Summary
Les mitochondries contiennent plusieurs enzymes de flavin-dépendante qui peuvent produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS). ROS de surveillance communiqué de sites individuels dans les mitochondries est difficile en raison de réactions secondaires indésirables. Nous présentons une méthode simple et peu coûteuse pour une évaluation directe des tarifs natives pour libération ROS en utilisant flavoenzymes purifiée et microplaque fluorométrie.
Abstract
Il a été signalé que les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 sources enzymatiques des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Une majorité de ces sites sont complexes respiratoires flavin-dépendante et déshydrogénases qui produisent un mélange de superoxyde (O2● -) et de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Une quantification précise du potentiel ROS-produisant des sites individuels dans les mitochondries isolées peut être difficile en raison de la présence de systèmes de défense antioxydants et les réactions secondaires qui forment aussi O2●-/ h2O2. Utilisation d’inhibiteurs non spécifiques qui peuvent perturber la bioénergétique mitochondriale peut aussi compromettre Mensurations en altérant la libération ROS provenant d’autres sites de production. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure simultanée de la libération de H2O2 et de la production de la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) par purifiée déshydrogénases lié à flavin. Pour nos besoins ici, nous avons utilisé purifiée pyruvate déshydrogénase complexe (CPD) et α-cétoglutarate déshydrogénase complexe (KGDHC) d’origine porcine coeur comme exemples. Cette méthode permet une mesure précise native H2O2 taux de lixiviation par différents sites de production en éliminant les autres sources potentielles des systèmes ROS et antioxydant. En outre, cette méthode permet une comparaison directe de la relation entre la libération de H2O2 et de l’activité enzymatique et de la projection de l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la production de ROS. Dans l’ensemble, cette approche peut permettre l’évaluation approfondie des taux natifs de ROS libération d’enzymes individuelles avant d’effectuer des expériences plus sophistiqués avec des mitochondries isolées ou perméabilisée fibre musculaire.
Introduction
Le but ultime du métabolisme des éléments nutritifs est de faire de l’adénosine triphosphate (ATP). Dans les cellules de mammifères, cela se produit dans les mitochondries, organites membrane double qui convertissent l’énergie stockée en carbone en ATP. La production d’ATP commence lorsque le carbone est brûlé par les mitochondries formant deux transporteurs d’électrons, NADH et la flavine adénine dinucléotide (FADH2)1. NADH et FADH2 sont ensuite oxydé par sous-unité multiples complexes respiratoires I et II, respectivement, et les électrons libérés sont transportés à la terminal d’électron accepteur moléculaire l’oxygène (O2) au complexe IV1. Le thermodynamiquement favorable « descente » transfert d’électrons à O2 à la fin de la chaîne est couplé à l’exportation des protons dans l’intermembranaire espace par les complexes I, III et IV. Cela crée un gradient électrochimique transmembranaire de protons (force proton-motrice), une forme temporaire d’énergie libre de Gibbs qui est exploité par complexe V faire ATP2. Réactions de transfert d’électrons dans les mitochondries ne sont pas parfaitement couplées à la production de l’ATP. À divers moments durant le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, les électrons peuvent interagir prématurément avec O2 pour former ROS3. Les ROS plus biologiquement pertinentes générées par les mitochondries sont O2● - et H2O2. O2● - est considéré souvent comme le ROS proximale formées par les mitochondries, il est maintenant évident que les sites de production de forment un mélange de O2● - et H2O2, qui est associé à la libre chimie radicalaire de flavin prothétique regroupe4,5. Des niveaux élevés, ROS peuvent être dangereux, endommageant des constituants biologiques requis pour la fonction cellulaire résultant en détresse oxydante6. Toutefois, à de faibles quantités, ROS mitochondriales remplissent les fonctions vitales de signalisation. Par exemple, H2O2 libération des mitochondries a été impliquée en contrôlant l’activation des lymphocytes T, la contrainte de signalisation (par exemple, l’induction des voies de signalisation Nrf2), l’induction de la prolifération cellulaire et la différenciation, signalisation de l’insuline et libération et alimentation comportement7. Des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la fonction de signalisation de ROS. Cependant, importantes questions demeurent au sujet desquels enzymes dans les mitochondries servent de sources les plus importantes et la façon dont la production est contrôlée.
