Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Published: May 8, 2018 doi: 10.3791/56973
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Summary

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Abstract

De mogelijkheid te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) genesis tijdens de embryonale ontwikkeling heeft is beperkt door de zeldzaamheid van HSC precursoren in het vroege embryo en het ontbreken van tests waarmee functioneel het lange termijn potentieel van de multilineage engraftment van individuele putatief HSC precursoren. Hier beschrijven we een methodologie waarmee de isolatie en de karakterisering van functioneel gevalideerde HSC precursoren op het niveau van één cel. Ten eerste, wij gebruiken index Sorteren om de precieze fenotypische parameter van elke cel afzonderlijk gesorteerde winkel met behulp van een combinatie van fenotypische markers te verrijken voor HSC precursoren met extra markeringen voor experimentele analyse. Ten tweede, elke index-gesorteerd op cel is mede gekweekte met vasculaire niche stroma uit de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio, die ondersteunt de rijping van niet-enten HSC voorlopers van functionele HSC met multilineage, op de lange termijn engraftment potentieel in transplantatie testen. Deze methode maakt een correlatie van fenotypische eigenschappen van klonen hemogenic precursoren met hun functionele engraftment potentieel of andere eigenschappen zoals transcriptionele profiel, het verstrekken van een middel voor de gedetailleerde analyse van de voorloper van de HSC ontwikkeling op het niveau van één cel.

Introduction

Klonen studies is gebleken heterogeniteit in de lange termijn engraftment eigenschappen van volwassen HSCs, nieuwe inzicht bijbrengen in HSC subtypen en wijzigingen in de HSC gedrag tijdens veroudering1. Echter, soortgelijke studies van embryonale HSCs en hun uitgangsstoffen zijn uitdagender. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, HSCs die ontstaan is uit een populatie van precursoren bekend als hemogenic endotheel in een voorbijgaande proces bedoeld als het endotheel hematopoietische overgang2. Het eerste HSC, gedefinieerd door hun vermogen om te leveren robuuste, op lange termijn multilineage engraftment na transplantatie in geconditioneerde volwassen geadresseerden, worden niet gedetecteerd totdat na embryonale dag 10.5 (E10.5) in het lymfkliertest embryo, met zeer lage frequentie3 . Tijdens hun ontwikkeling, moeten voorlopers van HSC (pre-HSC) die voortvloeien uit hemogenic endotheel rijping voorafgaand aan het verwerven van de eigenschappen van volwassen HSC die voorzien in efficiënte engraftment in4,5 van de tests van de transplantatie ondergaan , 6. de studie van zeldzame HSC oorsprong, een veelheid van hematopoietische progenitorcellen met erythroid, verduisterend myeloïde en lymfoïde potentieel al worden gedetecteerd vóór de opkomst van HSC van pre-HSC7,8. Pre-HSC onderscheiden van andere hematopoietische progenitorcellen vereist dus, methoden voor klonaal cellen isoleren en hen voorzien van voldoende voor hun rijping signalen naar HSC, om te ontdekken hun engraftment eigenschappen in het testen van de transplantatie.

Een aantal benaderingen zijn beschreven die voldoende zijn voor de detectie van pre-Help en ondersteuning door ex vivo of in vivo rijping naar HSC. Ex vivo methoden hebben afhankelijk van de cultuur van embryonale weefsels, zoals de AGM-regio, waar het eerste HSC in ontwikkeling9worden gedetecteerd. Voortbouwend op deze methoden, protocollen waarin de dissociatie opgenomen, hebben sorteren, en opnieuw aggregatie van AVA weefsels toegestaan de karakterisatie van gesorteerde populaties met HSC precursoren tijdens de ontwikkeling van E9.5 naar E11.5 in de para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regio's4,5,10; deze benaderingen zijn echter niet vatbaar voor high-throughput analyse van precursoren op het niveau van de eencellige vereist voor klonen analyse. Ook in vivo rijping door transplantatie in pasgeboren muizen, waar de communicatie wordt geacht te zijn meer geschikt voor de ondersteuning van eerdere fasen van HSC precursoren, ook heeft onderzoek van gesorteerde populaties van de dooierzak en AVA / P-Sp (P-Sp is de regio van de voorloper van de AVA) met kenmerken van pre-HSC, maar deze methoden ook niet te voorzien van een robuust platform voor single cell analysis11,12.

Studies van Rafii et al. aangetoond dat Akt-geactiveerde endothelial cel (EG) stroma kan bieden een niche-substraat voor de ondersteuning van volwassen HSC zelf-vernieuwing in vitro13,14,15. We onlangs vastgesteld dat Akt-geactiveerde EG afgeleid van de AVA regio (AGM-EG) een niche geschikt in vitro voor de rijping van hemogenic precursoren biedt, zo vroeg als E9 in ontwikkeling, tot volwassene-enten HSC, evenals de latere geïsoleerd zelf-vernieuwing van de gegenereerde HSC16. Gezien het feit dat dit systeem maakt gebruik van een eenvoudige CO 2-dimensionale cultuur, is het gemakkelijk aanpasbaar voor klonen analyse van het potentieel van de HSC van individueel geïsoleerde hemogenic precursoren.

