Summary
Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.
Abstract
A capacidade de estudar a gênese de células-tronco hematopoiéticas (HSC) durante o desenvolvimento embrionário tem sido limitada pela raridade dos precursores HSC no embrião precoce e a falta de ensaios que funcionalmente, identificar o potencial a longo prazo de multilineage enxertia de precursores HSC putativos individuais. Aqui, descrevemos a metodologia que permite o isolamento e caracterização de precursores HSC funcionalmente validados a nível de célula única. Primeiro, nós utilizamos índice classificação para catalogar o parâmetro fenotípico preciso de cada célula individualmente classificado, usando uma combinação de marcadores fenotípicos para enriquecer para os precursores HSC com marcadores adicionais para análise experimental. Em segundo lugar, cada célula de índice-classificados é co cultivada com estroma vascular nicho da região de aorta-gônada-mesonephros (AGM), que suporta a maturação dos precursores HSC não-engrafting de HSC funcional com enxertia de multilineage, a longo prazo potencial em ensaios de transplante. Esta metodologia permite a correlação de propriedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal com seu potencial de enxertia funcional ou outras propriedades, como o perfil transcricional, proporcionando um meio para a análise detalhada do precursor do HSC desenvolvimento a nível de célula única.
Introduction
Clonais estudos revelaram heterogeneidade nas propriedades de enxertia de longo prazo de linfócitos adultos, fornecendo a introspecção nova de subtipos HSC e mudanças no comportamento HSC durante envelhecimento1. Entretanto, estudos semelhantes de linfócitos embrionários e seus precursores foram mais desafiadora. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, linfócitos surgem de uma população de precursores, conhecida como endotélio hemogenic em um processo transitório referido como o endotelial de transição hematopoiéticas2. O primeiro HSC, definido por sua capacidade de fornecer enxertia multilineage robusta, a longo prazo, seguindo o transplante no condicionado destinatários adultos, não são detectados até depois de dia embrionário 10.5 (E10.5) o embrião murino, com muito pouca frequência3 . Durante seu desenvolvimento, precursores da HSC (pre-HSC) decorrentes de endotélio hemogenic devem ser submetidas a maturação antes de adquirir as propriedades de HSC adulto que permitem uma eficiente enxertia em transplante ensaios4,5 , 6. obscurecendo o estudo da origem HSC rara, uma infinidade de progenitores hematopoiéticos com eritroide, mieloide e linfoide potencial já são detectados antes do surgimento de HSC de pre-HSC7,8. Assim, distinguir pre-HSC de outros progenitores hematopoiéticos exige métodos para isolar uma relação clonal células e fornecê-los com os sinais suficientes para sua maturação de HSC, para detectar suas propriedades de enxertia em ensaios de transplante.
Uma série de abordagens têm sido descrita que permitem a detecção de pre-HSC pela maturação ex vivo ou no vivo de HSC. Ex vivo métodos têm dependia da cultura de tecidos embrionários, como a região AGM, onde o primeiro HSC são detectadas no desenvolvimento9. Construindo sobre esses métodos, protocolos que incorporam a dissociação, a classificação e re-agregação dos tecidos AGM permitiram a caracterização das populações classificadas contendo precursores HSC durante o desenvolvimento de E9.5 para E11.5 no Pará-aórtica splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiões4,5,10; no entanto, essas abordagens não são passíveis de análise do elevado-throughput de precursores no nível da célula única necessária para análise clonal. Da mesma forma, na vivo maturação por transplante em ratos recém-nascidos, onde o microambiente presume-se ser mais adequado para o apoio das fases anteriores de precursores HSC, permitiu também estudos de populações classificadas do saco vitelino e AGM / P-Sp (P-Sp é a região de precursor para o AGM) com características de pre-HSC, mas estes métodos também não proporcionar uma plataforma robusta para single cell análise11,12.
Estudos de Rafii et al demonstraram que estroma de células endoteliais Akt-ativado (CE) pode fornecer um substrato de nicho para o apoio do adulto HSC auto-renovação em vitro13,14,15. Recentemente determinamos que CE Akt-ativado derivado da região AGM (AGM-CE) fornece um nicho adequado em vitro para a maturação dos precursores hemogenic, isolado, tão cedo quanto E9 em desenvolvimento, para adulto-engrafting HSC, bem como a posterior autorenovação da gerado HSC16. Dado que este sistema emprega uma simples cultura de co 2-dimensional, é facilmente adaptável para clonal análise do potencial HSC de precursores hemogenic individualmente isolados.