Communiqué de ROS par un site de production dépend de plusieurs facteurs : 1) la concentration de l’électrodonneur site, 2) l’état d’oxydoréduction du site Don électron, 3) l’accès à l’oxygène et 4) la concentration et le type d’oxydation substrat3, 8 , 9. dans les mitochondries, d’autres facteurs comme la concentration de NADH et membrane force potentielle aussi influer sur la production de ROS8,10. Par exemple, le taux de O2●-/ h2O2 production de purifiée CPD ou KGDHC augmente avec l’augmentation NADH disponibilité5,11. Dans ce scénario, les électrons sont refluer de NADH vers le centre de la FAD dans la sous-unité de3 E du CPD ou KGDHC, le site d’O2●-/ h2O2 production12. De même, la fourniture de NAD+ a l’effet inverse, en diminuant la libération ROS du KGDHC12. Ainsi, contrôle entrée ou sortie des électrons provenant de sites de production de ROS peut altérer combien O2●-/ h2O2 est formé. Par exemple, blocage de la sous-unité de2 E de la CPD ou KGDHC avec un acide lipoïque analogique, diminuent des résultats dans un presque 90 % O2●-/ h2O2 production13, CPI-613. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec le chimique S-glutathionylation catalyseurs, diamide et disulfiram, qui abolir presque O2●/h2O2 production de CPD ou KGDHC par l’intermédiaire de la conjugaison du glutathion au E 2 sous-unités14. Le compromis pour bloquer le flux d’électrons par l’intermédiaire de la sous-unité de2 E de la CPD et KGDHC y a une diminution dans la production de NADH qui diminue la formation de ROS par la chaîne de transport d’électrons (p. ex., complexe III). Cela peut également diminuer la production d’ATP par la chaîne de transport d’électrons. Dans l’ensemble, le fait de bloquer l’entrée des électrons à des sites de production de ROS peut être un moyen très efficace de contrôle de la O2●-/ h2O2 production.
Les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 potentiels O2●-/ h2O2 sources6. La plupart de ces sites sont flavin-contenant des enzymes qui génèrent un mélange d’O2● - et H2O2. Utilisation de différents substrats et carboxypénicillines ont permis l’identification dont complexes respiratoires et déshydrogénases mitochondriales servent de haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites en 3de différents tissus. CPD et KGDHC ont démontré pour servir de grande capacité O2●-/ h2O2 sites émettant dans le muscle et les mitochondries du foie13,15. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne l’examen de l’O2●-/ h2O2 formant des potentiels des sites individuels dans les mitochondries et l’impact ayant différents substrats et carboxypénicillines sur les activités des enzymes. Cela est dû à la présence de réactions secondaires indésirables (p. ex., formation de O2●-/ h2O2 par des sites autres que l’enzyme d’intérêt), contaminant nutriments endogènes (p. ex.,gras les acides) ou organites (p. ex., peroxysomes qui font également O2●-/ h2O2) et l’utilisation d’inhibiteurs que le manque de sélectivité, ou l’utilisation de composés qui n’inhibent pas complètement la production de ROS. Certains inhibiteurs peuvent également altérer la bioénergétique mitochondriale et la direction du flux d’électrons, et cela modifie ROS communiqué provenant d’autres sites de production et confond les résultats. Les taux absolus de O2●/h2O2 libération de sites individuels dans les mitochondries sont également difficiles à quantifier en raison de la forte concentration d’O2● - et H2O2 éliminer les enzymes dans l’espace intermembranaire et de matrice. Par conséquent, élimination de toute réaction concurrente qui peuvent interférer avec l’O2●-/ h2O2 communiqué de mesures peut être utile lorsqu’on veut identifier haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites.
Nous présentons ici une méthode simple qui permet l’examen simultané de O2●-/ h2O2 production et de la formation de NADH par purifiée déshydrogénases flavin-dépendante. À l’aide d’enzymes purifiées, indésirables ROS formant des réactions secondaires et ROS enzymes dégradant peut être éliminé permettant une mesure plus précise des indigènes O2●-/ h2O2 taux de production pour chaque flavoenzymes. Cette méthode peut être utilisée pour comparer directement l’O2●-/ h2O2 formant la capacité des différents déshydrogénases purifiées ou aux inhibiteurs spécifiques au site potentiel écran pour O2●-/ h2O version 2 . Enfin, mesurant O2●-/ h2O2 et la production de NADH en même temps permet une évaluation en temps réel de la relation entre l’activité enzymatique et la capacité de sortie ROS.