We hebben onlangs gemeld dat een benadering van het potentieel van de HSC van klonen hemogenic precursoren assay door het combineren van index sortering van individuele hemogenic precursoren van lymfkliertest embryo's met AGM-EG mede cultuur en latere functionele analyse van transplantatie testen van17. Het sorteren van de index is een modus van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) dat records (indexen) alle fenotypische parameters (d.w.z., voorwaartse scatter (FSC-A), naast scatter (WS-A), fluorescentie parameters) van elk afzonderlijk gesorteerde cel dat deze functies kunnen met terugwerkende kracht worden gecorreleerd aan latere functionaalanalyse na sorteren. FACS software registreert beide fenotypische informatie voor elke cel en de positie per putje van de 96-wells-plaat waarin het werd geplaatst. Deze techniek is eerder elegant gebruikt voor het identificeren van heterogeniteit in volwassen HSC, fenotypische parameters die verder verrijken voor de lange termijn enten subset van HSC, en fenotypische parameters van HSC correleren met transcriptionele bepalen eigenschappen op de single cell niveau18,19. Hier, bieden wij gedetailleerde methodologie van deze aanpak waarmee identificatie van unieke fenotypische parameters en bloedlijn bijdragen van pre-Help en ondersteuning tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. bereiding van de AVA-EG Monolayers co cultuur

  1. 24 uur voorafgaand aan de AVA dissectie en sorteren, maken AVA-EG cultuurmedia en filter steriliseren.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten Aspirate de gelatine, 0,1% gelatine in water (100 µL per putje) toevoegen aan elk putje van een 96-wells-plaat en de plaat in de kap van een weefselkweek laat met de deksel verwijderd totdat de putten droog zijn.
  3. Distantiëren van de AVA-EG monolayers en plaat met 96-wells-platen.
    Opmerking: Handhaven de AGM-EG, bereid als hierboven beschreven16, in AGM-EG voedingsbodems. Voor consistentie, moeten AGM-EG cellijnen worden bevroren, zodra voldoende aantallen worden verkregen (in het algemeen passage 1-3) en voor co cultuur proeven op een gedefinieerde passage nummer (over het algemeen passage 5-12) gebruikt. AGM-EG cellijnen zijn afgeleid van C57BL/6J (CD45.2) AVA. Zie de Tabel van materialen voor alle media composities.
    1. De media van de AVA-EG cultuur in een maatkolf van 75 cm2 gecombineerd en voeg 5 mL PBS. PBS gecombineerd en voeg 3 mL trypsine oplossing (Zie Tabel van materialen).
    2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-4 minuten totdat de meeste cellen zijn opstijgen van de plaat. Voeg 7 mL AGM-EG cultuurmedia en Pipetteer 8 - 10 keer met een pipet 10 mL Maak afzonderlijke cellen suspensie, en overbrengen naar een tube van 15 mL.
    3. Spin bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant resuspendeer in 10 mL AGM-EG cultuurmedia en schatten van het aantal cellen met een hemocytometer. Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 105 cellen/mL in AGM-EG voedingsbodems.
  4. Voeg 100 µL AGM-EG celsuspensie (1 x 104 cellen) toe aan elk putje van een gelatinized 96-wells-plaat. Plaats in een 37 ° C, 5% CO2 weefselkweek incubator's nachts om de AVA-EG te hechten en vormen een confluente enkelgelaagde.
    Opmerking: Verdeel de AGM-EG stromale cellen dus er beperkte begroeiing is of cel samendoen voor optimale co cultuur.
  5. De AGM-EG enkelgelaagde voorbereiden op AVA co cultuur.
    1. De volgende ochtend, bereiden de AVA serumvrij media.
    2. Met behulp van een meerkanaalspipet 12-well, verwijder de AGM-EG voedingsbodems uit de AGM-EG en voeg 200 µL per putje van AVA serumvrij media zonder cytokines te wassen alle resterende serum-bevattende media.
    3. Verwijder het medium en 200 µL per putje van AVA serumvrij media met cytokines toevoegen. Werk snel als verwijderen en het toevoegen van de media, zodat de endothelial laag niet in gevaar komt; bijvoorbeeld, verwijderen en opnieuw toe te voegen media één rij tegelijk. Plaats de 96-wells-platen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C, totdat de embryonale cellen klaar voor het sorteren zijn.

2. voorbereiding van enkele celsuspensie van lymfkliertest embryonale weefsels

  1. Het ontleden van de AVA van getimede verparingen.
    1. Instellen van getimede verparingen voor het genereren van embryonale weefsels van de gewenste leeftijd.
    2. Oogst embryo's van zwangere koeien op 9,5 tot 11,5 dagen post coitum (dpc), afhankelijk van de fase van pre-Help en ondersteuning te worden geanalyseerd.
      Opmerking: Embryonale weefsels worden geoogst als eerder beschreven en juist geënsceneerde op basis van Somiet graaf16van C57BL/6J (CD45.2) muizen. We hebben gericht op de analyse van populaties uit de embryonale AGM-regio en zijn voorganger, de P-Sp, tussen E9.5 aan E11.5, gebaseerd op Somiet enscenering.
    3. Het ontleden van de AVA van de embryo's20.
      Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor de dissectie van AVA van lymfkliertest embryo's zijn gepubliceerd door anderen20. Als alternatief, dooierzak of andere weefsels die beweerde te hebben pre-HSC activiteit kunnen ook worden geanalyseerd door deze methode.
  2. De ontleed embryonale weefsels te distantiëren.
    1. Verzamelen van de ontleed weefsels in een conische tube van 15 mL, met 10 mL PBS met 10% FBS op ijs. Zwaartekracht weefsels regelen de PBS/FBS gecombineerd en onmiddellijk Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% collagenase in een waterbad 37 ° C gedurende 25 minuten.
    2. Voeg 1 mL PBS/10% FBS en Pipetteer ongeveer 20 - 30 keer met een 1 mL pipet tip om het verkrijgen van een enkele celsuspensie. Voeg een extra 8 mL PBS/10% FBS en centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.