Temos recentemente relatado uma abordagem a ensaiar o potencial HSC de precursores hemogenic clonal, combinando a classificação de índice de precursores hemogenic individuais de murino embriões com co-cultura AGM-CE e posterior análise funcional em transplante ensaios de17. Classificação de índice é um modo de fluorescência-ativado celular classificação (FACS) que registra (índices) todos os parâmetros fenotípicos (isto é, dispersão direta (FSC-A), lado dispersão (SSC-A), fluorescência parâmetros) de cada célula individualmente classificado que estes características podem ser retrospectivamente correlacionadas para posterior análise funcional após a classificação. FACS software grava ambas as informações fenotípicas para cada célula e posição/poço da placa de 96 poços, na qual ele foi colocado. Esta técnica anteriormente foi elegantemente usada para identificar a heterogeneidade na HSC adulto, determinar parâmetros fenotípicos que mais enriquecem para o subconjunto engrafting a longo prazo do HSC e correlacionam parâmetros fenotípicos de HSC com transcricional Propriedades para o single de pilha nível18,19. Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada desta abordagem que permite a identificação de parâmetros fenotípicos únicos e contribuições de linhagem de pre-HSC durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de monocamadas de AGM-CE para cultura co
- 24 h antes da dissecação AGM e tipo, fazer AGM-CE meios de cultura e filtro esterilizar.
- Adicionar 0,1% gelatina em água (100 µ l/poço) para cada poço de uma placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Aspire a gelatina e deixar a placa em uma capa de cultura de tecidos com a tampa removida até os poços estão secos.
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Dissocia o monocamadas de AGM-CE e placa para placas de 96 poços.
Nota: Manter a AGM-CE, preparada como descrito anteriormente16, em meios de cultura de AGM-CE. Para obter consistência, linhas de células de AGM-CE devem ser congeladas, assim como números suficientes são obtidos (geralmente passagem 1-3) e usadas em um número definido de passagem (passagem geralmente 5-12) para experiências de co-cultura. Linhas de células de AGM-CE são derivadas C57BL/6J (CD45.2) AGM. Consulte a Tabela de materiais para todas as composições de mídia.- Aspirar a mídia da cultura AGM-CE num balão de2 de 75 cm e adicionar 5 mL de PBS. Aspire o PBS e adicionar 3 mL de solução de tripsina (ver Tabela de materiais).
- Incube a 37 ° C durante 2-4 minutos até que a maioria das células está levantando o prato. Adicione 7 mL de meio de cultura de AGM-CE e pipetar 8 - 10 vezes com uma pipeta de 10 mL para preparar a suspensão de células únicas e transfira para um tubo de 15 mL.
- Girar a 300 x g por 5 min, retire o sobrenadante, re-suspender em meios de cultura de AGM-CE de 10 mL e estimar o número de células com um hemocytometer. Dilua as células a uma concentração de 1 x 105 células/mL em meios de cultura de AGM-CE.
- Adicione 100 µ l AGM-CE suspensão (1 x 104 células) a cada poço de uma placa de 96 poços gelatinizado. Lugar em um 37 ° C, 5% CO2 tecido cultura incubadora durante a noite para permitir que o AGM-CE unir e formar uma monocamada confluente.
Nota: Distribua uniformemente as células do estroma AGM-CE, então não há supercrescimento limitado ou célula aglutinação para co-cultura ideal. -
Prepare a monocamada de AGM-CE para co-cultura AGM.
- Na manhã seguinte, prepare a mídia AGM isento de soro.
- Usando uma pipeta multicanal 12-poços, remova a mídia de cultura de AGM-CE da AGM-CE e adicionar 200 µ l/poço de media serum-free de AGM sem citocinas para lavar qualquer mídia contendo soro residual.
- Remova a mídia e adicione 200 µ l/poço de media serum-free de AGM com citocinas. Trabalhar rapidamente quando remover e adicionar a mídia para que a camada endotelial não está comprometida; por exemplo, remover e re-adicionar uma linha de mídia de cada vez. Coloque as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C até que as células embrionárias estão prontas para a classificação.
2. preparação da suspensão de célula única de tecidos embrionários murino
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Disse o AGM de acasalamentos cronometrados.
- Configure acasalamentos cronometrados para gerar tecidos embrionários da idade desejada.
- Colheita de embriões de fêmeas grávidas em 9,5 a 11,5 dias post coitum (dpc), dependendo da fase do pré-HSC para ser analisado.
Nota: Tecidos embrionários são colhidos de camundongos C57BL/6J (CD45.2) como descrito anteriormente e precisamente encenado somite com base na contagem de16. Temos focado na análise das populações da região AGM embrionária e seu precursor, o P-Sp, entre os E9.5 para E11.5, com base no estadiamento somite. - Disse o AGM do embriões20.
Nota: Protocolos detalhados para a dissecção da AGM de murino embriões têm sido publicados por outros20. Alternativamente, saco vitelino ou outros tecidos purported ter atividade pré-HSC também poderiam ser analisados por este método.
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Dissocia os tecidos embrionários dissecados.
- Recolher os tecidos dissecados em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de PBS com 10% FBS no gelo. Gravidade resolver os tecidos, Aspire o PBS/FBS e então imediatamente adicione 1 mL de colagenase de 0,25% e coloque em um banho de água de 37 ° C durante 25 min.
- Adicione 1 mL de PBS/10% FBS e pipetar cerca de 20 - 30 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL para obter uma suspensão de célula única. Adicionar um adicional 8 mL de PBS/10% FBS e células de centrifugação a 300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante.