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Protocol
1. produits chimiques et des Enzymes purifiées
- Se procurer les matériaux suivants : CPD et KGDHC d’origine porcine de coeur (ou un autre flavoenzymes mitochondrial purifié) ; H2O2 (solution à 30 %), le pyruvate, α-cétoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, pyrophosphate de thiamine (TPP), saccharose mannitol, HEPES, EGTA, 3-méthyl-2-oxo-valérique (KMV), superoxyde dismutase (SOD), la peroxydase de raifort (HRP), 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réactif (AUR) et CPI-613.
2. planification de l’analyse et préparation du réactif
- Mettre en place l’analyse selon le tableau 1 dans une plaque à 96 puits.
Remarque : Le volume total de chaque réaction est 200 µL. concentrations de Stock sont ajustées de façon à 20 µL de réactif est ajouté à chaque puits. Cela garantit l’ajout rapide de cofacteurs et substrats à chaque réaction bien avant de commencer l’essai. - Préparer le tampon de réaction contenant 220 mM de mannitol, sucrose de 70 mM, 1 mM EGTA et 20 mM HEPES (pH 7,4 avec HCl).
Remarque : Cela pourrait changer en fonction des propriétés physiques des différentes enzymes purifiées. - Examiner les KGDHC ou les CPD purifiée de la contamination à l’aide d’enzyme dosages d’activité14,16,17 ou par immunoblot ou tache de bleu de Coomassie5.
- Préparer tous les réactifs dans la mémoire tampon de réaction selon la concentration de solution de travail dans le tableau 1.
- Conserver tous les réactifs comme aliquotes de 1 mL à-20 ° C. Stocker le pyruvate et le α-cétoglutarate à-80 ° C dans des aliquotes de 100 µL à prévenir la dégradation spontanée due à l’auto-oxydation et de gel-dégel répété.
- Préparation du réactif AUR maître stock dans 1 mL de DMSO et diluer à 100 µM de tampon de réaction. Boutique abri de la lumière.
NOTE : Ici, la solution de travail 100 µM est fait frais par 2 ou 3 semaines et l’abri de la lumière.
3. mise en place du modèle d’essai
- Configurer le mode opératoire sur un lecteur de microplaques monochrome avec des capacités de mesure double.
- Définissez la procédure de lecture en sélectionnant « Protocole ». Puis cliquez sur « Procédure ».
- « TEMPÉRATURE » de la valeur à 25 ° C (Figure 1 a).
- Cliquez sur « Démarrer KINETIC » pour définir les conditions de lecture (Figure 1 a). Régler l’heure et le nombre d’intervalles/expériences de lecture.
- Cliquez sur « lire » (Figure 1 b).
Remarque : Les échantillons sont lues à partir en position supérieure avec un gain de 50. Durée : 5 min, lire à intervalles de 30 s. Canal 1 : Fluorescence résorufine - excitation/émission = 565 nm:600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Canal 2 : NADH autofluorescence - excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm. - Sous « Lecture », sélectionnez puits au moniteur (p. ex., A1-A4 et B1-B4).
- Sélectionnez « END cinétique ».
4. courbes de niveau
- Décongeler les réactifs et les stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
-
Courbe d’étalonnage (Figure 2 a) de la NADH
- Préparer les solutions de travail pour le NADH dans des concentrations allant de 0,5 à 10 mM de tampon de réaction.
- Ajouter 20 µL d’extraits de chaque NADH travailler la concentration de la solution aux puits contenant 180 µL de tampon de réaction. La concentration finale de NADH dans chacune est bien 0.05-1 mM.
- Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm.
Remarque : Il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - les paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.
-
Courbe d’étalonnage AUR (Figure 2 b)
- Préparer les stocks de travail du peroxyde d’hydrogène dans le tampon de réaction ; concentrations de stock varient de 200-4 000 nM.