3. antilichaam kleuring van lymfkliertest embryonale stamcellen

  1. Voorbereiden op de buffer met blokkerend antilichaam kleuring.
    1. Toevoegen van 10 µg/mL-antimuis CD16/CD32 (Fc receptor (FcR) blok) en 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL stockoplossing in H2O) tot 1 mL PBS met 10% FBS.
    2. Opstellen in een spuit met 3 mL en passeren een 0,22 µm spuit filter te steriliseren. Resuspendeer de pellet van de cel van de gedissocieerde lymfkliertest embryonale weefsels (uit stap 2.2.2) 500 µL blokkeren buffer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
  2. De antilichaam mix17voor te bereiden.
    1. Toevoegen van 10 µg/mL FcR blok aan 1 mL PBS met 10% FBS en 10 µL van elke anti-VE-cadherine fluorescerende-geconjugeerde antilichaam (CD144, zie de Tabel van materialen) en anti-EPCR fluorescerende-geconjugeerde antilichaam (CD201, zie de Tabel van de materialen). Gebruik een 1:100 in de uiteindelijke verdunning van de antilichamen tenzij anders aangegeven gebaseerd op aanbevelingen van de fabrikant of volgens titraties.
      Opmerking: Deze combinatie van antilichaam wordt gebruikt voor het definiëren van gates voor sorteren, zoals hieronder (stap 4.2) beschreven. Sortering op basis van de co uitdrukking van VE-cadherine en EPCR in staat stelt belangrijke verrijking voor het gedeelte van de AVA-afgeleide cellen met HSC voorloper activiteit, als eerder beschreven17.
    2. Het toevoegen van extra fluorescerende-geconjugeerde antilichamen voor verdere fenotypische analyse van individuele index-gesorteerd op precursoren.
      Opmerking: Deze antilichamen zijn niet noodzakelijk voor het definiëren van gates voor het sorteren gebruikt. In dit voorbeeld protocol, hebben we opgenomen anti-CD41 PE-geconjugeerde antilichaam en anti-CD45 FITC-geconjugeerd antilichaam voor het analyseren van de relatieve uitdrukking van deze hematopoietische markers, die tijdens de opkomst van pre-Help en ondersteuning van hemogenic endotheel4 evolueren ,5,16,17. Andere markeringen van belang kunnen worden opgenomen zoals gewenst. Monsters gekleurd met isotype fluorescerende-geconjugeerde antilichaam besturingselementen worden gebruikt voor het definiëren van negatieve en positieve gates voor analyse.
    3. Opstellen van de mix van antilichaam in een spuit met 3 mL en passeren een 0,22 µm spuit filter te steriliseren. Voeg 500 µL van het mengsel van antilichaam aan de celsuspensie in blokkeerbuffer, pipet te mengen, en broeden op het ijs gedurende ten minste 15-20 minuten.
  3. Wassen van de gekleurde cellen.
    1. 8 mL PBS/10% FBS toevoegen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g voor 5 min, aspirate en resuspendeer de cel met 1 mL PBS/10% FBS pellet.
    2. Verwijderen cel klontjes door pipetteren de celsuspensie via een 35 μm cel zeef GLB op een 5 mL-buis. De zeef van de cel met een extra 3 mL PBS/10% FBS wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min, gecombineerd resuspendeer in 500 µL PBS/10% FBS en plaats op het ijs tot FACS.

