Summary
Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.
Abstract
Es wurde berichtet, dass Mitochondrien können bis zu 12 enzymatische Quellen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) enthalten. Ein Großteil dieser Seiten gehören Flavin-abhängige Atemwege komplexe und Dehydrogenases, die eine Mischung aus Superoxid (O2● -) und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu produzieren. Genaue Quantifizierung der ROS-Produktion Potenzial der einzelnen Standorte in isolierten Mitochondrien kann aufgrund des Vorhandenseins von antioxidativen Verteidigungssysteme und Nebenreaktionen, die auch O2●-/ h2O2bilden schwierig sein. Verwendung von unspezifische Inhibitoren, die mitochondriale Bioenergetik stören können kann auch Messungen beeinträchtigen, durch ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion ändern. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode für die gleichzeitige Messung von H2O2 -Version und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) Produktion von gereinigtem Flavin verbunden Dehydrogenases. Für unsere Zwecke hier haben wir gereinigten Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) und α-Ketoglutarate Dehydrogenase Komplex (KGDHC) Schweine Herz Ursprungs als Beispiele verwendet. Diese Methode ermöglicht eine genaue Messung der native H2O2 Freisetzungsraten von einzelnen Standorten der Produktion durch den Wegfall von anderen potenziellen Quellen von ROS und antioxidativen Systeme. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für einen direkten Vergleich des Verhältnisses zwischen H2O2 -Version und Enzym-Aktivität und die Prüfung der Wirksamkeit und Selektivität von Inhibitoren für ROS-Produktion. Alles in allem kann dieser Ansatz für die eingehende Beurteilung der native Raten von ROS Freigabe für einzelne Enzyme vor komplexere Experimente mit isolierten Mitochondrien oder permeabilized Muskelfaser ermöglichen.
Introduction
Das ultimative Ziel der Nährstoff Stoffwechsel ist Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. In Säugerzellen geschieht dies in den Mitochondrien, Doppel-membraned Organellen, die in Kohlenstoff in ATP gespeicherte Energie umwandeln. Die ATP-Produktion beginnt, wenn Kohlenstoff verbrannt von Mitochondrien bilden zwei Elektronen Träger, NADH und Flavin-Adenin-Dinucleotide (FADH2)1ist. NADH und FADH2 werden dann oxidiert durch Multi-Untereinheit Atemwege komplexe I und II, beziehungsweise, und die freigesetzten Elektronen werden auf das terminal Elektron Akzeptor molekularer Sauerstoff (O2) am Komplex IV1befördert. Die thermodynamisch günstigen "bergab" Übertragung von Elektronen auf O2 am Ende der Kette ist gekoppelt an den Export von Protonen in den Intermembrane Raum von komplexen I, III und IV. Dies schafft einen transmembranen elektrochemischen Gradienten von Protonen (Proton Motive Force), eine temporäre Form der freien Enthalpie von komplexen V zu ATP2getippt wird. Electron Transferreaktionen in den Mitochondrien sind nicht perfekt, ATP Produktion gekoppelt. An verschiedenen Punkten in der Krebs-Zyklus und die Atmungskette können Elektronen vorzeitig mit O2 Formular ROS3interagieren. O2●- und H2O2sind die biologisch relevanten ROS von Mitochondrien erzeugt. O2● - oft der proximalen ROS von Mitochondrien gebildet gilt, ist es jetzt offensichtlich, dass Produktionsstätten eine Mischung aus O2●- und H2O2 bilden, das ist verbunden mit dem kostenlosen radikale Chemie der Flavin prothetische Gruppen4,5. Auf einem hohen Niveau kann ROS gefährlich sein, biologische Bestandteile, die notwendig für die Zellfunktion durch oxidativen Stress6zu beschädigen. Allerdings in geringen Mengen erfüllen mitochondrialen ROS Signalisierung Vitalfunktionen. Zum Beispiel hat H2O2 -Version von Mitochondrien verwickelt, bei der Kontrolle der T-Zellaktivierung, Stress-Signalisierung (z.B. Induktion von Nrf2 Signalwege), die Induktion der Zell-Proliferation und Differenzierung, Insulin-Signal und Freigabe und Fütterung Verhalten7. Erhebliche Fortschritte im Verständnis der Signalisierung Funktion von ROS. Jedoch wichtige Fragen bleiben in Bezug auf die Enzyme in den Mitochondrien als die wichtigsten Quellen und dienen wie Produktion gesteuert wird.
ROS-Freigabe durch einen Aufstellungsort der Produktion hängt von mehreren Faktoren ab: (1) die Konzentration der Elektronen zu Spenden vor Ort, (2) die Redox-Status der Elektron Spenden Site, (3) Zugang zu Sauerstoff, und (4) die Konzentration und Art der Oxidation Substrat3, 8 , 9. in den Mitochondrien, andere Faktoren wie die Konzentration von NADH und Membran mögliche Stärke beeinflussen auch ROS Produktion8,10. Zum Beispiel erhöht die Rate der O2●-/ h2O2 Produktion von gereinigtem PDHC oder KGDHC mit zunehmender NADH Verfügbarkeit5,11. In diesem Szenario sind Elektronen von NADH zu FAD-Center in der E-3 -Untereinheit des PDHC oder KGDHC, der Website für O2● // h2O2 Produktion12rückwärts fließt. In ähnlicher Weise hat die Bereitstellung von NAD+ den gegenteiligen Effekt, abnehmender ROS Release von KGDHC12. So kann steuernde Eingang oder den Ausgang der Elektronen von ROS Produktionsstätten verändern wie viel O2●-/ h2O2 gebildet wird. Zum Beispiel blockiert der E-2 -Untereinheit PDHC oder KGDHC mit CPI-613, ein Liponsäure analog, Ergebnisse in fast 90 % O2●-/ h2O2 Produktion13verringern. Ähnliche Ergebnisse können mit chemischen S-Glutathionylation Katalysatoren, Diamide und Disulfiram, O2●-/ h2O2 Produktion von PDHC oder KGDHC über die Konjugation von Glutathion nach E fast abschaffen 2 -Untereinheit14. Der Nachteil für die Sperrung der Elektronenfluss durch die E-2 -Untereinheit des PDHC und KGDHC ist eine Abnahme der NADH-Produktion die ROS-Bildung durch den Elektronentransport-Kette (z.B.komplexe III) vermindert. Dies kann auch ATP Ausgabe durch den Elektronentransport-Kette verringern. Insgesamt kann blockieren Elektron Eintritt in ROS Produktionsstätten ein hochwirksames Mittel zur Produktionskontrolle O2●-/ h2O2 sein.
Mitochondrien können bis zu 12 mögliche O2●-/ h2O2 Quellen6enthalten. Die meisten dieser Seiten sind Flavin-haltige Enzyme, die eine Mischung aus O2●- und H2O2zu generieren. Verwendung von verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen konnten für die Identifizierung von denen Atemwege komplexe und mitochondriale Dehydrogenases dienen alshoher Kapazität O2●-/ h2O2 Standorte in Bildung verschiedenen Geweben3. PDHC und KGDHC haben gezeigt, als hoher Kapazität O2●-/ h2O2 emittierenden Websites in Muskeln und Leber Mitochondrien13,15dienen. Jedoch bleiben einige Schwierigkeiten in Bezug auf die Prüfung der O2●-/ h2O2 bilden einzelner Websites in Mitochondrien und die Auswirkungen, die verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen auf potenzielle die Aktivitäten der Enzyme. Dies ist aufgrund des Vorhandenseins von unerwünschten Nebenreaktionen (z.B. Bildung von O2●-/ h2O2 von Websites außer das Enzym von Interesse), verunreinigen endogenen Nährstoffe (z. B.Fettsäuren Säuren) oder Organellen (z. B., Peroxisomen bilden auch O2●-/ h2O2), und Gebrauch von Inhibitoren, die Selektivität fehlt und/oder Nutzung von Verbindungen, die nicht vollständig ROS Produktion hemmen. Bestimmte Inhibitoren können auch verändern die mitochondriale Bioenergetik und Richtung der Elektronenfluss, und dies ändert ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion und verwirrt Ergebnisse. Absolute Preise für O2●-/ h2O2 -Version von einzelnen Standorten in den Mitochondrien sind auch schwer zu quantifizieren, aufgrund der hohen Konzentration von O2●- und H2O2 Beseitigung von Enzymen in der Matrix und Intermembrane Raum. Beseitigung konkurrierende Reaktionen, die mit O2●-/ h2O2 Release Messungen stören können kann daher sinnvoll sein, beim Identifizieren von hoher Kapazität O2●-/ h2O 2 Seiten bilden.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, die für die gleichzeitige Prüfung der O2●-/ h2O2 Produktions- und NADH Bildung von gereinigten Flavin-abhängige Dehydrogenases ermöglicht. Durch die Verwendung gereinigter Enzyme, können unerwünschte Nebenreaktionen bilden ROS und ROS entwürdigende Enzyme ermöglicht ein genaueres Maß der nativen O2●-/ h2O2 Produktionsraten für individuelle Flavoenzymes eliminiert. Diese Methode kann verwendet werden, die O2●-/ h2O2 bilden Kapazität der verschiedenen gereinigte Dehydrogenases oder Bildschirm potenzielle ortsspezifische Inhibitoren für O2●-/ h2O direkt vergleichen 2 -Version. Schließlich können gleichzeitige Messung von O2●-/ h2O2 und NADH Produktion für eine Echtzeit-Bewertung des Verhältnisses zwischen Enzymaktivität und ROS Freisetzung Kapazität.
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Protocol
(1) Chemikalien und gereinigten Enzyme
- Die folgenden Materialien beziehen: PDHC und KGDHC der Schweine Herz Herkunft (oder eine andere gereinigte mitochondriale Flavoenzyme); H2O2 (30 % ige Lösung), Pyruvat, α-Ketoglutarate NAD+, NADH, CoASH, Thiamin-Pyrophosphat (TPP), Mannit, HEPES, Saccharose, EGTA, 3-Methyl-2-Oxo-Valeric-Säure (KMV), Superoxid-Dismutase (SOD), Meerrettich-Peroxidase (HRP), 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine Reagenz (AUR), und CPI-613.
2. Planung der Probe und Reagenz Vorbereitung
- Richten Sie die Probe gemäß Tabelle 1 in eine 96-Well-Platte.
Hinweis: Das Gesamtvolumen für jede Reaktion ist 200 µL. Lager-Konzentrationen sind so eingestellt, dass 20 µL des Reagenz hinzugefügt wird in jede Vertiefung. Dies sorgt für schnelle Zugabe von Cofaktoren und Substrate zu jeder Reaktion gut vor Beginn des Tests. - Bereiten Sie Reaktion Puffer mit 220 mM Mannit, 70 mM Saccharose, EGTA 1 mM und 20 mM HEPES (pH 7.4 mit HCl).
Hinweis: Dies könnte abhängig von den physikalischen Eigenschaften der verschiedenen gereinigten Enzyme ändern. - Untersuchen Sie die gereinigten KGDHC oder PDHC für Kontamination mit Enzym-Aktivität Assays14,16,17 oder Immunoblot oder Coomassie Fleck5.
- Bereiten Sie alle Reagenzien im Puffer Reaktion nach der Arbeit Lösungskonzentrationen in Tabelle 1.
- Speichern Sie alle Reagenzien als 1 mL Aliquote bei-20 ° C. Speichern Sie Pyruvat und α-Ketoglutarate bei-80 ° C in 100 µL Aliquots, spontane Degradation durch Auto-Oxidation und wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu verhindern.
- Bereiten Sie das AUR-Reagenz Meister Lager in 1 mL DMSO und dann bis 100 µM in Reaktion Puffer verdünnen. Vor Licht geschützt lagern.
Hinweis: Hier ist die 100 µM Arbeitslösung aus frisch alle 2 bis 3 Wochen und vor Licht geschützt werden.
3. Einrichten der Assay-Vorlage
- Richten Sie das Testverfahren auf eine monochromatische Mikrotestplatte Leser mit dual Messmöglichkeiten.
- Definieren Sie die Lesung durch Auswahl von "Protokoll". Klicken Sie dann auf "Verfahren".
- Stellen Sie "Temperatur" auf 25 ° C (Abb. 1A).
- Klicken Sie auf "Kinetische starten", um lesen Sie Bedingungen (Abbildung 1A). Legen Sie die Zeit und lesen Sie Intervalle/Experimente.
- Klicken Sie auf "lesen" (Abbildung 1 b).
Hinweis: Proben werden gelesen von Spitzenposition mit einem Gewinn von 50. Zeit: 5 min, 30-s Abständen zu lesen. Kanal 1: Resorufin Fluoreszenz - Anregung/Emission = 565 Nm:600 nm Wellenlänge Breite von 13,5 nm. Kanal 2: NADH Autofluoreszenz - Erregung/Emission = 376 Nm:450 nm Wellenlänge Breite von 20 nm. - Wählen Sie unter "READ" Brunnen zu überwachen (z.B.A1-A4 und B1-B4).
- Wählen Sie "Ende kinetische".
4. Standardkurven
- Die Reagenzien Auftauen und speichern auf Eis, bis benötigt.
-
NADH Standardkurve (Abbildung 2A)
- Bereiten Sie die funktionierende Lösungen für NADH im Konzentrationsbereich von 0,5-10 mM in Reaktion Puffer.
- Fügen Sie 20 µL-Aliquots von jedem NADH Lösungskonzentration in Vertiefungen mit 180 µL Reaktion Puffer arbeiten. Die Endkonzentration von NADH in jedem gut ist 0,05-1 mM.
- Klicken Sie auf "Lesen" und Erregung/Emission = 376 Nm:450 nm Wellenlänge Breite von 20 nm.
Hinweis: Dies ist ein Endpunkt nur-Lese - kinetische Parameter sind nicht erforderlich.
-
AUR Standardkurve (Abb. 2 b)
- Bereiten Sie die Arbeiten Bestände von Wasserstoffperoxid in Reaktion Puffer; Lager-Konzentrationen reichen von 200-4.000 nM.
- Jedes gut 120 µL des Puffers Reaktion hinzufügen.
- Fügen Sie 20 µL HRP (arbeiten Lager Konzentration = 30 U/mL, Endkonzentration im Brunnen = 3 U/mL), 20 µL der SOD (arbeiten Lager Konzentration = 250 U/mL, Endkonzentration im Brunnen = 25 U/mL), und 20 µL AUR (arbeiten Lager Konzentration = 100 µM Endkonzentration im Brunnen = 10 µM) auf jeder gut mit Reaktion-Puffer.
- Fügen Sie 20 µL jeder H2O2 arbeiten Vorratslösung zu jeweils gut Puffer und Assay Reagenzien. Das endgültige Reaktionsvolumen ist 200 µL und die Endkonzentration von H2O2 in jede Vertiefung 20-400 nM.
- Inkubieren Sie die Platten für 1 min in der Platte Leser bei 25 ° c
- Klicken Sie auf "Lesen" und Erregung/Emission = 565 nm/600 nm Wellenlänge Breite von 13,5 nm. Beachten Sie, dass dies ein Endpunkt nur-Lese - kinetische Parameter nicht erforderlich sind.
5. Messung von O2●- / h2 O2 Release und NADH-Herstellung von KGDHC und PDHC
- Siehe Tabelle 1 für die Reihenfolge der Zugabe von verschiedenen Reagenzien, die Konzentration von jedem Arbeitslösung und die Lautstärke der einzelnen hinzugefügt gut.
- Jedes gut 40 µL Puffer Reaktion hinzufügen. Fügen Sie für Assays mit KMV oder CPI-613 20 µL Puffer in jede Vertiefung.
- Fügen Sie 20 µL PDHC oder KGDHC (arbeiten Lager von 1 U/mL, Endkonzentration pro Bohrloch = 0,1 U/mL) in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie PDHC und KGDHC bei 25 ° C für 2 min.
- Fügen Sie 20 µL des KMV (arbeiten Lager = 100 mM, Endkonzentration = 10 mM) oder 20 µL der CPI-613 (arbeiten Lager Konzentration = 1,5 mM, Endkonzentration = 150 µM) (Tabelle 2).
Hinweis: Dieser Schritt kann ausgeschlossen werden, wenn nicht die Assays Inhibitoren eingesetzt werden. - 1 min bei 25 ° c inkubieren
Hinweis: Dieser Schritt kann ausgeschlossen werden, wenn nicht die Assays Inhibitoren eingesetzt werden. - Fügen Sie 20 µL HRP (arbeiten Lager Konzentration = 30 Einheiten/mL, Endkonzentration im Brunnen = 3 Einheiten/mL) und 20 µL der SOD (arbeiten Lager Konzentration = 250 Einheiten/mL, Endkonzentration im Brunnen = 25 Einheiten/mL) in jede Vertiefung.
- Fügen Sie 20 µL des Coenzym A (arbeiten Lager Konzentration = 1 mM Endkonzentration = 0,1 mM), 20 µL TPP (arbeiten Lager Konzentration = 3 mM, Endkonzentration = 0,3 mM), und 20 µL NAD+ (arbeiten Lager Konzentration = 10 mM, Endkonzentration = 1 mM) zu jedem w Ell.
- AUR-Reagenz vom schützenden Alufolie abdecken und fügen Sie 20 µL in jede Vertiefung.
- Fügen Sie 20 µL Pyruvat (Lager Konzentration reicht von 1-100 mM, Endkonzentration für Assays arbeiten = 0,1-10 mM), Brunnen, PDHC und α-Ketoglutarate enthält (arbeiten Lager Konzentration reicht von 1-100 mM, Endkonzentration für Assays = 0,1-10 mM), Brunnen mit KGDHC.
- Klicken Sie auf "Lesen" um kinetische Messung zu starten.
(6) Datenanalyse
- Halten Sie die "Strg" Taste auf der Tastatur gedrückt und klicken Sie auf Brunnen um ein Diagramm enthält alle kinetische Messungen entsprechend Kanal 1 (Abbildung 3A) zu generieren.
- Klicken Sie auf "Daten" in das Symbol "anzeigen" in der oberen rechten Ecke für Rohwerte für relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) zu den verschiedenen Zeitpunkten (Abb. 3 b) gemessen.
- Exportieren Sie die Werte für die Analyse (Tabelle 3).
- Klicken Sie "Graph" Dropdown-Menü oben rechts (Abb. 3 b) für RFU Werte der Fluoreszenz-Kanal 2 zugeordnet.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3 für Kanal 2.
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Representative Results
Abbildung 3A bietet eine repräsentative Spur für das RFU während der gleichzeitigen Messung von H2O2 und NADH Produktion von gereinigten KGDHC gesammelt. Die RFU-Rohdaten für jedes Zeitintervall ist in Abbildung 3 bdargestellt. Die RFU Rohdaten werden dann zur Analyse exportiert. Durch Extrapolation aus standard Kurven in Abbildung 2dargestellt, kann die absolute Menge an NADH und H2O2 im 5-Minuten-Zeitraum an jedem Messintervall gebildet ermittelt werden. Ein Beispiel für diese Berechnung ist in Tabelle 3angegeben. Sobald der Betrag von NADH und H2O2 gebildet durch KGDHC oder PDHC in unterschiedlichen Abständen festgestellt wurde, Werte werden kopiert und in einer Grafik/Statistik-Software zur weiteren Analyse eingegeben. Mit XY-Diagramm-Typ-Analyse, kann die Menge an NADH (µmol) und H2O2 (Pmol) durch KGDHC oder PDHC gebildet als Funktion der Zeit (Abb. 4A) geplottet werden. Mithilfe dieser Werte kann die Rate der NADH und H2O2 Formation während Substrat Oxidation auch berechnet werden. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, zeigen KGDHC und PDHC unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf NADH und H2O2 Fähigkeiten bilden.
Einmal wurde festgestellt, dass KGDHC und PDHC enzymatisch aktiv sind und NADH und H2O2 Bildung gleichzeitig verfolgt werden kann, ROS Eigenschaften lassen und Enzym-Aktivitäten gemessen werden. Wir entschieden uns für KGDHC und PDHC zu vergleichen, denn sie hochgradig homologen in Grundstruktur sind und zu hoher Kapazität Sites für ROS Produktion5dokumentiert wurden. Abbildung 5 und Abbildung 6 zeigen die Abhängigkeit der NADH und H2O2 Produktion auf Substratkonzentration. PDHC ist leicht gesättigt durch geringe Mengen an Substrat mit der Rate von NADH und H2O2 Produktion erreicht ihr Maximum bei 0,1-0,5 mM Pyruvat. KGDHC, auf der anderen Seite zeigt schrittweise erhöht in NADH und H2O2 Produktion mit zunehmendem α-Ketoglutarate (Abbildung 5). Dies zeigt, dass KGDHC und PDHC, obwohl hochgradig homologen in Grundstruktur, haben unterschiedliche kinetische Eigenschaften in Bezug auf, wie viel Substrat erforderlich ist, um maximale ROS Freisetzung zu induzieren. Abbildung 5 zeigt auch, dass H2O2 -Version von KGDHC stark mit NADH Produktions- und Substrat Verfügbarkeit korreliert. PDHC andererseits muss nicht die gleichen kinetischen Eigenschaften. KGDHC und PDHC unterscheiden sich auch durch NADH und O2●-/ h2O2 Kapazität zu bilden, wenn NAD+ Konzentration variiert wird (Abbildung 6).
Durch die Nutzung der gleichzeitigen Messung von NADH und H2O2können potenzielle ortsspezifische Inhibitoren für ROS-Produktion gezeigt. Dies kann helfen, die Höhe der Inhibitor zu bestimmen, die maximale Hemmung der H2O2 Freigabe auslösen muss. Darüber hinaus kann durch NADH Produktion zur gleichen Zeit messen, die Website für Inhibitor Aktion sowie die Quelle der ROS identifiziert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die α-Ketoglutarate Analog, KMV, sehr effektiv bei der Hemmung der ROS-Freisetzung aus KGDHC (≥ 90 % Inhibition)13,15. Wir zeigten auch, dass CPI-613, Liponsäure analog, die Dihydrolipoamide von der E-2 -Untereinheit des PDHC und KGDHC, blockiert auch ROS Freisetzung aus entweder Komplex von hemmen kann ~ 90 %13,14. Der Ort des Geschehens für KMV und CPI-613 sind in Abbildung 7dargestellt. CPI-613 ist ein Molekül mit Schwefel und es wird daher empfohlen, dass Thiol-reiche Reduktionsmittel (Dithiothreitol; DVB-t) oder Proteine (Albumin) entfallen ab dem Verfahren13. Abbildung 7 zeigt, dass KMV und CPI-613 beide sehr effektiv waren bei der NADH und H2O2 durch KGDHC zu begrenzen. CPI-613 abgeschafft ebenso komplett H2O2 -Version von PDHC (Abbildung 7). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass KMV und CPI-613 hochwirksame Inhibitoren für H2O2 -Version sind und somit auf Experimente mit isolierten Mitochondrien angewendet werden kann. Eine solche Leinwand wäre sehr nützlich für andere mögliche Bildung von ROS Enzyme, da es eine direkte Bewertung der Wirksamkeit und Selektivität von verschiedenen Inhibitoren auf gereinigten Flavin-haltigen Dehydrogenases ermöglicht. Die gleichzeitige Messung von NADH hat auch den zusätzlichen Vorteil, so dass die vorläufige Identifizierung der potenzielle Quelle von ROS in ein Enzym Komplex. Abbildung 7 bietet eine Darstellung des katalytischen Mechanismus für KGDHC, die höchst homolog zu PDHC. Die Beobachtung, dass KMV und CPI-613, die E1 und E2 -Untereinheit des KGDHC blockieren, H2O2 und NADH Produktion fast vollständig abgeschafft bestätigt, dass der E-3 -Untereinheit, wahrscheinlich die FAD, die ROS-Quelle 18. CPI-613 übte eine ähnliche Wirkung auf PDHC bestätigt wird, dass die Prinzip-Website für H2O2 -Version der E-3 Untereinheit18ist. Ein ähnlicher Ansatz kann für andere Dehydrogenases verwendet werden. Dazu müssten die Identifizierung von Inhibitoren, die den Elektronenfluss durch verschiedene Teile von einem Enzymkomplex zu blockieren.
Abbildung 1 : Repräsentative Screenshots für Assay Setup. (A) Darstellung des Verfahrens für die kinetischen Messung von Veränderungen im NADH und Resorufin Fluoreszenz eingerichtet. (B) die Einrichtung der Fluoreszenz-Parameter für den Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Standardkurven für NADH und Resorufin Fluoreszenz. Kurven werden genutzt, um die Rate von NADH und O2●-/ h2O2 Produktion zu schätzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Repräsentative Spuren für die RFU Rohdaten gesammelt während der Assay. (A) Kurven für jedes gut, das während des Tests gelesen wurde. Platte Ansicht Kurven entstehen, wenn die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie auf jedes gut, das gelesen wird. (B) für den Datenexport, Daten unter Ansicht, eine Tabelle mit den repräsentativen RFU Werte generieren geklickt werden. Dann auf die Tabelle Export Schaltfläche klicken, um die rohe Ergebnisse exportieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Direkter Vergleich der H-2 O 2 und NADH bilden KGDHC und PDHC. (A) simultane Messung von H2O2 und NADH, die Bildung von KGDHC und PDHC. (B) Berechnung der Rate von H2O2 und NADH-Bildung von KGDHC und PDHC. NADH und ROS-Produktion durch beide Flavin-haltige Enzyme im direkter Vergleich zeigt, dass KGDHC produziert mehr H2O2 bezogen auf seine höhere enzymatische Kapazität. n = 4, bedeuten ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Gleichzeitige Messung von H 2 O 2 und NADH Preise von KGDHC und PDHC bilden verschiedene Substrat-Konzentrationen oxidierende. Änderungen in Fluoreszenz wurden gemessen, wie zuvor beschrieben, außer das letzte Substratkonzentration von 0 mM bis 10 mM variiert wurde. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Abhängigkeit von H2O2 -Version auf die kinetischen Eigenschaften von KGDHC und PDHC zu ermitteln. n = 4, bedeuten ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : KGDHC und PDHC zeigen auch verschiedene H2 O 2 und NADH Verformungseigenschaften bei NAD + Ebenen geändert. Änderungen in Fluoreszenz wurden gemessen, wie zuvor beschrieben, außer die Endkonzentration von NAD+ von 0 mM bis 1 mM variiert wurde. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Abhängigkeit von H2O2 -Version auf die kinetischen Eigenschaften von KGDHC und PDHC zu ermitteln. n = 4, bedeuten ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Screening von verschiedenen ortsspezifische Inhibitoren für NADH und H2 O 2 Produktion. (A) schematische Darstellung der katalytischen Zyklus für KGDHC und die Seiten für KMV und CPI-613. Beachten Sie, dass PDHC einen homologen katalytischen Zyklus hat, außer dass KMV nicht für die Pyruvat-Bindungsstelle zu konkurrieren. E1: Pyruvat oder α-Ketoglutarate Dehydrogenase, E2: Dihydrolipoamide Acyltransferase, E3: Dihydrolipoamide Dehydrogenase. (B) Auswirkungen der KMV und CPI-613 auf NADH und H2O2 Produktion von KGDHC und PDHC. Proben wurden im KMV (10 mM) oder CPI-613 preincubated (150 µM) und dann für die NADH und H2O2 untersucht. n = 4, bedeuten ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Reagenz | Arbeiten Lager Konzentration | Hinzu kommt nun Volumen | Endkonzentration in Brunnen |
| KGDHC oder PDHC | 1 Einheit/mL | 20 ΜL | 0.1 Einheiten/mL |
| Superoxid-dismutase | 250 Einheiten/mL | 20 ΜL | 25 Einheiten/mL |
| Meerrettich-peroxidase | 30 Einheiten/mL | 20 ΜL | 3 Einheiten/mL |
| Thiamin-Pyrophosphat | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzym A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0,1-10 mM |
Tabelle 1: Beispiel eines einfachen Protokolls eingerichtet zur Messung des O 2 ●– / H 2 O 2 und NADH Produktion von gereinigtem PDH oder KGDH. Da jede Vertiefung und das Finale 20 µL jedes Reagenz hinzugefügt Lautstärke/Reaktion 200 µL, die Endkonzentration jedes Reagenz ist 10-mal weniger als die Lager Konzentration (z. B.die Endkonzentration von NAD+ im Reaktionsgemisch ist 1 mM ). Beachten Sie, dass die Reagenzien, die auch in der Reihenfolge in der Tabelle hinzugefügt werden soll.
| Inhibitor | Ziel |
| 3-Methyl-2-Oxo-Valeric-Säure | E1-Untereinheit des KGDHC |
| CPI-613 | E2 Untereinheit der Oxo-Säure-dehydrogenases |
Tabelle 2: Liste der Inhibitoren und ihre Ziele. Websites der Aktion sind auch in Abbildung 8dargestellt.
| NADH Autofluoreszenz | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Zeit | T ° 376.450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin Fluoreszenz | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Zeit | T ° 565.600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 Uhr | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabelle 3: Tabellen-Ansicht der Ergebnisse aus der Reihe von Experimenten gesammelt. RFU Rohwerte generiert aus dem Experiment werden in einer Tabelle für weitere Analysen exportiert. Standardkurven vor Experimenten generiert kann, die Produktionsrate NADH und H2O2 in der Tabelle berechnet werden.
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Discussion
Dieses Protokoll ist vorteilhaft da, (1) Es beseitigt alle konkurrierenden Reaktionen, die sonst mit H2O2 Nachweis (z.B., Antioxidans oder anderen Quellen von ROS), 2 stören können) bietet eine direkte Bewertung der einheimischen Rate ROS zu lösen, indem eine Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenase, 3) erlaubt den Vergleich der einheimischen ROS veröffentlichen Preise von zwei oder mehr gereinigt Flavin-basierte Dehydrogenases, 4) ermöglichen einen direkten Vergleich der Rate der ROS-Release und Enzym-Aktivität und 5) Screening von selektiven wettbewerbsfähigen Inhibitoren für ROS Release ermöglicht. Unsere Fraktion und andere verwendet haben diese Methode in früheren Publikationen um zu prüfen, die Regulierung der ROS durch allosterische und Redox signaling Mechanismen vor Durchführung experimentiert mit Mitochondrien oder permeabilized Muskel14,16, 17,19,20.
Modifikationen und Fehlerbehebung:
Dieses Verfahren nutzt an fast jede Institution Grundausstattung zur Verfügung. Der Ansatz ist auch low-cost und nutzt gebräuchlichen Chemikalien über verschiedenen Lieferanten erhältlich. Die Puffer-Zusammensetzung variieren je nach Enzym Eigenschaften - obwohl wir festgestellt haben, dass ein grundlegende Reaktion Puffer bestehend aus Saccharose, HEPES, Mannit und EGTA in den meisten Anwendungen gut funktioniert. Rohwerte für Resorufin Fluoreszenz sind in der Regel rund 50-500 RFU für ein ROS Freigabe Enzym bis 0,1 U/mL verdünnt. Höheren RFU Werte können darauf hinweisen, dass das AUR Reagenz Auto oxidiert durch Einwirkung von Licht oder wiederholte Frost-Tau-Wechseln wurde. Daher sollte AUR Gebrauchslösungen routinemäßig alle 2 bis 3 Wochen (abhängig von der Häufigkeit der Nutzung) ersetzt werden. Verunreinigungen in das Enzympräparat oder Denaturierung können um zu niedriger als normale ROS und NADH Werte führen. Reinheit des Enzyms sollten routinemäßig durch Gelelektrophorese überwacht werden. Kinetische Eigenschaften (Km und Vmax für Substrat und NAD+) sollte auch sofort nach Kauf oder Reinigung eines Enzyms bewertet und dann routinemäßig überwacht danach. Die meisten der im Test verwendeten Reagenzien sind stabil und können mehrere Gefrier-Tau-Zyklen unterworfen werden. Pyruvat und α-Ketoglutarate Lagern in Aliquote von 100 µL bei-80 ° C, Auto-Oxidation zu vermeiden. Vermeiden Sie die Verwendung von Reduktionsmitteln wie DVB-t, da es O2●-/ h2O2 direkt durch Radikalbildung in PDHC und KGDHC (und möglicherweise andere Flavoenzymes)17bildet. Assays können bei 37 ° C durchgeführt werden; Allerdings hat unsere Fraktion festgestellt, dass diese Experimente bei 25 ° C ideal ist für die Bereitstellung konsistenter Daten.
Grenzen der Technik:
Eine große Hürde, die verbunden sind mit dieser Technik ist Zugriff auf gereinigten Flavin-haltigen mitochondrialen Enzyme. Hier verwendeten wir handelsübliche KGDHC und PDHC nachweisen können, dass diese Technik verwendet werden kann, die ROS Freisetzung Kapazität und Enzym Aktivität der Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases direkt zu vergleichen. Jedoch die meisten ROS Herstellung Flavin-haltige Enzyme sind nicht im Handel erhältlich und muss im Labor gereinigt werden. Dies kann schwierig sein, einige dieser Enzyme erwägen Membran gebunden oder zu absorbieren, die innere Mitochondrien-Membran. Neue Protokolle für die erfolgreiche Reinigung der Membrane-springen Flavin-haltige Enzyme, die ROS zu produzieren sind jetzt verfügbar. Dazu gehören Reinigungsverfahren für komplexe I, komplexe II und sn-Glycerin-3-Phosphat Dehydrogenase21,22,23. Daher, obwohl die meisten der aufgeführten ROS Generatoren möglicherweise nicht im Handel erhältlich, gibt es Protokolle für ihre Isolierung und Reinigung. Die physiologischen Relevanz der Ergebnisse gesammelt, mit Hilfe von gereinigten Flavin-basierte Enzymen ist auch eine Einschränkung. Daher sollten Erkenntnisse gesammelt mit gereinigtem Enzyme mit Assays mit isolierten Mitochondrien oder permeabilized Gewebe weiterverfolgt werden. Fünf separate Studien verwendet diesen Ansatz, um Mechanismen zur Regulierung der ROS Freisetzung von KGDHC und PDHC14,16,17,19,20zu untersuchen. Vorläufige Ergebnisse für die Rolle des Redox-Schalter bei der Kontrolle der ROS-Release wurden zunächst mit gereinigtem KGDHC und PDHC getestet, und dann wurden Mechanismen zur Regulierung weiter in Leber und kardialen Mitochondrien und Muskelfaser14analysiert, 16,17,20.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:
Messen ROS kann Freigabe von einzelnen Standorten der Produktion in den Mitochondrien durch das Vorhandensein von konkurrierenden Nebenreaktionen anspruchsvoll sein, die auch O2●/h2O2 und antioxidativen Systeme erzeugen, die sonst zu führen kann die Unterschätzung der native Preise. Das Membranpotential verändern auch ROS Freisetzungsraten von verschiedenen Seiten und der Einsatz von Inhibitoren kann der Elektronenfluss, verwirrende O2●-/ h2O2 Bildung Messungen ändern. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die direkte Auswertung der ROS Version macht aus einzelnen Enzymen bei der Begutachtung gleichzeitig der Beziehung zwischen einheimischen Raten von O2●-/ h2O2 und Enzym-Aktivität. Diese kostengünstige Methode kann als ein Werkzeug für den Vergleich der nativen ROS Freisetzungsraten für einzelne Flavin-haltigen mitochondrialen Enzyme vor komplexere Experimente mit Mitochondrien, Zellen oder Gewebe dienen. Darüber hinaus kann die hier vorgestellte Methode genutzt werden, um die Wirksamkeit und Selektivität von Inhibitoren für ROS Release vor der Durchführung von Assays mit isolierten Mitochondrien vor dem Bildschirm.
Zukünftige Anwendungen:
Die hier vorgestellte Methode wurde in fünf separaten Studien zur Untersuchung von Kontrolle über ROS Freisetzung von PDHC und KGDHC14,16,17,19,20eingesetzt. In diesen Studien Inhibitoren liefen und ROS freizugeben und NADH produziert Preise wurden anhand gereinigten Enzyme. Mit den gereinigten Enzymen gesammelten Ergebnisse wurden dann verifiziert mit isolierten Mitochondrien und permeabilized Muskelfasern14,16,17,20. Daher kann dieses Verfahren zu einer Reihe von zukünftigen Studien, die darauf abzielen, native ROS Freisetzungsraten von Mitochondrien und Zellen Muskelfasern zu studieren.
Wichtige Schritte im Protokoll:
Enzym-Reinheit und seine kinetischen Eigenschaften sollten regelmäßig überwacht werden. Die AUR arbeiten Lager Reagenz sollte auch häufig ersetzt werden. Dadurch wird sichergestellt, gesammelten Ergebnisse konsistent sind. Die Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien ist entscheidend für ein gelungenes Experiment (Tabelle 1) ausgeführt. Inhibitoren sollten titriert werden, um festzustellen, die Konzentration erforderlich, um maximale Hemmung der Freisetzung von ROS zu entlocken. In dieser Studie, wir entschieden uns für 10 mM KMV und 150 µM CPI-613, da wir zuvor festgestellt hatte, dass diese Konzentrationen maximale Hemmung der ROS Freisetzung von KGDHC und PDHC13 induzieren.
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Disclosures
Es gibt nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) finanziert. Video-Produktion erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Innovation in Lehre und lernen (CITL) an der Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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