Summary
המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.
Abstract
בעבר דווח כי המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 מקורות אנזימטי של מינים חמצן תגובתי (ROS). רוב האתרים הללו כוללים מתחמי הנשימה פלווין תלוית dehydrogenases המייצרים תערובת של סופראוקסיד (O2● -) מי חמצן (H2O2). כימות מדויק של הפוטנציאל לייצור ROS אתרים בודדים המיטוכונדריה מבודד יכול להיות מאתגר בשל נוכחותם של מערכות הגנה נוגדת החמצון ותגובות בצד כי גם טופס O2●/H2O2. השימוש מעכבי ספציפי יכול לשבש ביואנרגיה מיטוכונדריאלי גם להתפשר מדידות על ידי שינוי ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשקילת סימולטני H2O2 שחרור וייצור nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH) על ידי dehydrogenases מקושר פלווין מטוהרים. לענייננו כאן, השתמשנו מטוהרים פירובט דהידרוגנאז קומפלקס (PDHC) וα-ketoglutarate דהידרוגנאז מורכבים (KGDHC) ממוצא הלב חזירי כדוגמאות. שיטה זו מאפשר מדד מדויק של יליד H2O2 שחרור המחירים על ידי אתרים בודדים של הייצור על ידי ביטול מקורות פוטנציאליים אחרים של ROS ומערכות נוגד חמצון. בנוסף, שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה של היחסים בין H2O2 שחרור, פעילות אנזים, ההקרנה של יעילות, סלקטיביות של מעכבי לייצור ROS. באופן כללי, גישה זו תוכל לאפשר להערכה מעמיק של שיעורי מקורית של ROS שחרור עבור אנזימים בודדים לפני ביצוע ניסויים מתוחכמים יותר עם המיטוכונדריה מבודד או סיבי השריר permeabilized.
Introduction
המטרה הסופית של חילוף החומרים התזונתיים היא להפוך אדנוזין טריפוספט (ATP). בתרבית של תאים, הדבר מתרחש בתוך המיטוכונדריה, organelles כפול-membraned להמיר את האנרגיה המאוחסן הפחמן לתוך ATP. הייצור של ATP מתחילה כאשר פחמן התלקחות על ידי המיטוכונדריה ויוצרים שתי נושאות אלקטרון, NADH ו פלווין אדנין dinucleotide (FADH2)1. NADH ו FADH2 הם ואז תחמוצת על-ידי יחידת משנה רב מתחמי הנשימה I ו- II, בהתאמה, האלקטרונים המשוחרר הם שנהגים של אלקטרון מסוף מקבל חמצן מולקולרי (O2)-IV מורכבים1. למה חיובית ". בירידה" העברת אלקטרונים O2 בסוף השרשרת הוא מצמידים הייצוא של הפרוטונים לתוך intermembrane החלל על ידי קומפלקסים, השלישי, הרביעי. זה יוצר הדרגתי אלקטרוכימי transmembrane של פרוטונים (הכוח המניע-פרוטון), צורה זמני של אנרגיה חופשית של גיבס כי הוא טפח מאת V מורכבים להרוויח ATP2. תגובות העברת אלקטרונים המיטוכונדריה הם לא לגמרי ביחד לייצור ATP. בנקודות שונות של מעגל קרבס, שרשרת הנשימה, האלקטרונים יכולים בטרם עת לקיים אינטראקציה עם O2 לטופס ROS3. האבחון הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית שנוצר על ידי המיטוכונדריה הם2O● - ו H2O2. למרות2O● - נחשב לעתים קרובות את האבחון proximal הנוצרת על-ידי המיטוכונדריה, זה עכשיו ברור כי אתרי ייצור טופס תערובת של2O● - ו H2O2, אשר מזוהה עם חופשי כימיה הרדיקלית של תותבת פלווין מקבץ4,5. ברמה גבוהה, ROS יכול להיות מסוכן, גרימת נזק ביולוגי המרכיבים הדרושים לתפקוד התא וכתוצאה מכך מצוקה חמצוני6. אולם, ב כמויות נמוכות, ROS מיטוכונדריאלי למלא תפקידים חיוניים איתות. למשל, H2O2 שחרור המיטוכונדריה היה מעורב השליטה הפעלה T-cell, מתח איתות (למשל, אינדוקציה של Nrf2 איתות המסלולים), את תנאי הגיוס של התפשטות תא ובידול, אינסולין איתות שחרור ו האכלה התנהגות7. התקדמות ניכרת נעשתה בהבנת הפונקציה איתות של ROS. עם זאת, חשוב שאלות נותרו עדיין לגבי אשר אנזימים בתוך המיטוכונדריה לשמש המקורות החשובים ביותר ונשלט איך הייצור.