4. Index sorteren van één Hemogenic precursoren tot 96-wells met AGM-EG Stroma voor co cultuur

  1. Bereid de FACS machine voor plaat-modus en uitlijnen naar 96-wells-platen volgens instructies van de fabrikant worden gesorteerd. Selecteer één cel modus en index modus in de software voor maximale zuiverheid masker instellingen en om de verwerving van index parameters voor elke gesorteerde cel sorteren.
  2. Verwerven van een steekproef van cellen van het antilichaam gekleurd monsters als u wilt instellen van gates voor sorteren.
    1. Het monster van gekleurde cel op de machine FACS laden en het verwerven van cellen bij het laagste debiet. Uitzetten van de FSC-A verzen SSC-A en selecteer een hek dat cellen van verschillende grootte (figuur 1B) (die is gebaseerd op de observatie dat pre-HSC activiteit wordt geïdentificeerd in cellen van verschillende grootte profielen in de AVA17) bevat. Plot FSC-A verzen FSC-W en WS-A verzen SSC-W en selecteer de poorten te sluiten paren. Vervolgens plot FSC-A verzen DAPI aan de poort van levende cellen (negatief voor de DAPI) (figuur 1B).
    2. Uitzetten PECy7 (of de relevante fluorescerende voor de VE-cadherine vlek) versus PerCP (of de relevante fluorescerende voor de EPCR vlek). Poort van cellen die zijn positief voor VE-cadherine (waaronder een gemengde bevolking van endotheliale cellen evenals hematopoietische progenitorcellen en pre-Help en ondersteuning van de AVA) en die hoge EPCR-expressie (die verrijkt voor pre-HSC van P-Sp/AGM17). Dit is de laatste poort die zullen worden aangewend om de index van de afzonderlijke cellen sorteren in stap 4.3 (figuur 1B).
    3. Extra fluorochromes gebruikt voor de kleuring worden uitgezet.
      Opmerking: Afhankelijk van de populaties te analyseren, extra poorten kunnen worden ingesteld op basis van het detecteren van andere merkers voor de kleuring van de cellen opgenomen. Echter kan de opname van de fluorescerende parameters voor elke gesorteerde cel index Sorteren zodanig dat deze parameters kunnen met terugwerkende kracht worden geanalyseerd. Dus is geen extra gating noodzakelijk op dit punt. Voor alle FACS setups, moeten monsters gekleurd met één antilichamen worden gebruikt voor het aanpassen van de compensatie, ter verantwoording voor spill-over de uitstoot van overlappende fluorochromes, en met isotype controle antilichamen, zijn goed voor achtergrondkleuring te bepalen negatief/positief gates.
  3. Index Sorteren de AGM-cellen.
    1. Plaats een 96-wells-plaat bereid met de AGM-EG stroma in AVA serumvrij media met cytokines (uit stap 1.5.3) in het blok van de plaat van de FACs Sorteer machine. Laden van het monster en begint monster acquisitie. Index Sorteren/één cel kiezen en beginnen sortingsingle cellen aan afzonderlijke 96-wells. Het laagste debiet gebruiken om te minimaliseren van shear stress op embryonale stamcellen.
    2. Zorg ervoor dat alle gebeurtenissen worden vastgelegd tijdens het sorteren van de index. Hierdoor zal de opsomming van het totale aantal cellen geanalyseerd in de sorteer poort ten opzichte van het werkelijke aantal gesorteerde aan afzonderlijke 96-wells, aangezien niet alle gebeurtenissen die zijn vastgelegd in putjes worden gesorteerd.
    3. Zodra de cellen zijn gesorteerd op een hele 96-wells-plaat, plaatst u de plaat in een incubator weefselkweek bij 37 ° C vastgesteld op 5% CO2. Herhaal voor extra platen nodig per experiment.
    4. Co cultuur afzonderlijk gesorteerd op cellen in 96-wells met AGM-EG (uit stap 4.3) tot maximaal 7 dagen (5 dagen voor cellen gesorteerd van E11-11,5 embryo's, 6 dagen van E10-10.5 embryo's, 7 dagen vanaf E9-9.5 embryo's). Visualiseer hematopoietische kolonies van verschillende maten en morphologies met een omgekeerde Microscoop op 100 X vergroting (figuur 2B) na de periode van co-cultuur.
      Opmerking: De media hoeft niet te worden gewijzigd tijdens de periode van co-cultuur. Gesorteerd op hemogenic precursoren in eerste instantie kunnen integreren in de AVA-EG laag met een EG-achtige morfologie en kunnen niet worden in eerste instantie onderscheiden van AVA-EG stroma (figuur 2A). Echter volgende 24-48 h in co-cultuur, kleine, afgeronde hematopoietische cellen of clusters van cellen kunnen worden gedetecteerd. Aan het einde van co cultuur (5-7 dagen), kunnen afzonderlijke kolonies van hematopoietische cellen worden gevisualiseerd in de subset van 96-wells waarvoor een gesorteerde cel met klonen hematopoietische potentieel. Als visueel geïnspecteerde wells bevatten meer dan één afzonderlijke kolonie, dan in dit voorbeeld wordt uitgesloten van de downstream-analyse uit te sluiten van monsters die meer dan één cel, gesorteerd per putje hebben gekregen.

5. analyse van het klonen van hematopoietische nakomelingen na co cultuur

  1. Oogst klonen van elk 96-Wells FACS p.a..
    1. Pipetteer krachtig te distantiëren van hematopoietische cellen uit endotheel lagen met behulp van een meerkanaalspipet met 200 µL Pipetteer tips. Probeer niet te distantiëren van het endotheel laag. 100 µL (~ 50% van het monster) voor fenotypische analyse van hematopoietische nageslacht door FACS verwijderen.
    2. Overbrengen naar een 96-Wells-V-bodemplaat samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van de cellen. Verwijder het medium door flicking media van de plaat met een enkele snelle beweging, terwijl de plaat is omgekeerd (flick plaat).
    3. Plaats de resterende 100 µL cellen in de oorspronkelijke 96-wells-plaat in een 37 ° C incubatorfor gebruik in de volgende engraftment-test (stap 6).
  2. Incubeer de cellen met de juiste antilichamen voor hematopoietische analyse.
    1. Resuspendeer de cel pellets in ieder putje van een 96-Wells V-bodem met 50 µL van PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en 1 µg/mL DAPI. Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 5 min.
    2. Voeg 50 µL van PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en een mix van antilichaam voor HSC analyse met PE-Cyanine7-geconjugeerde anti-VE-cadherine, PerCP-geconjugeerde anti-CD45, PE-geconjugeerde anti-EPCR, APC-geconjugeerde anti-Sca1 en anti-Gr1 FITC-geconjugeerd en anti-F4/80 (elke antilichaam in de uiteindelijke verdunning 1:100 tenzij anders aangegeven op basis van aanbevelingen van de fabrikant of volgens titraties). Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende ten minste 20 min.
  3. Verwijder unbound antilichaam met opeenvolgende verdunningen en analyseren van de cellen.
    1. Voeg 200 µL per putje PBS/2% FBS en centrifuge bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van de cellen. Vervolgens flick plaat te Verwijder het supernatant en 200 µL PBS/2% FBS toevoegen aan elke cel pellet en centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van cellen.
    2. Flick plaat Verwijder het supernatant en toevoegen van 50 µL per putje PBS/2% FBS voor analyse. Ga verder met het analyseren van cellen door FACS met behulp van een cytometer van de stroom voorzien van een afleesapparaat.
      Opmerking: Verwerven een vaste hoeveelheid cellen (bijvoorbeeld, 35 µL van het totale 50 µL gebruikt voor resuspensie) bij het inventariseren van de deelverzamelingen van hematopoietische nakomelingen.
  4. Het analyseren van de gegevens van de FACS voor elk putje met hematopoietische nageslacht aan het scherm voor kolonies die HSC potentiële (Figuur 3 bevatten).
    1. Poort eerst de CD45 positieve bevolking dat is negatief voor myeloïde markeringen Gr1 en F480. Niet uit cellen die nog steeds uitdrukking geven aan lage niveaus van VE-cadherine gate. Cellen uit de AGM-EG-laag die worden verstoord tijdens oogst van hematopoietische kolonies zijn VE-cadherine positieve en negatieve CD45.
    2. Gate CD45+VE-CAD-- / lowGr1-- F4/80 cellen verder op de deelverzameling die hoge niveaus van EPCR en Sca1 express (figuur 3A -C).
      Opmerking: In de voorafgaande studies, kolonies ontbreekt cellen met CD45+VE-CAD-- / lowGr1-F4/80-Sca1HalloEPCRHallo fenotype (figuur 3D) geen reproducibly aantoonbaar multilineage perifeer bloed engraftment in bestraalde ontvangende muizen17 (gegevens niet worden weergegeven); deze kolonies moeten dus niet worden opgenomen in de analyse van de latere transplantatie in stap 6.

