Summary
Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.
Abstract
La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.
Introduction
Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento1. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche2. Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto in destinatari adulti condizionati, non vengono rilevati fino a dopo giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nell'embrione murino, a bassissima frequenza3 . Durante il loro sviluppo, precursori di HSC (pre-HSC) derivanti dall'endotelio hemogenic devono essere sottoposti a maturazione prima di acquisire la proprietà di HSC adulto che consentono per efficiente attecchimento nel trapianto saggi4,5 , 6. oscurando lo studio rari HSC origine, una moltitudine di progenitori ematopoietici con degli eritrociti, mieloidi e linfoidi potenziale sono già individuati prima l'emergere di HSC da pre-HSC7,8. Così, distinguendo pre-HSC da altri progenitori ematopoietici richiede metodi clonally isolare cellule e fornire loro i segnali sufficienti per la loro maturazione per HSC, per rilevare le loro proprietà di attecchimento in saggi di trapianto.
È state descritte una serie di approcci che consentono il rilevamento di pre-HSC di maturazione sia ex vivo o in vivo di HSC. Ex vivo metodi hanno dipendeva da coltura di tessuti embrionali, come la regione AGM, dove il primo HSC vengono rilevati in sviluppo9. Sulla base di questi metodi, protocolli che incorporano la dissociazione, l'ordinamento e ri-aggregazione dei tessuti AGM hanno permesso la caratterizzazione delle popolazioni ordinati contenenti precursori di HSC durante lo sviluppo da E9.5 per E11.5 in para-aortica Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioni4,5,10; Tuttavia, questi approcci non sono suscettibili di analisi di alto-rendimento dei precursori a livello di singola cellula necessari per l'analisi clonale. Allo stesso modo, maturazione in vivo da trapianto in topi neonati, dove il microambiente è presunta per essere più adatto per il supporto delle precedenti fasi di precursori HSC, ha permesso anche gli studi delle popolazioni ordinati dal sacco vitellino e AGM / P-Sp (P-Sp è la regione di precursore per l'AGM) con caratteristiche di pre-HSC, ma questi metodi anche non riescono a fornire una piattaforma robusta per singola cella analisi11,12.
Gli studi da Rienzi et al hanno dimostrato che quello stroma Akt-attivata delle cellule endoteliali (EC) può fornire un substrato di nicchia per il supporto dell'adulto HSC auto-rinnovamento in vitro13,14,15. Abbiamo recentemente hanno determinato che la CE Akt attivato derivato dalla regione AGM (AGM-CE) fornisce una nicchia adatta in vitro per la maturazione dei precursori hemogenic, isolato più presto E9 in sviluppo, per HSC adulto-capacità di integrazione, così come la successiva auto-rinnovamento di generato HSC16. Dato che questo sistema utilizza una semplice 2-dimensionale co-coltura, è facilmente adattabile per analisi clonale del potenziale HSC di precursori hemogenic individualmente isolato.
Recentemente abbiamo segnalato un approccio di saggiare le potenzialità HSC di precursori hemogenic clonale combinando Indice ordinamento dei precursori hemogenic individuali da embrioni murini con AGM-CE co-cultura e successiva analisi funzionale nel trapianto analisi di17. Indice di ordinamento è una modalità di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) che registra (indici) tutti i parametri fenotipici (cioè, parametri di forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescenza) di ciascuna cella individualmente ordinato tale che questi caratteristiche possono essere correlati in modo retrospettivo per successiva analisi funzionale seguendo l'ordinamento. FACS software registra sia informazioni fenotipiche per ogni cella e la posizione/pozzetto della piastra 96 pozzetti in cui è stato disposto. Questa tecnica è stata utilizzata precedentemente elegantemente per identificare eterogeneità nell'adulto HSC, determinare parametri fenotipici che ulteriormente arricchiscono per il sottoinsieme di attecchimento a lungo termine di HSC e correlano parametri fenotipici di HSC con trascrizionale Proprietà presso la singola cella livello18,19. Qui, forniamo metodologia dettagliata di questo approccio che consente l'identificazione di parametri univoci fenotipici e contributi di lignaggio di pre-HSC durante le prime fasi dello sviluppo embrionale.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. preparazione di monostrati AGM-CE per la co-cultura
- 24 h prima della dissezione AGM e ordinamento, fare filtro sterilizzare e terreni di coltura AGM-CE.
- Aggiungere la gelatina di 0,1% in acqua (100 µ l/pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aspirato la gelatina e lasciare il piatto in una cappa di coltura del tessuto con il coperchio rimosso fino a quando i pozzi sono asciutti.
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Dissociare la strati monomolecolari AGM-CE e la piastra per piastre da 96 pozzetti.