ROS שחרורו על ידי אתר הייצור תלוי במספר גורמים: 1) את הריכוז של אלקטרון תרומת באתר, 2) מצב חמצון-חיזור של אתר תורם אלקטרון, 3) גישה חמצן, ו 4) ריכוז וסוג של חמצון המצע3, 8 , 9. בתוך המיטוכונדריה, גורמים אחרים כמו הריכוז של NADH וכוח פוטנציאל ממברנה משפיע גם ROS הייצור8,10. לדוגמה, הקצב של O2●/H2O2 ייצור מטוהרים PDHC או KGDHC עולה עם הגדלת NADH זמינות5,11. בתרחיש זה, האלקטרונים זורמים לאחור מ- NADH אל מרכז אופנה יחידת משנה3 E של PDHC או KGDHC, דרך האתר O2● /H2O2 הפקה-12. באופן דומה, הפרשה של NAD+ יש השפעה הפוכה, הפחתת שחרור ROS KGDHC12. לפיכך, השליטה כניסה או יציאה של אלקטרונים מאתרי הייצור ROS יכול לשנות כמה O2●/H2O2 נוצר. למשל, חוסם את E2 יחידת משנה של PDHC או KGDHC עם מדד המחירים לצרכן-613, חומצה ליפואית אנלוגי, תוצאות כמעט 90% הדירי O2●/H2O-2 -הייצור-13. ניתן להשיג תוצאות דומות עם הכימי S-glutathionylation זרזים, diamide disulfiram, אשר כמעט לבטל את O2●/H2O2 ייצור PDHC או KGDHC דרך הבניין של גלוטתיון אל ה-E 2 יחידה משנית14. החלופה לחסימת זרימת אלקטרונים דרך יחידת משנה2 E של PDHC, KGDHC היא ירידה בייצור NADH אשר פוחתת היווצרות ROS ולחוליגנים תחבורה אלקטרון (למשל, השלישי מורכב). זה יכול גם להקטין פלט ATP על ידי שרשרת האלקטרונים תחבורה. בסך הכל, החוסם את האלקטרונים הכניסה לאתרים של ROS הייצור יכול להיות אמצעי יעיל שליטה O2●/H2O2 ייצור.
המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 פוטנציאליים O2● /H2O2 מקורות-6. רוב האתרים הללו נמצאים פלווין המכילים אנזימים אשר יוצרים תערובת של2O● - ו H2O2. השימוש סובסטרט שונים ושילובים מעכב אפשרו לצורך זיהוי אשר מכלולי מערכת הנשימה, dehydrogenases מיטוכונדריאלי לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 הקמת אתרים ברקמות שונות3. PDHC, KGDHC הוכחו לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 אתרים פולטות שריר, כבד המיטוכונדריה13,15. עם זאת, קשיים מסוימים יישארו לגבי הבדיקה של O2● -/H2O2 ויוצרים פוטנציאל של אתרים בודדים בתוך המיטוכונדריה ואת ההשפעה שיש סובסטרט שונים ושילובים מעכב על הפעילות של האנזימים. זאת בשל נוכחותם של תופעות לוואי בלתי רצויות (למשל, היווצרות O2●/H2O2 אתרים מלבד האנזים עניין), מזהם מזינים אנדוגני (למשל,שומן חומצות) או organelles (למשל, peroxisomes אשר גם טופס O2●/H2O2), השימוש מעכבי חסרי סלקטיביות, ו/או השימוש של תרכובות המעכבות לא לחלוטין ייצור ROS. מעכבי מסוימים עשויה גם לשנות את ביואנרגיה מיטוכונדריאלי והכיוון של זרימת אלקטרונים, זה משתנה ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור, מבלבל תוצאות. המחירים מוחלטת עבור O2●/H2O2 שחרור מאתרי בודדים בתוך המיטוכונדריה הם גם קשה לכמת בשל הריכוז הגבוה של2O● - ו H2O2 ביטול אנזימים בחלל מטריקס ו- intermembrane. לכן, חיסול של כל תגובות מתחרים יכולים להפריע O2● -/H2O2 שחרור מדידות יכולה להיות שימושית בעת זיהוי קיבולת גבוהה O2●/H2O2 יוצרי האתרים.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לבחינת סימולטני O2●/H2O2 ייצור ויצירת NADH מאת dehydrogenases תלויי-פלווין מטוהרים. באמצעות אנזימים מטוהרים, ROS להרכיב את ריאקציות צדדיות ולא ROS משפילים אנזימים רצוי ניתן לסלק המאפשר מדד מדויק יותר של יליד O2● -/H2O2 קצב ייצור עבור flavoenzymes בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות ישירות את O2●/H2O2 ויוצרים קיבולת שונה dehydrogenases מטוהרים או מעכבי בייעודי לאתר פוטנציאל מסך עבור O2●/H2O שחרור 2 . לבסוף, מדידת O2●/H2O2 וייצור NADH בו זמנית יכול לאפשר הערכה בזמן אמת של הקשר בין פעילות אנזים ROS שחרור קיבולת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כימיקלים ואנזימים מטוהרים
- להשיג את החומרים הבאים: PDHC ו- KGDHC של הלב חזירי מקור (או עוד flavoenzyme מיטוכונדריאלי מטוהרים); H2O2 (30% פתרון), פירובט, α-ketoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, תיאמין רב-תכליתי (TPP), מניטול, HEPES, סוכרוז, EGTA, 3-מתיל-2-אוקסו valeric חומצה (KMV), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), חזרת peroxidase (HRP), מגיב 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine (AUR), מדד המחירים לצרכן-613.