6. analyse van de Engraftment eigenschappen van individuele klonen en correlatie met fenotypische eigenschappen toegelicht door Index sorteren

  1. De dag van (indien mogelijk) of de ochtend na de fenotypische analyse in stap 5, opnieuw de resterende 100 µL cellen uit elke 96-Wells met hematopoietische koloniën na co cultuur (uit stap 5.1) door krachtig pipetteren met behulp van een pipet tip van 200 µL geschorst.
  2. Bereiden en redding cellen toevoegen uit hele beenmerg van congenisch stam B6. SJL-PtprceenPepcb/BoyJ (B6-CD45.1) volwassen muizen16,17.
    1. Rekenen genucleëerde beenmergcellen in Turken oplossing onder een hemocytometer. Verdund tot een concentratie van 5 x 10 nucleated5 cellen/mL in PBS met 2% FBS.
    2. Voeg 100 µL van redding beenmergcellen (5 x 10-4) aan elk putje met hematopoietische nakomelingen voor analyse van transplantatie en meng door pipetteren.
  3. Transplantatie van nakomelingen van de individuele klonen in één dodelijk bestraald ontvangende congenisch stam B6. SJL-PtprceenPepcb/BoyJ (B6-CD45.1) volwassen muis.
    1. Dodelijk bestralen hetzelfde aantal B6 CD45.1 muizen als het aantal klonen om individueel injecteren van nakomelingen van met een enkele kloon (met behulp van 1.000 cGy uit een Cesium-bron).
    2. Teken 200 µL totale celsuspensie dat is (inclusief cellen uit de kloon en 5 x 10,4 B6 CD45.1 redding beenmergcellen) in een ½ mL insuline-injectiespuit met een naald 29 G ½ inch.
    3. Dodelijk bestralen B6 CD45.1 volwassen ontvangers 2-24 h vóór injectie.
    4. Injecteren met behulp van een plastic muis afdekking waarmee staart toegang, via het staart ader 200 µL volume met zowel cellen uit elke kloon en 5 x 104 B6 CD45.1 volwassen redding beenmergcellen op steun in begunstigde overleven.
    5. Oor label wegen de ontvangende muizen en controleren van hun gewicht/gezondheid met regelmatige tussenpozen (bv3 - 4 keer / week post bestraling/transplantatie, of per afzonderlijke institutionele standard operating procedures) om goede gezondheid.
  4. Analyses van perifeer bloed engraftment op regelmatige tijdstippen (bv2, 16, 24 weken) uit te voeren na de transplantatie.
    1. 50-100 µL bloed via retro-orbitaal afloopgebied of een andere methode van ethisch goedgekeurde bloed te laten verwijderen.
    2. Voeg 3 mL lysis-buffermengsel (16.6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 en 74.4 mg EDTA tot 2 L H2O) naar bloed en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge 300 x g voor 5 min. Aspirate en resuspendeer de pellet met 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
    3. Resuspendeer de pellet met 150 µL PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en 1 µg/mL DAPI, en afzien van 1/3 van het volume op een goed met 50 µL isotype besturingselementen voor donor en afkomst, 1/3 aan een goed met 50 µL antilichaam donor en isotype controles voor afkomst , en 1/3 aan een putje 50 µL antilichamen op te sporen van zowel donor als bloedlijn met.
      Opmerking: Antilichamen voor de detectie van multilineage engraftment: APCeFluor780-geconjugeerde anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-geconjugeerde anti-CD45.1, FITC-geconjugeerd anti-CD3, PE-geconjugeerde anti-F4/80, PerCP-geconjugeerde anti-Gr1 en APC-geconjugeerde anti-CD19, of relevante isotype besturingselementen.
    4. Identificeren van klonen met lange engraftment door beoordeling van de bijdrage van het perifeer bloed van FACS na verloop van tijd van CD45.2 (donor)-afgeleid van hematopoietische cellen naar myeloïde (Gr1 en/of F4/80 positief), B-cel (CD19 positief) en T-cel (CD3 positief) (figuur 4A -B).
      Opmerking: Hematopoietische engraftment kan ook worden geanalyseerd door CD45.2 (donor)-bijdrage hematopoietische populaties uit weefsels verkregen uit het beenmerg, milt, thymus en buikvlies, of naar aanleiding van secundaire transplantatie van beenmergcellen geoogst in B6 CD45.1 muizen voor het analyseren van seriële engraftment eigenschappen17.
  5. Correleren de fenotypische eigenschappen van elke kloon zoals bepaald door de index van de eerste eencellige sorteren met zijn engraftment eigenschappen. Met de software van de analyse van de stroom, uploaden sorteer parameters voor elke index-gesorteerd op cel (gecorreleerd aan de 96-Wells waarnaar het werd gesorteerd). Functionele kaartgegevens op stroom percelen te evalueren van de fenotypische eigenschappen van afzonderlijke cellen als ze betrekking op hun functionele output (bijvoorbeeld, op lange termijn, multilineage engraftment hebben) (figuur 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1A blijkt een schematische voorstelling van de proefopzet. Zodra P-Sp/AGM weefsels zijn ontleed, gebundeld en losgekoppeld in collagenase, zijn ze gekleurd met antilichamen tegen VE-cadherine en EPCR voor het sorteren van de index. Pre-HSC zijn verrijkt met cellen gesorteerd op VE-cadherine+EPCRhoge (figuur 1B). Andere fluorescerende-geconjugeerde antilichamen kunnen worden opgenomen om te analyseren achteraf extra fenotypische parameters, die zijn opgenomen voor elke cel bij het sorteren van de index. In dit representatieve experiment van E11 AGM, zijn de cellen ook gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-CD45 en anti-CD41 PE-geconjugeerde antilichamen. Heterogeniteit binnen de VE-cadherine+EPCRhoge bevolking voor deze hematopoietische-specifieke markers wordt waargenomen (Figuur 1 c), consistent met de bekende asynchrony in hematopoietische ontwikkeling zijn op deze fase5.

