Summary
ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。
Abstract
萌芽期の開発中に造血幹細胞 (HSC) の起源を調査する機能は、初期胚における HSC 前駆体の希少性と長期生着能性を識別する機能の試金の不足によって制限されており個々 の推定 HSC の前駆体。ここでは、分離・単一セルのレベルで機能的に検証された HSC 前駆体の同定を可能にする方法論について述べる。まず、駆使し個別に並べ替えの各セルの正確な表現型パラメーターをカタログにインデックス並べ替え HSC の前駆物質の実験的分析のための追加のマーカーと豊かに表現型マーカーの組み合わせを使用しています。第二に、インデックスの並べ替えの各セルは非接が HSC 前駆体多能、長期生着の潜在性と機能的な HSC の成熟を支える大動脈性腺発生 (AGM) 地域から血管性ニッチ間質との共培養移植の試金。この方法論により、機能性生着に秘めたクローン hemogenic 前駆体の表現型のプロパティまたは転写プロファイル、HSC 前駆体の詳細な分析手段を提供するなど他のプロパティの相関単一セルのレベルで開発。
Introduction
クローン研究は、高齢化1時に HSC サブタイプと HSC の動作の変更に新しい洞察力を提供する大人の HSCs の長期生着特性における不均一性を明らかにしました。ただし、胚性造血の研究およびその前駆物質によっては、難しくされています。初期胚の中に造血前駆細胞呼ばれる非定常過程の hemogenic 内皮細胞として知られている人口から生じる内皮細胞から造血転移2として。最初の HSC では、エアコンの成人のレシピエントに移植に続く堅牢で、長期の多能生着を提供するために彼らの能力によって定義されている超低周波3 でマウスの胚の胚日 10.5 (E10.5) 後まで検出されません。.HSC (pre-HSC) hemogenic 内皮細胞から発生する前駆物質開発の間に移植の試金4,5で効率的な生着を可能にする大人の HSC のプロパティを取得する前に成熟を受ける必要があります。,6。 まれな HSC の起源、赤芽球系、造血前駆細胞の多数の研究を隠すこと、骨髄性とリンパの可能性がすでに前 HSC7,8から HSC の出現する前に検出されました。したがって、事前 HSC を区別する他の造血前駆細胞クローン細胞を分離し、HSC では、移植の試金でその生着プロパティを検出するために十分な成熟のための信号を提供するためのメソッドが必要です。
Hsc の前のヴィヴォや生体内での成熟によって前 HSC の検出を実現するアプローチの数が記載されています。前のヴィヴォメソッドは、AGM 地域、開発9で最初の HSC を検出する場所などの萌芽期ティッシュの文化に依存しています。これらのメソッドは、プロトコルは、解離を組み込む建物並べ替え、および再集計 AGM 組織の許可している傍大動脈内 E11.5 E9.5 から開発中に HSC 前駆体を含む並べ替えられた個体群の特性評価splanchnopleura (P Sp)/AGM 地域4,5,10;ただし、これらのアプローチはクローン解析に必要な単一セルのレベルで前駆物質のハイスループット解析に従順ではありません。同様に、新生マウスへの移植による生体内で成熟、微小環境は HSC の前駆体の初期の段階のサポートに適して見なされどこにも有効な卵黄嚢と AGM から並べ替えられた個体群の研究/P Sp (P Sp は AGM に前駆体領域) pre-HSC では、これらのメソッドの特性とも単一の堅牢なプラットフォームを提供するために失敗する細胞分析11,12。
Rafiiらの研究は、その Akt 活性化血管内皮細胞 (EC) 間質は大人 HSC の自己複製の in vitro13,14,15のサポートのためニッチ基板を提供することができますを示しました。我々 は最近、AGM 地域 (AGM-EC) から派生した Akt 活性化 EC は適した体外ニッチ、分離早くも大人接が hsc の開発で E9 およびそれに続くのと同様、hemogenic の前駆体の成熟化の判断生成された HSC16の自己更新します。このシステムは、単純な 2次元の共培養を採用し、それは個々 に絶縁されて hemogenic 前駆体の HSC 可能性のクローン解析の容易に適応可能であります。
我々 は最近インデックスの AGM EC 共培養と移植後の機能分析とマウス胚からの個々 の hemogenic 前駆体の並べ替えを組み合わせることによりクローン hemogenic 前駆体の HSC の可能性を試金する方法を報告しています。17をの試金します。蛍光活性化のモードなどそれぞれの個別に並べ替えられたセルの表現型パラメーター (すなわち、前方散乱 (FSC-A)、側散布 (SSC-A)、蛍光パラメーター) すべて (インデックス) を記録する (FACS) をソートするセル インデックスの並べ替えは、これらの並べ替えを次以降の機能解析機能を遡及的に関連付けることができます。FACS ソフトウェアは、各セルに配置された 96 ウェル プレートの位置/よく表現型情報の両方を記録します。この手法は以前エレガントな大人の HSC の不均一性を識別、さらの HSC では、長期的な engrafting のサブセットを豊かにし、転写と HSC の表現型のパラメーターを関連付ける表現型のパラメーターを確認する使用されて1 つのプロパティはセル レベル18,19です。ここでは、胚の開発の初期段階中にユニークな表現型のパラメーターの同定と pre HSC の系統貢献を可能にするこの方法の詳細な方法論を提供します。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) フレッド ・ ハッチンソンがん研究センターのによって承認されています。