3. o anticorpo coloração de células embrionárias murino
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Prepare o tampão de bloqueio para anticorpos.
- Adicionar 10 µ g/mL anti-mouse CD16/CD32 (bloco do receptor (FcR) Fc) e DAPI (estoque de 1 mg/mL em H2O) de 1 µ g/mL a 1 mL de PBS com 10% FBS.
- Elaborar em uma seringa de 3 mL e passar por um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar. Ressuspender o pellet de células os tecidos embrionários murino dissociada (da etapa 2.2.2) em 500 µ l de bloqueio de buffer e incubar no gelo por 5 min.
- Prepare a mistura de anticorpo17.
- Adicione o bloco de FcR 10 µ g/mL a 1 mL de PBS com 10% FBS e 10 µ l de cada anticorpo anti-VE-caderina conjugados a fluorocromo (CD144, consulte a Tabela de materiais) e anticorpo anti-EPCR conjugados a fluorocromo (CD201, consulte a Tabela de materiais). Salvo indicação em contrário com base nas recomendações do fabricante ou de acordo com titulações, use uma diluição de 1: 100 final de anticorpos.
Nota: Esta combinação de anticorpos é usada para definir portas para classificação, conforme descrito abaixo (etapa 4.2). Classificação com base na expressão de co de VE caderina e EPCR permite significativo enriquecimento para a parte de AGM-derivado de células contendo atividade de precursor do HSC, como descrito anteriormente,17. - Acrescente os anticorpos conjugados a fluorocromo adicionais para análises posteriores fenotípica individuais precursores índice-classificados.
Nota: Estes anticorpos não são necessariamente usados para definir os portões para a classificação. Neste protocolo de amostra, incluímos anti-CD41 PE-conjugado anticorpo e anti-CD45 FITC-conjugado anticorpo para analisar a expressão relativa destes marcadores hematopoiéticas, que evoluem durante o surgimento de pre-HSC do endotélio hemogenic4 ,5,16,17. Outros marcadores de interesse podem ser incluídos como desejado. Amostras coradas com controles de anticorpos conjugados a fluorocromo isotype são usadas para definir portas negativas e positivas, para análise. - Elaborar a mistura de anticorpo em uma seringa de 3 mL e passar por um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar. Adicione 500 µ l do mix anticorpo para a suspensão de eritrócitos em tampão de bloqueio, pipeta para misturar e incubar no gelo pelo menos 15-20 min.
- Adicione o bloco de FcR 10 µ g/mL a 1 mL de PBS com 10% FBS e 10 µ l de cada anticorpo anti-VE-caderina conjugados a fluorocromo (CD144, consulte a Tabela de materiais) e anticorpo anti-EPCR conjugados a fluorocromo (CD201, consulte a Tabela de materiais). Salvo indicação em contrário com base nas recomendações do fabricante ou de acordo com titulações, use uma diluição de 1: 100 final de anticorpos.
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Lave as células manchadas.
- Adicione 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min, aspirado e ressuspender a célula de pelotas com 1 mL PBS/10% FBS.
- Remova grupos de células pipetando a suspensão de células através de uma tampa de filtro de célula μm 35 em um tubo de 5 mL. Lave o filtro de célula com um adicional 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugar as células em 300 x g durante 5 min, Aspire, re-suspender em 500 µ l PBS/10% FBS e Coloque gelo até FACS.
4. índice classificação de precursores Hemogenic único de 96 poços com estroma AGM-CE para cultura co
- Preparar a máquina de FACS para modo de placa e alinhar para classificação para placas de 96 poços, de acordo com as instruções do fabricante. Selecione modo de única célula e índice classificação modo no software para configurações de máscara de pureza máxima e para permitir a aquisição de parâmetros de índice para cada célula classificada.
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Obter uma amostra de células do anticorpo manchado amostras para definir portas para classificação.
- Carregar a amostra de células coradas na máquina FACS e adquirir as células para a mais baixa taxa de fluxo. Lote FSC-A versos SSC-A e selecionados um portão que inclui células de tamanho variável (figura 1B) (que é baseado na observação de que atividade de pre-HSC é identificada em células de perfis de tamanho diferente no AGM17). Plotar FSC-A versos FSC-W e SSC-A versos SSC-W e selecione gates excluir parelhas. Depois conspira FSC-A versos DAPI para portão células vivas (negativas para DAPI) (figura 1B).
- Lote PECy7 (ou o fluorocromo relevante para a mancha VE caderina) versus PerCP (ou o fluorocromo relevante para a mancha EPCR). Portão de células que são positivos para VE-caderina (que inclui uma população mista de células endoteliais bem como progenitores hematopoiéticos e pre-HSC de AGM) e que têm alta expressão EPCR (que enriquece para pre-HSC de AGM/P-Sp17). Este é o portão final que será usado para indexar o tipo de células únicas na etapa 4.3 (figura 1B).
- Parcela adicionais fluorochromes usados para coloração.