2. תכנון Assay והכנות ריאגנט
- להגדיר את הבדיקה על פי טבלה 1 בצלחת 96-ובכן.
הערה: הנפח הכולל עבור כל תגובה היא 200 מניות ריכוזי µL. מותאמים כך µL 20 של ריאגנט מתווסף ל מכל קידוח. פעולה זו מבטיחה תוספת מהירה של cofactors ותערובות גידול על כל תגובה טוב לפני הפעלת וזמינותו. - להכין את התגובה מאגר המכיל 220 מ מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 1 מ"מ EGTA, 20 מ מ HEPES (pH 7.4 עם HCl).
הערה: זה יכול להשתנות בהתאם המאפיינים הפיזיים של אנזימים שונים מטוהרים. - לבחון את KGDHC מטוהרים או PDHC עבור זיהום באמצעות אנזים פעילות מבחני14,16,17 או immunoblot או Coomassie כתם5.
- להכין את כל ריאגנטים במאגר התגובה לפי ריכוז פתרון עבודה בטבלה1.
- לאחסן כל ריאגנטים כמו aliquots 1 מ"ל ב-20 ° C. לאחסן פירובט וα-ketoglutarate ב-80 מעלות צלזיוס aliquots 100-µL כדי למנוע השפלה ספונטני עקב אוטומטי-חמצון, הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה.
- להכין הכימית AUR בסיס מניות של 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד, ואז לדלל 100 מיקרומטר במאגר התגובה. חנות מוגן מפני אור.
הערה: כאן, הפתרון עובד 100 מיקרומטר הוא כל 2-3 שבועות וחוף מוגן מפני אור.
3. הגדרת התבנית Assay
- להגדיר את ההליך assay על קורא microplate השחור-לבן עם יכולות מדידה כפול.
- הגדר את שגרת הקריאה על-ידי בחירה "פרוטוקול". לאחר מכן לחצו "נוהל".
- הגדר "טמפרטורה" 25 ° C (איור 1 א').
- לחץ על "התחל קינטי" כדי להגדיר תנאים קריאה (איור 1 א'). הגדר את הזמן ואת המספר של מרווחי זמן קריאה/ניסויים.
- לחץ על "קרא" (איור 1B).
הערה: דגימות הנקראות המיקום העליון עם רווח של 50. זמן: 5 דקות, קרא במרווחי זמן 30-s. ערוץ 1: Resorufin זריחה - עירור/פליטה = 565 nm:600 ננומטר, אורך גל רוחב 13.5 ננומטר. ערוץ 2: NADH autofluorescence - עירור/פליטה = 376 nm:450 ננומטר, אורך גל ברוחב של 20 ננומטר. - תחת "קריאה", בחר ולס לצג (למשל, A1-A4 ו- B1-B4).
- בחר "סיום קינטי".
4. תקן ' עקומות '
- להפשיר את ריאגנטים ולאחסן על הקרח עד שהוא נדרש.
-
NADH עיקול רגיל (איור 2 א)
- להכין את פתרונות העבודה NADH בטווח ריכוז של 0.5-10 מ"מ במאגר התגובה.
- הוסף 20 µL aliquots כל NADH עובד ריכוז פתרון בארות המכיל מאגר 180 של תגובה µL. הריכוז הסופי של NADH בכל אחד מהם הוא 0.05-1 מ מ.
- לחץ על "קרא" והגדר עירור/פליטה = 376 nm:450 ננומטר, אורך גל ברוחב של 20 ננומטר.
הערה: זהו נקודת קצה לקריאה בלבד - קינטי פרמטרים אינם נדרשים.
-
עיקול רגיל AUR (איור 2B)
- להכין את המניות עבודה של מימן על-חמצני במאגר התגובה; טווח הריכוזים מניות מ-4,000 200 ננומטר.
- להוסיף 120 µL של המאגר התגובה כל טוב.
- להוסיף 20 µL של HRP (עובד ריכוז מניות = 30 U/mL, הריכוז הסופי בבאר = 3 U/mL), 20 µL של SOD (עובד ריכוז מניות = 250 U/mL, הריכוז הסופי בבאר = 25 U/mL), ו- µL 20 של AUR (עובד ריכוז מניות = 100 מיקרומטר הריכוז הסופי בבאר = 10 מיקרומטר) למאגר טוב המכיל כל תגובה.
- הוסף 20 µL של כל2O H2 עובד פתרון מלאי כל טוב המכיל נוגדנים מאגר ואת וזמינותו. 200 µL שאמצעי האחסון התגובה האחרונה והוא הריכוז הסופי של H2O2 היטב כל 20-400 nM.