1. 共培養の AGM EC 膜の準備
- AGM の郭清と並べ替え、前に 24 h は、AGM EC 培地と滅菌フィルターを確認します。
- 96 ウェル プレートの各ウェルに水 (100 μ L/ウェル) に 0.1% ゼラチンを追加 15 分吸引ゼラチンのため室温で孵化させなさいし、井戸が乾くまで削除ふた付きティッシュ文化フードのプレートを残してください。
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AGM EC 化膜および 96-ウェル プレートにプレートを切り離して考えます。
注: は、AGM EC は、AGM EC 培地で、上記16として準備を維持します。一貫性を保つのための AGM EC 細胞を十分な数は (一般に通路 1-3) を得られるとすぐに冷凍し、共培養実験のために定義された通路番号 (一般道 5-12) で使用ください。AGM EC 細胞は c57bl/6 j (CD45.2) AGM から派生されます。すべてのメディアの組成の材料表を参照してください。- 75 cm2フラスコで AGM EC 文化からメディアを吸引し、5 mL の PBS を追加します。PBS を吸引し、3 mL のトリプシン溶液を追加 (材料の表を参照してください)。
- ほとんどの細胞は、プレートを持ち上げてまで 2 〜 4 分の 37 ° C で孵化させなさい。AGM EC 培地の 8-10 倍の単一細胞懸濁液を準備し、15 mL チューブに転送 10 mL ピペット ピペット 7 mL を追加します。
- 5 分間 300 x g でスピン、上澄みを除去、再 10 mL AGM EC 培地にサスペンドし、診断とセル数を見積もる。AGM EC 培地で 1 × 105セル/ml の濃度に細胞を希釈します。
- 糊の 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L AGM EC 細胞懸濁液 (1 x 10 の4セル) を追加します。37 ° C、5% CO2培養インキュベーターで一晩 AGM-EC にアタッチし、コンフルエント単層を形成できるように。
注: は、AGM EC 細胞限られた増殖があるのでまたは最適な培養の凝集のセルに均等に配る。 -
AGM 共培養の AGM EC 膜を準備します。
- 次の朝は、AGM 血清フリー メディアを準備します。
- 12 ウェル マルチ チャンネル ピペットを使用してには、AGM EC から AGM EC 培地を削除し、AGM 無血清メディアの任意の残留血清を含むメディアを洗浄するサイトカインなしの 200 μ L/ウェルを追加します。
- メディアを削除し、サイトカインと AGM 無血清メディアの 200 μ L/ウェルを追加します。取り外しと内皮層が損なわれない; メディアを追加するときにすぐに仕事例えば、削除し、再一度にメディアの 1 つの行を追加します。胚細胞は並べ替えのため準備ができているまで、37 ° C で培養のインキュベーターで 96 ウェルのプレートを配置します。
2. マウスの萌芽期ティッシュから単一細胞懸濁液の準備
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時限から AGM を解剖します。
- 希望年齢の萌芽期ティッシュを生成するためわれわれのタイムアウトを設定します。
- 分析する前 HSC の段階に応じて 9.5 11.5 日のポストの coitum (dpc) で妊娠中の女性から胚を収穫します。
注: 萌芽期ティッシュは、前述と正確に段階に基づいて体節数16と c57bl/6 j (CD45.2) マウスから収穫されます。胚の AGM 地域個体群の解析に注力、体節ステージングに基づいてその前駆体、P-Sp は、E11.5 へ E9.5 の間。 - 胚20から AGM を解剖します。
注: マウス胚から AGM の解剖のための詳しいプロトコルされている20他人によって公開されました。また、卵黄嚢や pre HSC 活性を有することを意味する他の組織もこのメソッドによって解析する可能性があります。
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切り裂かれた萌芽期ティッシュを切り離して考えます。
- 10 %10 mL の PBS を含む 15 mL の円錐管に切り裂かれたティッシュを集める政府短期証券の氷の上。重力組織を解決、PBS/FBS を吸引し、すぐに 25 分の 37 ° C の水浴中 0.25% コラゲナーゼと場所の 1 つの mL を追加します。
- 単一細胞懸濁液を取得する 1 mL ピペット チップで約 20-30 倍 PBS/10% FBS のピペット 1 mL を追加します。PBS/10% FBS の追加 8 mL を追加し、300 x g で 5 分間遠心分離細胞上清を破棄します。