- Ajouter 120 µL de tampon de la réaction dans chaque puits.
- Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 U/mL, la concentration finale dans le puits = 3 U/mL), 20 µL de SOD (travail stock concentration = 250 U/mL, la concentration finale dans le puits = 25 U/mL) et 20 µL d’AUR (travail stock concentration = 100 µM la concentration finale dans le puits = 10 µM) pour chaque tampon bien contenant de la réaction.
- Ajouter 20 µL de chaque H2O2 solution stock à chaque cupule contenant le tampon et le dosage des réactifs de travail. Le volume réactionnel final est 200 µL et la concentration finale de H2O2 dans chaque puits est de 20 à 400 nM.
- Incuber les boîtes pendant 1 min dans le lecteur de plaque à 25 ° C.
- Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 565 nm/600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Notez qu’il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.
5. mesure O●- / h2 O2 version2et la Production de NADH par KGDHC et CPD
- Voir le tableau 1 de l’ordre d’ajout des différents réactifs, la concentration de chaque solution de travail et le volume ajouté à chaque puits.
- Ajouter 40 µL de tampon de réaction dans chaque puits. Pour les tests à l’aide de KMV ou CPI-613, ajouter 20 µL de tampon dans chaque puits.
- Ajouter 20 µL de CPD ou KGDHC (stock de travail de 1 U/mL, la concentration finale / puits = 0,1 U/mL) dans chaque puits.
- Incuber les CPD et KGDHC à 25 ° C pendant 2 min.
- Ajouter 20 µL de KMV (stock de travail = 100 mM, concentration finale = 10 mM) ou 20 µL du CPI-613 (travail de concentration stock = 1,5 mM, concentration finale = 150 µM) (tableau 2).
Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais. - Incuber pendant 1 min à 25 ° C.
Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais. - Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 3 unités/mL) et 20 µL de SOD (travail de concentration stock = 250 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 25 unités/mL) dans chaque puits.
- Ajouter 20 µL du coenzyme A (concentration stock de travail = 1 mM, concentration finale = 0,1 mM), 20 µL de biens meubles corporels (concentration stock de travail = 3 mM, concentration finale = 0,3 mM) et 20 µL de NAD+ (travail concentration stock = 10 mM, concentration finale = 1 mM) à chaque w Ell.
- Retirer le réactif AUR du revêtement de papier d’aluminium protectrice et ajouter 20 µL à chaque puits.
- Ajouter 20 µL du pyruvate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des CPD et le α-cétoglutarate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des KGDHC.
- Cliquez sur « Lecture » pour démarrer la mesure cinétique.
6. analyse de données
- Maintenez enfoncée la touche « CTRL » du clavier et cliquez sur puits pour générer un graphique contenant toutes les mesures cinétiques correspondant à la chaîne 1 (Figure 3 a).
- Cliquez sur « données » dans l’icône à afficher dans le coin supérieur droit pour les valeurs brutes pour les unités de la fluorescence relative (RFU) mesurées aux points différents temps (Figure 3 b).
- Exporter les valeurs pour l’analyse (tableau 3).
- Cliquez sur la « Graph » liste déroulante en haut à gauche (Figure 3 b) pour accéder aux valeurs de la RFU associées au canal de fluorescence 2.
- Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour canal 2.
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Representative Results
Figure 3 a prévoit une trace représentante la RFU recueillie pendant la mesure simultanée de la production de NADH et de H2O2 KGDHC purifiée. Les données brutes de RFU pour chaque intervalle de temps sont représentées dans la Figure 3 b. Les données brutes de la RFU sont ensuite exportées pour analyse. En extrapolant à partir des courbes standard présentés dans la Figure 2, la quantité absolue de NADH et H2O2 formé à chaque intervalle de mesure au cours de la période de 5 min peut être déterminée. Un exemple de ce calcul est fourni dans le tableau 3. Une fois que la quantité de NADH et H2O2 formée par KGDHC ou CPD aux intervalles différents a été déterminée, les valeurs sont copiés et entrés dans un logiciel graphique et statistique pour l’analyse approfondie. À l’aide de l’analyse de type graphe XY, la quantité de NADH (µmol) et H2O2 (pmol) formé par KGDHC ou CPD peut être tracée en fonction du temps (Figure 4 a). À l’aide de ces valeurs, le taux de NADH et H2O2 formation au cours de l’oxydation du substrat peut aussi être calculé. Comme le montre la Figure 4 b, KGDHC et CPD affichent des caractéristiques différentes en termes de NADH et H2O2 formant la capacité.