Na de index sortering van afzonderlijke VE-cadherine+EPCRhoge AGM cellen aan afzonderlijke 96-wells met AGM-EG in AVA serumvrij media en cytokines, kolonie-vorming optreedt. In eerste instantie integreren gesorteerde VE-cadherine+EPCRhoge AGM cellen in de AVA-EG laag voordat ze beginnen te ronden en vormen van hematopoietische clusters (figuur 2A, hieronder uit cellen gesorteerd van een transgene lymfkliertest embryo uiten GFP onder de Ly6a promotor21, ze te onderscheiden van de AVA-EG stroma). Na 5-7 dagen van co cultuur, kunnen kolonies van verschillende afmetingen en morphologies worden gedetecteerd door inspectie met een omgekeerde Microscoop (figuur 2B), hier weergegeven uit een representatieve experiment, 6 dagen na sortering van E11 AGM.

Volgende, fenotypische analyse door FACS wordt uitgevoerd op de helft van het nageslacht van elke VE-cadherine+EPCRhoge cel die een hematopoietische kolonie heeft gevormd. Met cellen met HSC fenotype kolonies worden geïdentificeerd als VE-cadherine- / lowGr1-F4/80-CD45+Sca1HalloEPCRhi (Figuur 3). Hier, laten we vier verschillende kolonies verkregen na co cultuur van index-gesorteerd E11 AGM VE-cadherine+EPCRhoge cellen, drie met verschillende verhoudingen van fenotypische HSC met andere meer gedifferentieerde celtypes (figuur 3A -C), en de vierde ontbreekt cellen met HSC fenotype (figuur 3D). Het aantal kolonies per aantal cellen verguld en het percentage dat in de cel van de stam van de engraftable kolonies resulteerde in acht genomen zijn, is afhankelijk van de embryonale leeftijd en het soort uitgevoerd. VE-cadherine- / lowGr1-F4/80-CD45+Sca1HalloEPCRHallo E11 AGM klonen gegenereerde 53 ± 15 kolonies uit 192 cellen verguld met 5% ± 1,3% van de 192 cellen vergulde genereren die lang geaccepteerd klonen termijn (gemiddelde ± SD voor 3 experimenten).

Als u wilt het fenotype correleren met potentiële engraftment, de resterende helft van de nakomelingen van elke VE-cadherine+EPCRhoge cel die heeft gevormd een hematopoietische kolonie met cellen met HSC fenotype gedetecteerd door FACS (b.v., de kolonies vertegenwoordigd in figuur 3A--C) is aan bestraalde (1.000 cGy) volwassen congenisch stam (B6-CD45.1) muizen samen met een dosis van redding cellen getransplanteerd van B6 CD45.1 beenmerg. Op lange termijn multilineage engraftment voor elke kloon wordt bevestigd door de bijdrage van de donor (CD45.2) te volgen naar de myeloïde (Gr1 en F4/80), B-cel (CD19), en T-cel (CD3) compartiment van het perifere bloed na verloop van tijd (figuur 4A). Hoewel de meeste koloniën met cellen met HSC fenotype gedetecteerd door FACS op lange termijn engraftment bieden, is transplantatie nodig om te bevestigen van functionele multilineage engraftment zoals sommige klonen engraftment na verloop van tijd (figuur 4B) verliezen of weergeven unieke engraftment eigenschappen zoals lymfoïde-vooringenomen engraftment (gegevens niet worden weergegeven). Zodra het functionele HSC potentieel van elke VE-cadherine+EPCRhoge kloon is bepaald, is dit gecorreleerd terug naar dat kloon van index parameters worden gebruikt voor het identificeren van de precieze fenotypische kenmerken sorteren. In dit voorbeeld zien we dit bevestigd functioneel pre-HSC klonen (rode stippen) zijn heterogeen van hun uitdrukking van CD41 en CD45, overeenstemming met gevestigde dynamische expressie van deze markeringen tijdens pre-HSC rijping naar HSC (figuur 4C). Klonen vorming van hematopoietische kolonies maar beide ontbreken HSC potentieel door fenotypische screening of door afwezigheid van lange termijn, multilineage engraftment, na transplantatie (niet-HSC hemogenic klonen, blauwe stippen) zijn ook heterogene voor CD41 en CD45, Hoewel een subset express hogere niveaus van CD41 in vergelijking met pre-HSC klonen, die voornamelijk CD41laag. Klonen die geen hematopoietische koloniën (niet-hemogenic klonen, licht groene stippen vormden) zijn voornamelijk CD41- / lowCD45-, die weerspiegelen waarschijnlijk niet-hemogenic VE-cadherine+EPCRhoge endotheliale cellen.