- דגירה הלוחות עבור 1 דקות בקורא צלחת ב 25 º C.
- לחץ על "קרא" והגדר עירור/פליטה = 565 nm/600 ננומטר, אורך גל רוחב 13.5 ננומטר. שימו לב כי זוהי נקודת קצה לקריאה בלבד - קינטי פרמטרים אינם נדרשים.
5. מדידת O2● /H2 O2 שחרור וייצור NADH KGDHC, PDHC
- ראה טבלה 1 עבור הסדר של תוספת של נוגדנים שונים, הריכוז של כל הפתרון עובד, ונפח הוסיף לכל טוב.
- להוסיף 40 µL התגובה מאגר כל טוב. עבור מבחני באמצעות KMV או מדד המחירים לצרכן-613, להוסיף 20 µL מאגר כל טוב.
- הוסף 20 µL של PDHC או KGDHC (מלאי עבודה של 1 U/mL, הריכוז הסופי לכל טוב = 0.1 U/mL) כדי מכל קידוח.
- דגירה PDHC ו- KGDHC ב- 25 ° C למשך 2 דקות.
- להוסיף 20 µL של KMV (מלאי עבודה = 100 מ מ, ריכוז סופי = 10 מ מ) או 20 µL של מדד המחירים לצרכן-613 (עובד ריכוז מניות = 1.5 מ מ, ריכוז סופי = 150 מיקרומטר) (טבלה 2).
הערה: שלב זה יכול להיות לא נכלל אם מעכבי שאינם בשימוש עבור מבחני. - תקופת דגירה של 1 דקות ב- 25 ° C.
הערה: שלב זה יכול להיות לא נכלל אם מעכבי שאינם בשימוש עבור מבחני. - להוסיף 20 µL של HRP (עובד ריכוז מניות = 30 יחידות/mL, הריכוז הסופי בבאר = 3 יחידות/mL) ו- µL 20 מקומות (עובד ריכוז מניות = 250 יחידות/mL, הריכוז הסופי בבאר = 25 יחידות/mL) כדי מכל קידוח.
- להוסיף 20 µL של קואנזים A (עובד ריכוז מניות = 1 מ"מ, הריכוז הסופי = 0.1 מ מ), 20 µL של TPP (עובד ריכוז מניות = 3 מ מ, הריכוז הסופי = 0.3 מ מ), ו- µL 20 של NAD+ (עובד ריכוז מניות = 10 מ"מ, הריכוז הסופי = 1 מ מ) על כל w פר.
- הסר הכימית AUR כיסוי מגן אלומיניום ולהוסיף 20 µL כל טוב.
- להוסיף 20 µL של פירובט (עובד ריכוז מניות הנע בין 1 ל- 100 מ מ, הריכוז הסופי עבור מבחני = 0.1-10 מ מ) כדי בארות המכיל PDHC וα-ketoglutarate (עובד ריכוז מניות הנע בין 1 ל- 100 מ מ, הריכוז הסופי עבור מבחני = 0.1-10 מ מ) כדי וולס המכיל KGDHC.
- לחץ על "קרא" כדי להתחיל את המדידה קינטי.
6. ניתוח נתונים
- החזק את לחצן CTRL' בלוח המקשים ' ולחץ על ' בארות כדי ליצור גרף אחד המכיל את כל המדידות קינטי המתאים ערוץ 1 (איור 3 א) '.
- לחץ על "נתונים" בסמל תצוגה בפינה הימנית העליונה עבור ערכים גולמיים עבור יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) נמדד בנקודות זמן שונות (איור 3B).
- לייצא את הערכים עבור ניתוח (טבלה 3).
- לחץ על התפריט על הימנית העליונה (איור 3B) הנפתח "גרף" כדי לגשת RFU ערכים המשויכים פלורסצנטיות ערוץ 2.
- חזור על שלבים 6.1-6.3 בערוץ 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3A מספק מעקב נציג RFU שנאספו במהלך המדידה בו זמנית של2O H2 ו- NADH הייצור על ידי מטוהרים KGDHC. הנתונים הגולמיים RFU עבור כל מרווח זמן מצטיירת דמות 3B. הנתונים הגולמיים RFU מיוצאים ואז לניתוח. מאת והגדלתי רגיל עקומות המוצג באיור2, הכמות האבסולוטית של NADH ו- H2O2 נוצר בכל פרק זמן מדידה במהלך תקופת 5-מין יכול להיקבע. דוגמא של חישוב זה מסופק בטבלה3. לאחר שהקים הסכום של2O של NADH ו- H-2 KGDHC או PDHC במרווחי זמן שונים נקבע, ערכים מועתקים, להזין קלט לתוך תוכנת יצירת גרפים/סטטיסטי לצורך ניתוח נוסף. באמצעות ניתוח גרף-סוג של XY, ניתן להתוות את כמות NADH (µmol) ו- H2O2 (pmol) נוצר על ידי KGDHC או PDHC כפונקציה של הזמן (איור 4A). באמצעות ערכים אלה, קצב היווצרות NADH ו- H2O2 במהלך חמצון המצע גם ניתן לחשב. כפי שמוצג באיור 4B, KGDHC ו- PDHC מציגים מאפיינים שונים מבחינת NADH ו- H2O2 ויוצרים יכולת.