Une fois il a été établi que KGDHC et CPD sont enzymatiquement actif et NADH et H2O2 formation peut être suivie en même temps, ROS libérer des propriétés et l’activité enzymatique peut être mesurée. Nous avons choisi de comparer KGDHC et CPD puisqu’ils sont hautement homologues dans la structure de base et ont été documentés pour être des sites de grande capacité pour la production de ROS5. Figure 5 et Figure 6 montrent la dépendance du NADH et H2O2 production sur la concentration du substrat. CPD est facilement saturé par une faible quantité de substrat avec le taux de NADH et H2O2 production atteignant son maximum à 0,1 à 0,5 pyruvate mM. KGDHC, en revanche, affiche des augmentations en NADH et H2O2 production avec le α-cétoglutarate (Figure 5). Cela montre que KGDHC et CPD, bien que très homologues dans la structure de base, ont des propriétés cinétiques différentes en termes de quantité de substrat est nécessaire pour induire la libération maximale de ROS. Figure 5 montre également que H2O2 version de KGDHC est fortement en corrélation avec la disponibilité production et substrat de NADH. CPD de l’autre n’a pas les mêmes caractéristiques cinétiques. KGDHC et CPD diffèrent également en termes de NADH et O2●-/ h2O2 capacité de formage, lorsque la concentration de NAD+ est variée (Figure 6).
En tirant parti de la mesure simultanée de NADH et H2O2, potentiels inhibiteurs spécifiques pour la production de ROS peuvent être projetés. Cela peut aider à déterminer la quantité d’inhibiteur qui est nécessaire pour induire une inhibition maximale de la libération de H2O2 . En outre, en mesurant la production de NADH dans le même temps, le site d’action inhibiteur ainsi que la source de ROS peut être identifié. Des études antérieures ont montré que l’analogue de le α-cétoglutarate, KMV, est très efficace en inhibant la libération ROS du KGDHC (≥ 90 % d’inhibition)13,15. Nous avons également montré que CPI-613, un acide lipoïque analogique qui bloque la dihydrolipoamide de la sous-unité de2 E de la CPD et KGDHC, peut également inhiber la libération ROS de chaque complexe de ~ 90 %13,14. Le site d’action de KMV et CPI-613 sont indiquées à la Figure 7. CPI-613 est un soufre contenant la molécule et par conséquent, il est conseillé que les agents réducteurs thiol riche (dithiothréitol ; TNT) ou les protéines (albumine) figurent plus dans la procédure13. La figure 7 montre que KMV et CPI-613 étaient tous les deux très efficace pour limiter les NADH et H2O2 par KGDHC. De même, le CPI-613 abolit complètement H2O2 sortie de CPD (Figure 7). Collectivement, ces résultats démontrent que KMV et CPI-613 sont inhibiteurs hautement efficaces pour la libération de H2O2 et peuvent donc être appliquée à des expériences avec des mitochondries isolées. Un tel écran serait très avantageux pour les autres enzymes formant des ROS potentiels puisqu’elle permet une évaluation directe de l’efficacité et la sélectivité des différents inhibiteurs sur purifiée flavine déshydrogénases. La mesure simultanée du NADH a également l’avantage supplémentaire de permettre l’identification préliminaire de la source potentielle de ROS dans une enzyme complexe. Figure 7 fournit une représentation du mécanisme catalytique pour KGDHC, qui est hautement homologue de CPD. L’observation que KMV et CPI-613, qui bloquent la E1 et la sous-unité2 E de la KGDHC, presque complètement supprimé la H2O2 et la production de NADH, confirme que la sous-unité de3 E, probablement le FAD, est la source ROS 18. CPI-613 a exercé un effet similaire sur la CPD confirmant que le site de principe pour la libération de2 H2O est la E3 sous-unité18. Une approche similaire peut être utilisée pour d’autres déshydrogénases. Cela nécessiterait l’identification des inhibiteurs qui bloquent le flux d’électrons à travers différentes parties d’une complexe d’enzymes.