Nota: Dependendo da subpopulação para ser analisado, portas adicionais podem ser definidas com baseadas na detecção de outros marcadores incluído para coloração de células. No entanto, índice de classificação permite a gravação dos parâmetros fluorescentes para cada célula classificada tal que estes parâmetros podem ser analisados retrospectivamente. Assim, nenhuma porta adicional é necessário neste momento. Para todas as configurações de FACS, amostras coradas com anticorpos único devem ser usadas para ajustar a compensação, conta para repercussões na emissão de fluorochromes sobrepostas e com anticorpos controle isotype, conta para a coloração de fundo e determinar portões de negativo/positivo.
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Índice de classificar as células AGM.
- Coloca uma placa de 96 poços, preparada com o estroma AGM-CE em media serum-free de AGM com citocinas (da etapa 1.5.3) no bloco de placa da máquina classificação FACs. Carregar a amostra e começar a aquisição de amostra. Selecionar o modo de classificação/simples célula de índice e começar sortingsingle células de 96-poços individuais. Use a menor taxa de fluxo para minimizar a tensão de cisalhamento em células embrionárias.
- Certifique-se de que todos os eventos são registrados durante a classificação de índice. Isto irá permitir a enumeração do número total de células analisadas no portão de classificação relativo aos real número classificada para o individual 96-poços, como nem todos os eventos registrados serão classificados para poços.
- Uma vez que as células foram classificadas para um prato inteiro de 96 poços, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C, fixado em 5% CO2. Repita para placas adicionais exigidas por experiência.
- Células de cultura co individualmente classificada em 96-poços contendo AGM-CE (da etapa 4.3) por até 7 dias (5 dias para células classificadas de embriões E11-11.5, 6 dias de embriões E10-10.5, 7 dias de embriões E9-9.5). Visualize colônias hematopoiéticas de vários tamanhos e morfologias com um microscópio invertido na ampliação de 100 X (Figura 2B) após o período de co-cultura.
Nota: A mídia não precisa ser alterado durante o período de co-cultura. Classificados hemogenic precursores inicialmente podem integrar a camada de AGM-CE com uma morfologia semelhante CE e não podem ser inicialmente distinguida estroma AGM-CE (Figura 2A). No entanto, seguir 24-48 h em co-cultura, pequena, arredondado de células hematopoiéticas ou aglomerados de células podem ser detectados. No final da co-cultura (5-7 dias), colónias individuais de células hematopoiéticas podem ser visualizadas no subconjunto de 96 poços que recebeu uma célula classificada com potencial hematopoética clonal. Se visualmente inspeccionados poços contenham mais de uma colônia distinta e, em seguida, esta amostra é excluída da análise a jusante para excluir amostras que podem ter recebido mais de uma célula, classificada por bem.
5. análise de progênie hematopoiéticas Clonal, seguindo co-cultura
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Clones de colheita de cada 96 poços para análise de FACS.
- Vigorosamente a pipeta para dissociar as células hematopoiéticas de camadas endoteliais utilizando uma pipeta multicanal com pontas de pipetas 200 µ l. Não tente dissociar a camada endotelial. Remova 100 µ l (~ 50% da amostra) para análise fenotípica de progênie hematopoiéticas por FACS.
- Transferir para uma placa de V-fundo de 96 poços e centrifugar a 300 x g por 2 min para as células de Pelotas. Remova a mídia por agredir mídia da placa com um único movimento rápido, enquanto a placa é invertida (filme de placa).
- Coloque as restante 100 células µ l da placa de 96 poços original em um uso de incubatorfor de 37 ° C no ensaio de subsequentes de enxertia (etapa 6).
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Incube as células com os anticorpos apropriados para análise hematopoiética.
- Re-suspenda as pelotas de célula em cada poço de um V-fundo de 96 poços com 50 µ l de PBS/2% FBS contendo 10 µ g/mL FcR bloco e 1 µ g/mL DAPI. Incube a placa a 4 ° C por 5 min.
- Adicionar 50 µ l de PBS/2% FBS contendo 10 µ g/mL FcR bloco e uma mistura de anticorpo para análise HSC contendo anti-Gr1 conjugado FITC, PE-conjugado anti-EPCR, APC-conjugado anti-Sca1 e PE-Cyanine7-conjugado anti-VE-caderina, PerCP-conjugado anti-CD45 e anti-F4/80 (cada anticorpo na diluição final de 1: 100 a menos que indicado de outra forma com base nas recomendações do fabricante ou de acordo com titulações). Incube a placa a 4 ° C, durante pelo menos 20 min.
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Remover o anticorpo não acoplado com diluições sequenciais e analisar as células.
- Adicione 200 µ l/poço PBS/2% FBS e centrifugar a 300 x g por 2 min para as células de Pelotas. Em seguida, agite a placa para descartar o sobrenadante e adicionar 200 µ l PBS/2% FBS cada pellet celular e centrifugar a 300 x g por 2 min para células de Pelotas.
- Filme de placa para descartar o sobrenadante e adicionar 50 µ l/poço PBS/2% FBS para análise. Proceda para analisar as células por FACS usando um citômetro de fluxo, equipado com um leitor de placa.