פעם זה נקבע כי KGDHC, PDHC enzymatically פעילים NADH ו- H2O2 היווצרות ניתן לעקוב בו-זמנית, ROS לשחרר נכסים, ניתן למדוד פעילות האנזים. בחרנו להשוות KGDHC PDHC מאז הם מאוד הומולוגי במבנה הבסיסי, תועדו להיות קיבולת גבוהה באתרי הייצור ROS5. איור 5 ו איור 6 להדגים את התלות של NADH ו- H2O2 הפקת ריכוז המצע. PDHC בקלות, רווי על ידי כמויות נמוכות של המצע עם קצב הפקת NADH ו- H2O2 להגיע שלה היותר 0.1-0.5 מ מ פירובט. KGDHC, מצד שני, מציג מגביר מצטבר NADH ו- H2O2 הפקה עם הגדלת α-ketoglutarate (איור 5). זה מדגים כי KGDHC PDHC, למרות מאוד הומולוגי במבנה הבסיסי, יש מאפיינים שונים קינטית מבחינת כמה המצע נדרש כדי לעודד שחרור ROS מקסימלי. איור 5 גם מדגים כי H2O2 שחרור KGDHC להרכב חריפה הייצור NADH וזמינות המצע. PDHC מצד שני אין את אותם מאפיינים קינטי. KGDHC PDHC גם שונים מבחינת NADH ו- O2●/H2O2 ויוצרים קיבולת כאשר ריכוז NAD+ מגוונת (איור 6).
ניצול היתרונות של המדד בו זמנית של2O של NADH ו- H-2, מעכבי בייעודי לאתר פוטנציאל לייצור ROS יכולים להיות מוקרן. זה יכול לעזור לקבוע את כמות מעכב הדרוש כדי לגרום עיכוב מקסימלי של H2O2 שחרור. בנוסף, על ידי מדידת הפקת NADH באותו הזמן, האתר מעכב פעולה, כמו גם המקור של ROS ניתן לזהות. מחקרים קודמים הראו כי α-ketoglutarate אנלוגי, KMV, הוא מאוד יעיל עיכוב שחרור ROS13,KGDHC (עיכוב 90% ≥)15. גם הראנו כי מדד המחירים לצרכן-613, חומצה ליפואית אנלוגי חוסם dihydrolipoamide של יחידת משנה2 E של PDHC, KGDHC, גם יכול לעכב שחרור ROS ממתחם או על-ידי ~13,90%14. האתר של פעילות KMV, מדד המחירים לצרכן-613 מוצגים באיור 7. מדד המחירים לצרכן-613 גופרית המכיל מולקולה, לכן מומלץ כי תיול-עשיר צמצום סוכנים (dithiothreitol; DTT) או חלבונים (אלבומין) מושמטים מכל הליך13. איור 7 מדגים כי מדד המחירים לצרכן-613 והן KMV היו שניהם יעילים-הגבלת NADH ו- H2O2 באמצעות KGDHC. באופן דומה, מדד המחירים לצרכן-613 ביטל לחלוטין H2O2 שחרור PDHC (איור 7). באופן קולקטיבי, תוצאות אלו ממחישות כי KMV מדד המחירים לצרכן-613 הן מעכבי יעיל לשחרור2 2O H, ובכך ניתן להחיל על ניסויים עם המיטוכונדריה מבודד. מסך כזה יהיה מאוד מועיל עבור אנזימים להיוות ROS פוטנציאליים אחרים שכן הוא מאפשר הערכה ישירה של יעילות, סלקטיביות של מעכבי שונים על dehydrogenases המכילים פלווין מטוהרים. המדד בו זמנית של NADH כולל גם את ערך מוסף המאפשר זיהוי ראשוני מקור פוטנציאלי של ROS בתוך אנזים מורכבים. איור 7 מספק תיאור של המנגנון קטליטי KGDHC, אשר הוא מאוד הומולוגי ל PDHC. התצפית כי KMV, מדד המחירים לצרכן-613, ואשר לחסום את E1 E2 יחידת משנה של KGDHC, כמעט לחלוטין ביטל H2O2 והן הפקת NADH, מאשרת כי יחידת משנה3 E, סביר להניח אופנה, היא המקור ROS 18. מדד המחירים לצרכן-613 המופעל השפעה דומה על PDHC המאשר כי האתר עיקרון לשחרור2 2O H הוא E3 יחידה משנית18. בגישה דומה יכול לשמש dehydrogenases אחרים. זה ידרוש הזיהוי של מעכבי החוסמים את זרימת אלקטרונים דרך חלקים שונים של אנזים מורכב.