Figure 1 : Captures d’écran représentant pour l’installation de dosage. (A) représentation de procédure mis en place pour mesurer des changements cinétique en NADH et résorufine de fluorescence. (B) mise en place des paramètres de fluorescence pour l’essai. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbes d’étalonnage représentatives pour fluorescence NADH et résorufine. Les courbes sont utilisées pour estimer le taux de NADH et O2●/h2O2 production. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traces représentatives pour les données brutes de la RFU recueillies pendant le test. (A) les courbes pour chaque puits qui a été lu pendant le test. Courbes de vue plaque sont générés en maintenant enfoncée la touche Ctrl en cliquant sur chaque puits qui est en cours de lecture. (B) pour l’exportation de données, données sont cliquées sous vue pour générer un tableau contenant les valeurs représentatives de la RFU. Le tableur exportation puis clic sur bouton pour exporter les résultats bruts. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Une comparaison de l’H2 directe O 2 et NADH formant des taux de KGDHC et de la CPD. (A) la mesure simultanée de H2O2 et NADH formant le potentiel de KGDHC et de la CPD. (B) Calcul du taux d’H2O2 et de la formation de NADH par KGDHC et CPD. Une comparaison directe de la production de NADH et de ROS par les deux enzymes flavine montre que KGDHC produit plus H2O2 qui est liée à sa capacité enzymatique plus élevée. n = 4, moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Mesure simultanée de H 2 O 2 et NADH formant des tarifs par KGDHC et CPD oxydant des concentrations de substrat différentes. Variations de fluorescence ont été mesurées comme décrit précédemment, sauf que la concentration du substrat final variait de 0 mM à 10 mM. Cette approche a été utilisée pour déterminer la dépendance de la libération de2 H2O sur les propriétés cinétiques de KGDHC et de la CPD. n = 4, moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : KGDHC et CPD aussi affichent différents H2 O 2 et NADH formant des propriétés quand NAD + niveaux sont changés. Variations de fluorescence ont été mesurées comme décrit précédemment, sauf que la concentration finale de NAD+ variait de 0 mM à 1 mM. Cette approche a été utilisée pour déterminer la dépendance de la libération de2 H2O sur les propriétés cinétiques de KGDHC et de la CPD. n = 4, moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Projection de différents inhibiteurs spécifiques au site pour NADH et H2 O 2 production. (A) schéma illustrant le cycle catalytique pour KGDHC et les sites d’action de KMV et CPI-613. Notez que le CPD a un cycle catalytique homologue, sauf que KMV ne fait pas concurrence pour le site de liaison du pyruvate. E1 : pyruvate ou α-cétoglutarate déshydrogénase, E2 : dihydrolipoamide acyltransférase, E3 : dihydrolipoamide déshydrogénase. (B) effet de KMV et CPI-613 le NADH et H2O2 production par KGDHC et CPD. Les échantillons sont préincubés KMV (10 mM) ou CPI-613 (150 µM) et ensuite testés pour NADH et H2O2 production. n = 4, moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Travail concentration stock | Volume ajouté bien | Concentration finale dans le puits |
| KGDHC ou CPD | 1 unité/mL | 20 ΜL | 0,1 unités/mL |
| Superoxyde dismutase | 250 unités/mL | 20 ΜL | 25 unités/mL |
| Peroxydase de raifort | 30 unités/mL | 20 ΜL | 3 unités/mL |
| Pyrophosphate de thiamine | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzyme A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0,1 à 10 mM |
Tableau 1 : Exemple d’un protocole de base mis en place pour la mesure des O 2 ●– / H 2 O 2 et la production de NADH par purifiée PDH ou KGDH. Puisque 20 µL de chaque réactif est ajouté à chaque puits et la finale volume/réaction est 200 µL, la concentration finale de chaque réactif est 10 fois inférieure à la concentration de stock (par exemple, la concentration finale de NAD+ dans le mélange réactionnel est 1 mM ). Notez que réactifs devraient être ajoutées dans la cupule dans l’ordre présenté dans le tableau.