Nota: Adquirir um volume fixo de células (por exemplo, 35 µ l da 50 µ l total usado para re-suspensão) para enumerar os subconjuntos de progênie hematopoiéticas.
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Analise os dados de FACS para cada poço contendo progênie hematopoiéticas para triagem de colônias que contêm HSC potencial (Figura 3).
- Portão primeiro a população de CD45 positiva que é negativa para os marcadores mieloides Gr1 e F480. Não portão células que expressam ainda baixos níveis de VE-caderina. As células da camada de AGM-CE que são rompidas durante a colheita das colônias hematopoiéticas são VE-caderina positivo e negativo de CD45.
- Portão CD45+VE-Cad- / baixaGr1 células de F4/80– –mais adiante o subconjunto que expressam altos níveis de EPCR e Sca1 (Figura 3A -C).
Nota: em estudos prévios, colônias faltando células com CD45+VE-Cad- / baixaGr1––de F4/80 Sca1OiEPCROi fenótipo (Figura 3D) reproducibly falha para fornecer detectável enxertia de multilineage sangue periférico em ratos irradiados de destinatário17 (dados não mostrados); assim, estas colônias não precisam ser incluídas na análise subsequente transplante na etapa 6.
6. análise das propriedades de enxertia de Clones individuais e correlação com propriedades fenotípicas elucidadas, classificando o índice
- O dia de (se possível) ou a manhã a análise fenotípica na etapa 5, a seguir re-suspenso as restantes 100 células µ l de cada 96 poços contendo colônias hematopoiéticas seguindo co-cultura (da etapa 5.1) pipetando vigorosa usando uma ponta de pipeta de 200 µ l.
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Preparar e adicionar células de resgate de toda medula óssea da estirpe congenic B6. SJL-PtprcumPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) ratos adultos16,17.
- Contagem de células nucleadas da medula óssea em solução de turcos sob um hemocytometer. Diluído a uma concentração de 5 x 105 nucleated células/mL em PBS com 2% FBS.
- Adicione 100 µ l de células de medula óssea de resgate (5 x 104) a cada poço contendo progênie hematopoiéticas para análise de transplante e misture por pipetagem.
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Transplante a descendência dos clones individuais em uma cepa única letalmente irradiados destinatário congenic B6. SJL-PtprcumPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) rato adulto.
- Letalmente irradiar o mesmo número de camundongos B6 CD45.1 como o número de clones para injetar individualmente a descendência de um único clone (usando 1.000 cGy de uma fonte de césio).
- Desenhe suspensão de célula total 200 µ l (incluindo células do clone, bem como 5 x 104 B6 CD45.1 células da medula óssea de resgate) em uma seringa de insulina ½ mL com agulha 29g ½ polegada.
- Letalmente irradiar B6 CD45.1 antes da 2-24 h destinatários adultos injeção.
- Usando uma retenção de plástico do mouse que permite o acesso de cauda, injete através do volume de 200 µ l de veia de cauda contendo células de cada clone e 5 x 104 B6 CD45.1 células de resgate do adulto de medula óssea para ajudar na sobrevivência de destinatário.
- Marca auricular e pesar os ratos de destinatário e verificar seu peso/saúde em intervalos regulares (por exemplo, 3 - 4 vezes / semana pós irradiação/transplante, ou por individuais institucionais procedimentos habituais de funcionamento) para garantir a boa saúde.
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Realizar análise de enxertia de sangue periférico em intervalos regulares (por exemplo, 2, 16, 24 semanas) após o transplante.
- Remova 50-100 µ l de sangue via retrô-orbital sangramento ou outro método de deixar sangue eticamente aprovada.
- Adicionar 3 mL de tampão de lise (16,6 g NH4Cl, 2G NaHCO3 e 74,4 mg EDTA para L 2 H2O) sangue e incubar a temperatura ambiente por 5 min. centrifugar a 300 x g por 5 min. aspirado e ressuspender o sedimento com 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
- Ressuspender o sedimento com 150 µ l PBS/2% FBS contendo 10 µ g/mL FcR bloco e 1 µ g/mL DAPI e dispense a 1/3 do volume para um bem contendo 50 µ l isotipo de comando para doador e linhagem, 1/3 de um anticorpo de 50 µ l contendo bem para doador e isotipo controles para linhagem e 1/3 para um poço contendo 50 µ l anticorpos para detectar tanto doador e a linhagem.
Nota: Os anticorpos para a deteção de multilineage enxertia: APCeFluor780-conjugado anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-conjugado anti-CD45.1, FITC Conjugado anti-CD3, PE-conjugado anti-F4/80, PerCP-conjugado anti-Gr1 e APC-conjugado anti-CD19, ou controles do isotipo relevantes. - Identificar clones com enxertia a longo prazo, avaliando a contribuição de sangue periférico por FACS ao longo do tempo de CD45.2 (doador)-derivado de células hematopoiéticas para mieloide (positivo Gr1 e/ou F4/80), célula B (CD19 positivo) e células T (CD3 positivo) (Figura 4A -B).