איור 1 : צילומי מסך נציג להתקנה assay. (א) תיאור של הליך להגדיר עבור המידה קינטי של שינויים בזריחה NADH ו resorufin. (B) הגדרת הפרמטרים פלורסצנטיות עבור וזמינותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג רגיל עקומות עבור קרינה פלואורסצנטית NADH ו resorufin. עקומות מנוצלים כדי להעריך את קצב הפקת NADH ו- O2● -/H2O2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : עקבות נציג עבור הנתונים RFU גלם שנאספו במהלך וזמינותו. עקומות (A) עבור כל טוב, זה היה לקרוא במהלך וזמינותו. לוח תצוגה עקומות נוצרות על-ידי החזקת לחצן CTL ולחיצה על כל טוב זה נקראים. (B) עבור ייצוא נתונים, נתונים נלחץ תחת תצוגה כדי ליצור טבלה המכילה את הערכים RFU נציג. לאחר מכן על לחצן ייצוא הגיליון האלקטרוני כדי לייצא את התוצאות raw. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ישיר השוואה של H2 O 2 NADH שיעורי ויוצרים של KGDHC ושל PDHC. (א) מדידה בו זמנית של2O H2 ו- NADH ויוצרים פוטנציאל של KGDHC ושל PDHC. (B) חישוב של שיעור של2O H2 ו- NADH צורה על-ידי KGDHC PDHC. השוואה ישירה של הפקת NADH ו ROS על ידי שני אנזימים המכילות פלווין מדגים כי KGDHC מייצרת יותר H2O2 אשר קשורה יכולתה אנזימטי גבוה יותר. n = 4, זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מדידה סימולטני של H 2 O 2 ו- NADH ויוצרים המחירים על-ידי KGDHC PDHC מחמצן ריכוז סובסטרט שונים. שינויים פלורסצנטיות נמדדו כפי שתואר לעיל אלא ריכוז המצע הסופי היו מגוונים מ מ מ 0 עד 10 מ מ. בגישה זו נעשה שימוש כדי לברר את התלות של H2O2 שחרור על מאפיינים קינטי של KGDHC ו- PDHC. n = 4, זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : KGDHC, PDHC גם להציג H שונים2 O 2 ו- NADH ויוצרים המאפיינים כאשר NAD + רמות משתנות. שינויים פלורסצנטיות נמדדו כפי שתואר לעיל, אלא הריכוז הסופי של NAD+ היו מגוונים מ מ מ 0 עד 1 מ מ. בגישה זו נעשה שימוש כדי לברר את התלות של H2O2 שחרור על מאפיינים קינטי של KGDHC ו- PDHC. n = 4, זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : הקרנת הסרט שונה מעכבי ספציפיות-לאתר עבור NADH ו- H2 O 2 ייצור. (א) דיאגרמה המתארת את מחזור קטליטי KGDHC ואת האתרים של פעולה KMV, מדד המחירים לצרכן-613. שימו לב כי PDHC יש מחזור קטליטי הומולוגיים, פרט לכך KMV לא להתחרות עבור אתר איגוד פירובט. E1: פירובט או α-ketoglutarate דהידרוגנאז, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide דהידרוגנאז. (B) אפקט של KMV, מדד המחירים לצרכן-613-NADH ו- H2O2 הייצור על ידי KGDHC ו PDHC. הדגימות היו preincubated KMV (10 מ מ) או מדד המחירים לצרכן-613 (150 מיקרומטר) ולאחר מכן לבדיקה לייצור2 2O NADH ו- H. n = 4, זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | ריכוז מניות בעבודה | נפח יתווספו. טוב | ריכוז סופי בבאר |
| KGDHC או PDHC | יחידה 1/mL | 20 ΜL | 0.1 יחידות/mL |
| סופראוקסיד דיסמוטאז | 250 יחידות/mL | 20 ΜL | 25 יחידות/mL |
| חזרת peroxidase | 30 יחידות/mL | 20 ΜL | 3 יחידות/mL |
| תיאמין רב-תכליתי | 3 מ מ | 20 ΜL | 0.3 מ מ |
| קואנזים A | 1 מ מ | 20 ΜL | 0.1 מ מ |
| NAD+ | 10 מ מ | 20 ΜL | 1 מ מ |
| 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 מיקרומטר | 20 ΜL | 10 מיקרומטר |
| המצע | 1-100 מ מ | 20 ΜL | 0.1-10 מ מ |
טבלה 1: דוגמה של פרוטוקול בסיסי להגדיר עבור המידה של O 2 ●– /H 2 O 2 על ידי PDH מטוהרים או KGDH הפקת NADH. מאז 20 µL של כל ריאגנט מתווסף בכל טוב, הגמר נפח-תגובה 200 µL, הריכוז הסופי של כל ריאגנט 10-fold פחות ריכוז מניות (למשל, הריכוז הסופי של NAD+ בתערובת התגובה הוא 1 מ מ ). שימו לב כי יש להוסיף ריאגנטים לבאר לפי סדר הופעתן בטבלה.