| Inhibiteur de la | Objectif |
| 3-méthyl-2-oxo-valérique | Sous-unité E1 de KGDHC |
| IPC-613 | Sous-unité E2 des déshydrogénases acide oxo |
Tableau 2 : liste des inhibiteurs et leurs cibles. Sites d’action sont également représentés à la Figure 8.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| CPD | KGDHC | ||||||||
| Temps | T ° 376 450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24,4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24,4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24,4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24,4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24,4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24,4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24,4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24,4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24,4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24,4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24,4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Résorufine fluorescence | |||||||||
| CPD | KGDHC | ||||||||
| Temps | T ° 565 600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24,4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24,4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24,4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24,4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24,4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24,4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24,4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24,4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24,4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24,4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24,4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tableau 3 : vue de la feuille de calcul des résultats provenant de la série d’expériences. Les valeurs RFU brutes tirées de l’expérience sont exportées vers une feuille de calcul pour une analyse ultérieure. À l’aide des courbes standard générés avant l’expérimentation, le taux de NADH et H2O2 production peut être calculé dans la feuille de calcul.
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Discussion
Ce protocole est avantageux depuis, 1) il élimine toute réactions concurrentes qui peuvent interférer avec la détection de2 H2O (p. ex., systèmes antioxydants ou autres sources de ROS), 2) fournit une évaluation directe de la vitesse native de ROS de sortie par une déshydrogénase mitochondriale flavine, 3) permet la comparaison de l’indigène ROS libérer les taux de deux ou plus purifiée axée sur la flavine déshydrogénases, 4) peut permettre une comparaison directe du taux d’activité de libération et de l’enzyme ROS et 5) permet le dépistage des inhibiteurs sélectifs de la concurrence pour diffusion ROS. Notre groupe et autres ont utilisé cette méthode dans des publications antérieures afin d’examiner la régulation de ROS par allostérique et oxydo-réduction avant de procéder à des mécanismes de signalisation expérimente des mitochondries ou muscle perméabilisées14,16, 17,19,20.
Modifications et dépannage :
Cette procédure utilise l’équipement de base disponible à presque toutes les institutions. L’approche est également faible coût et utilise des produits chimiques courants disponibles auprès de divers fournisseurs. La composition du tampon peut varier selon les propriétés de l’enzyme - même si, nous avons trouvé qu’un tampon de réaction de base composée de saccharose, HEPES, mannitol et l’EGTA fonctionne bien dans la plupart des applications. Les valeurs brutes pour résorufine fluorescence sont généralement autour de 50-500 RFU pour un ROS libérant enzyme jusqu'à 0,1 U/mL. Des valeurs plus élevées de RFU peuvent indiquer que le réactif AUR a été auto-oxydé en raison de l’exposition à la lumière ou de gel-dégel répété. Par conséquent, les solutions de travail AUR systématiquement remplacer par 2 ou 3 semaines (selon la fréquence d’utilisation). Présence d’impuretés dans la préparation enzymatique ou dénaturation peut conduire à plus faible que la normales lectures de ROS et le NADH. Pureté de l’enzyme doit être régulièrement surveillée par électrophorèse sur gel. Les propriétés cinétiques (Km et Vmax pour substrat et NAD+) devraient également être évalués immédiatement après l’achat ou la purification de l’enzyme et ensuite un suivi régulier par la suite. La plupart des réactifs utilisés dans le test est stable et peut être soumise à plusieurs cycles de gel-dégel. Pyruvate et α-cétoglutarate doivent être stockés dans des parties aliquotes de 100 µL à-80 ° C afin d’éviter l’auto-oxydation. Évitez d’utiliser des agents réducteurs comme TNT car il forme O2●-/ h2O2 directement par le biais de la formation radicale au CPD et KGDHC (et potentiellement d’autres flavoenzymes)17. On peuvent effectuer des essais à 37 ° C ; Toutefois, notre groupe a constaté que ces expériences à 25 ° C est idéal pour fournir des données plus cohérentes.