Nota: Mantenere l'AGM-CE, preparato come descritto in precedenza16, in terreni di coltura AGM-CE. Per coerenza, linee cellulari AGM-CE dovrebbero essere congelate appena sufficienti numeri sono ottenuti (generalmente passaggio 1-3) e utilizzate in un numero definito di passaggio (in genere il passaggio 5-12) per gli esperimenti di co-coltura. Linee cellulari AGM-CE sono derivate da C57BL/6J (CD45.2) AGM. Vedi la Tabella materiali per tutte le composizioni multimediali.- Aspirare i media dalla cultura AGM-CE in un pallone da2 di 75 cm e aggiungere 5 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina (Vedi Tabella materiali).
- Incubare a 37 ° C per 2-4 minuti fino a quando la maggior parte delle cellule sono sollevamento fuori la piastra. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura di AGM-CE e dispensare 8 - 10 volte con una pipetta 10ml per preparare la sospensione di singole cellule e trasferire in una provetta da 15 mL.
- Girare a 300 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, risospendere in terreni di coltura di 10ml AGM-CE e stimare il numero di cellulare con un emocitometro. Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in terreni di coltura AGM-CE.
- Aggiungere 100 µ l AGM-CE cella sospensione (1 x 104 celle) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti gelatinizzata. Posto in un 37 ° C, 5% CO2 coltura tissutale incubatore durante la notte per consentire alla AGM-CE di allegare e formano un monostrato confluente.
Nota: Distribuire uniformemente le cellule stromal AGM-CE c'è limitata crescita eccessiva o cella agglutinamento per ottima co-coltura. -
Preparare il monostrato di AGM-CE per AGM co-culture.
- La mattina seguente, preparare i supporti di privo di siero AGM.
- Usando una pipetta multicanale 12-pozzetti, rimuovere il supporto di cultura AGM-CE da AGM-CE e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM senza citochine per lavare qualsiasi supporto contenente siero residuo.
- Rimuovere il supporto e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM con citochine. Lavorare velocemente quando si rimuove e aggiungendo il supporto in modo che lo strato endoteliale non è compromessa; ad esempio, rimuovere e aggiungere nuovamente una riga media in un momento. Posizionare le piastre da 96 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C fino a quando le cellule embrionali sono pronte per l'ordinamento.
2. preparazione della sospensione singola cella da tessuti embrionali murini
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Sezionare l'AGM da accoppiamenti temporizzati.
- Impostare accoppiamenti temporizzati per la generazione di tessuti embrionali dell'età desiderata.
- Raccolta embrioni da femmine gravide al coitum dell'alberino di 9.5-11.5 giorni (dpc), a seconda della fase di pre-HSC per essere analizzati.
Nota: Tessuti embrionali vengono raccolte da topi C57BL/6J (CD45.2) come descritto in precedenza e precisamente in fasi somite basata su conteggio16. Ci siamo concentrati sull'analisi delle popolazioni della regione di AGM embrionali e suo precursore, il P-Sp, tra E9.5 a E11.5, basata sulla stadiazione somite. - Sezionare l'AGM da embrioni20.
Nota: Protocolli dettagliati per la dissezione dell'AGM da embrioni murini sono stati pubblicati da altri20. In alternativa, vitellino o altri tessuti pretesi di avere attività pre-HSC potrebbero anche essere analizzati da questo metodo.
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Dissociare i tessuti embrionali dissecati.
- Raccogliere i tessuti dissecati in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di PBS con 10% FBS sul ghiaccio. Gravità stabilirsi tessuti, aspirare il PBS/FBS e quindi immediatamente aggiungere 1 mL di 0,25% collagenosi e posto in bagnomaria a 37 ° C per 25 min.
- Aggiungere 1 mL di PBS/10% FB e dispensare circa 20 - 30 volte con una punta di pipetta da 1 mL per ottenere una sospensione di singola cellula. Aggiungere un ulteriore 8 mL di PBS/10% FBS e cellule di centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.
3. anticorpo macchiatura delle cellule embrionali Murine
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Preparare il tampone bloccante per la macchiatura dell'anticorpo.
- Aggiungere 10 µ g/mL anti-mouse CD16/CD32 (blocco del recettore (FcR) di Fc) e 1 µ g/mL DAPI (1 mg/mL di brodo in H2O) a 1 mL di PBS con 10% FBS.
- Elaborare in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Risospendere il pellet cellulare dai tessuti embrionali murini dissociati (dal punto 2.2.2) in 500 µ l blocco buffer e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Preparare il mix di anticorpo17.
- Aggiungere il blocco di FcR 10 µ g/mL a 1 mL di PBS con 10% FBS e 10 µ l di ogni anticorpo di anti-VE-caderina fluorocromo-coniugate (CD144, vedere la Tabella materiali) e dell'anticorpo anti-EPCR fluorocromo-coniugate (CD201, Vedi Tabella materiali). Utilizzare una diluizione finale di 1: 100 di anticorpi, se non diversamente indicato basata sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni.