| מעכב | היעד |
| 3-מתיל-2-אוקסו valeric חומצה | E1 יחידת משנה של KGDHC |
| מדד המחירים לצרכן-613 | E2 יחידת משנה של אוקסו חומצה dehydrogenases |
בטבלה 2: רשימת מעכבי ואת המטרות שלהם. אתרים של פעולה מתוארים גם באיור8.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| זמן | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24.4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0: 00:34 | 24.4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24.4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24.4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24.4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0: 02:34 | 24.4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24.4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0: 03:34 | 24.4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24.4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24.4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24.4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin קרינה פלואורסצנטית | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| זמן | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0: 00:00 | 24.4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0: 00:30 | 24.4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0: 01:00 | 24.4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24.4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0: 02:00 | 24.4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24.4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0: 03:00 | 24.4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0: 03:30 | 24.4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0: 04:00 | 24.4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0: 04:30 | 24.4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0: 05:00 | 24.4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
טבלה 3: תצוגת גיליון אלקטרוני של התוצאות שנאסף ערכת ניסויים. ערכים RFU גלם המופקים הניסוי מיוצאים ל גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. שימוש רגיל עקומות שנוצרו לפני ניסויים, ניתן לחשב את קצב ייצור2 2O NADH ו- H בגיליון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה יש יתרון מאז, 1) היא מבטלת כל התגובות מתחרות שעשויים אחרת להפריע H2O2 זיהוי (למשל, מערכות נוגדי חמצון או מקורות אחרים של ROS), 2) מספק הערכה ישירה של קצב מקורי ROS לשחרר על-ידי המכילות פלווין מיטוכונדריאלי דהידרוגנאז, 3) מאפשר את ההשוואה של הילידים ROS לשחרר את המחירים של שניים או יותר טהור מבוסס פלווין dehydrogenases, 4) שיכולים לאפשר השוואה ישירה של קצב שחרור ROS פעילות האנזים, ו- 5) מאפשר סינון של מעכבי תחרותי סלקטיבי לשחרור ROS. הקבוצה שלנו ואחרים השתמשו בשיטה זו בפרסומים קודמים לבחון ברגולציה של ROS מאת allosteric, חמצון-חיזור איתות מנגנונים לפני ביצוע ניסויים המיטוכונדריה או שריר permeabilized14,16, 17,19,20.
שינויים, פתרון בעיות:
הליך זה משתמש ציוד בסיסי זמין כמעט בכל מוסד. הגישה הוא גם בעלות נמוכה, ומשתמש כימיקלים נפוצים זמין דרך ספקים שונים. מאגר הרכב עשויים להשתנות בהתאם מאפיינים של אנזים - למרות, מצאנו כי מאגר התגובה הבסיסית של סוכרוז, HEPES, מניטול, EGTA עובד טוב ברוב היישומים. Raw ערכים עבור זריחה resorufin הם בדרך כלל בסביבות 50-500 RFU עבור ROS משחררים אנזים מדולל כדי 0.1 U/mL. ערכים גבוהים יותר RFU עשוי להצביע על שהכימית AUR כבר מחומצן אוטומטי עקב חשיפה לאור או להקפיא חוזרות ונשנות-הפשרה. לכן, פתרונות עבודה AUR באופן שגרתי יוחלף כל 2-3 שבועות (תלוי תדירות השימוש). זיהומים אנזים הכנה או דנטורציה יכולה להוביל נמוכה יותר נורמלי קריאות ROS ו- NADH. טוהר אנזים צריך לפקח באופן שגרתי על ידי אלקטרופורזה בג'ל. מאפייני קינטי (Km, Vmax עבור המצע ו- NAD+) צריך להיות גם העריך מיד לאחר הרכישה או טיהור של אנזים ולעקוב אחר ואז באופן שגרתי לאחר מכן. רוב ריאגנטים בשימוש וזמינותו יציבים, יכול להיות נתון מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. פירובט α-ketoglutarate צריך להיות מאוחסנים ב- aliquots של µL 100 ב- 80 ° C כדי להימנע אוטומטי-חמצון. הימנע משימוש צמצום סוכנים כמו DTT מאז טפסים O2●/H2O2 ישירות דרך היווצרות קיצוני PDHC, KGDHC (ואת פוטנציאל אחרים flavoenzymes)17. מבחני יכול להתבצע ב 37 מעלות צלזיוס; עם זאת, הקבוצה שלנו מצא כי ניסויים אלה 25 ° c הוא אידיאלי עבור אספקת נתונים עקבי יותר.