Limites de la Technique :
Un obstacle majeur associé à cette technique est l’accès à des enzymes mitochondriales flavine purifiées. Ici, nous avons utilisé commercialement disponible KGDHC et CPD pour démontrer que cette technique peut être utilisée pour comparer directement l’activité ROS communiqué de capacité et de l’enzyme de déshydrogénases mitochondriales flavine. Cependant, la plupart ROS production d’enzymes flavine ne sont pas disponibles dans le commerce et doit être purifiés en laboratoire. Cela peut être difficile compte tenu de certaines de ces enzymes sont membrane liée ou absorber à la membrane interne mitochondriale. Nouveaux protocoles de purification réussie de membrane-bondissent flavin-contenant des enzymes qui produisent les ROS sont maintenant disponibles. Cela inclut des méthodes de purification pour complexe I, complexe II et sn-glycérol-3-phosphate déshydrogénase21,22,23. Par conséquent, même si la plupart des générateurs ROS cotées n’est peut-être pas disponible dans le commerce, il existe des protocoles pour l’isolement et la purification. La pertinence physiologique des résultats recueillis à l’aide d’enzymes purifiées axée sur la flavine est également une limitation. Par conséquent, résultats recueillis avec des enzymes purifiées devraient être suivies avec des analyses à l’aide de mitochondries isolées ou tissu perméabilisée. Cinq études distinctes a utilisé cette approche pour étudier les mécanismes de règlement de la libération ROS par KGDHC et CPD14,16,17,19,20. Préliminaire des résultats pour le rôle d’interrupteurs rédox dans le contrôle de version ROS ont été initialement testées à l’aide de purifiée KGDHC et CPD, et puis les mécanismes de règlement ont été analysées plus loin dans le foie et les mitochondries cardiaques et les fibres musculaires14, 16,17,20.
Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :
Mesure de ROS libération des différents sites de production dans les mitochondries peut s’avérer difficile en raison de la présence de concurrents réactions secondaires qui produisent aussi O2●/h2O2 et antioxydant systèmes pouvant entraîner autrement la sous-estimation du taux natives. Le potentiel de membrane peut également modifier ROS taux de rejet de différents sites et l’utilisation d’inhibiteurs peut modifier les flux d’électrons, O2●-/ h2O2 formation mesures de confusion. La méthode présentée ici permet l’évaluation directe de la capacité de sortie ROS d’enzymes individuelles tout en évaluant simultanément la relation entre taux native dactivité O2●-/ h2O2 et l’enzyme. Cette méthode peu coûteuse peut servir comme un outil pour comparer le taux de libération ROS native pour individuels flavin-contenant des enzymes mitochondriales avant d’effectuer des expériences plus sophistiqués avec des mitochondries, des cellules ou des tissus. En outre, la méthode présentée ci-après peut être utilisée pour pré-visualiser l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la libération de ROS avant de procéder à des essais avec des mitochondries isolées.
Applications futures :
La méthode présentée ici a été utilisée dans cinq études distinctes visant à déterminer le contrôle sur la libération ROS de CPD et KGDHC14,16,17,19,20. Dans ces études, inhibiteurs ont été testés et ROS de sortie et tarifs NADH production ont été évalués à l’aide d’enzymes purifiées. Résultats recueillis avec les enzymes purifiées ont ensuite vérifiés à l’aide de mitochondries isolées et perméabilisées fibres musculaires14,16,17,20. Par conséquent, cette méthode peut être appliquée à un certain nombre de futures études visant à étudier le taux de libération ROS natifs de mitochondries, de cellules et les fibres musculaires.
Étapes cruciales dans le protocole :
Pureté de l’enzyme et ses propriétés cinétiques doivent être régulièrement surveillées. L’AUR réactif stock de travail devrait également être remplacé fréquemment. Cela garantira que les résultats recueillis sont compatibles. L’ordre d’addition des réactifs est vital pour l’exécution d’une expérience réussie (tableau 1). Inhibiteurs de devraient être réglées pour déterminer la concentration requise pour provoquer une inhibition maximale de la libération ROS. Dans cette étude, nous avons choisi 10 mM KMV et 150 µM CPI-613 puisque nous avions déjà déterminé que ces concentrations induisent une inhibition maximale de sortie ROS par KGDHC et CPD13.
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Disclosures
Il n’y a rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). Production vidéo a été réalisée en collaboration avec le centre d’Innovation dans l’enseignement et l’apprentissage (CITL) à l’Université Memorial de Terre-Neuve.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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