Nota: Questa combinazione di anticorpo viene utilizzata per la definizione di cancelli per l'ordinamento, come descritto di seguito (punto 4.2). L'ordinamento in base il co-espressione di VE-caderina ed EPCR consente un arricchimento significativo per la parte di cellule derivate da AGM che contiene attività di precursore HSC, come descritto in precedenza17. - Aggiungere altri anticorpi fluorocromo-coniugate per ulteriore analisi fenotipica dei singoli precursori indice ordinato.
Nota: Questi anticorpi non sono necessariamente utilizzati per la definizione di cancelli per l'ordinamento. In questo protocollo di campione, abbiamo incluso PE-coniugato anti-CD41 anticorpo e l'anticorpo coniugato FITC anti-CD45 per analizzare l'espressione relativa di questi marcatori ematopoietici, che evolvono durante l'emersione di pre-HSC dall'endotelio hemogenic4 ,5,16,17. Altri markers di interesse possono essere incluse come desiderato. Campioni colorati con controlli di fluorocromo-coniugate dell'isotipo dell'anticorpo vengono utilizzati per definire gate di negativi e positivi per l'analisi. - Redigere il mix di anticorpo in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Aggiungere 500 µ l della miscela dell'anticorpo alla sospensione di cellule in tampone bloccante, pipetta per mixare e incubare in ghiaccio per almeno 15-20 min.
- Aggiungere il blocco di FcR 10 µ g/mL a 1 mL di PBS con 10% FBS e 10 µ l di ogni anticorpo di anti-VE-caderina fluorocromo-coniugate (CD144, vedere la Tabella materiali) e dell'anticorpo anti-EPCR fluorocromo-coniugate (CD201, Vedi Tabella materiali). Utilizzare una diluizione finale di 1: 100 di anticorpi, se non diversamente indicato basata sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni.
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Lavare le cellule marcate.
- Aggiungere 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere le cellule a pellet con 1 mL PBS/10% FBS.
- Rimuovere grumi di cellule pipettando sospensione delle cellule attraverso un tappo filtro di cella μm 35 su una provetta da 5 mL. Lavare il filtro cella con un ulteriore 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare, risospendere in 500 µ l PBS/10% FBS e metterli su ghiaccio fino al FACS.
4. Indice ordinamento dei precursori Hemogenic singolo 96-pozzetti con lo Stroma AGM-CE per la co-cultura
- Preparare la macchina di FACS per modalità di piastra e allineare per l'ordinamento per piastre da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Selezionare la modalità singola cella e indice ordinamento nel software per impostazioni di maschera di massima purezza e per consentire l'acquisizione di parametri di indice per ogni cella ordinato.
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Acquisire un campione di cellule dall'anticorpo macchiato campioni per impostare le porte per l'ordinamento.
- Caricare il campione di cellule macchiato sulla macchina FACS e acquisire le cellule alla minima portata. Plot FSC-A versi SSC-A e selezionare un cancello che include celle di varie dimensioni (Figura 1B) (che si basa sull'osservazione che attività di pre-HSC è identificato in cellule di profili di diverse dimensioni a AGM17). Trama: FSC-A versi FSC-W e SSC-A versi SSC-W e selezionare cancelli per escludere doppietti. Poi tracciare FSC-A versi DAPI a cancello cellule vive (negative per DAPI) (Figura 1B).
- Trama PECy7 (o il fluorocromo pertinente per la macchia di VE-caderina) contro PerCP (o il fluorocromo pertinente per la macchia EPCR). Le cellule che sono positive per VE-caderina (che comprende una popolazione mista di cellule endoteliali come progenitori ematopoietici e pre-HSC da AGM) e che hanno alta espressione EPCR (che arricchisce per pre-HSC dal P-Sp/AGM17) del cancello. Questa è la porta finale che verrà utilizzata per indicizzare sorta singole cellule in fase 4.3 (Figura 1B).
- Trama fluorocromi aggiuntivi utilizzati per la colorazione.
Nota: A seconda la sottopopolazione per essere analizzati, porte aggiuntive possono essere impostate in base sulla rilevazione di altri marcatori incluso per la macchiatura delle celle. Tuttavia, l'ordinamento indice permette di registrare i parametri fluorescenti per ogni cella ordinato tale che questi parametri possono essere analizzati in modo retrospettivo. Così, ulteriori gating non è necessario a questo punto. Per tutte le impostazioni di FACS, campioni macchiati con gli anticorpi singoli devono essere utilizzati per regolare la compensazione, per tenere conto di ricaduta nell'emissione dei fluorocromi sovrapposti e con gli anticorpi di controllo isotipo, al conto per una colorazione di fondo e determinare cancelli di negativo/positivo.
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Indice di ordinare le celle AGM.
- Posto una piastra a 96 pozzetti preparata con lo stroma di AGM-CE in media senza siero AGM con citochine (dal punto 1.5.3) nel blocco piastra del sorter FACs. Caricare l'esempio e iniziare l'acquisizione del campione. Selezionare la modalità di ordinamento/singola cella di indice e iniziare sortingsingle cellule individuali 96-pozzetti. Utilizzare il più basso tasso di flusso per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio sulle cellule embrionali.
- Garantire che tutti gli eventi vengono registrati durante l'ordinamento di indice. Ciò consentirà di enumerazione del numero totale delle cellule analizzate nel cancello ordinamento relativo per l'effettivi numeri ordinato ai singoli 96-pozzi, come non tutti gli eventi registrati verranno ordinati per pozzi.
- Una volta che le cellule sono state ordinate per un'intera piastra a 96 pozzetti, posizionare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 ° C, impostato al 5% CO2. Ripetere per piastre aggiuntive richieste per ogni esperimento.
- Cellule di co-coltura individualmente ordinato a 96 pozzetti contenenti AGM-CE (dal punto 4.3) fino a 7 giorni (5 giorni per le celle filtrate dagli embrioni E11-11.5, 6 giorni da embrioni E10-10.5, 7 giorni da embrioni E9-9.5). Visualizzare colonie ematopoietiche di varie dimensioni e morfologie con un microscopio invertito a 100 ingrandimenti (Figura 2B) dopo il periodo di co-coltura.
Nota: I media non ha bisogno di essere cambiato durante il periodo di co-coltura. Ordinato hemogenic precursori inizialmente possono integrare il livello di AGM-CE con una morfologia simile a CE e non possono essere inizialmente distinto dallo stroma AGM-CE (Figura 2A). Tuttavia, seguenti 24-48h in co-coltura, piccola, arrotondate cellule ematopoietiche o mazzi delle cellule possono essere rilevati. Alla fine di co-coltura (5-7 giorni), diverse colonie di cellule ematopoietiche possono essere visualizzati nel sottoinsieme di 96-pozzi che ha ricevuto un'ordinata delle cellule con potenziale ematopoietico clonale. Se visivamente ispezionati pozzetti contengono più di una colonia distinto, quindi in questo esempio viene escluso dall'analisi a valle per escludere campioni che potrebbero aver ricevuto più di una cella ordinata per pozzetto.
5. analisi della progenie ematopoietici clonali dopo co-coltura
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Cloni di raccolto da ogni 96 pozzetti per analisi al FACS.
- Vigorosamente dispensare a dissociare le cellule ematopoietiche da strati endothelial usando una pipetta multicanale con punte di pipetta 200 µ l. Cercate di non dissociare lo strato endoteliale. Rimuovere 100 µ l (~ 50% del campione) per analisi fenotipica di ematopoietico progenie di FACS.
- Versare in un piatto fondo V 96 pozzetti e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Rimuovere il supporto scorrendo media dalla piastra con un unico movimento rapido, mentre la piastra è invertita (Scorri la piastra).
- Inserire le celle rimanenti 100 µ l nell'originale piastra a 96 pozzetti in un uso di incubatorfor di 37 ° C nel dosaggio successivo attecchimento (passaggio 6).
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Incubare le cellule con gli anticorpi adatti per analisi ematopoietico.
- Risospendere il pellet cellulare in ciascun pozzetto di una carena a V-96 pozzetti con 50 µ l di PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL FcR blocco e 1 µ g/mL DAPI. Incubare la piastra a 4 ° C per 5 min.
- Aggiungere 50 µ l di PBS/2% FBS contenente il blocco di FcR 10 µ g/mL e un mix di anticorpo per analisi HSC contenente PE-Cyanine7-coniugato anti-VE-caderina, PerCP-coniugati anti-CD45, PE-coniugato anti-EPCR, APC-coniugato anti-Sca1 e FITC Coniugato anti-Gr1 e anti-F4/80 (ogni anticorpo a diluizione finale di 1: 100 se non diversamente indicato basato sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni). Incubare la piastra a 4 ° C per almeno 20 min.
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Rimuovere l'anticorpo non legato con diluizioni sequenziale e analizzare le cellule.
- Aggiungere 200 µ l/pozzetto PBS/2% FBS e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Quindi, scorri la piastra per scartare il surnatante e aggiungere 200 µ l PBS/2% FBS ad ogni pellet cellulare e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule.
- Scorri a piastra per scartare il surnatante e aggiungere 50 µ l/pozzetto PBS/2% FBS per l'analisi. Procedere per analizzare le cellule di FACS utilizzando un citometro a flusso dotato di un lettore di piastra.
Nota: Acquisire un volume fisso di cellule (ad es., 35 µ l del totale 50 µ l utilizzato per risospensione) per enumerare i sottoinsiemi della progenie ematopoietico.
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Analizzare i dati di FACS per ciascun pozzetto contenente ematopoietiche progenie alla schermata per le colonie che contengono potenziali HSC (Figura 3).
- Cancello in primo luogo la popolazione di CD45 positiva che è negativa per gli indicatori mieloidi Gr1 e F480. Non cancello le cellule che ancora esprimono bassi livelli di VE-caderina. Cellule dallo strato AGM-CE che sono interrotti durante la vendemmia delle colonie ematopoietiche sono VE-caderina positivo e negativo di CD45.
- Gate CD45+VE-Cad- / lowGr1 cellule F4/80– –più avanti il sottoinsieme che esprimono alti livelli di EPCR e Sca1 (Figura 3A -C).
Nota: In studi precedenti, colonie carente di cellule con CD45+VE-Cad- / lowGr1––F4/80 Sca1CiaoEPCRCiao fenotipo (Figura 3D) riproducibile non è riuscito a fornire rilevabile attecchimento multilineare sangue periferico in topi irradiati destinatario17 (dati non mostrati); così, queste colonie non devono essere inclusi nell'analisi successivo trapianto nel passaggio 6.
6. analisi delle proprietà di Engraftment di singoli cloni e correlazione con proprietà fenotipiche delucidato da indice di ordinamento
- Il giorno della (se possibile) o la mattina seguente l'analisi fenotipica nel passaggio 5, ri-sospese le restanti cellule µ l 100 da ogni 96 pozzetti contenenti colonie ematopoietiche dopo co-coltura (dal passaggio 5.1) pipettando vigoroso utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.
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Preparare e aggiungere celle di salvataggio intero midollo osseo del ceppo Congenici B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) topi adulti16,17.
- Contare le cellule nucleate del midollo osseo in soluzione turchi sotto un emocitometro. Diluire a una concentrazione di 5 x 105 nucleate cellule/mL in PBS con 2% FBS.
- Aggiungere 100 µ l di cellule del midollo osseo di salvataggio (5 x 104) ad ogni pozzetto contenente ematopoietiche progenie per analisi di trapianto e Miscelare pipettando.
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Progenie di trapianto dei singoli cloni in un unico irradiati letalmente destinatario Congenici ceppo B6. SJL-PtprcunPepcbtopo adulto di /BoyJ (CD45.1 B6).
- Letalmente irradiano lo stesso numero di topi B6 CD45.1 come il numero di cloni per iniettare individualmente la progenie di un singolo clone (utilizzando cGy 1.000 da una fonte di cesio).
- Disegnare 200 sospensione totale delle cellule di µ l (questo include le cellule dal clone così come cellule del midollo osseo di 5 x 104 B6 CD45.1 soccorso) in una siringa di insulina ½ mL con ago 29 G ½ pollice.
- Letalmente irradiare B6 CD45.1 destinatari adulti 2-24 h prima all'iniezione.
- Utilizzando un dispositivo di ritenuta di plastica del mouse che consente l'accesso di coda, iniettare tramite il volume di 200 µ l della vena della coda contenente entrambe le cellule da ogni clone e 5 x 104 B6 CD45.1 del midollo osseo adulto le cellule soccorso per aiutare nella sopravvivenza destinatario.
- Marchio auricolare e pesare i topi destinatari e controllare il loro peso/salute a intervalli regolari (ad esempio, 3 - 4 volte / settimana post trapianto di irradiazione, o per individuali e istituzionali delle procedure operative standard) per garantire una buona salute.
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Eseguire analisi di engraftment di sangue periferico ad intervalli regolari (ad es., 2, 16, 24 settimane) dopo trapianto.
- Rimuovere il 50-100 µ l di sangue tramite retro-orbitale sanguinare o un altro metodo di locazione sangue eticamente approvati.
- Aggiungere 3 mL di tampone di lisi (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 e mg 74,4 EDTA a L 2 H2O) al sangue e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere il pellet con 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet con blocco FcR di 150 µ l PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL e 1 µ g/mL DAPI e versare 1/3 del volume da un contenente controlli di isotipo 50 µ l per donatore e lignaggio, 1/3 ad un anticorpo contenente 50 µ l per donatore e isotype controlli per lignaggio e 1/3 ad un pozzo contenente 50 µ l anticorpi per rilevare donatore e del lignaggio.
Nota: Gli anticorpi per il rilevamento di attecchimento multilineare: APCeFluor780-coniugato anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-coniugati anti-CD45.1, FITC Coniugato anti-CD3, PE-coniugato anti-F4/80, PerCP-coniugato anti-Gr1 e APC-coniugato anti-CD19, o isotype pertinenti controlli. - Identificare cloni con attecchimento a lungo termine per valutare il contributo di sangue periferico da FACS nel tempo di CD45.2 (donatore)-derivato cellule ematopoietiche mieloidi (Gr1 e/o F4/80 positivo), delle cellule di B (CD19 positiva) e cellule T (CD3 positivi) (Figura 4A -B).
Nota: Engraftment ematopoietico può essere analizzato anche da CD45.2 (donatore)-derivato contributo alle popolazioni ematopoietiche da tessuti raccolte da midollo osseo, milza, timo e peritoneo, o a seguito di trapianto secondario delle cellule del midollo osseo nei topi di B6 CD45.1 per analizzare seriale engraftment proprietà17.
- Correlare il proprietà fenotipiche di ogni clone come determinato dall'indice iniziale singola cella ordinamento con le sue proprietà di attecchimento. Utilizzando software di analisi di flusso, caricare i parametri di ordinamento per ogni cella di indice ordinato (correlato al 96-pozzo a cui è stato risolto). Mappa dati funzionali su diagrammi di flusso per valutare le proprietà fenotipiche delle singole cellule in relazione alla loro uscita funzionale (ad esempio, attecchimento a lungo termine, multilineare) (Figura 4).
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Representative Results
Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina+EPCRalta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per ogni cella durante l'ordinamento Indice altri anticorpi coniugati fluorocromo. In questo esperimento rappresentanza da E11 AGM, le cellule sono anche macchiato con gli anticorpi anti-CD41 PE-coniugati e FITC Coniugato anti-CD45. Eterogeneità all'interno della popolazionealta EPCR VE-caderina+per questi indicatori ematopoietici specifici è osservata (Figura 1), coerente con il noto asincronia in sviluppo ematopoietico in questa fase5.
A seguito di indice ordinamento delle celluli di VE-caderina+EPCRalta AGM per singoli 96-pozzetti contenenti AGM-CE in AGM privo di siero media e citochine, formazione della Colonia si verifica. Inizialmente, ordinato VE-caderina+EPCRalta AGM cellule integrano lo strato di AGM-CE prima che comincino ad arrotondare e formare ammassi ematopoietici (Figura 2A, mostrato qui dalle cellule ordinate da un embrione murino transgenico che esprimono GFP sotto il Ly6a promotore21, per distinguerli dallo stroma AGM-CE). Dopo 5-7 giorni di co-coltura, colonie di varie dimensioni e morfologie possono essere rilevate mediante ispezione con un microscopio invertito (Figura 2B), mostrato qui da un esperimento rappresentativo, 6 giorni che seguono l'ordinamento da E11 AGM.
Successiva analisi fenotipica di FACS viene eseguita su metà della progenie di ogni cellaalta EPCR VE-caderina+, che ha formato una colonia ematopoietica. Colonie contenenti cellule con fenotipo HSC sono identificate come VE-caderina- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1CiaoEPCRCiao (Figura 3). Qui, indichiamo quattro diverse colonie ottenute dopo co-coltura di indice ordinato E11 AGM VE-caderina+EPCRalta celle, tre contenente diverse proporzioni di HSC fenotipica con altri tipi di cellule più differenziati (Figura 3A –C), e il quarto privo di cellule con fenotipo HSC (Figura 3D). Il numero di colonie osservata per il numero di cellule placcate e la percentuale che ha provocato le colonie delle cellule staminali engraftable varia a seconda della età embrionale e ordinamento eseguito. VE-caderina- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1CiaoEPCRCiao E11 AGM cloni generato 53 ± 15 colonie fuori 192 celle placcate con 1.3 ± 5% delle 192 cellule placcato generando cloni che engrafted lungo termine (media ± SD per 3 esperimenti).
Per correlare il fenotipo con potenziale di attecchimento, la restante metà della progenie di ogni cellaalta EPCR VE-caderina+che si è formata una colonia ematopoietica contenenti cellule con fenotipo HSC rilevato da FACS (ad es., il colonie rappresentati in Figura 3A–C) viene trapiantato su topi di ceppo (B6 CD45.1) Congenici adulti (1.000 cGy) irradiati con una dose di cellule di salvataggio dal midollo CD45.1 B6. Attecchimento multilineare a lungo termine è confermato per ogni clone del secondo contributo di donatore (CD45.2) per la mieloide (Gr1 e F4/80), delle cellule di B (CD19) e cellule T (CD3) compartimento del sangue periferico nel tempo (Figura 4A). Anche se la maggior parte delle colonie che contengono le cellule con fenotipo HSC rilevato da FACS forniscono attecchimento a lungo termine, il trapianto è necessario confermare attecchimento multilineare funzionale come alcuni cloni perdono attecchimento nel tempo (Figura 4B), o visualizzare Proprietà unica attecchimento quali linfoide-biased attecchimento (dati non mostrati). Una volta determinato il potenziale HSC funzionale di ogni clonealta EPCR VE-caderina+, questo è correlato torna all'indice di quel clone parametri per identificare le sue precise caratteristiche fenotipiche di ordinamento. In questo esempio, vediamo che funzionalmente confermato pre-HSC cloni (punti rossi) sono eterogenei nella loro espressione di CD41 e CD45, coerente con l'espressione dinamica consolidata di questi marcatori durante la maturazione pre-HSC per HSC (Figura 4). Cloni formando colonie ematopoietiche ma sia carente potenziale HSC tramite selezione fenotipica o di assenza di lunga durata, multilineare attecchimento dopo trapianto (non-HSC hemogenic cloni, puntini blu) inoltre sono eterogenee per CD41 e CD45, anche se un sottoinsieme esprimono livelli più elevati di CD41 rispetto con cloni di pre-HSC, che sono principalmente CD41basso. Cloni che non hanno formato colonie ematopoietiche (non-hemogenic cloni, puntini verdi chiari) sono prevalentemente CD41- / lowCD45-, che probabilmente riflette le cellule endoteliali dellaalta di non-hemogenic VE-caderina+EPCR.
Figura 1: Panoramica del protocollo e analisi di citometria a flusso rappresentativo per l'indice ordinamento di cellule singole. (A) rappresentazione schematica del protocollo. (B) flusso cytometry analisi di dissociata E11 AGM cellule visualizzando gating strategia per indice ordinamento di VE-caderina+EPCRalto cellule arricchite per pre-HSC (analisi con software di analisi di FACS). Numeri in ogni cancello rappresentano la percentuale di cellule. (C) flusso cytometry analisi risultati CD41 e CD45 colorazione all'interno della popolazionealta EPCR VE-caderina+. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: formazione di colonie ematopoietiche durante la co-coltura di AGM-CE. (A) time-lapse imaging delle cellule GFP+ ordinatoaltadi EPCR VE-caderina+da Ly6a-GFP transgenici embrioni21 co-coltivate su AGM-EC. Barre della scala in µm sono mostrati in basso a sinistra di ogni immagine. Colonie rappresentative (B) formano da VE-caderina+EPCRalto indice ordinato celluli dopo 6 giorni co-cultura il AGM-EC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Flusso cytometry analisi della progenie di una singole cellule dialta EPCR E11 AGM-derivati VE-caderina+seguito di co-coltura su AGM-EC. Gating di cellule con potenziale HSC è indicato come il sottoinsieme che è VE-caderina- / lowGr1–F4/80– (pannello sinistro), CD45+ (pannello centrale) e Sca1CiaoEPCRCiao (pannello di destra). (A) Colonia rappresentativo costituito da una popolazione omogenea delle cellule con il fenotipo HSC. (B–C) Colonie rappresentative che contiene un mix di cellule con il fenotipo HSC e più tipi di cellule differenziate. (D) rappresentante Colonia che consiste delle cellule manca il fenotipo HSC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi di engraftment di sangue periferico della progenie di singoli cloni dopo co-coltura AGM-CE e correlazione con indice parametri di ordinamento. (A) engraftment CD45.2 donatore-derivati di sangue periferico di mieloide (Gr1 e F4/80), B-cellula (CD19) e sottoinsiemi a cellula T (CD3) da un rappresentanza destinatario (B6 CD45.1) trapiantati con progenie di singolo E11 VE-caderina+EPCRalta clone dopo co-coltura AGM-CE. (B) CD45.2 del donatore-derivati di sangue periferico attecchimento nel tempo dopo il trapianto di progenie di EPCR E11 VE-caderina+singoli clonialta dopo co-coltura AGM-CE. (C) correlazione di CD41 e CD45 espressione per ciascun indice ordinato VE-caderina+EPCRalto clone con il suo potenziale HSC seguente AGM-CE co-cultura basata sull'attecchimento a lungo termine, multilineare nell'analisi di trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazione di indice ordinamento permessi l'analisi retrospettiva dei parametri fenotipici di caratterizzare le proprietà di pre-HSC come definito da marcatori di superficie inclusi nell'analisi. Questo approccio offre quindi un vantaggio rispetto ad altri metodi che si basano su la cernita delle popolazioni precursore con basata sul re-aggregation HSC saggi4,5,10, abilitazione efficiente di screening per i potenziali marcatori di pre-HSC mentre allo stesso tempo fornendo informazioni sul livello di relativa espressione di marcatori di superficie per ogni singola cella. Utilizzando questa metodologia, per esempio, precedentemente abbiamo segnalato che, oltre all'utilizzo di EPCR arricchire per popolazioni pre-HSC a diversi stadi di sviluppo, espressione intermedia del ligando Notch Dll4 ulteriormente definito una sottopopolazione di clonale Precursori EPCR+ +VE-caderina con HSC potenziali, mentre Dll4 negativo per la maggior parte dei precursori EPCR VE-caderina++ hemogenic mancavano HSC potenziali17.