Nota: Hematopoietic enxertia também pode ser analisada pelo CD45.2 (doador)-derivado contribuição às populações hematopoiéticas tecidos colhidos da medula óssea, baço, Timo e peritônio, ou na sequência de secundário transplante de células de medula óssea em camundongos B6 CD45.1 para analisar a enxertia serial propriedades17.
- Correlacione Propriedades fenotípicas de cada clone conforme determinado pelo índice inicial única célula classificação com suas propriedades de enxertia. Usando o software de análise de fluxo, carregar parâmetros de classificação para cada célula de índice-classificados (correlacionada com o 96 poços para o qual ele foi ordenado). Mapear dados funcionais em parcelas de fluxo para avaliar as propriedades fenotípicas de células únicas, como eles se relacionam com sua saída funcional (por exemplo, a longo prazo, multilineage enxertia) (Figura 4).
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Representative Results
A figura 1A mostra um esquema do projeto experimental. Uma vez que tecidos P-Sp/AGM são dissecados, pool e dissociados em colagenase, eles estão manchados com anticorpos para VE caderina e EPCR para classificação de índice. Pré-HSC são enriquecidos em células classificadas em VE-caderina+EPCRalta (figura 1B). Outros anticorpos conjugados a fluorocromo podem ser incluídos para analisar retrospectivamente parâmetros fenotípicos adicionais, que são registrados para cada célula durante a classificação de índice. Neste experimento representativos da AGM E11, as células também estão manchadas com FITC-Conjugado anti-CD45 e anticorpos anti-CD41 PE-conjugados. Heterogeneidade da populaçãoalta EPCR VE caderina-+para estes marcadores específicos hematopoiético é observada (Figura 1), consistente com o assincronismo conhecido em desenvolvimento hematopoiético esta fase5.
Seguindo o índice de classificação de células únicas de AGMalta de EPCR VE caderina-+para 96-poços individuais contendo AGM-CE em media serum-free AGM e citocinas, formação de colônia ocorre. Inicialmente, classificada EPCR VE caderina-+alta AGM células integrarem a camada de AGM-CE antes que comecem a reunir e formar grupos hematopoiéticos (Figura 2A, mostrado aqui de células seleccionadas de um embrião de murino transgênico expressando GFP sob o Ly6a promotor21, para os distinguir do estroma da AGM-CE). Após 5-7 dias de co-cultura, colônias de vários tamanhos e morfologias podem ser detectadas por inspeção com um microscópio invertido (Figura 2B), mostrada aqui de uma experiência representativa, 6 dias, seguindo a classificação de AGM E11.
Próxima análise fenotípica por FACS é realizada na metade da progênie de cada célula dealta VE-caderina+EPCR que formou uma colônia hematopoiética. Colônias, contendo células com fenótipo HSC são identificadas como VE caderina- / baixaGr1–CD45 F4/80–+Sca1OiEPCROi (Figura 3). Aqui, nós mostramos quatro diferentes colônias obtidas seguindo co cultura de índice-classificados EPCR E11 AGM VE caderina+alta células, três contendo diferentes proporções de HSC fenotípica com outros tipos de células mais diferenciados (Figura 3A –C), e a quarta falta de células com fenótipo HSC (Figura 3D). O número de colônias observadas por número de células chapeadas e a percentagem que resultaram em colônias de células-tronco engraftable varia de acordo com a idade embrionária e classificação realizada. VE-caderina- / baixaGr1–CD45 F4/80–+Sca1OiEPCROi E11 AGM clones gerados 53 ± 15 colônias fora de 192 células chapeadas com 5% ± 1,3% das 192 células chapeado gerando clones que incorporada há muito tempo termo (média ± DP para 3 experiências).
Para correlacionar o fenótipo com potencial de enxertia, a metade restante da progenitura de cada célula dealta EPCR VE caderina-+que se formou uma colônia hematopoiética contendo células com fenótipo HSC detectado pela FACS (por exemplo, o colônias, representadas na Figura 3A–C) é transplantado para irradiados (1.000 cGy) adulto congenic ratos de estirpe (B6 CD45.1) junto com uma dose de células de resgate da medula CD45.1 B6. Enxertia de multilineage a longo prazo é confirmada para cada clone contribuição do doador (CD45.2), seguindo para o mieloide (Gr1 e F4/80), célula B (CD19) e células T (CD3) compartimento de sangue periférico ao longo do tempo (Figura 4A). Embora a maioria das colônias contendo células com fenótipo HSC detectado pela FACS fornecem enxertia a longo prazo, o transplante é necessário confirmar enxertia multilineage funcional como alguns clones perdem enxertia ao longo do tempo (Figura 4B), ou exibir Propriedades de enxertia exclusivo como enxertia linfoides polarizados (dados não mostrados). Uma vez que o potencial HSC funcional de cada clone dealta VE-caderina+EPCR é determinado, isto é correlacionado retornar ao índice do clone que classificação de parâmetros para identificar suas características fenotípicas precisas. Neste exemplo, vemos que funcionalmente confirmou pre-HSC clones (pontos vermelhos) são heterogêneos na sua expressão de CD41 e CD45, consistente com a expressão dinâmica estabelecida destes marcadores durante o amadurecimento de pre-HSC para HSC (Figura 4). Clones formando colônias hematopoiéticas mas qualquer potencial HSC carente por triagem fenotípica ou por ausência de longo prazo, multilineage enxertia após transplante (não-HSC hemogenic clones, pontos azuis) também são heterogêneos para CD41 e CD45, Apesar de um subconjunto de expressar níveis mais elevados de CD41 comparado com clones de pre-HSC, que são principalmente CD41baixa. Clones que não formavam colônias hematopoiéticas (clones não-hemogenic, luz pontos verdes) são predominantemente CD41- / baixaCD45-, que provavelmente refletem a não-hemogenic+VE-caderina EPCRalta as células endoteliais.