Figure 1
Figuur 1: overzicht van Protocol en representatieve stroom cytometry analyse voor het sorteren van de index van interne cellen. (A) Schematische weergave van het protocol. (B) stroom cytometry analyse van gedissocieerde E11 AGM weergegeven: gating strategie cellen voor het sorteren van de index van VE-cadherine+EPCRhoog cellen verrijkt voor pre-HSC (analyse met de software van de analyse van de FACS). Getallen in elke poort geven het percentage van de cellen. (C) stroom cytometry analyse met CD41 en CD45 vlekken binnen de VE-cadherine+EPCRhoge bevolking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vorming van hematopoietische kolonies tijdens de AVA-EG mede cultuur. (A) Time-lapse beeldvorming van VE-cadherine+EPCRhogeGFP+ gesorteerd op cellen uit Ly6a-GFP transgene embryo's21 mede gekweekt op AVA-EG. Schaal bars in µm worden weergegeven in de linkerbenedenhoek van elke afbeelding. (B) vertegenwoordiger kolonies gevormd uit VE-cadherine+EPCRhoge index-gesorteerd op afzonderlijke cellen na 6 dagen cultuur samen op AVA-EG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Stroom cytometry analyse van de nakomelingen van een enkel E11 AGM-afgeleide VE-cadherine+EPCRhoge cellen na co cultuur op AVA-EG. Gating voor cellen met HSC potentieel wordt weergegeven als de deelverzameling die VE-cadherine- / lowGr1-F4/80- (linker paneel), CD45+ (middelste deelvenster), en Sca1HalloEPCRhi (rechtervenster). (A) representatieve kolonie bestaat uit een homogene bevolking van cellen met het fenotype van HSC. (B-C) Representatieve kolonies met een mix van cellen met de HSC fenotype en meer gedifferentieerde celtypes. (D) vertegenwoordiger kolonie bestaat uit cellen ontbreekt het HSC fenotype. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: analyse van perifeer bloed engraftment van nakomelingen van de individuele klonen na AVA-EG mede cultuur en correlatie met index Sorteren parameters. (A) engraftment van de Donor CD45.2 afkomstige perifere bloed van myeloïde (Gr1 en F4/80), B-cel (CD19) en deelverzamelingen van de T-cel (CD3) van een representatieve ontvanger (B6-CD45.1) getransplanteerde met nakomelingen van individuele E11 VE-cadherine+EPCRhoog kloon na AVA-EG mede cultuur. (B) Donor CD45.2 afkomstige perifere bloed engraftment na verloop van tijd na transplantatie van nakomelingen van met individuele E11 VE-cadherine+EPCRhoge klonen na AVA-EG mede cultuur. (C) correlatie van CD41 en CD45-expressie voor elke index gesorteerd op VE-cadherine+EPCRhoog kloon met het potentieel van de HSC volgende AVA-EG mede cultuur gebaseerd op lange termijn, multilineage engraftment in kwantitatieve analyse van transplantatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De studie van HSC genesis tijdens de embryonale ontwikkeling vereist kunnen detecteren HSC potentiële in hemogenic precursoren nog ontbreekt de bevoegdheid om te bieden op de lange termijn multilineage hematopoietische reconstitutie in getransplanteerde volwassen ontvangers. In dit protocol presenteren we een klonale assay van embryonale hemogenic precursoren door stromale co cultuur op vasculaire niche ECs van de AVA, die de rijping van precursoren naar HSC ondersteunt, met latere functionele analyse van transplantatie testen. Opneming van index vergunningen sorteren de retrospectieve analyse van fenotypische parameters te karakteriseren van de eigenschappen van pre-HSC zoals gedefinieerd door de oppervlakte markeringen opgenomen in de bepaling. Deze aanpak biedt dus een voordeel ten opzichte van andere methoden die afhankelijk zijn van bulk sortering van de populaties van de voorloper met re-aggregation gebaseerde HSC testen4,5,10, efficiënte screening voor potentiële markeringen inschakelen van pre-Help en ondersteuning en tegelijkertijd het verstrekken van informatie over de relatieve expressie niveau van oppervlakte markers voor elke afzonderlijke cel. Met behulp van deze methode, bijvoorbeeld, hebben we eerder gemeld dat, naast het gebruik van EPCR te verrijken voor pre-HSC populaties in verschillende stadia van ontwikkeling, tussenliggende uitdrukking van de inkeping ligand Dll4 nader gedefinieerd een subpopulatie van klonen VE-cadherine++ EPCR precursoren met HSC potentiële, overwegende dat Dll4 negatieve VE-cadherine+EPCR+ hemogenic precursoren meestal ontbrak HSC potentiële17.