Un altro vantaggio di questo metodo è la capacità di schermo per il potenziale HSC immediatamente dopo co-coltura basata sulla rilevazione della progenie ematopoietiche con un fenotipo (VE-caderina- / lowGr1–CD45 F4/80–+Sca1 CiaoEPCRCiao) che è correlato con attecchimento a lungo termine, multilineare. Questo elimina la necessità di trapianto colonie carente ematopoietiche progenie con questo fenotipo HSC, come queste colonie non forniscono attecchimento a lungo termine nei saggi di trapianto. Inoltre, informazioni iniziali distinguere potenziali pre-HSC da precursori hemogenic carente potenziale HSC immediatamente dopo co-coltura, senza la necessità di attendere i risultati di analisi di attecchimento a lungo termine, sono utile, ad esempio, in rapidamente marcatori candidati di HSC-precursori di screening. Tuttavia, la correlazione di dati fenotipici con attecchimento a lungo termine dopo trapianto fornisce ulteriori informazioni preziose variazioni delle proprietà precisa attecchimento dei cloni pre-HSC. Abbiamo trovato, ad esempio, quella pre-HSC clonali provenienti dalla regione di P-Sp/AGM tra E9.5 ed E11.5 hanno il potenziale unico per dare origine a sia B1a e B2-linfociti, mentre B1a-linfocita potenziale è carente in adulto HSC17. Inoltre, abbiamo rilevato un'evoluzione nelle proprietà dell'attecchimento dei cloni pre-HSC tra E9.5 ed E11.5 con precedenti pre-HSC dimostrando un'inclinazione relativa verso peritoneale B1a versi B2-linfocita attecchimento e meno robusto potenziale di auto-rinnovamento basato il trapianto secondario dosaggi17.
Mentre questo protocollo fornisce un valido approccio per delucidare le proprietà uniche dei precursori HSC clonale, ci sono alcune limitazioni che devono essere riconosciuti. Anche se la rilevazione della progenie con HSC fenotipica di FACS dopo co-coltura AGM-CE è correlato generalmente a lungo termine attecchimento multilineare, alcune colonie con questo fenotipo forniscono solo a breve termine attecchimento o carenti di attecchimento in uno o più filiere emopoietiche (Figura 4B; dati non mostrati). Così, trapianto rimane il gold standard nella convalida funzionale HSC. Inoltre, si può escludere che alcune delle differenze nelle proprietà di attecchimento di pre-HSC cloni, piuttosto che riflettere differenze intrinseche delle cellule in hemogenic potenziale precursore, possono derivare da variabilità stocastica durante co-coltura AGM-CE nei versi di auto-rinnovamento decisioni di differenziazione, come pre-HSC sono simultaneamente con scadenza a HSC e in fase di divisioni cellulari. Infatti, questo può in parte rappresentare l'eterogeneità osservata della morfologia di Colonia ed il fenotipo delle cellule generate da cloni individuali pre-HSC (ad es., Figura 3A–C) e può comportare una sottovalutazione del pre-HSC di Questo saggio, se non tutti i potenziali pre-HSC cloni vengono rilevati dalla generazione di HSC funzionali dopo co-coltura AGM-CE. Tuttavia, la capacità di distinguere funzionalmente distinte hemogenic cloni di loro espressione differenziale dei marcatori fenotipici unici (come Dll417) attivata da questo metodo fornisce i mezzi per identificare le sottopopolazioni di precursori hemogenic con differenze intrinseche delle cellule intrinseche.
Sulla base di questo protocollo di base, un numero di applicazioni estese può essere incluso per approfondire ulteriormente il potenziale ematopoietico di precursori hemogenic clonale durante lo sviluppo. Oltre l'uso di anticorpi per la rilevazione degli indicatori della superficie, espressione di marcatori di fluorescenza in embrioni transgenici (ad es., Ly6a- GFP21 o Runx1 -GFP22 espresso in hemogenic endotelio/pre-HSC) può essere incorporato per indice ordinamento dei precursori hemogenic. Oltre a saggi di trapianto dopo co-coltura AGM-CE per rilevare putativo pre-HSC, progenie può essere valutato anche per il potenziale ematopoietico lignaggio basato su analisi di secondario in vitro , come cultura su OP9 o OP9-Dl1 per rilevare B - e T-cellula potenziale23, o colonie clonogenic saggi in metilcellulosa per rilevare erythromyeloid potenziale. Infatti, alcuni dei cloni hemogenic non-HSC (ad es., Figura 3D) rappresentano probabilmente progenitori multipotenti, progenitori erythromyeloid, o T - e B-cellule progenitrici precedentemente descritto che precedono e sono indipendenti di sviluppo HSC 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28e questa analisi può facilitare ulteriormente gli studi clonali di queste onde distinte dei precursori ematopoietici. Finalmente, indice ordinamento di pre-HSC può essere combinato con altre analisi a valle come singola cella RNA-sequenziamento, per correlare le proprietà fenotipiche con i profili trascrizionali globali di HSC i precursori. Complessivamente, questo protocollo fornisce un metodo per l'analisi robusta dell'emopoiesi clonale da precursori embrionali hemogenic che dovrebbero fornire nuove conoscenze sulla sviluppo di HSC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden nel Fred Hutchinson flusso Cytometry nucleo per assistenza con FACS. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione di istituti nazionali di salute NHLBI UO1 #HL100395, accessorie collaborativo Grant #HL099997 e NIDDK concedere #RC2DK114777. Brandon Hadland è supportato da di Alex Lemonade Stand della Fondazione e Hyundai Hope su ruote Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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