3. 抗体がマウスの萌芽期細胞の染色
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抗体の汚損のブロック バッファーを準備します。
- 10 %1 mL の PBS に 10 μ g/mL 抗マウス CD16/CD32 (Fc 受容体 (FcR) ブロック) と 1 μ G/ml DAPI (1 mg/mL 入荷 H2O) 追加 FBS。
- 3 mL の注射器を描画し、殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。再中断 500 μ L ブロック (ステップ 2.2.2) からマウス解離の萌芽期ティッシュからの細胞ペレットをバッファーし、氷上で 5 分間インキュベートします。
- 抗体ミックス17を準備します。
- 10 %1 mL の PBS に 10 μ g/mL FcR ブロックを追加 FBS と各蛍光色素標識された抗 VE カドヘリン抗体の 10 μ L (CD144、材料表を参照してください)、蛍光色素標識された抗 EPCR 抗体 (CD201、材料表を参照してください)。製造元の推奨事項または滴定によるとに基づいて指示がない限り、抗体の 1: 100 最終希釈を使用します。
注: この抗体は組み合わせて、並べ替えのためのゲートを定義するため (ステップ 4.2) 下記のとおり。共同 VE カドヘリン発現に基づく並べ替えと EPCR により HSC 前駆活動、前述の17を含む AGM 由来細胞の部分の重要な濃縮。 - 個々 のインデックスの並べ替えの前駆体のさらに表現型解析のための追加蛍光色素標識された抗体を追加します。
注: これらの抗体はない使用並べ替えのためのゲートを定義するため必ずしも。このサンプル プロトコルで我々 は PE 共役アンチ CD41 抗体および pre-HSC hemogenic 内皮4 からの出現の間に進化これらの造血のマーカーの相対的な表現を分析する FITC 標識抗 CD45 抗体を含まれています。 ,5,16,17。興味の他のマーカーは、必要に応じて指定できます。アイソタイプの蛍光色素標識された抗体コントロールで染色サンプルを使用して、解析における正および負のゲートを定義します。 - 3 mL シリンジで抗体ミックスを描画し、殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。ブロック バッファー、ミックス、および少なくとも 15-20 分間氷の上をインキュベートするピペットで細胞懸濁液 500 μ L 抗体ミックスを追加します。
- 10 %1 mL の PBS に 10 μ g/mL FcR ブロックを追加 FBS と各蛍光色素標識された抗 VE カドヘリン抗体の 10 μ L (CD144、材料表を参照してください)、蛍光色素標識された抗 EPCR 抗体 (CD201、材料表を参照してください)。製造元の推奨事項または滴定によるとに基づいて指示がない限り、抗体の 1: 100 最終希釈を使用します。
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ステンド グラスのセルを洗浄します。
- 8 mL PBS/10% FBS を追加します。5 分、吸引、およびセルを再中断ペレット 1 ml PBS/10% FBS の 300 x g で細胞を遠心します。
- 35 μ m セル ストレーナー キャップ 5 mL チューブを介して細胞懸濁液をピペットで細胞を削除します。追加 3 ml PBS/10% FBS セル ストレーナーを洗浄します。5 分間 300 x g で細胞を遠心分離、吸引、PBS/10% FBS を 500 μ L で再停止、FACS まで氷の場所します。
4. インデックスが培養 96 ウェル AGM EC 間質とする単一 Hemogenic 前駆体のソート
- プレート モードの FACS マシンを準備し、製造元の指示に従って 96 ウェルのプレートへの並べ替えを揃えます。単一セル モード、インデックス並べ替え最大純度マスク設定と並べ替えの各セルのインデックス パラメーターの取得を有効にするソフトウェアのモードを選択します。
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並べ替えのためのゲートを設定するサンプルを染色抗体からの細胞のサンプルを取得します。
- FACS マシンで染色細胞サンプルをロードし、最低流量でセルを取得します。FSC の詩 SSC A と選択をプロット (これは事前 HSC 活動が AGM17でサイズの異なるプロファイルの細胞で識別されている観測に基づく) 様々 なサイズ (図 1 b) のセルを含むゲート。FSC は FSC W 詩と SSC の詩 SSC W プロット、ダブレットを除外するゲートを選択します。FSC の詩 (DAPI の負) の生きているセルをゲートに DAPI をプロット (図 1 b)。
- 対 PerCP (または EPCR 染色関連の螢光色素)、PECy7 (または VE カドヘリン染色関連の螢光色素) をプロットします。ゲートの細胞 (内皮細胞と同様に造血前駆細胞と AGM から pre HSC の混合された人口を含む) を VE カドヘリン陽性であるし、(P ・ Sp/AGM17から pre HSC の潤す) 高 EPCR 式があります。これは、インデックスの並べ替え手順 4.3 (図 1 b) で単一のセルに使用される最後のゲートです。