Een ander voordeel van deze methode is de mogelijkheid om scherm voor HSC potentieel onmiddellijk na co cultuur gebaseerd op de detectie van hematopoietische nakomelingen met een fenotype (VE-cadherine- / lowGr1-F4/80-CD45+Sca1 HalloEPCRHallo) die is gecorreleerd met op lange termijn, multilineage engraftment. Dit elimineert de noodzaak transplantatie kolonies ontbreekt hematopoietische nakomelingen met deze HSC fenotype, zoals deze koloniën geen lange-termijn engraftment in transplantatie testen bieden. Bovendien eerste informatie onderscheiden van potentiële pre-Help en ondersteuning van hemogenic precursoren ontbreekt HSC potentieel onmiddellijk na co cultuur, zonder de noodzaak om te wachten op resultaten van langdurige engraftment testen, is nuttig, bijvoorbeeld snel screening kandidaat-markers van HSC-precursoren. De correlatie van fenotypische gegevens met langdurige engraftment na transplantatie biedt echter extra waardevolle inzichten in variaties van de precieze engraftment eigenschappen van pre-HSC klonen. We vonden, bijvoorbeeld dat klonen pre-HSC uit de P-Sp/AGM-regio tussen E9.5 en E11.5 hebben unieke kunnen aanleiding geven tot zowel B1a en B2-lymfocyten, terwijl B1a-lymfocyt potentieel is tekort aan volwassen HSC17. Bovendien, we een evolutie in de engraftment eigenschappen van pre-HSC klonen tussen E9.5 en E11.5 met eerdere pre-HSC demonstreren een relatieve scheef richting van peritoneale B1a verzen B2-lymfocyt engraftment en minder robuuste zelf-vernieuwing potentieel gebaseerd ontdekt testen op secundaire transplantatie17.

Terwijl dit protocol zorgt voor een waardevolle manier om het verhelderen van de unieke eigenschappen van klonen HSC precursoren, zitten ziedaar sommige beperktheid dat moeten worden erkend. Hoewel detectie van nakomelingen met HSC fenotypische door FACS na AVA-EG mede cultuur is meestal gecorreleerd aan lange termijn multilineage engraftment, bieden sommige kolonies met dit fenotype alleen op korte termijn engraftment of engraftment tekort in één of meer hematopoietische lineages (figuur 4B; gegevens niet worden weergegeven). Transplantatie blijft dus, de gouden standaard bij het valideren van functionele HSC. Worden bovendien, het kan niet uitgesloten dat enkele van de verschillen in de engraftment eigenschappen van pre-HSC klonen, in plaats van als gevolg van cel-intrinsieke verschillen in hemogenic voorloper potentieel, kan voortvloeien uit stochastische variabiliteit tijdens de AVA-EG mede cultuur in zelf-vernieuwing verzen zijn differentiatie besluiten, als pre-HSC tegelijk rijpen naar HSC en celdelingen ondergaan. Inderdaad, dit kan gedeeltelijk rekening voor de waargenomen heterogeniteit van kolonie morfologie en fenotype van cellen die zijn gegenereerd op basis van individuele pre-HSC klonen (bijvoorbeeld figuur 3A--C), en kan leiden tot een onderschatting van pre-Help en ondersteuning door deze test als niet alle mogelijke pre-HSC klonen worden gedetecteerd door de generatie van functionele HSC na AVA-EG mede cultuur. Echter biedt de mogelijkheid om te onderscheiden van functioneel verschillende hemogenic klonen door hun differentiële expressie van unieke fenotypische gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in Dll417) ingeschakeld door deze methode een manier om te identificeren van de subpopulaties van hemogenic precursoren met inherente cel-intrinsieke verschillen.

Voortbouwend op deze basisprotocol, kan een aantal uitgebreide toepassingen worden opgenomen hematopoietische potentieel van klonen hemogenic precursoren tijdens de ontwikkeling verder te bestuderen. Buiten het gebruik van antilichamen voor detectie van oppervlakte markers, expressie van fluorescentie markers in transgene embryo's (bv., Ly6a- GFP21 of Runx1 -GFP22 uitgedrukt in hemogenic endotheel/pre-HSC) kan worden opgenomen voor het sorteren van de index van hemogenic precursoren. Naast transplantatie testen na AVA-EG mede cultuur voor het detecteren van vermeende pre-HSC, de nakomelingen ook voor hematopoietische lineage potentieel op basis van secundaire in vitro testen, zoals cultuur op OP9 of OP9-Dl1 te detecteren van B - en T-cel kan worden beoordeeld potentiële23, of clonogenic kolonievormende testen in methylcellulose te detecteren erythromyeloid potentieel. Inderdaad, enkele van de niet-HSC hemogenic klonen (bijvoorbeeld afbeelding 3D) waarschijnlijk vertegenwoordigen multipotente voorlopercellen, erythromyeloid progenitorcellen, of T - en B-cel progenitoren eerder beschreven die voorafgaan aan en die onafhankelijk zijn van HSC ontwikkeling 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, en deze test kan verder klonale studies van deze verschillende golven van hematopoietische precursoren te vergemakkelijken. Ten slotte, index Sorteren van pre-Help en ondersteuning kan worden gecombineerd met andere stroomafwaartse analyses uitgevoerd, zoals eencellige RNA-sequencing, te correleren fenotypische eigenschappen met de globale transcriptionele profielen HSC precursoren te ontwikkelen. Over het geheel genomen biedt dit protocol een methode voor de robuuste analyse van klonen Haematopoiese van embryonale hemogenic precursors waarmee nieuwe inzichten in de ontwikkeling van de HSC moeten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Andrew Berger, Stacey Dozono en Brian Raden in het Fred Hutchinson Stroom Cytometry kern voor hulp met FACS. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid NHLBI UO1-subsidie #HL100395, bijkomende Collaborative Grant #HL099997 en NIDDK verlenen #RC2DK114777. Brandon Hadland wordt ondersteund door de Alex's limonade staan Foundation en Hyundai Hope op wielen Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 135 hematopoietische stamcellen (HSC) pre-HSC aorta-gonaden-mesonephros regio (AVA) embryonale Haematopoiese index Sorteren eencellige klonen analyse hematopoietische stamceltransplantatie
Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hadland, B. K., Varnum-Finney, B.,… More

Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter