanten og tilsæt 50 µL/brønd PBS/2% FBS for analyse. Gå videre til at analysere celler af FACS ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en pladelæseren.
Bemærk: Erhverve et fast antal celler (f.eks., 35 µL af den samlede 50 µL anvendes til resuspension) til at optælle delmængder af hæmatopoietisk afkom.
-
Analysere FACS data for hver brønd indeholder hæmatopoietisk afkom til at screene for kolonier, der indeholder HSC potentielle (figur 3).
- Gate først CD45 positive befolkningen, der er negative for myeloide markører Gr1 og F480. Ikke gate ud celler, der stadig express lave niveauer af VE-Cadherin. Celler fra AGM-EF-lag, der er afbrudt under høsten af hæmatopoietisk kolonier er VE-Cadherin positive og CD45 negative.
- Gate CD45+VE-Cad- / lavGr1-F4/80- celler videre på den delmængde, der udtrykker høje niveauer af EPCR og Sca1 (figur 3A -C).
Bemærk: I tidligere undersøgelser, kolonier mangler celler med CD45+VE-Cad- / lavGr1-F4/80-Sca1HejEPCRHej fænotype (figur 3D) reproducerbar undladt at levere påviselige multilineage perifert blod engraftment i bestrålede recipient mus17 (data ikke vist); disse kolonier behøver således ikke indgå i den efterfølgende transplantation analyse i trin 6.
6. analyse af Engraftment egenskaber af enkelte kloner og korrelation med fænotypiske egenskaber belyst ved indeks sortering
- Dag (hvis muligt) eller om morgenen efter den fænotypiske analyser i trin 5, re suspenderet de resterende 100 µL celler fra hver 96-brønd indeholdende hæmatopoietisk kolonier efter fælles kultur (fra trin 5.1) af energisk pipettering ved hjælp af en 200 µL pipette tip.
-
Forberede og tilføje rescue celler fra hele knoglemarven af congenic stamme B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) voksne mus16,17.
- Tælle nukleeret knoglemarv celler i tyrkerne løsning under en hemocytometer. Fortyndes til en koncentration på 5 x 105 nukleeret celler/mL i PBS med 2% FBS.
- Tilsæt 100 µL af rednings knoglemarv celler (5 x 104) til hver brønd indeholder hæmatopoietisk afkom til transplantation analyse og mix af pipettering.
-
Transplantation afkom af de enkelte kloner til en enkelt lethally bestrålede modtagerens congenic stamme B6. SJL-PtprcenPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) voksen mus.
- Lethally bestråle det samme antal B6 CD45.1 mus som antallet af kloner til individuelt injicere afkom af en enkelt klon (ved hjælp af 1.000 cGy fra en kilde, cæsium).
- Trække 200 µL cellen total suspension (Dette omfatter celler fra klonen samt 5 x 104 B6 CD45.1 redning knoglemarv celler) i en ½ mL insulin sprøjte med en 29 G ½ tomme nål.
- Lethally bestråle B6 CD45.1 voksen modtagere 2-24 timer før injektion.
- Brug en plastik mus Tilbageholderen, der giver hale adgang, indsprøjtes via den hale vene 200 µL diskenhed, der indeholder både celler fra hver klon og 5 x 104 B6 CD45.1 voksen knoglemarv rescue celler til støtte i modtagerens overlevelse.
- Øremærke og vejer recipient mus og kontrollere deres vægt/sundhed med jævne mellemrum (f.eks.3 - 4 gange / uge post bestråling/transplantation, eller pr. enkelte institutionelle standardforskrifter) til at sikre et godt helbred.
-
Udføre analyse af perifert blod engraftment med jævne mellemrum (f.eks.2, 16, 24 uger) efter transplantation.
- Fjerne 50-100 µL af blodet via retro-orbital bløder eller et andet etisk godkendt blod at lade metode.
- Tilføj 3 mL lysisbuffer (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 og 74.4 mg EDTA til 2 L H2O) til blod og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuge på 300 x g i 5 min. aspirat og genopslæmmes pellet med 2 mL PBS/2% FBS. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Genopslæmmes pellet med 150 µL PBS/2% FBS indeholdende 10 µg/mL FcR blok og 1 µg/mL DAPI, og give afkald på 1/3 af volumen til en godt indeholdende 50 µL isotype kontrolelementer for donor og afstamning, 1/3 til et godt indeholdende 50 µL antistof for donor og isotype kontrolelementer for afstamning , og 1/3 til en brønd, der indeholder 50 µL antistoffer til at opdage både donor og afstamning.
Bemærk: Antistoffer til påvisning af multilineage engraftment: APCeFluor780-konjugerede anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-konjugerede anti-CD45.1, FITC-konjugeret anti-CD3, PE-konjugerede anti-F4/80, PerCP-konjugerede anti-Gr1 og APC-konjugerede anti-CD19, eller relevante isotype kontrol. - Identificere kloner med langsigtede engraftment ved vurderingen af perifert blod bidrag af FACS over tid af CD45.2 (donor)-afledt hæmatopoietisk celler til myeloide (Gr1 og/eller F4/80 positive), B-celle (CD19 positive), og T-celle (CD3 positive) (figur 4A -B).
Bemærk: Hæmatopoietisk engraftment kan også analyseres ved CD45.2 (donor)-afledt bidrag til hæmatopoietisk populationer af væv høstes fra knoglemarven, milten, thymus og bughinde, eller efter sekundær transplantation af knoglemarv celler til B6 CD45.1 mus til at analysere seriel engraftment egenskaber17.
- Korrelere hver klon fænotypiske egenskaber som bestemt af indledende enkelt celle indeks sortering med dens engraftment egenskaber. Brug flow analyse software, uploade sortering parametre for hvert indeks-sorteret celle (korreleret til 96-brønd som det var sorteret). Funktionelle kortdata på flow grunde til at evaluere de fænotypiske egenskaber af enkelt celler, som de vedrører deres funktionelle output (f.eks langsigtede, multilineage engraftment) (fig. 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en skematisk af forsøgets udformning. Når P-Sp/AGM væv er dissekeret, samles og adskilles i collagenase, er de farves med antistoffer mod VE-Cadherin og EPCR for indekset sortering. Pre-HSC er beriget med celler sorteret på VE-Cadherin+EPCRhøj (figur 1B). Andre fluorokrom-konjugerede antistoffer kan inkluderes efterfølgende analysere yderligere fænotypiske parametre, der er registreret for hver celle under indeks sortering. I denne repræsentative eksperiment fra E11 AGM farves cellerne også med FITC-konjugeret anti-CD45 og PE-konjugerede anti-CD41 antistoffer. Heterogenitet i VE-Cadherin+EPCRhøj befolkning for disse hæmatopoietisk-specifikke markører er observeret (figur 1 c), i overensstemmelse med den kendte asynkroniske i hæmatopoietisk udvikling på denne fase5.
Efter indeks sortering af enkelt VE-Cadherin+EPCRhøj AGM celler til individuelle 96-brønde indeholdende AGM-EF i AGM serumfrit medier og cytokiner, koloni dannelsen sker. I første omgang, integrere sorterede VE-Cadherin+EPCRhøj AGM celler i AGM-EF lag, før de begynder at runde op og danne hæmatopoietisk klynger (figur 2A, vist her fra celler sorteret fra en transgene murine Foster udtryk for normal god landbrugspraksis under Ly6a promotor21, at skelne dem fra AGM-EF stroma). Efter 5-7 dage af fælles kultur, kan kolonier af forskellige størrelser og morfologier påvises ved inspektion med en inverteret mikroskop (figur 2B), vist her fra en repræsentativ eksperiment, 6 dage efter sortering fra E11 AGM.
Næste, fænotypiske analyser af FACS udføres på halvdelen af afkommet af hver VE-Cadherin+EPCRhøj celle, som har dannet en hæmatopoietisk koloni. Kolonier celler med HSC fænotype er identificeret som VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1HejEPCRHej (figur 3). Her viser vi fire forskellige kolonier opnåede efter Co kultur af indeks-sorteret E11 AGM VE-Cadherin+EPCRhøj celler, tre indeholdende forskellige proportioner af fænotypiske HSC med andre mere differentieret celletyper (figur 3A -C), og fjerde mangler celler med HSC fænotype (figur 3D). Antallet af kolonier observeret pr. antal celler forgyldt og den procentdel, der resulterede i engraftable stamceller kolonier varierer afhængigt af embryonale alder og art udføres. VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1HejEPCRHej E11 AGM kloner genererede 53 ± 15 kolonier fra 192 celler belagt med 5% ± 1,3% af 192 cellerne forgyldt skaber kloner, aflægger længe sigt (gennemsnit ± SD for 3 forsøg).
For at korrelere fænotype med engraftment potentielle, de resterende halvdelen af afkommet af hver VE-Cadherin+EPCRhøj celle, der har dannet en hæmatopoietisk koloni, der indeholder celler med HSC fænotype opdaget af FACS (f.eks., at kolonier repræsenteret i figur 3A-C) er transplanteret til bestrålet (1.000 cGy) voksen congenic stamme (B6 CD45.1) mus sammen med en dosis af rednings celler fra B6 CD45.1 marv. Langsigtede multilineage engraftment bekræftes for hvert klon af følgende donor (CD45.2) bidrag til den myeloide (Gr1 og F4/80), B-celle (CD19), og T-celle (CD3) rum i det perifere blod over tid (figur 4A). Selv om de fleste kolonier der indeholder celler med HSC fænotype opdaget af FACS give langsigtede engraftment, er transplantation nødvendigt at bekræfte funktionelle multilineage engraftment som nogle kloner mister engraftment over tid (figur 4B), eller få vist unikke engraftment egenskaber såsom lymfoide-partisk engraftment (data ikke vist). Når den funktionelle HSC potentiale af hver VE-Cadherin+EPCRhøj klon bestemmes, er dette korreleret tilbage til at klon indeks sortering parametre for at fastslå dens præcise fænotypiske egenskaber. I dette eksempel ser vi, at funktionelt bekræftet pre-HSC kloner (røde prikker) er heterogene i deres udtryk af CD41 og CD45, overensstemmelse med etablerede dynamiske udtryk for disse markører under pre-HSC modning til HSC (figur 4 c). Kloner danner hæmatopoietisk kolonier men enten mangler HSC potentiale ved fænotypiske screening eller manglende langsigtet, multilineage engraftment efter transplantation (ikke-HSC hemogenic kloner, blå prikker) er også heterogene for CD41 og CD45, selv om en delmængde express sammenlignet højere niveauer af CD41 med pre-HSC kloner, som er primært CD41lav. Kloner, der ikke danner hæmatopoietisk kolonier (ikke-hemogenic kloner, lyse grønne prikker) er overvejende CD41- / lavCD45-, hvilket sandsynligvis afspejler ikke hemogenic VE-Cadherin+EPCRhøje endothelial celler.
Figur 1: oversigt over protokol og repræsentative flow flowcytometri analyse for indekset sortering af enkelt celler. (A) skematisk gengivelse af protokollen. (B) Flow flowcytometri analyse af dissocierede E11 AGM celler viser gating strategi for indekset sortering af VE-Cadherin+EPCRhøjt celler beriget for pre-HSC (analyse med FACS analyse software). Tallene i hver gate repræsenterer procentdelen af celler. (C) Flow flowcytometri analyse viser CD41 og CD45 farvning inden for befolkningens VE-Cadherin+EPCRhøj . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dannelsen af hæmatopoietisk kolonier under AGM-EF Co kultur. (A) Time-lapse billeddannelse af VE-Cadherin+EPCRhøjnormal god landbrugspraksis+ sorteres celler fra Ly6a-NGL transgene embryoner21 Co kulturperler på AGM-EF. Skala barer i µm er vist i nederste venstre hjørne af hvert billede. (B) repræsentative kolonier dannet fra VE-Cadherin+EPCRhøjt indeks-sorteret enkelt celler efter 6 dage Co kultur på AGM-EF. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow flowcytometri analyse af afkommet af en enkelt E11 AGM-afledte VE-Cadherin+EPCRhøj celler efter fælles kultur på AGM-EF. Gating for celler med HSC potentiale er vist som den delmængde, der er VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80- (venstre panel), CD45+ (midterste panel), og Sca1HejEPCRHej (højre panel). (A) repræsentative koloni bestående af en homogen population af celler med HSC fænotype. (B-C) Repræsentative kolonier indeholdende en blanding af celler med HSC fænotype og mere differentieret celletyper. (D) repræsentative koloni bestående af celler mangle HSC fænotype. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af perifert blod engraftment afkom af de enkelte kloner efter generalforsamlingen-EF Co kultur og korrelation med indeks sortering parametre. (A) Donor CD45.2-afledte perifert blod engraftment myeloide (Gr1 og F4/80), B-celle (CD19), og T-celle (CD3) delmængder fra en repræsentativ modtager (B6 CD45.1) transplanteret med afkom af individuelle E11 VE-Cadherin+EPCRhøj klon efter generalforsamlingen-EF Co kultur. (B) Donor CD45.2-afledte perifert blod engraftment over tid efter transplantation af afkom af enkelte E11 VE-Cadherin+EPCRhøj kloner efter generalforsamlingen-EF Co kultur. (C) korrelation af CD41 og CD45 udtryk for hvert indeks sorteret VE-Cadherin+EPCRhøjt klon med sin HSC potentiale følgende AGM-EF Co kultur baseret på langsigtede, multilineage engraftment i transplantation assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af HSC genesis under fosterudviklingen nødvendiggør midler til at opdage HSC potentielle i hemogenic prækursorer endnu mangler kompetence til at give langsigtede multilineage hæmatopoietisk rekonstituering i transplanterede voksen modtagere. I denne protokol præsenterer vi en klonal analysen af embryonale hemogenic prækursorer af stromale Co kultur på vaskulære niche ECs fra den ordinære generalforsamling, som understøtter modning af prækursorer til HSC, med efterfølgende funktionalanalyse i transplantation assays. Indarbejdelse af indeks sortering tilladelser retrospektiv analyse af fænotypiske parametre til at karakterisere egenskaber af pre-HSC som defineret af celleoverflademarkører inkluderet i analysen. Denne tilgang giver således en fordel frem for andre metoder, der er afhængige af bulk sortering af forløber populationer med aggregation-baserede HSC assays4,5,10, muliggør effektiv screening for potentielle markører af pre-HSC samtidig med at de giver oplysninger om relative udtryk niveauet af overflade markører for hver enkelt celle. Brug denne metode, for eksempel, rapporteret vi tidligere, at ud over brugen af EPCR til at berige for pre-HSC befolkninger på forskellige udviklingsstadier, mellemliggende udtryk for Notch ligand Dll4 yderligere defineret en delpopulation af klonede VE-Cadherin+EPCR+ prækursorer med HSC potentielle, der henviser til, at Dll4 negative VE-Cadherin+EPCR+ hemogenic prækursorer for det meste manglede HSC potentielle17.
En anden fordel ved denne metode er muligheden for at screene for HSC potentiale straks følge fælles kultur baseret på påvisning af hæmatopoietisk afkom med en fænotype (VE-Cadherin- / lavGr1-F4/80-CD45+Sca1 HejEPCRHej) der er korreleret med langsigtede, multilineage engraftment. Dette eliminerer behovet for at omplante kolonier mangler hæmatopoietisk afkom med denne HSC fænotype, da disse kolonier ikke giver langsigtet engraftment i transplantation assays. Derudover er oprindelige oplysninger skelne potentielle pre-HSC fra hemogenic prækursorer mangle HSC potentiale umiddelbart efter fælles kultur, uden at skulle afvente resultaterne fra langsigtede engraftment assays, nyttige, for eksempel i hurtigt screening kandidat markører af HSC-prækursorer. Korrelationen mellem fænotypiske data med langsigtede engraftment efter transplantation indeholder dog yderligere værdifuld indsigt i variationer af de præcise engraftment egenskaber af pre-HSC kloner. Vi har fundet, for eksempel, at klonede pre-HSC fra P-Sp/AGM-regionen mellem E9.5 og E11.5 har unikke potentiale til at give anledning til både B1a og B2-lymfocytter, B1a-lymfocyt potentiale er mangelfuld i voksen HSC17. Desuden, vi opdaget en evolution i engraftment egenskaberne for pre-HSC kloner mellem E9.5 og E11.5 med tidligere pre-HSC demonstrerer en relativ skew mod peritoneal B1a vers B2-lymfocyt engraftment og mindre robuste selvfornyelse potentiale baseret undersøgelser vedrørende17på sekundære transplantation.
Mens denne protokol giver en værdifuld tilgang for at belyse de unikke egenskaber af klonede HSC prækursorer, er der visse begrænsninger, der skal erkendes. Selv om sporing af afkom med HSC fænotypiske af FACS efter generalforsamlingen-EF Co kultur er generelt korreleret til langsigtet multilineage engraftment, giver nogle kolonier med denne fænotype kun kortsigtet engraftment eller engraftment mangelfuld i en eller flere hæmatopoietisk lineages (figur 4B; data ikke vist). Således fortsat transplantation guldstandarden i validering funktionelle HSC. Desuden, det kan ikke udelukkes, at nogle af forskellene i engraftment egenskaber af pre-HSC kloner i stedet afspejler celle-iboende forskelle i hemogenic forløber potentiale, kan følge af stokastiske variabilitet under AGM-EF Co kultur i selvfornyelse vers er differentiering beslutninger, som pre-HSC samtidig modning til HSC og gennemgår celledelinger. Ja, dette kan delvis hensyn til de observerede heterogenitet af kolonien morfologi og fænotype af celler genereret fra individuelle pre-HSC kloner (f.eks. figur 3A-C), og kan resultere i en undervurdering af pre-HSC ved denne analyse, hvis ikke alle potentielle pre-HSC kloner er opdaget af generation af funktionelle HSC efter generalforsamlingen-EF Co kultur. Men, evnen til at skelne funktionelt adskilte hemogenic kloner ved deres differentiel ekspression af unikke fænotypiske markører (f.eks. Dll417) aktiveret ved denne metode giver en måde at identificere delpopulationer af hemogenic prækursorer med iboende celle-iboende forskelle.
Med udgangspunkt i denne grundlæggende protokol, kan en række udvidede programmer være inkluderet til yderligere undersøgelse af klonede hemogenic prækursorer hæmatopoietisk potentiale under udvikling. Ud over brugen af antistoffer til påvisning af celleoverflademarkører, udtryk for fluorescens markører i transgene embryoner (fx., Ly6a- NGL21 eller Runx1-normal god landbrugspraksis22 udtrykt i hemogenic endotelet/pre-HSC) kan være indarbejdet for indekset sortering af hemogenic prækursorer. Ud over transplantation assays efter generalforsamlingen-EF Co kultur for at påvise formodede pre-HSC, kan afkom også blive vurderet for hæmatopoietisk lineage potentiale baseret på sekundære in vitro- assays, såsom kultur på OP9 eller OP9-Dl1 påvise B - og T-celle potentielle23eller clonogenic kolonidannende assays i methylcellulose at opdage erythromyeloid potentiale. Faktisk, nogle af de ikke-HSC hemogenic kloner (f.eks. figur 3D) sandsynligvis repræsenterer Multipotente progenitorceller, erythromyeloid progenitorceller, eller T - og B-celle stamfaderen tidligere beskrevet at gå forud for og er uafhængig af HSC udvikling 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, og dette assay kan yderligere lette klonede undersøgelser af disse forskellige bølger af hæmatopoietisk prækursorer. Endelig kan index sortering af pre-HSC kombineres med andre downstream analyser som enkelt celle RNA-sekvens, at korrelere fænotypiske egenskaber med de globale transcriptional profiler for at udvikle HSC prækursorer. Helt, denne protokol indeholder en metode til robust analyse af klonede bloddannelsen fra embryonale hemogenic prækursorer, der bør give ny indsigt i HSC udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Andrew Berger, Stacey Dozono og Brian Raden i Fred Hutchinson Flow flowcytometri kernen for bistand med FACS. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed NHLBI UO1 grant #HL100395, accessoriske Collaborative Grant #HL099997, og NIDDK at give #RC2DK114777. Brandon Hadland understøttes af Alexs limonade stå Foundation og Hyundai Hope på hjul Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