- 染色に使用される追加の螢をプロットします。
注: 分析する個体によって更なるゲートすることができますに基づいて設定セルを汚すために含まれるその他のマーカーの検出。ただし、これらのパラメーターは、遡及的に分析できるように、各並べ替えられた細胞の蛍光パラメーターの記録がインデックス並べ替えできます。したがって、追加のゲートは必要ありませんこの時点で。すべて FACS のセットアップは、単一の抗体で染色サンプルが波及を背景を汚すため考慮し、決定のアイソタイプ コントロール抗体と重複する蛍光色素の排出を考慮する補正を調整する使用してください。正/負ゲート。
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インデックスは、AGM セルを並べ替えます。
- FACs 選別機のプレート ブロック (ステップ 1.5.3) からサイトカインと AGM 血清自由な媒体の AGM EC 間質を使用した 96 ウェル プレートを配置します。サンプルをロードし、サンプルの収集を開始します。ソート/単一セルのインデックス モードを選択し、個々 の 96 ウェルに sortingsingle セルを開始します。萌芽期細胞のせん断応力を最小限に抑えるために低流量を使用します。
- インデックスの並べ替え時にすべてのイベントが記録されることを確認します。これは、記録されたすべてのイベントは井戸に並べ替えられますと実際番号個別に並べ替えられた 96 - 井戸、相対的な並べ替えのゲートで分析セルの合計数の列挙体を有効になります。
- 一度細胞が全体の 96 ウェル プレートにソートされている 37 ° C 5% CO2で設定で組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。実験ごとに必要な追加のプレートを繰り返します。
- 96 ウェルで個別にソート共培養細胞 (E10 10.5 胚から 6 日、7 日 E9 9.5 胚から E11 11.5 胚由来細胞の 5 日) まで 7 日間 (4.3 のステップ) から AGM EC を含みます。100 倍の倍率 (図 2 b) で倒立顕微鏡と培養期間の後さまざまなサイズおよび形態の造血コロニーを視覚化します。
注: メディアは、培養期間中に変更する必要はありません。Hemogenic 前駆体 EC のような形態を持つ AGM EC レイヤーに統合される最初と最初の AGM EC 間質 (図 2 a) 区別することはできませんを並べ替えられます。ただしの培養、小さい、次の 24-48 h 丸め造血細胞や細胞のクラスターを検出可能性があります。共培養 (5-7 日) の終わりには、造血細胞の個々 のコロニーはクローン性造血秘めた並べ替えセルを受け取った 96 ウェルのサブセットで視覚化できます。視覚的に検査された井戸を含む 1 つ以上の異なるコロニー、このサンプルはウェルあたり並べ替え 1 つ以上のセルを受信可能性がありますサンプルを除外するダウン ストリームの解析から除外されます。
5. 次の共培養クローン性造血子孫の解析
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FACS 解析の各 96 ウェルからクローンを収穫します。
- 200 μ L ピペット チップでマルチ チャンネル ピペットを使用して内皮層から造血細胞を分離するに積極的にピペット。内皮層を分離しないようにします。FACS による造血の子孫の表現型解析のため 100 μ L (サンプルの 〜 50%) を削除します。
- 96 ウェル V 底プレートに移し、細胞のペレットを 2 分間 300 × g で遠心分離機します。プレートが反転しながら 1 つの急速な動きにプレートからメディアをフリックでメディアを削除 (プレートにフリック)。
- その後の生着の試金 (手順 6) の 37 ° C incubatorfor 使用元の 96 ウェル プレートに残り 100 μ L のセルを配置します。
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造血解析に適切な抗体と細胞を孵化させなさい。
- 再 10 μ G/ml FcR ブロックと 1 μ G/ml DAPI を含む PBS/2% FBS の 50 μ L の 96 ウェルの V 下部の各ウェルの細胞ペレットを中断します。5 分の 4 ° C でプレートを孵化させなさい。
- 10 μ G/ml FcR ブロックと PE Cyanine7 共役アンチ VE カドヘリン、PerCP 標識抗-CD45、PE 共役アンチ EPCR、APC 共役アンチ-Sca1、FITC 結合抗 Gr1 を含む HSC 解析抗体ミックスを含む PBS/2% FBS の 50 μ L を追加し、アンチ-F4/80 (1: 100 最終希釈抗体各滴定によると製造元の推奨事項に基づく指示がない限り)。少なくとも 20 分の 4 ° C でプレートを孵化させなさい。
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順次希釈で自由な抗体を削除し、セルを分析します。
- 細胞のペレットを 2 分間 300 x g で 200 μ L/ウェル PBS/2% FBS と遠心分離機を追加します。その後、フリック プレート上澄みを廃棄、各細胞ペレットに 200 μ L PBS/2% FBS を追加し、細胞のペレットを 2 分間 300 × g で遠心します。
- プレート上澄みを廃棄し、50 μ L/ウェル PBS/2% FBS 解析を追加するにフリックします。FACS フローサイト プレート リーダーを搭載による細胞の分析に進みます。
注: 取得一定量 (例えば再懸濁液に使用される合計 50 μ L の 35 μ L) 細胞の造血の子孫のサブセットを列挙します。
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潜在的な HSC (図 3) を含むコロニーのため画面に造血の子孫を含む各ウェルの FACS データを分析します。
- 骨髄系マーカー Gr1 と F480 の負 CD45 陽性人口ゲート最初。まだ低レベルの VE カドヘリンを発現する細胞をゲートはないです。造血コロニーの収穫中に中断が AGM EC 層から細胞、VE カドヘリン陽性と CD45 ネガティブです。
- CD45 ゲート+VE Cad-/低Gr1 EPCR と Sca1 の高レベル表現サブセットにさらに-F4/80-細胞 (図 3 a -C)。
注: 先行研究、CD45 の細胞に欠けているコロニーで+VE Cad-/低Gr1-F4/80-Sca1こんにちはEPCRこんにちは表現型 (図 3 D) が再現性をもって検出を提供するために失敗しました放射線照射した受信者マウス17 (データは示されていない); 多能末梢血移植したがって、これらの植民地は、手順 6 でその後移植解析に含まれません必要。
6. インデックスの並べ替えが明らかにした表現型のプロパティを持つ個々 のクローンと相関の生着特性の解析
- 日 (可能な場合) または手順 5 で表現型解析の翌朝再各 96 ウェル含む造血植民地から 200 μ L ピペット チップを使用して積極的なピペッティングによる培養 (ステップ 5.1) から、次の残りの 100 μ L 細胞を中断しました。
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準備し、コンジェニック系統 B6 の全体の骨髄から救助セルを追加します。SJL Ptprc、Pepcb/BoyJ (B6 CD45.1) 成体マウス16,17。
- 診断ソリューションをトルコ人の骨髄の有核細胞を数えます。5 x 10 の濃度に希釈5核細胞/mL PBS で 2% で政府短期証券。
- 移植解析造血の子孫を含む各ウェルに救助骨髄細胞 (5 x 10 の4) の 100 μ L を加え、ピペッティングで混ぜます。
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個々 のクローンの子孫を単一照射致死受信者コンジェニック系統 B6 に移植します。SJL Ptprc、Pepcb/BoyJ (B6 CD45.1) アダルト マウス。
- (セシウム ソースから 1,000 cgy-ルンビアを使用して) 単一のクローンの子孫を個別に挿入するクローンの数と同じ数の B6 CD45.1 マウスは致死に照射します。
- 29 G 1/2 インチ針 ½ mL インスリン注射器に 200 μ L 総細胞懸濁液 (細胞クローンからだけでなく、5 × 104 B6 CD45.1 救助骨髄細胞を含む) を描画します。
- 致死的照射 B6 CD45.1 成人レシピエント 2 24 h 前に注入します。
- 各クローンの細胞と受信者生存で支援するために 5 × 104 B6 CD45.1 成人の骨髄救助セルの両方を含む尾静脈 200 μ L のボリュームを介して注入プラスチック マウス落末尾のアクセスを可能にするを使用して。
- 耳のタグと受信者のマウスの重さし、自分の体重/健康を定期的にチェック (例えば3-4 回/週ポスト照射/移植、または個々 の機関の標準操作手順ごと) 良い健康を確保します。
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定期的に (例えば2、16、24 週間) 末梢血移植の解析を実行次の移植。
- レトロな軌道出血または別の倫理的承認された血させるメソッドを介して血液の 50-100 μ L を削除します。
- 血液を 3 mL の溶解バッファー (16.6 g NH4Cl、2 g を 2 L H2O NaHCO3と 74.4 mg EDTA) を追加し、PBS/2% FBS で 5 分間遠心分離機 300 x g で 5 分間吸引と 2 mL にペレットを再停止、室温でインキュベートします。5 分間 300 × g で遠心分離機します。
- 再 150 μ L PBS/2% FBS 含む 10 μ G/ml FcR ブロックと 1 μ G/ml DAPI、ペレットを中断し、ドナーの系統で、1/3 リネージュのドナーとアイソタイプ コントロールも含む 50 μ L 抗体も含む 50 μ L アイソタイプ コントロールするボリュームの 1/3 分配、ドナーと系列の両方を検出する 50 μ L 抗体を含む井戸に 3 分の 1。
注: 能生着の検出の抗体: APCeFluor780 共役アンチ CD45.2、Pe Cyanine7 共役アンチ CD45.1、FITC 結合抗 CD3、PE 共役アンチ-F4/80、PerCP 標識抗-Gr1、APC 共役アンチ-CD19、または関連するアイソタイプ コントロール。 - CD45.2 (ドナー) の時間をかけて FACS によって末梢血の貢献を評価することによって長期生着のクローンを識別-由来造血細胞の骨髄 (Gr1 や F4/80 正) (CD19 陽性)、B 細胞と T 細胞 (CD3 陽性) (図 4 a -B)。
注: CD45.2 (ドナー) によって造血の生着を分析もできます-造血の集団に貢献由来組織から骨髄、脾臓、胸腺、腹膜、またはセカンダリ骨髄細胞移植を収穫B6 CD45.1 マウス シリアル生着プロパティ17を分析します。
- その生着プロパティで並べ替えを行う最初の単一のセル インデックスによって決定される各クローンの表現型プロパティを関連付けます。流動解析ソフトを使用して、並べ替えパラメーター (96 ウェルが並べ替えられた相関) 各インデックス並べ替えセルをアップロードします。流プロット機能出力 (たとえば、長期、能生着) に関連する単一細胞の表現型特性を評価するために機能的なデータ マップ (図 4)。
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Representative Results
図 1 aは、実験的なデザインの概略を示しています。P-Sp/AGM 組織は、解剖をプールし、コラゲナーゼで解離が、一度インデックス ソートの VE カドヘリンおよび EPCR に抗体と染みが。Pre HSC は、VE カドヘリン+EPCR高(図 1 b) 細胞で濃縮されています。他の蛍光色素標識された抗体遡及的各セルのインデックス ソート中に記録された追加の表現型パラメーターを分析することができます。E11 AGM から代表的な実験の結果, セルは FITC 標識抗 CD45 と PE 共役アンチ CD41 抗体も汚れます。これらの造血固有マーカー VE カドヘリン+EPCR高い人口内の不均一性が観察 (図 1) このステージ5で造血の開発で知られている非同期性と一貫性のあります。
次の個々 の 96 ウェル単一 VE カドヘリン+EPCR高AGM 電池の並べ替えインデックス含む AGM EC AGM 無血清メディアとサイトカイン、コロニー形成が発生します。当初は、並べ替えられた VE カドヘリン+EPCR高AGM 電池を統合 AGM EC 層に切り上げるし、(図 2 a、gfp トランスジェニック マウス胚由来細胞から造血クラスターを形成する開始する前にLy6aプロモーターの下で21AGM EC 間質と区別するため)。共培養の 5-7 日後様々 なサイズや形態の植民地は代表的な実験では、6 日 E11 AGM から並べ替えを次から次に示す (図 2 b)、倒立顕微鏡による検査で検出できます。
FACS による次、表現型の分析は、造血コロニーを形成してきた各 VE カドヘリン+EPCR高セルの子孫の半分で実行されます。HSC の表現型と細胞を含むコロニーが VE カドヘリンとして識別される-/低Gr1-F4/80-CD45+Sca1こんにちはEPCRこんにちは(図 3)。ここで、次得られる 4 つの異なるコロニー共同インデックス並べ替え E11 AGM VE カドヘリン+EPCR高細胞、他のより区別された細胞の種類 (図 3 a の表現型の HSC の異なる比率を含む 3 つの文化を紹介します。 -C)、第四に HSC 表現型 (図 3 D) と細胞が不足しています。めっきセルと engraftable の幹細胞のコロニーで起因した割合の数で観察したコロニーの数は、萌芽期の年齢との並べ替えによって異なります。VE カドヘリン-/低Gr1-F4/80-CD45+Sca1こんにちはEPCRこんにちはE11 AGM 長いしみ込んでめっきを生成するクローン 192 セルの 5% ± 1.3% メッキ 192 細胞から生成された 53 ± 15 コロニーのクローンを作成用語 (平均 ± SD 3 実験のため)。
生着の潜在的な表現型に関連付ける、FACS によって検出された HSC 表現型と細胞含んでいる造血コロニーを形成して各 VE カドヘリン+EPCR高セルの子孫の残りの半分 (例えば、図 3 a-Cで表されるコロニー) B6 CD45.1 骨髄から救助セルの線量と照射 (1,000 cgy-ルンビア) 大人コンジェニックひずみ (B6 CD45.1) マウスに移植します。(Gr1 と F4/80) に骨髄性、ドナー (CD45.2) 貢献を次により各クローンの長期多能生着を確認した B 細胞 (CD19) と長期 (図 4 a) 末梢血 T 細胞 (サブセット CD3) コンパートメント。FACS によって検出された HSC 表現型と細胞を含むほとんどのコロニーは、長期生着を提供する、移植はいくつかのクローン (図 4 b)、時間をかけて生着を失うまたは表示機能能生着を確認する必要リンパ バイアス生着 (データは示されていない) などユニークな生着プロパティします。VE カドヘリン+EPCR高の各クローンの機能の HSC の潜在性が特定されると、その正確な表現型特性を識別するためにパラメーターを並べ替えるクローンの目次へ戻るこの相関しています。この例では、機能確認事前 HSC クローン (赤い点)、CD41 と CD45、hsc (図 4) 事前 HSC 成熟に伴うこれらのマーカーの確立されたダイナミック式と矛盾の表現において異種を参照してください。表現型スクリーニングまたは長期の不在によってどちらか欠けている HSC 可能性が造血コロニーを形成のクローン、移植 (非 HSC hemogenic クローン、青いドット) 長生着が CD41 と CD45、異種もサブセットの表現が CD41 のハイレベルは主に CD41低事前 HSC のクローンと比較。造血コロニー (非 hemogenic クローン、光緑のドット) を形成したクローンは主に CD41-/低CD45-、非 hemogenic VE カドヘリン+EPCR高内皮細胞を反映する可能性が高い。
図 1: 単セルのプロトコルの概要とインデックスの並べ替えの代表的なフロー フローサイトメトリー解析します。(A) プロトコルの概略図。解離の E11 AGM のフローサイトメトリー解析細胞示すゲート戦略 VE カドヘリン+EPCR高細胞事前 HSC (FACS 解析ソフトウェアで解析) の濃縮の並べ替えインデックス (B) 流。各ゲートの番号は、細胞の割合を表しています。(C) 流動 CD41 と CD45 フローサイトメトリー解析 VE カドヘリン+EPCR高集団内で染色します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: AGM EC 共培養における造血コロニー形成します。(A) VE カドヘリン+EPCR高GFP+ソートLy6a GFPトランスジェニック胚21共同総会理事会上で培養した細胞のタイムラプス イメージングΜ m スケール バーは、各画像の左下に表示されます。(B) 代表的な植民地から形成された VE カドヘリン+EPCR高インデックス並べ替え単一電池 6 日共同文化総会理事会の後この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 流れに AGM 関する EC 共同文化を次高E11 AGM 派生 VE カドヘリン+EPCR の単一セルの子孫のフローサイトメトリー解析HSC の可能性と細胞のゲーティング、VE カドヘリンであるサブセットとして表示されます-/低Gr1-F4/80 CD45 (左のパネル)、- + (中央のパネル) と Sca1こんにちはEPCRこんにちは(右側のパネル)。(A) 代表的なコロニーの HSC の表現型と細胞の同質な人口で構成されます。(B-C)代表的な植民地より区別されたセルタイプの HSC の表現型と細胞の組み合わせを含みます。(D) 代表的なコロニーの HSC の表現に欠けているセルから成る。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: インデックス並べ替えパラメーターを持つ AGM EC 共同文化と相関関係を次の個々 のクローンの子孫の末梢血移植の解析。(A) 骨髄性 (Gr1、F4/80) のドナー CD45.2 由来末梢血移植 B 細胞 (CD19)、および子孫の個々 E11 VE カドヘリン+EPCR高移植代表受信者 (B6 CD45.1) から T 細胞 (サブセット CD3) サブセットAGM EC 共同文化を次のクローン。AGM EC 共同文化を次の個々 の E11 VE カドヘリン+EPCR高いクローンの子孫の移植後時間をかけて (B) ドナー CD45.2 由来末梢血移植。(C) CD41 相関と各索引 VE カドヘリン+EPCR高の CD45 表現その HSC に潜在的な次の AGM EC 共培養移植試験で長期、能生着とクローンを作成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
萌芽期の開発中に HSC 創世記の研究は、まだ移植成人レシピエントにおける血液造血系長期を提供する能力の欠けている hemogenic 前駆体の潜在的な HSC を検出するための手段を必要とします。このプロトコルで提案するクローン胚 hemogenic 前駆体法血管ニッチ ECs に間質の混合培養による HSC の前駆体の成熟化をサポートするには、AGM から移植アッセイで後続の機能解析と.設立許可の並べ替えインデックスのアッセイの表現型の pre-HSC 表面マーカーによって定義されているプロパティを特徴付けるパラメーターの回顧の分析が含まれています。このアプローチにより一括の効率的なスクリーニングの潜在的なマーカーを有効にする再 aggregation ベース HSC の試金4,5,10、前駆体集団の並べ替えに依存するその他の方法上の利点個々 のセルの表面のマーカーの相対的な表現のレベルについての情報を提供すると同時に、pre HSC。この方法を使用すると、たとえば、我々 は報告した、開発のさまざまな段階で事前 HSC 集団の豊かにする EPCR の使用、に加えて中間の式ノッチ リガンド Dll4 さらに定義クローンの亜種潜在的な Dll4 負の VE カドヘリン+EPCR+ hemogenic 前駆体主に対し HSC の VE カドヘリン+EPCR+前駆体は、HSC 潜在的な17を欠いていた。