Figura 1: visão geral do protocolo e análise de citometria de fluxo representativo para a classificação de índice de única células. (A) representação esquemática do protocolo. (B) fluxo cytometry análise de dissociada E11 AGM células apresentando estratégia associada para a classificação de índice de EPCR VE caderina-+célulasaltamente enriquecidas para pre-HSC (análise com software de análise de FACS). Números em cada portão representam a porcentagem de células. (C) fluxo cytometry análise mostrando CD41 e CD45 coloração no seio da populaçãoalta EPCR VE caderina-+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: formação de colônias hematopoéticas durante co-cultura AGM-CE. (A) imagem de lapso de tempo de células GFP+ classificadoaltaEPCR VE caderina-+de Ly6a-GFP embriões transgênicos21 co cultivadas na AGM-EC. Barras de escala em µm são mostradas no canto inferior esquerdo de cada imagem. (B) representante colônias formaram a partir VE caderina-+EPCRalto índice-classificados células únicas após 6 dias co cultura na AGM-EC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxo cytometry análise da descendência de um único EPCR E11 AGM-derivado VE caderina+alta de células seguindo co-cultura na AGM-EC. Retenção de células com potencial HSC é mostrado como o subconjunto que é VE-caderina- / baixaGr1–F4/80– (painel esquerdo), CD45+ (painel central) e Sca1OiEPCROi (painel direito). (A) representante colônia consistindo de uma população homogênea de células com o fenótipo HSC. (B–C) Representante colônias contendo uma mistura de células com o fenótipo HSC e mais tipos de células diferenciadas. (D) a colônia representativa consistindo de células falta o fenótipo do HSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise de enxertia de sangue periférico de progênie dos clones individuais seguindo co-cultura AGM-CE e correlação com índice de parâmetros de classificação. (A), enxertia de derivados de CD45.2 de doador de sangue periférico de mieloide (Gr1 e F4/80), célula B (CD19) e subconjuntos de células T (CD3) de um destinatário representativo (CD45.1 B6) transplantados com descendência de individual E11 VE caderina+EPCRalta clone co-cultura AGM-CE a seguir. (B), derivado de CD45.2 de doador de sangue periférico enxertia ao longo do tempo após o transplante de progênie de clones dealta individuais E11 VE-caderina+EPCR co-cultura AGM-CE a seguir. (C) correlação de CD41 e expressão de CD45 para cada índice classificado EPCR VE caderina-+alto clonagem com seu potencial HSC seguir co-cultura AGM-CE baseia a longo prazo, multilineage enxertia no ensaio de transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estudo da gênese HSC durante o desenvolvimento embrionário necessita de meios para detectar potencial precursores de hemogenic ainda falta a competência para fornecer a longo prazo multilineage reconstituição hematopoiética em transplantados adultos destinatários de HSC. Neste protocolo, apresentamos um ensaio clonal de precursores hemogenic embrionárias pela cultura co do estroma em nicho vascular ECs de AGM, que suporta a maturação dos precursores de HSC, com posterior análise funcional em ensaios de transplante. Incorporação do índice de classificação permite a análise retrospectiva dos parâmetros fenotípicos para caracterizar as propriedades da pre-HSC conforme definido pelos marcadores de superfície incluído no ensaio. Essa abordagem fornece assim uma vantagem sobre outros métodos que dependem de classificação de em massa das populações do precursor com re-aggregation baseada em HSC ensaios4,5,10, permitindo eficiente triagem para potenciais marcadores de pre-HSC e, ao mesmo tempo fornecendo informações sobre o nível de expressão relativa de marcadores de superfície para cada célula. Usando esta metodologia, por exemplo, anteriormente informamos que, além do uso de EPCR para enriquecer as populações pre-HSC em diferentes estágios de desenvolvimento, expressão intermediário do ligante de entalhe Dll4 mais definido uma subpopulação de clonal Precursores EPCR+ +VE-caderina com HSC potencial, Considerando que Dll4 negativo precursores EPCR VE caderina-++ hemogenic principalmente carecia de HSC potenciais17.
Outra vantagem deste método é a capacidade de tela para potencial HSC imediatamente após co-cultura com base na detecção de progênie hematopoiéticas com um fenótipo (caderina VE- / baixaGr1–CD45 F4/80–+Sca1 OiEPCROi) que está correlacionada com a longo prazo, multilineage enxertia. Isto elimina a necessidade de transplante colônias falta hematopoiéticas progênie com este fenótipo HSC, como estas colônias não fornecem a longo prazo enxertia em ensaios de transplante. Além disso, informações iniciais distinguem pre-HSC potencial precursores de hemogenic falta potencial HSC imediatamente após cultura co, sem a necessidade de aguardar os resultados de ensaios de enxertia a longo prazo, são útil, por exemplo, rapidamente marcadores de candidato de HSC-precursores de triagem. No entanto, a correlação de dados fenotípicos com enxertia a longo prazo após transplante fornece adicionais insights valiosos sobre variações das propriedades da pre-HSC clones enxertia precisos. Encontramos, por exemplo, que pre-HSC clonal da região de P-Sp/AGM entre E9.5 e E11.5 têm o potencial único de originar tanto B1a e B2-linfócitos, enquanto potencial B1a-linfócito é deficiente em adultos HSC17. Além disso, detectamos uma evolução nas propriedades do enxerto de clones de pre-HSC entre E9.5 e E11.5 com pre-HSC anterior, demonstrando uma inclinação relativa em direção a enxertia de versos B2-linfócito B1a peritoneal e menos potencial de auto-renovação robusto baseado sobre transplante secundário ensaios17.
Este protocolo fornece uma abordagem valiosa para elucidar as propriedades únicas de precursores HSC clonais, existem algumas limitações que devem ser reconhecidas. Embora a deteção de progênie com HSC fenotípica por FACS seguindo co-cultura AGM-CE é geralmente correlacionada com enxertia multilineage a longo prazo, algumas colônias com este fenótipo fornecem apenas a curto prazo enxertia ou deficientes de enxertia em uma ou mais linhagens hematopoiéticas (Figura 4B; dados não mostrados). Assim, transplante continua a ser o padrão-ouro na validação funcional HSC. Além disso, ele não pode ser descartado que algumas das diferenças nas propriedades de enxertia de pre-HSC clones, ao invés de potencial precursor, refletindo diferenças intrínsecas célula em hemogenic podem resultar da variabilidade estocástica durante co-cultura AGM-CE nos versos de auto-renovação decisões de diferenciação, como pre-HSC são simultaneamente amadurecendo para o HSC e passando por divisões celulares. Na verdade, isso pode, em parte, conta para a heterogeneidade observada da morfologia das colónias e fenótipo das células, gerada a partir de clones individuais pré-HSC (por exemplo, Figura 3A–C) e pode resultar em uma subestimativa dos pre-HSC por Este ensaio se não todo potencial pre-HSC clones são detectados pela geração de HSC funcional seguindo co-cultura AGM-CE. No entanto, a capacidade de distinguir hemogenic funcionalmente distintos clones por sua expressão diferencial de marcadores fenotípicos exclusivos (como Dll417) habilitado por este método fornece um meio para identificar subpopulações de precursores hemogenic com diferenças inerentes de célula intrínsecas.
Com base no presente protocolo básico, um número de aplicações estendidos pode ser incluído para um estudo mais aprofundado hematopoiética potencial de precursores hemogenic clonal durante o desenvolvimento. Além do uso de anticorpos para a deteção de marcadores de superfície, expressão de marcadores de fluorescência em embriões transgênicos (EG., Ly6a- GFP21 ou Runx1 -GFP22 expressado em hemogenic endotélio/pre-HSC) pode ser incorporado para o índice de classificação de precursores hemogenic. Além de ensaios de transplante seguindo co-cultura AGM-CE para detectar putativo pre-HSC, progênie também pode ser avaliada pelo potencial de linhagem hematopoiética baseado na secundária em vitro ensaios, tais como cultura no OP9 ou OP9-Dl1 detectar células B e T potencial23, ou clonogenic formadoras de ensaios em metilcelulose para detectar o potencial erythromyeloid. Com efeito, alguns dos clones não-HSC hemogenic (por exemplo, a figura 3D) provavelmente representam progenitoras multipotentes, progenitores de erythromyeloid, ou progenitores de células T e B que precedem e são independentes de desenvolvimento HSC descrito anteriormente 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28e este ensaio podem facilitar ainda mais o estudos clonais destas ondas distintas de precursores hematopoiéticos. Finalmente, a classificação de índice de pre-HSC pode ser combinada com outras análises a jusante como única célula a sequenciação do ARN, correlacionar Propriedades fenotípicas com os perfis transcriptional globais de desenvolvimento de precursores do HSC. No total, este protocolo fornece um método para a análise robusta da hematopoiese clonal de precursores hemogenic embrionárias que devem fornecer novos insights sobre desenvolvimento HSC.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden no Fred Hutchinson Flow Cytometry núcleo para assistência com FACS. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde NHLBI UO1 concessão #HL100395, colaborativo auxiliares Grant #HL099997 e NIDDK concedem #RC2DK114777. Brandon Hadland é suportado pelo de o Alex Lemonade Stand Foundation e Hyundai Hope na Fundação de rodas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
References
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