מגבלות של הטכניקה:
אחד משוכה העיקריים הקשורים עם טכניקה זו היא גישה אנזימים מיטוכונדריאלי המכילות פלווין מטוהרים. כאן השתמשנו זמינים מסחרית KGDHC ו- PDHC כדי להדגים כי טכניקה זו ניתן להשוות ישירות ROS שחרור פעילות האנזים והיכולת של המכילות פלווין dehydrogenases מיטוכונדריאלי. עם זאת, רוב ROS בהפקת פלווין המכילים אנזימים אינם זמינים מסחרית, חייבים להיטהר במעבדה. זה יכול להיות מאתגר בהתחשב קצת של אנזימים אלה ממברנה מאוגדים או לספוג עד קרום פנימי מיטוכונדריאלי. פרוטוקולים חדשים ולטיהור מוצלחים ממברנה מכורך פלווין המכילים אנזימים המייצרים ROS זמינים כעת. זה כולל שיטות לטיהור עבור קומפלקס אני, השני מורכבים, sn-גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז21,22,23. לכן, אף-על-פי רוב הגנרטורים ROS המפורטים לא יכול להיות זמינים מסחרית, פרוטוקולים קיימים עבור טיהור וניקוי הבידוד שלהם. פיזיולוגיים הרלוונטיות של התוצאות נאסף באמצעות אנזימים מבוססי פלווין מזוכך הוא גם מגבלה. לכן, הממצאים שנאספו עם אנזימים מטוהרים צריך להיות במעקב עם מבחני באמצעות המיטוכונדריה מבודד או רקמות permeabilized. חמשת המחקרים נפרד להשתמש בגישה זו כדי לחקור מנגנוני ויסות ROS שחרור KGDHC ו- PDHC14,16,17,19,20. ראשוני תוצאות עבור התפקיד של חמצון-חיזור מתגי שליטה ROS שחרור בתחילה נבדקו באמצעות מטוהרים KGDHC ו- PDHC ולאחר מכן מנגנוני רגולציה נותחו עוד יותר כבד, המיטוכונדריה הלב ואת סיבי השריר14, 16,17,20.
משמעות לגבי שיטות קיימות:
מדידת ROS שחרור מאתרי בודדים של ייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיות מאתגר בשל נוכחותם של ריאקציות צדדיות מתחרות גם לייצר O2●/H2O2 ונוגד חמצון מערכות אחרת עלול להוביל underestimation של שיעורי מקורית. קרום פוטנציאלי יכול גם לשנות ROS המחירים שחרור מאתרים שונים, השימוש של מעכבי יכול לשנות זרימת אלקטרונים, בלבול O2● -/H2O2 היווצרות המידות. השיטה המוצגת כאן מאפשר הערכת ישיר קיבולת שחרור ROS אנזימים בודדים בזמן בו זמנית הערכת הקשר בין שערי O2●/H2O2 ואנזים פעילות מקורית. שיטה זולה זו יכולה לשמש כלי להשוואת את הילידים ROS שחרור במחירים בודדים המכילות פלווין מיטוכונדריאלי אנזימים לפני ביצוע ניסויים מתוחכמים יותר עם המיטוכונדריה, תאים או רקמות. בנוסף, השיטה המובאת במסמך זה יכול להיות מנוצל למסך מראש את היעילות ואת מידת הבררנות של מעכבי לשחרור ROS טרם ביצוע מבחני עם המיטוכונדריה מבודד.
יישומים עתידיים:
השיטה המובאת במסמך זה נעשה שימוש במחקרים נפרד חמש, שמטרתה לחקור שליטה על שחרור ROS PDHC ו- KGDHC14,16,17,19,20. במחקרים אלה, מעכבי הוקרנו ROS לשחרר, המחירים NADH בהפקת הוערכו באמצעות אנזימים מטוהרים. תוצאות שנאספו עם אנזימים מטוהרים היו לאחר מכן מאומתים באמצעות המיטוכונדריה מבודד, permeabilized סיבי השריר14,16,17,20. לכן, בשיטה זו ניתן ליישם מספר מחקרים עתידיים המכוונת לומד יליד המחירים שחרור ROS המיטוכונדריה, תאים, סיבי השריר.
שלבים קריטיים בפרוטוקול:
אנזים טוהר ואת מאפייניו קינטי צריך באופן שגרתי לפקח. יש AUR עובד ריאגנט מניות גם להחליף בתדירות גבוהה. פעולה זו תבטיח תוצאות שנאספו עקביים. הסדר של תוספת של ריאגנטים חיוני להפעלת ניסוי יירוט מוצלח (טבלה 1). מעכבי, צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את הריכוז הנדרש כדי להפיק עיכוב המרבי של שחרור ROS. במחקר זה, בחרנו 10 מ מ KMV ו 150 מיקרומטר מדד המחירים לצרכן-613 מאז היה קודם לכן קבענו כי ריכוזים אלה לגרום עיכוב מקסימלי של ROS שחרור מאת KGDHC ו- PDHC13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). הפקת וידאו בוצע בשיתוף פעולה עם המרכז לחדשנות למידה (CITL)-אנדרטת והגבלות והוראה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