造血の子孫の表現型の検出に基づく共培養の後すぐに、このメソッドの別の利点は HSC 潜在的なスクリーンする機能 (VE カドヘリン-/低Gr1-F4/80-CD45+Sca1こんにちはEPCRこんにちは) 長期、能生着と相関します。これはこれらの植民地は移植の試金の長期生着を指定しないため、この HSC の表現型と造血の子孫を欠けているコロニーを移植する必要があります。さらに、HSC の潜在的な長期生着アッセイの結果を待つことを必要とせず、共培養の直後に欠けている hemogenic 前駆体から潜在的なプレ-HSC を区別する最初の情報は有用、例えば、急速にHSC 前駆体の候補マーカーをスクリーニングします。ただし、移植長期生着と表現型の相関は、pre HSC クローンの正確な生着特性の変化に追加の貴重な洞察力を提供します。わかった、たとえば、E9.5 と E11.5 の間 P Sp/AGM 地域からそのクローン前 HSC 可能性があるユニークな B1a と B2-リンパ球の両方に上昇を与えるため B1a リンパ球の可能性は大人の HSC17の欠損に対し。さらに、我々 は相対的なスキュー腹膜 B1a 詩 B2 リンパ球移植に向けて、以下の強力な自己再生能力を示す以前 pre HSC の E9.5 と E11.5 間でクローンを pre HSC の生着特性の進化を検出二次移植に関する17をの試金します。
このプロトコルは、クローンの HSC の前駆体のユニークな特性を明らかにする貴重なアプローチを提供します、確認する必要がありますいくつかの制限があります。FACS 次の AGM EC 共培養による形質 HSC の子孫の検出が長期多能生着に関連付けられて一般的にこの表現型を持ついくつかのコロニーは提供短期生着または 1 つ以上の生着欠損のみ造血系統 (図 4 b; データは表示されません)。したがって、移植は機能的な HSC の検証のゴールド スタンダードを残ります。さらに、それは否定できません hemogenic のセルに本質的な違いを反映して、前駆体の可能性から生じる確率変動 AGM EC 共培養中になくプレ HSC の生着特性の違いのいくつかのクローン、自己複製の詩で pre HSC としての分化決定は HSC に成熟、細胞の分裂を受けて同時に。確かに、一部コロニー形態の観察された多様性と個々 の pre-HSC クローン (例えば図 3 a-C) から生成された細胞の表現型のアカウント可能性があります。 とこで pre HSC の過小評価があります。すべての潜在的前 HSC クローンされていない場合このアッセイは、機能的な HSC AGM EC 共同文化を次の世代によって検出されます。ただし、このメソッドによって有効になっている (Dll417) などユニークな表現型マーカーの差動表現によって機能的に異なる hemogenic のクローンを区別する能力と hemogenic 前駆体の集団を識別する手段を提供します本質的なセルに本質的な違い。
この基本的なプロトコル上に構築された拡張アプリケーションの数は、開発中にクローン hemogenic 前駆体の造血の可能性をさらに研究する含めることができます。表面マーカー、遺伝子組換え胚の蛍光マーカーの発現の検出用抗体の使用を超えて (e.g、 Ly6a- GFP21またはRunx1 -GFP22を hemogenic 内皮/pre-HSC で表現) することができます。hemogenic 前駆体の並べ替えインデックスに組み込まれています。次の推定 pre HSC を検出する AGM EC 共培養移植試金に加えて子孫はまたセカンダリの in vitroアッセイでは、B および T 細胞を検出する OP9 または OP9 Dl1 の文化などに潜在的な造血系統を評価します。潜在的な23、またはクローン コロニー erythromyeloid の可能性を検出するセルロースのアッセイを形成します。確かに、非 HSC hemogenic クローン (例えば図 3 D) のいくつかは erythromyeloid の前駆細胞、多能性前駆細胞を表す可能性がありますまたは T および B 細胞の前駆細胞は、前述の前に、HSC 開発の独立8,24,25,26,27,28日、この試金さらに造血前駆細胞のこれらの異なる波のクローンの研究を促進するかもしれない。最後に、pre HSC の並べ替えインデックスは、単一細胞 RNA 塩基配列解読、HSC の前駆体を開発するグローバル転写プロファイル表現型プロパティに関連付けるなど他の下流の分析と組み合わせることができます。完全に、このプロトコルでは、HSC 開発に新しい洞察力を提供する必要があります胚 hemogenic 前駆体からクローン性造血の堅牢な解析のメソッドを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
フレッド ハッチンソン流れ Cytometry コア援助を FACS でアンドリュー ・ ベルガー、ステイシー堂園とブライアン螺鈿に感謝したいと思います。この作業は、付属の共同助成金 #HL099997 と NIDDK 付与 #RC2DK114777 国立機関の健康 NHLBI UO1 グラント #HL100395、によって支えられました。ブランドン Hadland をサポートするには、アレックスのレモネードは、財団スタンドとホイール基礎現代希望。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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